CHŘIPKOVÉ VIRYSTRUKTURA, REPLIKACE,

ANTIGENY, GENETICKÉ ZVLÁŠTNOSTI

EMIL PAVLÍK

ÚSTAV IMUNOLOGIE A MIKROBIOLOGIE A ÚSTAV KLINICKÉ BIOCHEMIE A LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY 1.LÉKAŘSKÉ FAKULTY KARLOVY UNIVERZITY

A VŠEOBECNÉ FAKULTNÍ NEMOCNICE V PRAZE, KLINLAB SPOL. S R.O.

CHŘIPKOVÉ VIRYInfikují člověka již téměř 2500 let (popsány

epidemie vysoce nakažlivého onemocnění dýchacích cest s následnou pneumonií před rokem 400 př.n.l.

Extrémně krátká inkubační doba – 1 až 4 dnyInfekce se přenáší vzduchem kapénkami při

kýchání nebo kašli. Každá kapénka může obsahovat až 106 virionů.

Imunita: vytvářejí se protilátky proti hemaglutininu a neuraminidase. Prodělané onemocnění nezaručí odolnost vůči aktuální infekci.

Genetická variabilita jednotlivých typů viru.

NOMENKLATURA VIRŮ CHŘIPKY• Influenza – typ : A• Izolát z živočišného druhu: u lidských kmenů se

vynechává• Místo izolace : HongKong• Označení kmene : 1• Rok izolace : 68• Označení H N subtypů: H3N2

A/Hong Kong/1/68(H3N2)A/swine/Iowa/15/30(H1N1)A/Brisbane/57/2007(H1N1)

TAXONOMIE VIRŮ CHŘIPKY• Čeleď: Orthomyxoviridae• 3 rody: Influenza A,B,C

Influenza A Influenza B Influenza C

Hostitelé Člověk, prase, kůň, ptáci, mořští savci

Člověk Člověk, prase

Epidemiologie Antigenní drifty a shifty

Antigenní drifty Antigenní drifty

Genom 8 segmentů 8 segmentů 7 segmentů

Struktura 10 virových proteinů, unikátní M2

11 virových proteinů, unikátní NB

9 virových proteinů, unikátní HEF

Klinickézvláštnosti

Působí pandemie s vysokou mortalitou postižených mladých jedinců

Závažná onemocnění většinou starších a chronicky nemocných, pandemie nezazna- menány

Mírné onemocnění bez sezónních výkyvů, běžné u dětí

STRUKTURA CHŘIPKOVÉHO VIRU

NS2

Lipidová dvojvrstva

Neuraminidasa

HemaglutininIontový kanál M2

Matricový protein M1

nukleokapsidaTranskriptázový komplex SHORTS T: Understanding viruses, Jones & Bartlett 2009

Obalené viriony o průměru 80 až 120 nm vláknité s helikální symetrií nebo sférické. Virion Influenzy A má na povrchu přes 500 projekcí, 80 % z nich hemaglutinin, 20% neuraminidasa.Vnitřek obalu tvoří vrstva matricového proteinu M1, obalem prochází protein M2 (iontový kanál). Nukleokapsida obsahuje segmentovaný genom ssRNA negativní polarity. Každý segment obsahuje transkriptázový komplex.

GENOM: 8 SEGMENTŮ ssRNA KÓDUJE 10 CHŘIPKOVÝCH PROTEINŮ. SEGMENTY 7 A 8

KÓDUJÍ 2 PROTEINY V PŘESAHUJÍCÍCH ČTECÍCH RÁMEČCÍCH. PŘÍSLUŠNÉ RNA SE

PAK SPOJUJÍ (SPLICING)

PODLE FLINT S.J. ET AL. PRINCIPLES OF VIROLOGY ASM PRESS 2003

GENOM• Genom chřipkového viru byl kompletně

osekvenován již roku 1982. Šlo o izolát viru chřipky typu A/Puerto Rico/8/34 používaný hojně jako laboratorní kmen.

• Genové knihovny jsou postupně doplňovány o segmenty různých dalších nově izolovaných chřipkových virů

Kódující geny Influenzy ARNA seg- ment

Délka (nt)

Kódovaný polypeptid

Funkce

1 2341 PB1 757 Součást transkriptasového komplexu. Katalysuje adici nukleotidu.

2 2233 PA 716 Součást transkriptasového komplexu.

3 2341 PB2 759 Součást transkriptasového komplexu. Endonukleasa. Rozeznává cap hostitelských mRNAs

4 2073 HA 566 Hemaglutinin, velký povrchový glykoprotein. Vazba prostřednictvím kys. Křemičité, za nízkého pH fúze

5 1565 NP 498 Nukleokapsidový protein. Interakce s mRNA segmenty.Účastní se spuš- tění syntézy templátu a syntézy virionových RNA.

6 1413 NA 454 Povrchový glykoprotein. Neuraminidasa

7 1027 spliced

M1 252 M2 97

M1 matricový protein uvnitř lipidové dvojvrstvy virionu.M2 aktivita iontového kanálu.

8 934spliced

NS1 230NS2 121

NS1 – nestrukturální protein, inhibuje export poly(A)dmRNAs a splicing pre-mRNA, antagonista IFNNS2 – zprostředkovává export ribonukleoproeinů (RNP) z jádra buňky.

ANTIGENY• U virů chřipky se vyskytuje

celkem 16 rozdílných typů hemaglutininů a 9 typů neuraminidas

• U virů infikujících člověka však bylo zaznamenáno pouze 6 subtypů hemaglutininů (H1, H2, H3, H5, H7, H9) a 2 subtypy neuraminidas (N1,N2)

• Antigeny chřipkových virů nereagují zkříženě

• Všechny typy antigenů se vyskytují u ptačích virů

Největší výběr chřipkových antigenních typů lze nalézt u virů infikujících vodní ptáky, např. kachny

ADHEZE VIRU NA BUŇKUFIELDS BN et al: Fields Virology, 4 ed., LW&W 2001

H protein viru chřipky se váže na rezidua sialové kyseliny na glykoproteinech a glykolipidech cylindrického epitelu s řasinkami v dýchacích cestách a sinech. Následuje endocytóza viru buňkou. Uvnitř endosomu je virus vystaven silnému poklesu pH (ze 7 na 5), což vyvolá nevratnou změnu konformace H proteinu sestávajícího ze 2 polypeptidů H1 a H2

spojených disulfidickou vazbou.

Změna konformace H proteinu v důsledku poklesu pH v endosomu

BERGSTROM BP: Protein Sorting: Organellae Biogenesis and Protein Secretion, BIOL336: Cell Physiology. http://www.muskingum.edu

Při syntéze novotvořeného virionu se tvoří prekursor H0. Aby byl virion infekční, musí být tento prekursor rozštěpen proteasami na komponenty H1 a H2. Pokud prekursor obsahuje furinový štepný bod, dojde ke štěpení endogenními proteasami v Golgiho aparátu a buňku opouští zralý virion. Pokud se štěpné místo v prekursoru nenachází, musí dojít ke štěpení (trypsinu podobnými) exogenními proteasami mimo hostitelskou buňku.

ACHESON NH: Fundamentals of Molecular Virology, John Wiley&sons, 2006

Obecné pravidlo:• Patogenní viry chřipky mají prekursor H0 rozštěpený

buněčnými proteasami uvnitř buňky, takže po jejím opuštění jsou plně infekční, jejich šíření v hostitelském organismu není limitováno, mohou infikovat různé druhy buněk a napadat různé tělní systémy.

• Tzv. nepatogenní kmeny získávají infekčnost až po aktivaci exogenními proteasami. Jsou tedy závislé na určitých tkáních, kde se tyto enzymy vyskytují

• V případě bakteriální koinfekce chřipky však může dojít k aktivaci virionů bakteriálními proteasami, což výrazně zvyšuje závažnost infekce.

UNCOATING – OBNAŽENÍ GENOMUK obnažení genomu dochází v endosomu. Po fúzi virového obalu a membrány hostitelské buňky, spuštěné změnou konformace proteinu H a okyselením pH, virový transmembránový protein M2, vytvoří ve virovém obalu jakýsi „porin“, jímž do virionu vniknou H+ ionty.Tím se oslabí interakce matricového proteinu M1 s RNA, NP a trankriptasovým komplexem. Ribonukleotidy jsou uvolněny do cytoplasmy a exportovány do jádra buňky, kde se replikují.

FIELDS BN et al: Fields Virology, 4 ed., LW&W 2001

REPLIKACE RNA CHŘIPKOVÝCH VIRŮ PROBÍHÁ V JÁDŘE HOSTITELSKÉ BUŇKY

• Kromě virových mRNA (vmRNA) (vRNA=templát) se tvoří rovněž antigenom RNA pozitivní orientace

• Viry chřipky se mohou replikovat pouze ve fyziologicky aktivních buňkách obsahujících DNA- dependentní RNA polymerasu (RNA-polymerasa II)Virová mRNA + orientace Antigenom RNA (vcRNA)

Kratší než templát Přesná kopie genomu

Segmentovaný genom Segment

Obsahuje 3´poly(A) ocas Neobsahuje

Obsahuje 5´cap neobsahuje

Syntéza je intenzívní Syntéza vyžaduje kontinuální syntézu

k inhibitorům proteosyntézy virových proteinů

Cap-snatchingCAP-SNATCHING: virové PB2 proteiny se vážou na cap struktury hostitelských informačních RNA (mRNA), ty společně s 10 až 13 nukleotidy se od 5´konce mRNA hostitelské bbuňky oddělí a PB1 a PA z RNP komplexu je následně využijí jako primery k iniciaci transkripce vRNA.ACHESON NH: Fundamentals of Molecular Virology, John Wiley&sons, 2006

GENETICKÁ VARIABILITA• Mutace jsou v průběhu virové replikace RNA virů

běžné• Virové RNA-dependentní RNA polymerasy nejsou

schopné ani konroly (proofreading), ani opravy (vyskytuje se zde přibližně 104x více chyb než u DNA-polymeras

• Mutační poměr chřipky: 1.5x10-5/nukleotid/ infekční cyklus, což má za následek 2 až 3 změny aminokyselin v H proteinu ročně..

• Genetickou variabilitu zásadně ovlivňují 2 procesy: ANTIGENNÍ POSUN (DRIFT) a ANTIGENNÍ ZLOM (SHIFT)

ANTIGENNÍ POSUN(drift)

ANTIGENNÍ DRIFT JE VÝSLEDKEM MALÝCH POSTUPNÝCH ZMĚN GENŮ (AKUMULACE NOVÝCH EPITOPŮ) NA H PROTEINU (A V MENŠÍ MÍŘE NA N PROTEINU)

ANNENBERG MEDIA: Rediscovering Biology, 1997

ANTIGENNÍ ZLOM(shift)

ANTIGENNÍ SHIFT NASTÁVÁ, KDYŽ VIRUS CHŘIPKY ZÍSKÁ ZCELA NOVÝ H NEBO N GEN (PŘÍPADNĚ OBA). JDE O ZÁSADNÍ ZMĚNU POVRCHOVÝCH ANTIGENŮ VIRU. ČASTO JDE O VÝSLEDEK MEZIDRUHOVÉ REKOMBINACE VIRŮ

ANNENBERG MEDIA: Rediscovering Biology, 1997

JE ČÍNA INKUBÁTOREM VIRŮ CHŘIPKY ?

SHORTS T: Understanding viruses, Jones & Bartlett 2009

ČÍNSKÉ ZKUŠENOSTI

PROTICHŘIPKOVÁ ANTIVIROTIKAM2 INHIBITORY: AMANTIDIN a RIMANTIDIN

BLOKUJÍ IONTOVÝ KANÁL M2, ČÍMŽ BRÁNÍ OBNAŽENÍ GENO- MU. PODÁVAJÍ SE PROFYLAK- TICKY, NA TYP B NEÚČINNÉ, NA TYP A 80 AŽ 90 %.

N INHIBITORY: ZANAMIVIR a OSELTAMIVIR

ANALOGA KYSELINY SIALO- VÉ, VÁŽOU SE NA AKTIVNÍ MÍSTO NEURAMINIDASY, INHIBUJÍ VÝSEV VIRIONŮ. Ú- ČINNÉ PROTI CHŘIPCE A I B.NUTNO ZAHÁJIT LÉČBU DO 48 HODIN PO INFEKCI

SHORTS T: Understanding viruses, Jones & Bartlett 2009

ARDS a SIRSACUTE RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME

viz schéma na obrázku

SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE SYNDROMETzv. cytokinová bouře je možným vysvětlením pro devastující efekt některých pandemií (1918) nebo tzv. ptačí chřipky H5N1.Jde o IL-6, IL-8 monocytový profylaktický protein (CCL2) a CCL5

SHORTS, T: Understanding Viruses, Jones & Bartlett 2009