chem. listy 92, (1 zÁkladnÉ aspekty ...chem. listy 92, 406-414 (1998) zÁkladnÉ aspekty...

9
Chem. Listy 92, 406-414 (1998) ZÁKLADNÉ ASPEKTY SEKUNDÁRNÉHO METABOLIZMU A JEHO PREJAVY V METABOLIZME HÚB RENÁTA PAVLOVIČOVÁ Katedra biochemie a mikrobiologie, Chemickotechnolo- gická fakulta, Slovenská technická univerzita, Radlinské- ho 9, 812 037 Bratislava, Slovenská republika Došlo dňa 13.VL1997 Obsah 1. Charakteristika primárného a sekundárného metabolizmu 1.1. Nadváznosť sekundárného metabolizmu na primárné metabolické dráhy 1.2. Regulácia metabolizmu 1.3. Regulácia sekundárného metabolizmu 2. Primárné a sekundárné metabolity a ich význam 2.1. Sekundárné metabolity ako přírodně látky 2.2. Funkcie sekundárných metabolitov 2.2.1. Aktivity sekundárných metabolitov 2.3. Příčiny rozmanitosti sekundárných metabolitov 3. Diferenciácia a sekundárný metabolizmus húb 3.1. Sekundárný metabolizmus a rast 3.2. Mikrobiálna diferenciácia a sekundárný metabolizmus 3.2.1. Diferenciácia húb 4. Produkcia sekundárných metabolitov hubami 4.1. Klasifikácia fungálnych metabolitov Závěr 5. 1. Charakteristika primárného a sekundárného metabolizmu Primárný metabolizmus daného organizmu definoval Turner 1 ako súhrn vzájomných vzťahov enzýmovo-kata- lyzovaných reakcií (degradačných aj syntetických), ktoré poskytujú organizmu energiu, biosyntetické intermediáty a klučové makromolekuly, ako sú proteiny a DNA. Naproti tomu sekundárný metabolizmus zahřňa hlavně biosynte- tické procesy, ktorých koncové produkty - sekundárné metabolity hrajú zreteFnú úlohu v ekonomike organizmu. Primárný metabolizmus je základom pre všetky živé systé- my, sekundárný metabolizmus sa váčšinou obmedzuje na nižie formy života a je specifický pre druhy a často pre kmene. Pretože sekundárné metabolity sú odvodené od inter- mediátov primárného metabolizmu, často možu poskytovat niektoré informácie o primárnom metabolizme. Na druhej straně primárný metabolizmus poskytuje intermediáty, kto- ré sa mnohokrát stávajú základom pre tvorbu sekundárných metabolitov. Prvá zmienka o pojme „sekundárný metabolizmus" po- chádza z roku 1891 a prvýkrát sa týmto zaoberal Albrecht Kossel 1 ' 2 . Pojem „sekundárný" pre rastlinné produkty (napr. alkaloidy, regulátory rastu rastlín, terpény a iné) bol obnovený Czapekom v roku 1925. Do mikrobiálnej bioche- mie ho zaviedol profesor BďLock roku 1961, ktorý tento pojem přebral z rastlinnej biochemie 3 . Sekundárný metabolizmus nadvazuje na primárný vo viacerých aspektoch. Medziprodukty primárného metabo- lizmu sú stavebným materiálom pre biosyntézu sekundár- ných metabolitov. Táto biosyntéza však vyžaduje přísun energie, ktorá sa zvyčajne získává v podobě adenozíntrifos- fátu (ATP) z primárného metabolizmu. Niektoré sekundár- metabolity vznikajú biosyntetickými dráhami, ktoré sú příbuzné biosyntetickým dráhám primárného metaboliz- mu. (Napr. biosyntéza polyketidov je podobná biosyntéze vyšších mastných kyselin). Enzymy, ktoré katalyzujú tvor- bu sekundárných metabolitov, vznikajú v zásadě tým istým spósobom ako enzymy primárného metabolizmu. Ak tvor- ba a aktivita enzýmov primárného metabolizmu podlieha rozličným regulačným mechanizmom, dá sa očakávať, že podobné mechanizmy sa uplatňujú aj pri tvorbě a aktivitě enzýmov potřebných na katalýzu syntézy sekundárných metabolitov. Reguláciám musia podliehať aj vzájomné vzťahy medzi primárným a sekundárným metabolizmom. Ak určitý intermediárny produkt primárného metabolizmu slúži súčasne ako východisková látka na syntézu sekundár- ného metabolitu, musí aj jeho odčerpáváme do jedného alebo druhého procesu podliehať regulácii 1 . Zahner a kol. 4 (1982) opísali sekundárný metabolizmus ako „hraciu izbu" („games room") molekulárnej rulety a po- 406

Upload: others

Post on 30-Jan-2021

6 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

  • Chem. Listy 92, 406-414 (1998)

    ZÁKLADNÉ ASPEKTY SEKUNDÁRNÉHO METABOLIZMU A JEHOPREJAVY V METABOLIZME HÚB

    RENÁTA PAVLOVIČOVÁ

    Katedra biochemie a mikrobiologie, Chemickotechnolo-gická fakulta, Slovenská technická univerzita, Radlinské-ho 9, 812 037 Bratislava, Slovenská republika

    Došlo dňa 13.VL1997

    Obsah

    1. Charakteristika primárného a sekundárnéhometabolizmu1.1. Nadváznosť sekundárného metabolizmu

    na primárné metabolické dráhy1.2. Regulácia metabolizmu1.3. Regulácia sekundárného metabolizmu

    2. Primárné a sekundárné metabolity a ich význam2.1. Sekundárné metabolity ako přírodně látky2.2. Funkcie sekundárných metabolitov

    2.2.1. Aktivity sekundárných metabolitov2.3. Příčiny rozmanitosti sekundárných metabolitov

    3. Diferenciácia a sekundárný metabolizmus húb3.1. Sekundárný metabolizmus a rast3.2. Mikrobiálna diferenciácia a sekundárný

    metabolizmus3.2.1. Diferenciácia húb

    4. Produkcia sekundárných metabolitov hubami4.1. Klasifikácia fungálnych metabolitovZávěr5.

    1. Charakteristika primárnéhoa sekundárného metabolizmu

    Primárný metabolizmus daného organizmu definovalTurner1 ako súhrn vzájomných vzťahov enzýmovo-kata-lyzovaných reakcií (degradačných aj syntetických), ktoréposkytujú organizmu energiu, biosyntetické intermediátya klučové makromolekuly, ako sú proteiny a DNA. Naprotitomu sekundárný metabolizmus zahřňa hlavně biosynte-tické procesy, ktorých koncové produkty - sekundárné

    metabolity hrajú zreteFnú úlohu v ekonomike organizmu.Primárný metabolizmus je základom pre všetky živé systé-my, sekundárný metabolizmus sa váčšinou obmedzuje nanižie formy života a je specifický pre druhy a často prekmene.

    Pretože sekundárné metabolity sú odvodené od inter-mediátov primárného metabolizmu, často možu poskytovatniektoré informácie o primárnom metabolizme. Na druhejstraně primárný metabolizmus poskytuje intermediáty, kto-ré sa mnohokrát stávajú základom pre tvorbu sekundárnýchmetabolitov.

    Prvá zmienka o pojme „sekundárný metabolizmus" po-chádza z roku 1891 a prvýkrát sa týmto zaoberal AlbrechtKossel1'2. Pojem „sekundárný" pre rastlinné produkty(napr. alkaloidy, regulátory rastu rastlín, terpény a iné) bolobnovený Czapekom v roku 1925. Do mikrobiálnej bioche-mie ho zaviedol profesor BďLock roku 1961, ktorý tentopojem přebral z rastlinnej biochemie3.

    Sekundárný metabolizmus nadvazuje na primárný voviacerých aspektoch. Medziprodukty primárného metabo-lizmu sú stavebným materiálom pre biosyntézu sekundár-ných metabolitov. Táto biosyntéza však vyžaduje přísunenergie, ktorá sa zvyčajne získává v podobě adenozíntrifos-fátu (ATP) z primárného metabolizmu. Niektoré sekundár-né metabolity vznikajú biosyntetickými dráhami, ktoré súpříbuzné biosyntetickým dráhám primárného metaboliz-mu. (Napr. biosyntéza polyketidov je podobná biosyntézevyšších mastných kyselin). Enzymy, ktoré katalyzujú tvor-bu sekundárných metabolitov, vznikajú v zásadě tým istýmspósobom ako enzymy primárného metabolizmu. Ak tvor-ba a aktivita enzýmov primárného metabolizmu podlieharozličným regulačným mechanizmom, dá sa očakávať, žepodobné mechanizmy sa uplatňujú aj pri tvorbě a aktivitěenzýmov potřebných na katalýzu syntézy sekundárnýchmetabolitov. Reguláciám musia podliehať aj vzájomnévzťahy medzi primárným a sekundárným metabolizmom.Ak určitý intermediárny produkt primárného metabolizmuslúži súčasne ako východisková látka na syntézu sekundár-ného metabolitu, musí aj jeho odčerpáváme do jednéhoalebo druhého procesu podliehať regulácii1.

    Zahner a kol.4 (1982) opísali sekundárný metabolizmusako „hraciu izbu" („games room") molekulárnej rulety a po-

    406

  • Tabulka IZákladné znaky primárného a sekundárného metabolizmu5

    Metabolizmus

    primárný sekundárný

    Potřebný pre rastFyziologická úloha známaPrítomnosť za róznych rastových podmienokPřítomný vo všetkých organizmochSú tvořené samostatné definované produktyObyčajne produkty s relativné jednoduchou chemickou strukturou

    nepotřebný pre rastfyziologická úloha nie až tak samozřejmáprítomnosť závislá od rastových podmienok

    nie je všade přítomnýčasto je tvořená zmes příbuzných produktovčasto produkty s komplexnou chemickou strukturou

    kúšali sa vysvetliť, najma ako sa produkujú sekundárnémetabolity. Navrhli 5 hladin sekundárného metabolizmu:I. intermediárny metabolizmus, II. regulácia, III. transport,IV. diferenciácia, V. morfogenéza.

    Campbell6 definoval primárné a sekundárné metabolitynásledovně: „Primárné metabolity sú produktami normál-neho buňkového metabolizmu, ktoré sa vo vel'kej mierenachádzajú v přírodě a vyskytujú sa aspoň v každom rodev aspoň jednom rodokmeni. Sekundárné metabolity súproduktami normálneho buňkového metabolizmu, ktorýchvýskyt je obmedzený a nachádzajú sa v menej, než v kaž-dom druhu samostatného rodu."

    l . l . N a d v á z n o s ť s e k u n d á r n é h om e t a b o l i z m u n a p r i m á r n ém e t a b o l i c k é d r á h y

    Základná uhlíková dráha

    Sekundárný metabolizmus nadvazuje na primárný me-tabolizmus a v ňom najma na metabolizmus uhlíka a v men-šej miere na metabolizmus dusíka.

    Vačšina heterotrofných mikroorganizmov využívá glu-kózu ako základný zdroj uhlíka a energie1-

    Niekofko fungálnych metabolitov je odvodených pria-

    407

    Obr. 1. Tvorba sekundárných metabolitov z intermediátov primárného metabolizmu. Hrubo vyznačené sú základné dráhydegradácie glukózy1

  • mo od glukózy, ale uhlík glukózy sa stává použitelný aj premnohé biosyntetické procesy pri tvorbě intermediátov v ra-dě energiu uvofnujúcich reakcií. Hlavné linie týchto proce-sov sú naznačené na obr. 1. Ak sa intermediáty nepoužijúna syntetické účely, celkový výsledokreakčného poradiajeoxidácia molekuly glukózy na CO2 a vodu s produkciou 38molekul ATP. Disimilácia glukózy začíná jej přeměnou natriózy Embdenovou-Meyerhofovou dráhou alebo pentózo-fosfátovým cyklom. Ďalšia dráha vytvára pentózy, doležitév biosyntéze nukleotidov a tetrózu, ktorá móže reagovaťs fosfoenolpyruvátom a poskytuje kyselinu šikimovú. Ky-selina šikimová je intermediátom pre aromatické aminoky-seliny a tiež pre mnohé sekundárné metabolity. Trióza jetiež prekurzor serínu, ktorý sa premieňa na glycřn so stratouatomu uhlíka, a ten vstupuje do bunkovej hotovosti Cl -zlú-čenín. Postupnou dráhou uhlíka sa trióza přemění v prvejfáze na pyruvát a potom na acetyl-CoA, ktorý je najdóleži-tejším samostatným intermediátom vo fungálnom sekun-dárnom metabolizme. Karboxyláciou acetyl-CoA sa získa-va malonyl-CoA a lineárnou kondenzáciou acetyl-CoAs róznym počtom molekul malonyl-CoA sa získavajú po-lyketidy, najčastejšie sú to sekundárné metabolity húb ale-bo mastné kyseliny, ktoré móžu spatné viesť k vznikusekundárných metabolitov1-

    Aktinomycéty sú schopné tvoriť polyketidy jednakz acetyl-CoA a malonyl-CoA, ale aj z propionyl-CoA a me-tylmalonyl-CoA. Alternativně, kondenzáciou troch mole-kul acetyl-CoA sa získává kyselina mevalónová ako kíúčo-vý intermediát v biosyntéze terpenoidov.

    Kondenzáciou acetyl-CoA s oxálacetátom uhlík pochá-dzajúci z glukózy vstupuje do cyklu trikarboxylových ky-selin a slúži nielen na úplnú oxidáciu glukózy, ale tiež akomateriál uhlíkových skeletov niektorých aminokyselin ale-bo sekundárných metabolitov (obr. 1).

    Vznik koncových primárných a sekundárných metabo-litov si móžeme představit' tak, že existujú rozvětvené me-tabolické dráhy a v nich příslušné medziprodukty, od kto-rých jedna vetva dráhy vedie ku koncovému primárnémumetabolitu a druhá vetva ku sekundárnému metabolitu7.

    Na přeměnách týchto produktov primárného metaboliz-mu pri zabudovaní do sekundárných metabolitov sa uplat-ňujú tri typy výzmamných biochemických procesov1:7) oxidácie a redukcie,2) metylácie,3) halogenácie.

    Biologické oxidácie a redukcie významné pre sekun-dárný metabolizmus sú najma tieto: oxidácie alkoholov,redukcie karbonylových zlúčenín, zavedenie alebo reduk-

    cia dvojitých vazieb, zavedenie atómov kyslíka a oxidačněotvorenie aromatických kruhov.

    1 . 2 . R e g u l á c i a m e t a b o l i z m u

    Vzájomné vztahy reakcií naznačené na obr. 1 si vyža-dujú určitú kontrolu, ktorá zabráni nadprodukcii interme-diátov. Toto sa v každom případe dosiahne inhibíciou syn-tézy enzýmov alebo enzýmovej aktivity'. Existuj ú dva typyenzýmov: konstitutivné a indukovatelné enzymy.

    Existencia indukovatelných enzýmov priamo poskytujeorganizmu kontrolu nad jeho metabolizmom, a to zabraňujenadprodukcii enzymu. Organizmus má dva ďalšie použitelnékontrolně mechanizmy: represiu produkcie syntézy enzymukoncovým produktom a allosterickú inhibíciu enzýmovejaktivity. V represii koncovým produktom posledný produktbiosyntetickej dráhy specificky potláča syntézu všetkýchenzýmov katalyzujúcich jednotlivé kroky tohto sledu reakcií.

    V allosterickej inhibícii koncový produkt inhibuje akti-vitu enzýmov, táto inhibícia sa uskutočňuje připojenímkoncového produktu na receptorovom mieste (nie obsade-nom substrátom) enzymu, zapříčiňujúceho konformačnúzměnu v enzyme takú, že jeho molekula nemóže byť pri-spósobená danému substrátu.

    Enzymy sekundárného metabolizmu musia byť tiež podanalogickou kontrolou.

    1 .3 . R e g u 1 á c i a s e k u n d á r n é h om e t a b o l i z m u

    Podfa Demaina9 mikrobiálny sekundárný metabolizmusumožňuje nový teoretický pohlad a nové příležitosti priemy-selnej výroby sekundárných metabolitov a ich praktickéhovyužitia. Intenzita sekundárného metabolizmu móže byťčasto zvyšovaná prídavkom limitovaných prekurzorov. Akopříklad móžeme uviesť zo skupiny húb Penicillium chrysoge-num, kterého sekundárný metabolit je benzylpenicilín a jehoprekurzorom je kyselina fenyloctová, připadne jej amid.

    Sekundárný metabolizmus prebieha najlepšie pri sub-maximálnych rastových pomeroch, po skončení rastu máklesajúcu tendenciu. Rozlišovanie medzi rastovou fázou(trofofázou) a produkčnou fázou (idiofázou) je niekedyvelmi zreteFné, ale v mnohých prípadoch idiofáza překrývátrofofázu. Načasovanie medzi dvomi fázami móže byť ma-nipulovatelné, v komplexnom médiu upredňostňujúcomrýchly rast sú fázy často oddělené, kdežto ich čiastočnýalebo celkový překryv v chemicky definovanom médiupodporuje zvačša pomalší rast9.

    408

  • Gatenbeck, ktorý študoval biosyntézu antrachinóno-vých pigmentov v Penicillium islandicum, zistil, že syntézatýchto látok prebieha maximálnou intenzitou v střede ras-tovej fázy10.

    Sekundárné metabolity nie sú „sekundárné" preto, že súprodukované po skončení rastu, ale preto, že sú obsiahnutév raste produkujúcej kultury. Eliminácia produkcie sekun-dárného metabolitu mutáciou nezastaví ani nespomalí rast,samozřejmé móže zvýšit' rychlost' rastu. Rýchlosť rastu jedóležitá, ale nepoznáme jej základný mechanizmus. Nedo-statky v určitých nutričných faktoroch sú tiež důležité, aleopat' sú neznáme ich základné mechanizmy.

    Mnohé sekundárné metabolity majú antibiotickú akti-vitu a mohli by usmrtiť alebo poškodiť produkuj úcu kulturu,ak sú 1'ahko produkované. Samozřejmé, že rezistencia pro-ducentov antibiotik proti ich vlastným metabolitom je dob-ré známa1'. Rody produkujúce antibiotika vlastnia ochran-né mechanizmy, ktoré majú vedúce postavenie. Napr. ami-noglykozidové antibiotika aktinomycét by mohli inhibovaťsyntézu bielkovín v buňkách svojich producentov. Tomusa zabraňuje dočasnou fosforyláciou alebo adenylylácioumolekuly antibiotika počas jeho přítomnosti v buňkáchproducenta. V procese vylučovania do kultivačného pro-stredia uvedená modifikácia zaniká.

    V nutričně bohatých zdroj och, takých ako má napr.črevný trakt cicavcov (priaznivý pre enterobaktérie), nie jeprodukcia sekundárných metabolitov tak frekventovanáako v pode a vo vodě, kde je výživa limitovaná mikrobiál-nym rastom. Teda sekundárné metabolity nie sú vačšinouprodukované enterobaktériami, ako je napr. Escherichiacoli, ale podnymi a vodnými mikroorganizmami, a to baci-lami, aktinomycétami a hubami. Nutričný deficient v prí-rode často indukuje morfologickú a chemičku diferenciáciu- sporuláciu a sekundárný metabolizmus, čo je vefmi dóle-žité pre prežitie v púšťach.

    Vačšina sekundárných metabolitov vzniká osobitnýmienzymovými cestami9. Enzymy sa vyskytujú ako individu-álně proteiny vol'né alebo viazané v komplexoch alebo akočasti veVkých multifunkčných polypeptidov umožňujúcichvellcý počet enzymových reakcií napr. krokov biosyntézypolyketidov a peptidov9.

    2. Primárné a sekundárné metabolitya ich význam

    Primárný metabolizmus a primárné metabolity (amino-kyseliny, nukleotidy, mastné kyseliny a sacharidy) sú po-

    třebné a nevyhnutné pre všetky organizmy. Okrem tohtotypu metabolizmu a metabolitov existujú také taxonomickéskupiny mikroorganizmov, rastlín a živočíchov, ktoré súschopné syntetizovat' sekundárné metabolity.

    Sekundárné metabolity mikroorganizmov sú odvodenéod intermediátov primárného metabolizmu, ako sú: sacha-ridy, kyselina šikimová a (alebo) aromatické aminokyse-liny, nearomatické aminokyseliny, Cj zlúčeniny, mastnékyseliny, intermediáty citrátového cyklu, puríny a pyrimi-díny. Preto sa niekedy primárné a sekundárné metabolityoznačujú ako „všeobecné" a „speciálně" metabolity.

    V rastlinnej fyziologii sa termín „sekundárné metabo-lity" používá pre alkaloidy, terpény, flavonoidy a iné pro-dukty, ktoré nie sú potřebné a nevyhnutné pre rast samot-ných rastlín. Rastlinné sekundárné metabolity móžu slúžiťna ochranu rastlín13.

    Za sekundárné metabolity sa dnes ďalej považujú spe-ciálně produkty biochemickej aktivity baktérií, húb, užspomenutých vyšších rastlín, ba aj bezstavovcov a stavov-cov. Najnovšou skupinou sekundárných metabolitov súpeptidové defenzíny, objavené v krvných buňkách cicav-cov. Daktoré z nich fungujú ako endogenně antibiotickélátky v Tudských leukocytoch.

    Bioaktívne sekundárné metabolity mikroorganizmov sahodnotia zo štyroch základných poMadov7:7) ich biosyntéza z intermediátov primárného metabo-

    lizmu,2) vzťahy medzi strukturou a biologickou aktivitou,3) biochemické mechanizmy ich účinku,4) mechanizmy rezistencie.

    2 .1 . S e k u n d á r n e m e t a b o l i t ya k o p r í r o d n é l á t k y

    Antibiotika a iné sekundárné metabolity sú přírodnělátky. Kedže výše 30 rokov sa viedol spor okolo tohtotvrdenia, nakoniec sa po mnohých diskusiách táto tézapotvrdila a bola odóvodnená Demainom a Piretom8:7) Viac ako 40 % húb, aktinomycét a lišajníkov čerstvo

    izolovaných z přírody produkovalo antibiotika.2) Normálna póda a polnohospodárske produkty obsaho-

    vali antibakteriálne a antifungálne substancie. Jeden zovšeobecné spoločenských zdravotných problémov jeprodukcia mykotoxínov v pode a počas skladovaniazrna. Tieto mykotoxíny sú sekundárné metabolity s po-tenciálnymi mutagénnymi, toxickými a antibiotickýmivlastnosťami.

    3) Antibiotika ako sekundárné metabolity stí vačšinou

    409

  • produkované v prírodných podmienkach, ako je napr.nesterilná, neobohatená podá, nesterilná podá obohate-ná pšenicou, ďatelinou, hořčičnými semienkami alebokukuricou a nesterilné ovocie.

    4) Syntézu antibiotik katalyzujú multienzýmové sekven-cie, ktoré sú přítomné v přírodě14.

    2 . 2 . F u n k c i e s e k u n d á r n ý c hm e t a b o l i t o v

    Po mnohé storočia sa chemici zaujímali o objasňovanie,izoláciu a charakterizáciu látok v zemskej biosféře. Apliko-vali to aj na sekundárné metabolity, ktoré boli objavovanépostupné a v určitých množstvách. Po zavedení pojmu„sekundárné metabolity" nastal medzi biológmi a bioche-mikmi silný záujem o skúmanie ich funkcií.

    Struktury sekundárných metabolitov sú velmi rozmani-té a odlišné, niekedy právě u jedného druhu mikroorganiz-mu a tento poznatok pri úzko Specifikovaných podmien-kach iba posilňuje teóriu, že sekundárné metabolity nemajúesenciálnu metabolickú funkciu. Sú produktami špeciálne-ho metabolizmu15.

    Podlá Demaina a Pireta8 funkcie sekundárné metabolityzhrnúť do takejto podoby:1) Sekundárné metabolity móžu fungovat' ako transportně

    činitele v přenose kovov cez biologické membrány.Príkladom sú sideramíny, ktorých funkcia je chápanáako přenos a solubilizácia Fe. lnou skupinou móžu byťionofórové antibiotika, ktorých funkciou je přenos al-kalických iónov. K nim patria aj makrotetrolidové anti-biotika, ktoré zvačšujú permeabilitu membrán pre vápnik.

    2) Mnohé trispórové kyseliny a sekundárné metabolityradu Mucorales majú funkciu sexuálnych hormónova regulátorov sexuálneho rozmnožovania16.

    3) Aktivně sekundárné metabolity vo funkcii fytotoxínov(napr. fytotoxíny Pseudonionas) sú rozhodujúce v pa-togenite pre rastliny17-18. Tieto toxíny indukujúce chlo-rózu v rastlinných tkanivách zahrňujú napr. tabtoxína fazeolitoxín.

    4) Huby móžu produkovat antibiotika, ktoré slúžia naochranu rastlín proti patogénnym baktériám. Stávajú sarastlinnými symbiotickými činitelmi.

    5) Spórotvorná funkcia.Speciálně antibiotika pósobia ako dóležité elementy

    v premene vegetatívnych buniek na spory. Sarkar a Pau-lus1 9 zistili, že antibiotika regulujú transkripciu (počaspřechodu baktérií z rodu Bacillus z vegetatívneho rastu nasporuláciu) selektívnou termináciou funkcií vegetatívnych

    génov. Ďalej sa potvrdila inhibícia RNA-polymerázy tyro-cidínom a lineárnym gramicidínom. Nie je však isté a po-tvrdené, že tvorba spor je závislá od antibiotickej aktivity.Jedna možnost'je taká, že tvorba antibiotik a tvorba spor súsamostatné fenomény regulované všeobecným kontrolnýmmechanizmom20. Druhá možnost' je však taká, že antibio-tická produkcia často sprevádza sporuláciu. Antibiotikumje zabalené v spore a funkcia inhibovať klíčenie sa za týchtopodmienok stává znemožněnou. Samotné inhibitory klíče-nia sú velmi známe v hubách a sú to extrémně účinnésekundárné metabolity.

    Nisbet21 popisuje využitie funkcií mikrobiálnych meta-bolitov a zaoberá sa vyhledáváním mikrobiálnych metabo-litov na inhibíciu proteín-proteínových interakcií. Dospělk dvom zaujímavým hypotézám:1) mikroby produkujúce sekundárné metabolity, ktoré

    spósobujú zahynutie iných konkurenčných organiz-mov, sú takto užitočné pre objavenie nových antibiotik,

    2) nie je možné hl'adať molekuly, ktoré selektivně zasahujúdo proteín-proteínových interakcií (napr. medzi rasto-vými faktormi a ich receptormi).Vining22 sa v roku 1992 opat' vracia k vysvetleniu úloh

    sekundárných metabolitov získaných z mikróbov. Úlohysekundárných metabolitov smerujú k variabilnosti a rozma-nitosti ciest, ktorými boli sekundárné metabolity získané.Poukazuje na to, že sekundárné metabolické produkty pod-porujú produkujúci organizmus dvoma spósobmi:a) zlepšujú schopnost' organizmu rásť, reprodukovať alebo

    rozšiřovat' sa vo vhodných podmienkach alebob) móžu poskytovat' ochranu daného organizmu. Medzi

    tieto dané rastové výhody patria siderofóry (vyššie spo-menuté Fe-komplexné látky) a autoregulátory.I keď úlohy mnohých mikrobiálnych sekundárných me-

    tabolitov móžu byť dedukované s určitou dóverou, nie súvždy použitelné. Existujú tiež niektoré látky, pre ktoré jeich úloha pre producenta iba hypotetická. Porovnáníms primárným metabolizmom, enzymológia a regulácia se-kundárných metabolických drah je stále málo preskúmaná.Preto sa molekulovej biologii ponuka riešiť problémy funk-cií sekundárných metabolitov a ukázat' nový pohtad nageny, ktoré kódujú tieto metabolity. Ide o pochopenie tých-to signálov určujúcich úlohu metabolitov pre daný organiz-

    mus23,24

    2.2.1. Aktivity sekundárných metabolitov

    Rozsah a druh aktivity sekundárných metabolitovv rastlinách a živočíchoch sledoval Vining15. Na základe

    410

  • jeho prieskumov je možné hovoriť o viacerých aktivitáchsekundárných metabolitov.

    Antibiotická aktivita

    Vysoký poměr mikroorganizmov izolovaných z pódyukázal antibiotickú aktivitu. Hlavně početné produkty ak-tinomycét a mikroskopických hub sa zaraďujú medzi kli-nicky používané antibiotické látky. V pode, kde sú přítom-né velmi rozmanité antagonistické organizmy, je schopnost'prežitia jedného mikroorganizmu pravděpodobné násled-kom vylučovania toxických metabolitov.

    Aktinomycéty sú pozoruhodné producenty antibiotik,pretože 3/4 všetkých známých produktov je získaných prá-vě z aktinomycét. Streptomycéty sú špeciálnymi producen-tami. Antibiotika z aktinomycét majú rozmanité chemickéstruktury - sú to často peptidy alebo modifikované peptidy,ale aj iné nízkomolekulové látky.

    Imperfektné huby produkujú váčšinou antibiotika fun-gálneho typu.

    Askomycéty a bazidiomycéty sú menej produktivně,ale aj ich antibiotika sú menej rozmanité svojimi chemic-kými strukturami. Málokedy sa objavuje produkcia anti-biotik fykomycétami alebo kvasinkami.

    Antibiotika ako sekundárné metabolity majú schopnostinhibovať esenciálně primárné metabolické procesy. Viace-ré z nich vykonávajú funkcie antimetabolitov. Avšak, pro-dukty získané z jednej metabolickej dráhy móžu vo vše-obecnosti inhibovať rózne primárné procesy. Ich aktivita jeúplné závislá od formy a od rozmiestnenia funkčných sku-pin.

    Aktivita v živočíchoch

    Mnohé antibiotika sa nemóžu používat' na terapeutickéúčely v živočíchoch, lebo sú pre ne toxické. Táto zápornávlastnosť je často výsledkom spósobu činnosti usmernenejproti jednej z univerzálnych primárných drah. Napříkladamfomycín, ktorý ruší membránový transport intermediá-tov peptidoglykánov v baktériách, blokuje glykozyláciuv eukaryotických buňkách25.

    Mnohé z toxických metabolitov produkované hubamipatria do kategorie širokospektrálnych antibiotik. Selektív-nu aktivitu proti specifickým živočišným funkciám majúniektoré mykotoxíny.

    Aktivita v rastlinách

    Niektoré mikrobiálně patogény rastlín produkujú toxic-ké sekundárné metabolity, ktoré napomáhajú k patogén-nym poškodzujúcim efektom na hostitelovi. Medzi fungál-

    ne patogény patria napr. Fusarium oxysporum, ktorý pro-dukuje kyselinu fuzárovú.

    Iné aktivity

    Sekundárné metabolity móžu mať ďalšie aktivity15, ato:a) m6žu pósobiť ako inhibitory enzýmov, b) autoregu-

    látory, c) zachytávače minerálov, ď) povrchovo-aktívnelátky.

    2 . 3 . P ř í č i n y r o z m a n i t o s t is e k u n d á r n ý c h m e t a b o l i t o v

    Hranice medzi primárným a sekundárným metaboliz-mom nie sú vel'mi ostré. Primárné metabolické dráhy súveími podobné až rovnaké pre vrfmi rozdielne skupinymikroorganizmov7. Naproti tomu sekundárné metabolitya medzi nimi aj antibiotika sú produktami len určitýchskupin mikróbov a často sú odlišné, aj keď pochádzajúz velmi příbuzných kmeňov toho istého druhu. Genetickáinformácia na ich biosyntézu je nielen obmedzená na po-merne úzku taxonomickú skupinu, ale zvyčajne sa prejavu-je len v určitých štádiách životného cyklu organizmu alebov jednorazovej fermentácii14.

    Genetická rozmanitost sekundárného metabolizmu savšak prejavuje rozvětvenými sériami reakcií. Začiatočnéstupně týchto sérií sa často vyskytujú v taxonomicky odliš-ných skupinách druhov, kým nasledujúce stupně sú charak-teristické pre jednotlivé produkty, ako aj pre určité organizmy.

    Bu'Lock3 (1975) dokumentuje tuto skutočnosť na ter-pénoch húb a v ich rámci na skupině asi 60 seskviterpénov,ktoré uvádza Turner1 (1971) ako produkty okolo 35 druhov húb.

    Enzymy primárného metabolizmu majú zvyčajne vyso-kú špecifickosť - katalyzujú přeměnu jedného substrátu najediný produkt. V sekundárnom metabolizme sa však vy-skytujú enzymy, ktoré nemajú takúto špecifickosť.

    3. Diferenciácia a sekundárnýmetabolizmus húb

    3 . 1 . S e k u n d á r n y m e t a b o l i z m u s a r a s t

    Pozorovania, pri ktorých sa uskutočňuje rast danej kul-tury v nutričně bohatom médiu, obsahujú vysoké množstvasekundárných metabolitov pravidelné produkovaných naj-častejšie vo fáze rastu. BďLock1 rozlišil rastovú fázu ako„trofofázu" a produkčnú fázu ako „idiofázu". Rozdiel me-dzi trofofázou a idiofázou je pozorovaný najma v kulturách

    411

  • jednobunkových baktérií produkujúcich antibiotika, ale nietak zřetelné v kulturách vláknitých aktinomycét a húb. Pofáze nelimitovaného rastu množstvo kultur húb bolo spre-vádzané progresívnou spotřebou nutričných látok, čo jenevyhnutné pre limitový rast. Týmto sa pravidelné zabez-pečuje kontrola myceliárnej diferenciácie a biosyntézy se-kundárných metabolitov.

    Medzi najlepšie preštudované procesy trofofázy-idiofá-zy patří produkcia patulínu druhom Penicillium urticae.Penicillium urticae produkuje sériu polyketidových meta-bolitov zo skupiny patulínu, ktoré stí derivátmi kyseliny6-metylsalicylovej10.

    Mnohé laboratorně a priemyselné fermentácie pouka-zujú na to, že sekundárné metabolity sú tvořené počasidiofázy1.

    Kinetiku produkcie sekundárných metabolitov hubamipočas submerzného rastu charakterizuji! tri skutečnosti26:1) charakteristická idiofázová produkcia patulinu a iných

    fungálnych metabolitov,2) biosyntéza kyseliny mykofenolovej, enniatinu a tento-

    xínu počas trofofázy,3) bifázová produkcia citrinínového typu, v ktorom sú

    produkčně maxima dosahované počas rastu a stacionár-nej fázy.

    3 . 2 . M i k r o b i á l n a d i f e r e n c i á c i aa s e k u n d á r n ý m e t a b o l i z m u s

    Podlesek a Grabnar27 zosumarizovali rózne interpretá-cie vzťahu mikrobiálnej diferenciácie a sekundárného me-tabolizmu následovně:

    Posledně štádiá rastu v baciloch sú charakterizovanésporuláciou a syntézou sekundárných metabolitov.

    Uzavretý vzájomný vzťah medzi přerušeným vegetatív-nym rastom a syntézou antibiotik je podporovaný pozoro-vaniami citlivosti produkujúcich organizmov na ich vlastněantibiotika. Táto citlivosť sa ukazuje v nepřítomnosti anti-biotika (počas vegetatívneho rastu buniek). Skúmanie tohtodruhu móže indikovať, že peptidové antibiotika jednoznač-né inhibujú rast a následnú iniciáciu sporulácie. Peptidovéantibiotika móžu mať regulačně funkcie pri sporulácii alebopri vyrastení klíčiacich spor. Mutanty v antibiotickej syn-téze nestratili schopnost' sporulácie.

    Hypotéza navrhnutá Demainom a Piretom8 roku 1981naznačuje, že syntéza antibiotik a sporulácia móžu byť dvasamostatné procesy regulované všeobecným kontrolnýmmechanizmom nájdeným v niektorých štúdiách syntézyantibiotik a diferenciácie v aktinomycétach.

    3.2.1. Diferenciácia húb

    V roku 1980 boli postulované tri dominantně možnostifunkcií sekundárných metabolitov pre ich producentov7'10:1) ekologická úloha v přírodě, 2) regulačná úloha v meta-bolizme, 3) regulačná úloha v diferenciácii alebo časovozhodná s ňou.

    Biosyntéza sekundárných metabolitov húb (niekedyv asociácii so specifickou buňkovou diferenciáciou), ktoráprebieha počas asexuálnej sporulácie, je limitovaná rastomdaného mikroorganizmu3.

    Smith a Berry28 uviedli, že genetické a biochemickémechanizmy, ktoré sú striktně obsiahnuté v regulácii dife-renciálnej génovej expresie a biosyntéze daných molekul,sú centrálnym problémom.

    Vzájomný vzťah medzi produkciou sekundárných me-tabolitov, a fungálnou diferenciáciou je rozmanitý a nedása jednoznačné určit' jeho priama závislost' alebo nezávi-slost' pri róznych typoch húb. Smith a Berry v roku 1974(cit. 2 8 ) zistili, že maximálna parazitická produkcia ergoto-vých alkaloidov z Claviceps purpurea je v čase, keď satvoria skleróciá. Naopak, pri saprofytickej submerznej kul-tivácii sú tieto alkaloidy tvořené až po vytvoření konídií.

    Mnohí autoři zistili přítomnost fungálnych sekundár-ných metabolitov v iných reprodukčných strukturách ichproducentov. Zaujímavé výsledky sa získali pri štúdiáchsekundárných metabolitov húb, v ktorých je konidiáciaindukovaná svetlom29. V našom laboratóriu sa připravilisérie nekonidiujúcich a konidiujúcich farebných mutantovTrichoderma viride^0. Z hnědého konidiujúceho mutantasa izolovali dva pigmenty antrachinónovej struktury. Akvšak kultura rástla v trne, konidiácia aj tvorba pigmentovbola velmi slabá29'31.

    Na závěr tejto kapitoly však móžeme jednoznačné po-vedať, že diferenciácia a sekundárný metabolizmus húb sajavia ako dva samostatné procesy regulované všeobecnýmmechanizmom a neexistuje jednoznačnost' týchto procesov.

    4. Produkcia sekundárných metabolitovhubami

    Mnohé huby sú schopné produkovať sekundárné meta-bolity. V případe bazidiomycét, rozšířených askomycéta lišajníkov, móžu to byť látky získané z organizmov ob-siahnutých v pode. Ale velice množstvo húb ako producen-tov sekundárných metabolitov má schopnosť produkovaťlátky na kvapalných médiách. Sekundárné metabolity róz-

    412

  • něho typu sú vhodné použitelné v laboratóriu na chemické,biochemické a biologické studie. V iných prípadoch tie istésekundárné metabolity móžu byť získané z prírodnýchzdrojov a z kvapalných kultur bazidiomycét. V kvapalnýchkulturách sú sekundárné metabolity přítomné v médiu ajv mycéliu. Pre příbuzné látky móže byť rozdelenie medzimédiom a mycéliom často korelované s rozpustnosťou vovodě, hoci táto zdánlivá korelácia móže byť výsledkomniektorých dalších faktorov, napr. přenosu látky cez buňko-vé membrány1.

    Foster32 pokládal sekundárné metabolity za rezervnělátky zhromaždené počas produkcie nadbytočných sacha-ridov a použitelné v čase, keď sú zásoby sacharidov vyčer-pané. Tento názor však nevysvetfuje rozmanitost sekundár-ných metabolitov a ich distribúciu medzi buňkami a danýmipodmienkami. Vysvetlenie produkcie sekundárných meta-bolitov a chemickej rozmanitosti skupin zhrnul Foster32 dodvoch závažných poznatkov.1) Sekundárné metabolity móžu byť produkované z nie-

    kol'kých klučových intermediátov primárného metabo-lizmu a to vtedy, ak je množstvo substrátu iného nežuhlíka obmedzené.

    2) Sekundárný metabolizmus poskytuje dráhy na odstrá-nenie intermediátov, ktoré by sa ináč nazhromaždili,a takto umožňujú nasmerovanie primárných procesovk týmto intermediátom a k nasledujúcim operáciámpočas časového stresu.

    4 . 1 . K l a s i f i k á c i a f u n g á l n y c hm e t a b o l i t o v

    Turner1 navrhol klasifikáciu fungálnych sekundárnýchmetabolitov do viacerých skupin:1) Sekundárné metabolity odvodené bez účasti acetátu

    Tieto sú ďalej odvodené:- striktně od glukózy (napr. kyselina kójová, muska-

    rín, muskaridín) alebo od manitolu, kyseliny glukó-novej a i.;

    - od intermediátov dráhy kyseliny šikimovej (napr.fenylalanín, tyrozín, tryptofán, ďalšie aromatickékyseliny);

    - od intermediátov metabolizmu sacharidov a acetátu(napr. purínové a pyrimidínové bázy).

    2) Sekundárné metabolity odvodené od mastných kyselina) samostatné deriváty mastných kyselin (napr. kyse-

    lina laktarinová, kyselina fagikladospórová),b) polyacetylény (napr. konjugované acetyl-etylénové

    systémy, hexatriín, aromatické a heterocyklické látky),

    c) cyklopentány (napr. brefeldín A 3 3 známy tiež akocyaneín alebo dekumbin, jazmínová kyselina, pro-staglandíny),

    ď) iné látky (napr.polyketidy, palitantín, kurvalarín).3) Polyketidy (rozdelujú sa na základe biochemických

    procesov na tri- až dekaketidy)4) Terpény a steroidy

    terpény vyskytujúce sa ako monoterpény,sesquiterpény (napr. trichotecény, kulmorín, fomano-zin, salivén a iné),diterpény (napr. pimarín, giberelíny, kaurény)sesterterpény (napr. ofiobolín, fuzikocín A)triterpény a steroidy (napr. cholesterol, ergosterol, fun-gisterol, tetracyklické triterpény, cefalosporín PÍ, kyse-liny trispórové).

    5) Sekundárné metabolity odvodené od intermediátov cy-klu trikarboxylových kyseliná) metabolity odvodené od intermediátov cyklu trikar-

    boxylových kyselin,b) metabolity tvořené kondenzáciou acetátu s interme-

    diátmi cyklu trikarboxylových kyselin (napr. ky-selina y-metyltetrónová, erytroskyrín a pod.).

    Tieto metabolity majú predovšetkým strukturu 5-člán-kových laktónov, připadne dvoch spojených laktónov;v obidvoch prípadoch sú tieto laktóny substituované vovol'ných polohách laktónového kruhu.6) Sekundárné metabolity odvodené od aminokyselin

    (napr. penicilíny, cefalosporíny, diketopiperazíny, side-rochrómy)

    7) Rozmanité sekundárné metabolity (apr. cytochalazí-ny34)

    5. Závěr

    Předložený referát zahrnuje základné teoretické poznat-ky o sekundárnom metabolizme ako špecifickom metabo-lickom procese, ktorého prejavy sa nemusia vyskytovat'v každom organizme. Špecifickosť sekundárného metabo-lizmu je daná jeho předpokládaným druhořadým, vedlej-ším postavením v ekonomike organizmu.

    Hoci klučové prekurzory primárných a sekundárnýchmetabolitov sú spoločné, jednako v sekundárnom metabo-lizme vzniká širšia paleta výsledných produktov - sekun-dárných metabolitov. Zaujímavé je potom sledovat' ichbiosyntetickú dráhu, biologické vlastnosti, funkcie v pro-dukčnom mikroorganizme a určit' ich chemičku strukturu.Rozmanitost' struktur sekundárných metabolitov v mno-

    413

  • hom nasvědčuje, že biosyntetické dráhy ich tvorby a pro-dukcie sa prejavujú rozvětvenými sériami reakcií, čo móžebyť predmetom studia mikrobiálnej biochemie.

    LITERATURA

    1. Turner W. B.: Fungal Metabolites. Academie Press,London 1971.

    2. Bennet J. W., Bentley R.: Adv. Appl. Microbiol. 34,1 (1989).

    3. Bu'Lock J. D., v knihe: IndustrialMycology (Smith J.E., Berry R. D., ed.), 1, str. 33. Edward Arnold Ltd.,London 1975.

    4. Zahner H., Drautz H., Weber W., v knihe: BioactiveMicrobial Products, Search andDiscovery (BiťLock,D. J. et al., ed.), str. 51. Academie Press, New York1982.

    5. Lancashire Polytechnic, Department of Applied Bio-logy: Microbial Fermentation (Lecture notě supple-ment) M.Sc.Biotechnology, 1992.

    6. Campbell I. M.: Adv. Microb. Physiol. 25, 2 (1984).7. Betina V.: The Chemistry and Biology of Antibiotics.

    Elsevier, Amsterdam 1983.8. Demain A. L., Piret J. M: Am. Soc. Microbiol. 1981,

    363.9. Demain A. L., v knihe: Secondary Metabolites: Their

    Function and Evolution (Chadwick D. J., Whelan J.,ed.), Ciba Foundation Symposium 171, str. 3. Wiley,Chichester 1992.

    10. Betina V.: Mycotoxins - Chemical, Biological andEnvironmental Aspects. Bioactive Molecules, 9. Else-vier, Amsterdam 1989.

    11. Coundliffe E.: Annu. Rev. Microbiol. 43, 207 (1989).12. BďLock J. D.: Adv. Appl. Microbiol. 3, 293 (1961).13. Betina V.: Folia Microbiol. 40 (1), 51 (1995).14. Hopwood D. A., Merrick M. J.: Bacteriol. Rev. 41,

    595 (1977).15. Vining C. L.: Annu. Rev. Microbiol. 44, 395 (1990).16. Wolf J. C, Mirocha J. C: App. Environ. Microbiol.

    33,546(1977).17. Gasson M. J.: Appl. Environ. Microbiol. 39,25 (1980).18. Staskowics B. J., Panopoulos J. N.: Phytopathology

    69, 663 (1979).19. Sarkar N., Paulus H.: Nature New Biol. 239, 228

    London (1972).20. Vaněk Z., Mikulík K.: Folia Microbiol. 23, 309 (1978).21. Nisbet J. L., v knihe: Secondary Metabolites: Their

    Function and Evolution (Chadwick D. J., Whelan J.,

    ed.), Ciba Foundation Symposium 171, str. 215. Wi-ley, Chichester 1992.

    22. Vining C. L., v knihe: Secondary Metabolites: TheirFunction and Evolution (Chadwick D. J., Whelan J.,ed.), Ciba Foundation Symposium 171, str.184. Wi-ley, Chichester 1992.

    23. Grove F. J., v knihe: Biochemistry of Industrial Mic-roorganisms (Rainbow C, Rose H. A., ed.), str. 320.Academie Press, London 1963.

    24. Hunter S. L.: Tibtech. 10, 144 (1992).25. Banerjee D. K., Scher M. G., Waechter C. J.: Bioche-

    mistry 20, 1561 (1981).26. Betina V.: Závěrečná správa - Diferenciácia mikro-

    mycét pod vplyvom faktorov prostredia. Chemicko-technologická fakulta, Slovenská vysoká školatechnická, Bratislava 1989.

    27. PodlesekZ., GrabnarM.: J. Gen. Microbiol. 735,2813(1989).

    28. Smith J. E., Berry D. R.: An Introduction to Bioche-mistry of Fungal Development. Academie Press, Lon-don 1974.

    29. Betina V.: Biol. Listy 42, 1 (1977).30. FargašováA., SipiczkiM., Betina V.: Folia Microbiol.

    30, 433 (1985).31. Betina V.: Folia Microbiol. 40, 219 (1995).32. Foster W. J.: Chemical Activities ofFungi. Academie

    Press New York, London 1949.33. Betina V.: Folia Microbiol. 37, 3 (1992).34. Cole J. R.: Handbook of Toxic Fungal Metabolites.

    Academie Press, New York 1981.

    R. Pavlovičová (Department of Biochemistry andMic-robiology, Faculty of Chemistry and Chemical Technology,Slovák Technical University, Bratislava, Slovák Repub-lic): Fundamental Aspects of Secondary Metabolismand Its Expression in Fungal Metabolism

    Borderline between the primary and secondary metabo-lism is not very sharp. Secondary metabolism is discussedas a specific metabolic process that does not necessarilyoceurs during the whole life of organism. Its specificity isgiven by its probably minor side position in the economyof organism. The secondary metabolism involves syntheticprocesses producing secondary metabolites of variousstructures without obvious function in the producing orga-nism. Some secondary fungal metabolites are beneficial(antibiotics such as penicillin) while others are harmful(carcinogens such as sterigmatocystin and aflatoxins).

    414