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Chapter 7: Summary – Resumen – Samenvatting

Chapter

Summary – Resumen – Samenvatting

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170


Summary

Asthma is a condition that affects the small airways (bronchioles) that are

responsible for carrying air into and out of the lungs. During asthma, the

bronchioles are inflamed and narrowed (Fig. 7.1) due to an excess of mucus

causing clinical symptoms in the patient such as, coughing, wheezing, shortness of

breath, and a tightness of the chest. Although the specific underlying causes of

asthma are still incompletely defined, it has been shown that various genetic

factors can predispose an individual to allergic asthma. Besides genetic factors,

environmental factors, including dust mites, fungi, second-hand smoke,

cockroaches, pets (cats and dogs), air pollution, foods, respiratory infections, and

exercise can initiate an asthma attack, and they are called allergic triggers or

allergens.

The immune system is a complex environment, possessing a variety of elements

able to recognize and attack invading microorganisms. In allergic diseases, the

immune system is subverted by foreign substances, such as the allergens

mentioned above. In allergic asthma, the allergen reaches the airways by

inhalation where it can be ingested by specific cells (antigen-presenting cells;

APCs) that subsequently degrade it into small pieces (peptides), which can then be

exposed on the cell surface and presented to the immune system (Fig. 7.2A). The

immune response is initiated by lymphocytes (Fig. 7.2A), a white blood cell or

leukocyte that is recruited to the airways where it releases proteins called

cytokines. Cytokines act as messengers that deliver signals to a specific receptor

located on the surface of target cells (adjacent cells or distant cells) inducing

intracellular signals that result in specific biological responses including migration,

proliferation, or survival. There is a wide range of cytokines and their receptors,

and they have been grouped according to structural features in three main families:

Chemokine family: these induce migration of cells toward the source of the

chemokine.

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Hematopoietin family: it includes growth factors and many Interleukins (IL),

which are cytokines of leukocyte origin and can act on leukocytes.

Tumor necrosis factor (TNF) family: it includes trimeric proteins that are either

attached to the cells or secreted.

During allergic asthma, the main cytokines that play a role in the inflammatory

response are IL-4, IL-5, and IL-13. IL-4 induces the production of immunoglobulin

E (IgE), a specific type of antibody that is generated by exposure to allergens. IgE

can bind receptors on the surface of eosinophils and mast cells (immune effector

cells) (Fig. 7.2A) causing the release of toxic products as well as a variety of

inflammatory mediators including histamine and leukotrienes. These substances

cause contraction of the smooth muscle cells of bronchioles as well as attraction

and accumulation of eosinophils and neutrophils (Fig. 7.2A). IL-13 has been

associated with mucus hyper-secretion in the lung; and IL-5 is capable of inducing

recruitment of eosinophils to the lung as well as maintaining eosinophil survival by

binding specifically to its receptor (Fig. 7.2B).

The eosinophil is a specific type of white blood cell characterized by having a bi-

lobed nucleus and different types of granules, which store various toxic proteins

(Fig. 7.2B). The high content of positively-charged proteins make this cell capable

of binding eosin, a negatively-charged dye of orange-pink color, and for that

reason, the orange cells in a hematoxylin-eosin staining receive the name of

eosinophils. Eosinophils are produced in the bone marrow under the influence of

several cytokines. IL-5 is critical for the production of eosinophils, and as

mentioned above, it is also involved in maintaining their survival and inducing the

release of mature cells into the circulation. The number of eosinophils in healthy

donors is low (1-3% of the white blood cell population) with an estimated half-life of

18 hours in peripheral blood. During parasitic infections, the number of eosinophils

increases, which is essential for remission of the disease since these cells are

responsible of releasing their toxic granule proteins to kill parasites. However, in

absence of parasites, inappropriate release of these granule products are toxic to

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tissues causing inflammation and damage, as happens in allergic asthma. In

asthmatic patients, the number of eosinophils in sputum directly correlates with the

severity of the disease, and this parameter has been utilized to measure airway

inflammation together with the measurement of toxic eosinophil proteins in serum

and urine.

In this thesis, we have focused on understanding the mechanisms by which IL-5

induces survival of eosinophils. In Chapter 2 and 3, we have studied the

intracellular signals generated upon binding of IL-5 to its receptor. The IL-5

receptor (IL-5R) is expressed on the cell surface of eosinophils, and it is composed

of an α-chain that specifically binds IL-5 and a β-chain, which is shared with the

receptors for IL-3 and granulocyte–macrophage colony-stimulating factor (GM-

CSF). In the absence of IL-5, there are intracellular changes which eventually

leading to cell death after one to two days. Our results have revealed novel

mechanisms regulating IL-5-dependent survival, which could specifically be

targeted to inhibit eosinophil function therapeutically (Fig 7.2B).

In Chapter 4, we have investigated the effects of a novel IL-5R antagonist peptide

that specifically blocks both IL-5-mediated signaling as well as eosinophil functions

including migration and cell adhesion. This peptide could be considered as a

candidate for the development of novel asthma therapies. In chapter 5, we have

analyzed the use of protein transduction technology, a novel approach to deliver

large biologically active molecules (DNA, peptides, proteins, drugs) into living cells,

which could be utilized to inhibit intracellular signaling in eosinophils, and in that

way eosinophil function.

Currently, oral steroids are the most effective anti-inflammatory drugs available,

and are considered an essential treatment for moderate and severe asthmatics.

However, they only alleviate the symptoms temporally and their continued use

could cause severe side effects. Our work contributes to understanding eosinophil

biology and thus the development of safe antagonists that specifically target IL-5

and eosinophil function. An eosinophil-targeted approach may be useful for the

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development of molecules that could be utilized as alternative therapies in the

treatment of asthma and other eosinophil-associated diseases.

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Figure 1: Comparison between healthy small airways (bronchioles) and their narrowing due to mucus accumulation and the inflammatory response during asthma Figure 2 A) Representation of cell types involved in the inflammatory responses during asthma. B) The eosinophil is a white blood cell or leukocyte, characterized by having a nucleus with two lobules and many intracellular granules, which store a variety of proteins. On its membrane, it expresses the IL-5R, which is composed of one α-chain and one β-chain. IL-5, a cytokine produced by lymphocytes, binds to the α-chain of the receptor, which consequently becomes activated (1). Activation of IL-5R leads to the generation of specific signals inside the cell, which can be changed if there is not binding of cytokine. These signals determine the response of the cell (2). In presence of IL-5, eosinophils can survive whereas absence of IL-5 induces eosinophil death (3).

B

Antigen-presenting cell

MC

Mast cell

Lymphocyte

Eosinophil Neutrophil

A

α β

Eosinophil membrane

Eosinophil granules

Eosinophil nucleus

Eosinophil membrane

IL-5 receptor

Intracellular signals

Death

IL-5

Outside the cell

Inside the cell

1

2

Eosinophil responses

3

Survival

+ IL-5 - IL-5

α βα β

Eosinophil membrane

Eosinophil granules

Eosinophil nucleus

Eosinophil membrane

IL-5 receptor


Death

IL-5

Outside the cell

Inside the cell

1

2


3

Survival

+ IL-5 - IL-5

B

Antigen-presenting cell

MCMC

Mast cell

Lymphocyte

Eosinophil Neutrophil

A

α β

Eosinophil membrane

Eosinophil granules

Eosinophil nucleus

Eosinophil membrane

IL-5 receptor


Death

IL-5

Outside the cell

Inside the cell

1

2


3

Survival

+ IL-5 - IL-5

α βα β

Eosinophil membrane

Eosinophil granules

Eosinophil nucleus

Eosinophil membrane

IL-5 receptor


Death

IL-5

Outside the cell

Inside the cell

1

2


3

Survival

+ IL-5 - IL-5

Normal airway

Asthma airway

Normal airway

Asthma airway

Normal airway

Asthma airway

Normal airway

Asthma airway

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Resumen

El asma es una condición que afecta las vías aéreas pequeñas (bronquiolos), las

cuales están encargadas de la entrada y salida de aire a los pulmones. En el

asma, los broquiolos se encuentran inflamados y con disminución de la luz debido

al exceso de moco (Fig. 7.1) que ocasiona al paciente síntomas clínicos tales

como tos, dificultad para respirar y una sensación de congestión en el pecho.

Aunque las causas del asma no están bien determinadas, se ha demostrado que

factores genéticos pueden predisponer, pero los genes involucrados están aun en

proceso de investigación. Además, factores ambientales tales como el polvo de

ácaros, los hongos, el humo de fumadores, las cucarachas, las mascotas (perros y

gatos), la polución, los alimentos, las infecciones respiratorias y el ejercicio,

pueden inducir un ataque de asma y por lo tanto, han sido denominados

disparadores alérgicos o alergenos.

El sistema inmune posee una variedad de elementos capaces de reconocer y

atacar una sustancia extraña, tales como los alergenos mencionados

anteriormente. El alergeno llega a las vías respiratorias por inhalación y allí puede

ser ingerido por células (células presentadoras de antígeno) que lo destruyen en

partes pequeñas (péptidos), que son expuestas en la superficie de la célula para

presentarlo al sistema inmune (Fig. 7.2A). La respuesta inmune es iniciada por

linfocitos (Fig. 7.2A), una clase de células blancas o leucocitos, que son atraídos

hacia las vías aéreas, en donde secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas.

Las citocinas funcionan como mensajeros que llevan señales a receptores

específicos localizados sobre la superficie de las células (adjacentes o distantes) e

inducen señales intracelulares que generan respuestas biológicas específicas

como la migración, la proliferación o la supervivencia celular. Existe una gran

variedad de citocinas, que al igual que sus receptores, han sido agrupadas en tres

familias de acuerdo a sus caracteristicas estructurales:

Familia de las quimiocinas: estas citocinas pueden inducir migración de las

células hacia el orígen de la quimiocina.

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Familia de las hematopoyetinas: esta familia incluye factores de

crecimiento y las interleucinas (IL), las cuales son citocinas producidas por

leucocitos y que actúan sobre los leucocitos.

Familia del Factor de necrosis tumoral (TNF): esta familia incluye

proteínas triméricas que están ancladas a la célula o secretadas al medio.

En el asma, las citocinas claves en la respuesta inflamatoria son: IL-4, IL-5 y IL-13.

La IL-4 induce la producción de inmunoglobulina E (IgE), que es un tipo de

anticuerpo específico generado por exposición a alergenos. IgE puede unirse a

receptores sobre la superficie de eosinófilos y mastocitos, (Fig 7.2A) ocasionando

su degranulación y la liberación de productos tóxicos derivados de los gránulos

que contienen las células, al igual que varios mediadores de inflamación como la

histamina y los leucotrienos. Estas sustancias causan contracción de las células

musculares de los bronquiolos y acumulación de eosinófilos y neutrófilos (Fig

7.2A). La IL-13 se ha asociado con la excesiva producción de moco; y la IL-5 es

capáz de atraer eosinófilos hacia el pulmón y mantener su supervivencia cuando

se une específicamente a su receptor.

El eosinófilo es un tipo específico de célula blanca caracterizado por tener un

núcleo bilobulado y diferentes clases de gránulos, los cuales almacenan proteínas

tóxicas (Fig. 7.2B). El alto contenido de proteínas cargadas positivamente hacen

que ésta célula sea capaz de unirse a la eosina, una coloración cargada

negativamente y de color naranja-rosado, razón por la cual, las células naranja en

una coloración de hematoxilina-eosina reciben el nombre de eosinófilos. Los

eosinófilos son producidos en la médula ósea bajo la influencia de varias citocinas.

IL-5 juega un papel crítico en la producción de eosinófilos, y como se mencionó

anteriormente, está también encargada de su supervivencia y de inducir la salida

de células maduras a la circulación. El número de eosinófilos en personas sanas

es bajo (1-3% de la población de células blancas) con una vida media de unas 18

horas en sangre periférica. En infecciones parasitarias, el número de eosinófilos

aumenta, lo cual es esencial para la remisión de la enfermedad dado que estas

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células son responsables de liberar los productos tóxicos de sus gránulos para

matar los parásitos. Sin embargo, cuando no hay parásitos, hay una secreción

inapropiada de estos productos que son tóxicos para los tejidos causando

inflamación y daño tisular, como sucede en el asma alérgica. En los pacientes

asmáticos el número de eosinófilos en esputo se correlaciona directamente con la

severidad de la enfermedad, y este parámetro ha sido utilizado para medir

inflamación de las vías aéreas, al igual que la medición de proteínas granulares

del eosinófilo en suero y orina.

Esta tésis está especialmente enfocada a entender los mecanismos por los cuales

la IL-5 induce la supervivencia de los eosinófilos. En los capitulos 2 y 3, se han

estudiado las señales intracelulares generadas por la unión de la IL-5 a su

receptor. El receptor de IL-5 (IL-5R) está expresado sobre la superficie de los

eosinófilos, y está compuesto por una cadena α que se une específicamente a la

IL-5 y una cadena β, la cual es también utilizada por los receptores de otras

citocinas: la IL-3 y el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos

(GM-CSF). En ausencia de IL-5 se producen cambios en la señales intracelulares

que causan muerte celular. Nuestros resultados muestran nuevos mecanismos

que regulan la supervivencia dependiente de IL-5, los cuales pueden ser utilizados

para inhibir el funcionamiento de los eosinófilos. (Fig. 7.2B).

En el capítulo 4 investigamos los efectos de un péptido que funciona como

antagonista del IL-5R. Este péptido se une específicamente a la cadena α del

receptor e inhibe las señales inducidas por la IL-5 al igual que funciones de los

eosinófilos tales como migración y adhesión. Este péptido puede ser considerado

como un candidato en el desarrollo de nuevas terapias contra el asma. En el

capítulo 5 analizamos el uso de la transducción de proteínas, una tecnología que

ha sido descrita recientemente y que consiste en depositar moléculas

biológicamente activas (ADN, péptidos, proteinas, drogas) dentro de células vivas.

Esta técnica podría ser utilizada para inhibir señales intracelulares en los

eosinófilos y así, inhibir su función.

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Actualmente, los esteroides orales son las drogas anti-inflamatorias más efectivas

que están disponibles y son consideradas esenciales en el tratamiento del asma

moderada y severa. Sin embargo, estos medicamentos solo alivian los síntomas

temporalmente y su continuo uso puede causar efectos colaterales. Nuestro

trabajo contribuye al desarrollo de antagonistas seguros específicamente dirigidos

para bloquear la IL-5 y la función de los eosinófilos, lo cual puede ser utilizado en

el desarrollo de terapias alternativas para el tratamiento no solo del asma sino

también de otras enfermedades asociadas con eosinófilos.

Samevatting

Het begrijpen van de moleculaire mechanismen die de eosinofielen productie en

functie reguleren is essentieel voor de ontwikkeling van moleculen die mogelijk

kunnen worden ingezet in de behandeling van astma en andere eosinofiel-

geassocieerde ziektes. We hebben de mechanismen waarin IL-5 de celoverleving

van eosinofielen reguleert onderzocht, en hebben kritische mediatoren

geindentificeerd en een nieuw mechanismen gevonden die gebruikt kunnen

worden als therapeutische targets om eosinofiel functie te blokkeren. We hebben

ook het effect van een nieuw IL-5R antagonist peptide bestudeerd en vonden dat

het specifiek de IL-5 signaaltransductie routes blokkeert en eosinofiel functies,

waaronder chemotaxis en celadhesie, remt. Verder hebben we ook het gebruik van

eiwittransductie domeinen (PTD) geanalyseerd om eiwitten af te geven die de

eosinofiel intracellulaire signalen en daarmee eosinofiel functie kunnen blokkeren.

Dit werk draagt bij aan de ontwikkeling van veilige antagonisten die specifiek IL-5

en eosinofiel functie treffen. Alternatieve therapieën zijn nodig voor de behandeling

van astmatische reacties omdat het continue gebruik van orale steroïden serieuze

bijwerkingen kunnen hebben.

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Figura 1: Comparación entre vías aéreas normales (bronquiolos) y su angostamiento debido a la acumulación de moco y la respuesta inflamatoria en el asma. Figura 2 A)Representación de los tipos de células involucradas en la respuesta inflamatoria en el asma. B) El eosinófilo es una célula blanca o leucocito caracterizado por tener un núcleo con dos lóbulos y muchos gránulos intracelulares que almacenan diversas proteínas. En su membrana se encuentra el receptor para IL-5 (IL-5R), el cual está compuesto por una cadena α y una cadena β. IL-5, una citocina producida por linfocitos, se une a la cadena α del receptor e induce su activación (1) La activación de IL-5R genera señales específicas dentro de la célula, la cuales pueden cambiar si la citocina no se une a su receptor. Estas señales determinan las respuesta de la célula (2). En presencia de IL-5, los eosinófilos pueden sobrevivir mientras que la ausencia de IL-5 induce muerte de los eosinófilos (3).

B

Célula presentadora deantígeno

MC

Mastocito

Linfocito

Eosinófilo Neutrófilo

A

α β

Membrana celular

Gránulos del Eosinófilo

Núcleo del Eosinófilo

Membranadel

Eosinófilo

Receptor de IL-5

Señales intracelulares

Muerte

IL-5

Exterior de la célula

Interior de lacélula

1

2

Respuestas del Eosinófilo

3

Supervivencia

+ IL-5 - IL-5

α βα β

Membrana celular



Membranadel

Eosinófilo

Receptor de IL-5


Muerte

IL-5



1

2


3

Supervivencia

+ IL-5 - IL-5

B


MC

Mastocito

Linfocito


A


MC

Mastocito

Linfocito


A

α β

Membrana celular



Membranadel

Eosinófilo

Receptor de IL-5


Muerte

IL-5



1

2


3

Supervivencia

+ IL-5 - IL-5

α βα β

Membrana celular



Membranadel

Eosinófilo

Receptor de IL-5


Muerte

IL-5



1

2


3

Supervivencia

+ IL-5 - IL-5

Vía aéreanormal

Vía aéreaen el asma

Vía aéreanormal

Vía aéreaen el asma

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