cholestérol

article original

Évaluation multicentrique de quatre méthodesde dosage direct du cholestérol-LDL

P. Bayer1

F. Veinberg2

R. Couderc2

C. Cherfils3

M. Cambillau4

C. Cosson5

S. Fradin6

P. Gillery7

J. Steinmetz8

A. Legrand5

M. Egloff3

I. Beucler3

1 Laboratoire de biochimie et Centreclinicobiologique des lipides (Arcol),Groupe Hospitalier L’Archet, Nice<[email protected]>2 Laboratoire de biochimie, HôpitalArmand Trousseau, AP-HP, Paris3 Laboratoire des lipides, Service debiochimie médicale, Groupe hospitalierPitié-Salpêtrière, AP-HP, Paris4 Laboratoire de biochimie, Unitécardiovasculaire, Hôpital européenGeorges Pompidou, AP-HP, Paris5 Laboratoire de biochimie, Centrehospitalier de Bicêtre, AP-HP,Le Kremlin Bicêtre6 Laboratoire de biochimie,CHU Côte de Nacre, Caen7 Laboratoire central de biochimie,Hôpital Robert Debré, Reims8 Laboratoire de biologie clinique,Centre de médecine préventive,Vandœuvre-Les-Nancy

Article reçu le 7 mai 2004,accepté le 2 septembre 2004

Résumé. Les recommandations internationales soulignent l’importance de ladétermination du cholestérol-LDL (C-LDL) dans la prise en charge et le suivides patients à risque cardiovasculaire. Dans la plupart des études et en pratiquecourante le C-LDL est estimé par la formule de Friedewald. L’exactitude de cecalcul est étroitement dépendante de la précision des paramètres pris en compte(cholestérol total, triglycérides (TG) et cholestérol-HDL) et le C-LDL calculén’est plus corrélé aux méthodes de référence quand les TG sont supérieurs à4,5 mmol/L ou en présence de lipoprotéines anormales. Ces restrictions etincertitudes du C-LDL calculé ont conduit au développement récent de métho-des directes, homogènes et adaptables sur les analyseurs de biochimie usuels.L’évaluation multicentrique de quatre réactifs de dosage direct du C-LDL(Daiichi, Denka Seiken, Kyowa, Wako) a été réalisée dans huit laboratoiresutilisant différents automates d’analyse, et sur 45 échantillons sériques (TGinférieurs à 3,1 mmol/L). Pour trois de ces méthodes (Daiichi, Kyowa, Wako),la reproductibilité inter-laboratoire est nettement améliorée par rapport à celledu C-LDL calculé. Les nouvelles méthodes ont été comparées à une méthodede référence (bêta-quantification) à laquelle elles se sont toutes montrées hau-tement corrélées. Les biais moyens sont plus importants pour la méthodeDenka Seiken que pour Kyowa et Daiichi (bien que moins dispersés pour cettedernière) et pour la méthode Wako tous les biais sont positifs. La variation desbiais a été étudiée en fonction des paramètres lipidiques des sérums dosés.Pour trois méthodes, Daiichi, Kyowa et Wako, il existe une relation positivesignificative entre les biais et le rapport C-VLDL/TG qui indique que l’enri-chissement en cholestérol des VLDL est une source de variabilité dans lesdosages. La spécificité des quatre méthodes a été testée en situation de dyslipi-démie réalisée par des ajouts de lipoprotéines (chylomicrons, VLDL, HDL).Cette approche fait apparaître des différences de comportement notammentliées à la surcharge en VLDL : aucune méthode n’est à proprement parlerspécifique, mais jusqu’à 8 mmol/L de TG les variations sont acceptables ; enprésence d’hyperlipoprotéinémie de type III, cependant, seule la méthodeDenka Seiken est utilisable. La linéarité des tests jusqu’à 20 mmol/L de C-LDL(Daiichi et Denka Seiken) ou 14 mmol/L (Kyowa et Wako), permet leur utilisa-tion dans la grande majorité des cas de pratique quotidienne. Ces méthodes dedosage direct apportent un progrès technologique indiscutable en termes deperformances analytiques et d’aisance de mise en œuvre. Leur utilisation dansle diagnostic et le suivi des hyperlipidémies devrait devenir une alternative aucalcul de Friedewald dont elles dépassent les limites d’application.

Mots clés : dosage direct, cholestérol-LDL

Abstract. International guidelines emphasize the importance of LDL choleste-rol (LDL-C) assay in the care and follow-up of patients with cardiovascularrisk. Most studies and common practice use Friedewald’s formula for LDL-Ccalculation. The accuracy of the result depends closely on the precision of the

Tirés à part : P. Bayer

abcAnn Biol Clin 2005 ; 63 (1) : 27-41

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input parameters (total cholesterol, triglycerides (TG) and HDL cholesterol),and discrepancies between calculated LDL-C and measurement by referencemethods appear when TG exceed 4.5 mmol/L, or in the presence of abnormallipoproteins. These restrictions and uncertainties in calculations have promptedthe recent development of direct and homogeneous methods that fit all analy-zers. A multicenter evaluation of four direct assays of LDL-C (Daiichi, DenkaSeiken, Kyowa, Wako) was carried out on 45 serum samples (TG below 3.1mmol/L) in eight laboratories using different analyzers. For three methods(Daiichi, Kyowa, Wako), the interlaboratory reproducibility was markedly im-proved relative to that of calculation. A strong correlation was found for allnew methods when compared with a beta-quantification assay. Average bias inDenka Seiken assays was greater than Kyowa’s and Daiichi’s (although lessdispersed for the latter) and for Wako all bias were positive. The relationshipbetween bias variations and the lipid parameters of the samples was studied.Three methods, Daiichi, Kyowa and Wako, revealed a significant positivecorrelation between bias and serum VLDL-C/TG ratio, clearly indicating thatcholesterol enrichment of VLDL was a source of variability in these assays.Specificity of the four methods was tested in situation of dyslipidemia byspiking isolated lipoproteins (chylomicrons, VLDL and HDL). This experi-ment revealed differences in behavior, most evidently upon addition of VLDL.No method was truly specific, but up to 8 mmol/L of TG the variations wereacceptable. In the presence of type III hyperlipoproteinemia, however, only theDenka Seiken method was reliable. Linearity up to 20 mmol/L (Daiichi, DenkaSeiken) or 14 mmol/L (Kyowa, Wako) of LDL-C allows these tests to be usedin main routine cases. New direct assays are an obvious technological advancein terms of analytical performance and conveniency. Their use for the diagnosisand follow-up of hyperlipidemic patients offers an alternative that overcomesthe limitations of the Friedewald calculation.

Key words: direct assays, homogeneous assays, LDL-cholesterol

L’hypercholestérolémie et particulièrement l’augmenta-tion de la fraction de cholestérol liée aux lipoprotéines defaible densité (cholestérol-LDL, C-LDL) représente un ris-que cardiovasculaire bien établi [1, 2] et les études deprévention primaire et secondaire confirment clairement larelation entre concentration de C-LDL et morbi-mortalitécardiovasculaire [3, 4]. C’est pourquoi les recommanda-tions internationales placent la détermination de ce para-mètre au premier plan [5]. Ainsi, un dosage exact et précisdu C-LDL est nécessaire afin d’identifier de façon appro-priée les patients présentant une hypercholestérolémie etsuivre leurs réponses aux divers traitements.

En routine, le C-LDL ne peut être mesuré directement parultracentrifugation (ou bêta-quantification), car il s’agitd’une méthode laborieuse et chère et jusqu’à présent, ceparamètre était estimé par la formule de Friedewald [6],basée sur trois dosages indépendants : cholestérol total(CT), cholestérol-HDL (C-HDL) et triglycérides (TG). Ce-pendant, même si la formule de Friedewald est générale-ment bien corrélée avec la méthode de référence, ce qui lui

a permis d’être utilisée depuis 30 ans avec une satisfactioncorrecte [7], elle présente certains écueils : elle cumulenécessairement l’imprécision analytique de trois dosages[8] et ne peut être appliquée si le prélèvement n’est pasréalisé à jeun ou lorsque la concentration de triglycéridesest supérieure à 4,52 mmol/L (4 g/L) ou encore lors d’hy-perlipoprotéinémie de type III [6, 9]. De plus, certainesétudes mettent en évidence l’inexactitude de ce calcul lorsde concentrations modérément augmentées de TG (entre 2et 4 g/L) [10, 11] ou lors d’hyperlipoprotéinémies secon-daires comme dans le diabète [12, 13] ou l’insuffisancerénale [14, 15]. Ces dernières années ont vu l’introductionsur le marché de méthodes homogènes directes et automa-tisées de dosage du C-HDL [16, 17], et grâce à ces métho-des les performances analytiques du C-LDL calculé ont pusensiblement être améliorées. Des méthodes semi-automatisées de dosage de C-LDL avaient déjà étéproposées et faisaient appel soit à des précipitations chi-miques soit à une immunoséparation (méthodes hétérogè-nes). Cependant, elles ne semblaient pas offrir de réels

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avantages en précision, exactitude ou spécificité [18, 19].C’est également pour pallier les inexactitudes de la for-mule de Friedewald que d’autres équations ont été propo-sées, parmi elles, la formule de Planella [20], mettant enjeu l’apolipoprotéine B (ApoB) dont la standardisation estplus accomplie que celle du C-HDL [21]. Ces équationsprésentent le même inconvénient à savoir l’obligation dedéterminer simultanément plusieurs paramètres et d’intro-duire autant de facteurs d’erreur potentiels.C’est dans cet état d’esprit d’incertitude vis-à-vis duC-LDL calculé qu’une nouvelle génération de méthodesde dosage direct de C-LDL vient d’être mise au point. Ils’agit de méthodes homogènes, entièrement automatiséesqui permettent la détermination du C-LDL dans des volu-mes d’échantillons très faibles, sur des analyseurs multi-paramétriques et sans aucun pré-traitement, apportant ainsiun réel progrès méthodologique et laissant espérer de net-tes améliorations sur les méthodes antérieures et spéciale-ment sur le calcul de Friedewald [22].L’objectif a donc été de comparer dans une étude multi-centrique les concentrations en C-LDL de 45 échantillonssériques obtenues par quatre méthodes directes sur huitanalyseurs à celles obtenues par le calcul et à la techniquedite de référence, c’est-à-dire la mesure de la concentra-tion en cholestérol des LDL par une méthode de bêta-quantification. Le deuxième objectif était de vérifier laspécificité de ces méthodes, par des ajouts de lipoprotéi-nes isolées par ultracentrifugation, en contrôlant que d’unepart, seul le cholestérol des LDL était ainsi dosé et, d’autrepart, le C-LDL était bien dosé dans sa totalité.

Méthodes et matériel

Méthodes de dosage du cholestérol-LDL

Bêta-quantificationLes lipoprotéines de densité inférieure à 1,019 g/mL (chy-lomicrons, VLDL, IDL) ont été isolées par ultracentrifu-gation (rotor NVT 90, 560 196 g, à 10 °C, 135 min,ultracentrifugeuse Beckman Optima XL 90) [23] et récu-pérées par aspiration du surnageant. Les lipoprotéines LDLet HDL ont été recueillies dans les sous-nageants(d > 1,019 g/mL). Le cholestérol des sur- et sous- nageantsa été dosé en double, dans les mêmes conditions que pourles sérums. Le rendement de l’ultracentrifugation était de97,13 ± 4,15 % calculé d’après la somme des concentra-tions en cholestérol dans les fractions de d < 1,019 etd > 1,019, rapportée au CT du sérum. Dans les fractionsde d > 1,019 g/mL, le C-HDL a été dosé après précipita-tion des LDL par du phosphotungstate de sodium/chlorurede magnésium (PTA), suivant le protocole recommandépar l’Arcol/SFBC [24]. Les concentrations du cholestéroldes LDL par bêta-quantification (C-LDL bQ) ont été obte-

nues par le calcul suivant : C-LDL bQ = [CT] – [cholesté-rol de la fraction de d < 1,019] – [C-HDL]. La pureté desdifférentes fractions a été contrôlée par électrophorèse surgel d’agarose (Hydragel-Lp(a) Plus, Sebia, France). Afinde s’assurer de l’exactitude des concentrations du C-HDLdans les fractions de d > 1,019 g/mL, celui-ci a été aussidosé par une méthode directe à l’a-cyclodextrine (RocheDiagnostics) et aucune différence significative n’a étéconstatée entre les résultats des deux méthodes. Cesconcentrations n’étaient pas non plus significativement dif-férentes (p > 0,05) des concentrations de C-HDL des sé-rums (méthode directe Roche Diagnostics).

Méthodes directes de dosage du C-LDLQuatre méthodes directes homogènes ont été testées. Ellessont fondées sur l’action consécutive de deux réactifs, lepremier (R1) est destiné à bloquer ou solubiliser sélective-ment certaines classes de lipoprotéines, le second (R2)permet le dosage spécifique enzymatique du C-LDL dansla même cuvette.

1 - Procédé DaiichiCette méthode consiste à solubiliser sélectivement par undétergent ionique, contenu dans le premier réactif R1, leslipoprotéines non LDL (chylomicrons, VLDL, HDL) dontle cholestérol libéré réagit avec les enzymes cholestérolestérase, cholestérol oxydase et peroxydase. Le peroxyded’hydrogène généré réagit avec la 4-amino-antipyrine maisne peut former de dérivé coloré car le sel disodique de laN,N’-bis-(4-sulfobutyl)-m-toluidine (DSBmT) est absentde R1. Dans la deuxième étape (R2), un autre détergentpermet l’accessibilité des enzymes cholestérol estérase etcholestérol oxydase au C-LDL. En présence de peroxy-dase, le peroxyde d’hydrogène généré réagit avec le chro-mogène (4-amino-antypirine du premier réactif) et le DS-BmT pour former un produit coloré dont l’absorbance estmesurée à 660 nm. Cette méthodologie est commerciali-sée en France par BioMérieux (N-Geneous™LDL-C, Gen-zyme Corporation).

2 - Procédé Denka SeikenCette méthode consiste dans une première étape (R1) àfaire agir un surfactant pour libérer le cholestérol des lipo-protéines non LDL, qui réagit alors avec les enzymes cho-lestérol estérase et cholestérol oxydase. Le peroxyde d’hy-drogène généré est transformé sous l’action d’une catalase.Dans la deuxième étape (R2), plusieurs détergents vontagir spécifiquement sur les LDL dont le cholestérol seradosé par les cholestérol estérase et cholestérol oxydase.De l’azide de sodium inhibe la catalase de R1 et le pe-roxyde d’hydrogène généré réagit avec la peroxydase deR2 en présence de 4-amino-antipyrine et de sel disodiquede la N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-diméthoxyanilinepour former un complexe bleu dont l’intensité est mesurée

Dosage du cholestérol-LDL


à 600 nm. Cette méthodologie est commercialisée par leslaboratoires Randox (direct LDL-Cholesterol).

3 - Procédé KyowaCette méthode consiste à masquer les chylomicrons etVLDL par des sulfates d’a-cyclodextrine et de dextran enprésence d’ions Mg++ contenus dans R1. Les complexesainsi formés sont alors insensibles à l’action des enzymescontenues dans R2. Le second réactif contient, en outre,un détergent qui forme des micelles avec les HDL et leschylomicrons et VLDL précédemment stabilisés, afin d’in-hiber leur réactivité vis-à-vis des enzymes cholestérol esté-rase et cholestérol oxydase. Seul le cholestérol des LDLest susceptible de réagir et en présence de peroxydase, leperoxyde d’hydrogène généré réagit avec la 4-amino-antipyrine et la N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-diméthoxyaniline pour former un dérivé dont l’intensitéde la coloration est mesurée à 585 nm. Cette méthodologieest commercialisée par Roche Diagnostics (LDL-C Plus)et par Thermo Clinical Labsystems (LDL-Cholesterol).

4 - Procédé WakoUn agent « protecteur » (polyanions et surfactant ampho-tère) masque les LDL aux détergents et aux enzymes cho-lestérol estérase et cholestérol oxydase qui agissent alorsdans la première étape (R1) sur le cholestérol des lipopro-téines non LDL. Le peroxyde d’hydrogène généré est éli-miné par une catalase. Dans la deuxième étape (R2), lesLDL sont décomplexées par un surfactant non ionique etleur cholestérol est dosé par les enzymes du premier réac-tif. Le peroxyde d’hydrogène généré réagit avec la peroxy-dase en présence de N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline et de 4-amino-antipyrine, pour formerun produit bleu dont l’absorbance est lue à 600 nm. Sigmacommercialisait ce procédé sous le label Cholesterol EZLDL™ (réactif repris par la société Ingen).

Équations pour le calcul du cholestérol-LDLFormule de Friedewald [6] : le cholestérol-LDL est cal-culé par l’équation suivante :C-LDL (mmol/L) = CT (mmol/L) – C-HDL (mmol/L) –TG/2,2 (mmol/L)(ou C-LDL (g/L) = CT (g/L) – C-HDL (g/L) – TG/5 (g/L))Formule de Planella modifiée [20, 11] : le cholestérol-LDL est estimé par l’équation suivante :C-LDL (mmol/L) = CT × 0,41 (mmol/L) – TG × 0,32(mmol/L) + ApoB × 1,7 (g/L)

Analyseurs

Huit laboratoires ont participé à l’étude multicentriquereprésentant un total de 6 modèles d’analyseurs : lab 1 -Synchron CX4 (Beckman Coulter), lab 2 - Hitachi 917[A] (Roche Diagnostics), lab 3 - Dimension RXL (DadeBehring S.A), lab 4 - Olympus AU 600 (Olympus-Merck),

lab 5 - Hitachi 917 [B], lab 6 - Konelab 20 (ThermoClinical Labsystems), lab 7 - Hitachi 911 [A], lab 8 -Hitachi 911 [B].

Les méthodes Daiichi et Denka Seiken ont été évaluéespar tous les laboratoires. La méthode Kyowa a été évaluéesur les deux Hitachi 917 [A et B] (lab 2 et 5), les deuxHitachi 911 [A et B] (lab 7 et 8) et sur le Konelab 20 (lab6), les adaptations n’étant pas disponibles pour les autresanalyseurs. La méthode Wako a été évaluée sur les analy-seurs CX4 (lab 1), Hitachi 917 [A et B] (lab 2 et 5),Olympus AU 600 (lab 4) et Hitachi 911 [B] (lab 8). Lesadaptations communiquées par les fabricants ont été pro-grammées sur les différents analyseurs plusieurs joursavant l’étude et validées par des petites séries d’échan-tillons incluant les contrôles fournis dans les coffrets. Lesmêmes lots de réactifs, calibrateurs et sérums de contrôleont été fournis aux différents laboratoires.

Chaque laboratoire a effectué des études préliminaires derépétabilité et reproductibilité sur des sérums à diversesconcentrations en C-LDL et sur les sérums de contrôle.Les coefficients de variation (CV) trouvés (≤ 2 % pour lesrépétabilités et ≤ 3 % pour les reproductibilités) satisfai-saient aux recommandations internationales [25] et concor-daient avec ceux annoncés dans la littérature [22].

Échantillons sériques

Pour l’étude multicentrique, des fractions aliquotes nonnominatives provenaient d’échantillons sanguins analysésquotidiennement par le laboratoire 6. Il s’agissait d’unepopulation non triée et sans dyslipidémie majeure. Lesprélèvements ont été réalisés sur une seule journée (j0)après 12 heures de jeûne, sur tubes secs avec gélose sépa-ratrice (Vacutainer). Après centrifugation à 3 500 g pen-dant 10 minutes à 10 °C, les sérums ont été immédiate-ment décantés et aliquotés. L’analyse des paramètreslipidiques a été réalisée le jour du prélèvement, en double.Les échantillons (n = 45) ont été alors sélectionnés sur desconcentrations en triglycérides inférieures à 3,1 mmol/L(2,8 g/L) afin d’éviter toute erreur d’estimation du C-LDLcalculé par la formule de Friedewald [11], puis ils ont étéexpédiés à 4 °C par transport express, dès j0 à tous leslaboratoires participant à l’étude multicentrique. Les labo-ratoires ont reçu les échantillons le lendemain matin (j1) etont effectué les dosages de CT et TG par des méthodesenzymatiques classiques, du C-HDL par une méthode dedosage direct recommandée par l’Arcol (a-cyclodextrineou polyanions-détergent) [16] et de l’ApoB par néphélé-métrie ou turbidimétrie (sur l’automate dédié aux dosagesquotidiens de ce paramètre). La Lp(a) a été dosée par deuxlaboratoires en immunonéphélémétrie (Dade Behring)avec une limite inférieure de détection fixée à 0,10 g/L.Les 8 laboratoires participants étaient soumis au contrôle

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de qualité hebdomadaire de l’Arcol (CCTB Toulouse) etavaient satisfait aux critères d’exactitude exigés.

Les caractéristiques des 45 échantillons sériques utilisésdans l’étude multicentrique sont résumées dans le ta-bleau 1.

Deux séries indépendantes de dosages de C-LDL directont été réalisées à j1 et à j2 dans chaque laboratoire. Lesrésultats des 4 séries n’étant pas significativement diffé-rents, nous avons alors retenu la moyenne des résultats dechaque échantillon pour chaque méthode.

Études de la linéarité et de la spécificitédes méthodes directes de dosagedu cholestérol-LDL

Les limites de validité des méthodes de dosage direct deC-LDL ont été définies par la méthode d’ajouts de lipo-protéines isolées par ultracentrifugation à partir de sérumsindividuels dyslipidémiques (ou de pools de sérums pré-sentant le même profil lipidique). Les chylomicrons ontété isolés à la densité d < 0,99 g/mL pendant 30 min(Rotor 50.0 Ti, à 20 °C, 26 477 g, sur une ultracentrifu-geuse Beckman L8-55) ; les VLDL (d < 1,006 g/mL), lesLDL (1,019 < d < 1,063 g/mL) et les HDL (1,085 < d< 1,21 g/mL) ont été isolées respectivement pendant 135min, 3 h et 4 h (Rotor NVT 90, à 10 °C, 560 196 g sur uneultracentrifugeuse Beckman Optima XL 90) [16].

Études de la linéaritéLa linéarité pour les valeurs élevées de C-LDL a été véri-fiée par ajouts de LDL isolées à un sérum hypocholestéro-lémique de façon à faire varier les concentrations enC-LDL de 1,54 mmol/L (0,6 g/L) à 19,71 mmol/L (7,7g/L) dans le milieu réactionnel. La linéarité pour les va-leurs basses de C-LDL a été étudiée par dilution d’unsérum hypercholestérolémique (C-LDL = 6,91 mmol/Lsoit 2,7 g/L) dans un sérum dépourvu de lipoprotéines(SDLP) préparé par ultracentrifugation (4 h 30) à la den-sité de d > 1,25 g/mL, faisant varier le C-LDL théoriquede 6,91 à 0,35 mmol/L (2,7 à 0,14 g/L).

Études de la spécificitéLa spécificité de ces méthodes a été vérifiée en ajoutantdes quantités variables de chylomicrons, VLDL et HDLisolés par ultracentrifugation.Les HDL (HDL2 et HDL3) ont été ajoutées à un sérum(C-HDL = 1 mmol/L (0,39 g/L) ; C-LDL = 4,1 mmol/L(1,6 g/L) ; TG = 1,01 mmol/L (0,92 g/L)) faisant varier leC-HDL de 1 à 3,82 mmol/L (0,39 à 1,49 g/L).Les chylomicrons ont été ajoutés à un sérum normotrigly-céridémique (TG = 0,7 mmol/L (0,65 g/L) ; C-LDL = 4,1mmol/L (1,6 g/L)), faisant varier la triglycéridémie de 0,7à 26 mmol/L (0,65 à 23,5 g/L).Les VLDL ont été ajoutées :– à un sérum normotriglycéridémique et normocholestéro-lémique (TG = 1,15 mmol/L (1,05 g/L) ; C-LDL = 3,8mmol/L (1,5 g/L)) faisant varier la triglycéridémie de 1,15à 10,5 mmol/L (1,05 à 9,56 g/L) ;– à un sérum normotriglycéridémique et hypercholestéro-lémique (TG = 1,58 mmol/L (1,44 g/L) ; C-LDL = 7,7mmol/L (3 g/L)) faisant varier la triglycéridémie de 1,58 à10,7 mmol/L (1,44 à 9,7 g/L).Les dosages des C-LDL (par les différentes méthodes di-rectes) après surcharge ont été effectués en double pardeux laboratoires différents, sur deux automates différents(Konelab 30 et Hitachi 911). Les résultats n’étant passignificativement différents, seuls ceux de l’Hitachi ontété utilisés pour l’étude.

Études statistiques

L’exploitation statistique a été réalisée à l’aide du logicielStatView® (SAS Institute Inc., version 5.0). La distribu-tion des échantillons de C-LDL a été analysée et corres-pondait à celle d’une population normale. Les résultatsobtenus par les différentes méthodes directes ont donc étécomparés à ceux obtenus par b-quantification (méthode deréférence) par simple régression linéaire en déterminantles coefficients de régression et les paramètres des droitescorrespondantes (pente ± intervalle de confiance au seuilde 95 % (IC 95%) et ordonnée à l’origine). Par ailleurs,chaque série a été comparée à la méthode de référence parun test t sur séries appariées. Les significativités statisti-ques des différentes variables ont été déterminées à plu-sieurs seuils (p ≥ 0,05 non significatif). Pour chaque sériede C-LDL direct (y), les biais moyens à ± 2 écarts-typesont été calculés en pourcentage par rapport à la méthodede référence (x) selon la formule (y-x/x)×100.Les coefficients de variation (CV) inter laboratoires ontété calculés pour chaque échantillon et chaque méthodesur l’ensemble des laboratoires participants (n = 8 pour lesméthodes Daiichi et Denka Seiken ainsi que pour lesC-LDL calculés, n = 5 pour les méthodes Kyowa et Wako),puis les valeurs moyennes, minimales et maximales de cesCV ont été rapportées.

Tableau 1. Profil lipidique des sérums testés. Paramètresrésultant de 45 échantillons, sauf *Lp(a), résultant de 34échantillons (11 sérums indétectables, Lp(a) < 0,10 g/L).

Paramètre Moyenne (± ET) Min/max

Cholestérol total (mmol/L) 6,16 (± 1,28) 4,13/9,62Triglycérides (mmol/L) 1,30 (± 0,59) 0,37/3,07Cholestérol-HDL (mmol/L) 1,51 (± 0,47) 0,76/3,09ApoB (g/L) 1,18 (± 0,29) 0,69/1,80Lp(a) (g/L) * 0,39 (± 0,30) 0,10/1,34C-LDL �-quantification (mmol/L) 4,03 (± 1,04) 2,43/6,58



Résultats

Étude multicentrique

Les résultats de précision inter laboratoires pour les diffé-rentes méthodes testées sont rapportés dans le tableau 2.Les CV moyens inter laboratoires de trois méthodes direc-tes : Daiichi, Kyowa et Wako sont inférieurs à 2 % (va-leurs extrêmes : 0,65 % - 3,93 %). Les résultats obtenusavec la méthode Denka Seiken sont comparables à ceuxobtenus par l’équation de Friedewald (CV moyens interlaboratoires 4,4 % et 4 % respectivement).Nous avons comparé chaque méthode sur chaque analy-seur à la méthode de référence C-LDL ßQ et calculé lesdivers paramètres de régression (tableau 3). Toutes les mé-thodes sont hautement corrélées à la méthode de référence(p < 0,0001). Les coefficients de régression r sont comprisentre 0,96 et 0,99. Deux méthodes, Daiichi et Wako, pré-sentent sur tous les analyseurs des coefficients supérieursà 0,98.Pour le C-LDL calculé selon l’équation de Friedewaldainsi que pour les deux procédés Daiichi et Kyowa, lesparamètres de régression (pentes et ordonnées à l’origine)montrent une bonne concordance entre ces méthodes et labêta-quantification. Ainsi, avec la méthode Daiichi, uneseule pente est significativement différente de 1 (Hitachi911 [B]) et aucune ordonnée à l’origine n’est significative-ment différente de 0. Pour la méthode Kyowa, aucunepente n’est significativement différente de 1 et aucuneordonnée à l’origine n’est différente de 0. Pour la méthodeWako, une seule pente est significativement différente de 1(Olympus AU 600), cependant les ordonnées à l’originesont toutes positives et pour deux automates significative-ment différentes de 0 (Olympus AU 600 et Hitachi 917[B]). Enfin, avec la méthode Denka Seiken, les pentes derégression sont significativement différentes de 1 pour 6analyseurs sur 8 et les ordonnées à l’origine, toutes négati-ves, significativement différentes de 0 pour 5 analyseurs.La figure 1 et le tableau 3 analysent les biais (%) desrésultats de C-LDL direct par rapport à ceux de la méthodede référence pour chaque méthode et pour tous les analy-seurs concernés. Avec la méthode Daiichi (figure 1A), aucunbiais moyen ne dépasse ± 4 % qui est la valeur limiterecommandée par le NCEP (National cholesterol educa-tion program) [25]. En effet, on observe des biais moyensfaibles (de – 1,1 % à 2,7 %) pour l’ensemble des analy-seurs et une dispersion des biais (± 2 écarts-types) modé-rée : de 8,9 % à 11,4 %. La comparaison de séries appa-riées fait apparaître une différence significative (p < 0,05)avec la bêta-quantification (tableau 3) pour 5 automatesmais seul l’analyseur RXL a donné 4 résultats individuelsdont le biais est supérieur à �12 %� (cette valeur de 12 %représentant la limite admise par le NCEP pour l’erreurtotale du C-LDL [25]). Trois automates ne montrent aucun

résultat individuel dont le biais est supérieur à �12 %� :Hitachi 917[A], Olympus AU 600 et Hitachi 911 [A].Trois automates présentent un seul résultat dont le biaisest supérieur à �12 %� : CX 4, Hitachi 917 [B] et Hitachi911 [B], et 1 analyseur montre deux résultats dont le biaisdépasse cette limite (Konelab 20). Enfin, il n’y a pas derelation entre les biais et la concentration en C-LDL.Avec la méthode Denka Seiken (figure 1B), les biaismoyens sont plus importants et pour trois analyseurs dé-passent ± 4 % (RXL, AU 600, Konelab 20). La dispersiondes biais est également plus marquée pour tous les auto-mates. Les comparaisons de séries (tableau 3) montrentdes différences significatives avec la méthode de référencepour 7 automates sur 8. Le nombre de résultats individuelsdont le biais est supérieur à ± 12 % varie de 3 à 8. Il existeune relation significative entre la concentration en C-LDLet les biais (r varie de 0,30 à 0,47 avec des valeurs de p de0,04 à 0,001) pour 6 analyseurs (sauf RXL et Konelab20) : les faibles valeurs en C-LDL sont sous-estimées etles valeurs fortes surestimées.Pour la méthode Kyowa (figure 1C), les biais moyens sontmodérés de – 2,7 % à 0 %. Cependant, la dispersion desrésultats est importante (± 13 % en moyenne) et le nombrede résultats individuels dont le biais dépasse �12 %� variede 3 à 6. Aucune corrélation significative n’existe entre lesbiais et la concentration en C-LDL.Enfin, en ce qui concerne le procédé Wako (figure 1D), lesbiais moyens sont tous positifs, de 1,7 % à 4,9 %. Cetteméthode surestime la valeur du C-LDL comme le montreégalement le test t sur séries appariées (p < 0,05 dans tousles cas). Cependant, la dispersion des résultats est limitée(± 9,5 % en moyenne) entraînant un nombre faible (1 à 3)de biais individuels dépassant �12 %�.Nous avons également recherché s’il existait une relationentre les biais des différentes méthodes directes et diversparamètres : CT, TG, C-HDL, Lp(a) ainsi que le rapportC-VLDL/TG du sérum, le cholestérol-VLDL (C-VLDL)étant assimilé au cholestérol dosé dans la fraction d <1,019compte tenu de l’absence de chylomicrons et d’IDL véri-fiée par le lipoprotéinogramme. Pour les méthodes Daiichiet Wako, il n’y a pas de variation significative des biais

Tableau 2. Variabilité inter-laboratoires des méthodes de dosagedu cholestérol-LDL.

Méthode CV moyen ± ET Min/max(%) (%)

Friedewald 4,02 ± 1,37 1,79/9,25Planella 2,73 ± 0,64 1,60/4,45Daiichi 1,91 ± 0,68 1,01/3,80Denka Seiken 4,38 ± 0,71 3,04/6,95Kyowa 1,71 ± 0,55 0,65/3,93Wako 1,75 ± 0,58 0,81/3,46

article original


lorsque le CT, TG, C-HDL ou la Lp(a) augmentent. Parcontre, sur la plupart des analyseurs, nous avons trouvéune corrélation positive significative entre les biais de cesdeux techniques et le rapport C-VLDL/TG. Ainsi pour latechnique Daiichi, sur 6 analyseurs : r est compris de 0,30à 0,37 avec p variant de 0,04 à 0,01 ; pour le CX4 etKonelab 20, la corrélation n’atteint cependant pas la signi-

ficativité (r = 0,28 ; p = 0,06 et r = 0,23 ; p = 0,12, respec-tivement). En ce qui concerne la méthode Wako, sur les 5analyseurs : r varie de 0,30 à 0,41 avec des valeurs de p de0,04 à 0,005. Ces résultats suggèrent que la compositiondes VLDL serait une source de variabilité dans les dosagespar ces deux méthodes. Les biais de la méthode Kyowa neprésentent pas de variation significative lorsque le CT, le

Tableau 3. Résultats comparés des méthodes de dosage direct et du calcul de Friedewald avec la méthode de référence. Nombred’échantillons par série = 45.

Série Corrélation linéairea C-LDLb Biais (%) c

C-LDLx = A × C-LDL�Q + B moyenMéthode Analyseur A IC95 B (mmol/L) r (mmol/L) m ± 2 ET n > | 12 % |

Daiichi Beckman CX4 1,043 ns 0,991–1,094 - 0,097 ns 0,987 4,107 * 1,6 ± 9,3 1Hitachi 917 [A] 1,045 ns 0,995–1,096 - 0,117 ns 0,988 4,098 * 1,4 ± 9,3 0Dade Behring RXL 1,010 ns 0,948–1,072 0,064 ns 0,981 4,137 ** 2,7 ± 11,4 4Olympus AU 600 1,013 ns 0,964–1,063 - 0,072 ns 0,988 4,014 - 0,6 ± 8,9 0Hitachi 917 [B] 1,050 ns 0,995–1,105 - 0,127 ns 0,986 4,108 * 1,6 ± 9,9 1Konelab 20 0,991 ns 0,931–1,051 - 0,004 ns 0,981 3,992 - 1,1 ± 10,6 2Hitachi 911 [A] 1,031 ns 0,978–1,085 - 0,093 ns 0,986 4,065 0,6 ± 9,7 0Hitachi 911 [B] 1,054 * 1,001–1,106 - 0,152 ns 0,987 4,097 * 1,3 ± 9,6 1

Denka Seiken Beckman CX4 1,154 *** 1,075–1,232 - 0,498 ** 0,976 4,154 ** 2,2 ± 14,8 4Hitachi 917 [A] 1,075 * 1,012–1,139 - 0,351 * 0,982 3,986 - 1,8 ± 12,0 4Dade Behring RXL 1,107 ** 1,031–1,183 - 0,239 ns 0,976 4,225 **** 4,3 ± 14,2 8Olympus AU 600 1,031 ns 0,977–1,086 - 0,293 * 0,986 3,866 **** - 4,6 ± 10,4 4Hitachi 917 [B] 1,119 *** 1,054–1,183 - 0,345 * 0,983 4,166 *** 2,7 ± 12,0 3Konelab 20 0,978 ns 0,913–1,042 - 0,086 ns 0,978 3,856 **** - 4,6 ± 11,4 5Hitachi 911 [A] 1,090 ** 1,025–1,156 - 0,247 ns 0,981 4,149 ** 2,5 ± 11,6 4Hitachi 911 [B] 1,128 *** 1,062–1,193 - 0,331 * 0,983 4,215 **** 4,0 ± 12,4 3

Kyowa Hitachi 917 [A] 1,013 ns 0,932–1,094 - 0,151 ns 0,968 3,933 * - 2,7 ± 13,9 6Hitachi 917 [B] 1,026 ns 0,945–1,107 - 0,133 ns 0,969 4,003 - 0,9 ± 14,1 4Konelab 20 0,983 ns 0,909–1,058 - 0,034 ns 0,971 3,930 ** - 2,6 ± 12,8 4Hitachi 911 [A] 1,027 ns 0,949–1,106 - 0,131 ns 0,971 4,012 - 0,7 ± 13,3 3Hitachi 911 [B] 1,043 ns 0,963–1,123 - 0,162 ns 0,970 4,043 0,0 ± 13,8 4

Wako Beckman CX4 0,980 ns 0,926–1,035 0,191 ns 0,984 4,144 *** 3,0 ± 9,5 2Hitachi 917 [A] 0,962 ns 0,910–1,014 0,212 ns 0,985 4,091 * 1,7 ± 9,2 1Olympus AU 600 0,940 * 0,888–0,993 0,322 ** 0,984 4,114 ** 2,5 ± 9,9 2Hitachi 917 [B] 0,978 ns 0,924–1,022 0,238 * 0,984 4,182 **** 4,1 ± 9,5 3Hitachi 911 [B] 0,997 ns 0,943–1,052 0,197 ns 0,985 4,219 **** 4,9 ± 9,4 3

Friedewald Beckman CX4 1,001 ns 0,937–1,065 0,027 ns 0,979 4,064 0,8 ± 10,7 2Hitachi 917 [A] 1,016 ns 0,953–1,079 - 0,229 ns 0,980 3,867 **** - 4,5 ± 11,3 5Dade Behring RXL 1,030 ns 0,958–1,101 - 0,172 ns 0,975 3,979 - 1,6 ± 12,2 2Olympus AU 600 1,086 * 1,005–1,166 - 0,183 ns 0,972 4,196 *** 3,7 ± 14,3 5Hitachi 917 [B] 1,005 ns 0,926–1,084 - 0,105 ns 0,969 3,948 * - 2,3 ± 13,2 4Konelab 20 0,990 ns 0,917–1,062 0,225 ns 0,973 4,216 **** 4,9 ± 13,2 6Hitachi 911 [A] 1,026 ns 0,957–1,094 - 0,034 ns 0,977 4,102 1,7 ± 12,5 2Hitachi 911 [B] 1,020 ns 0,957–1,083 - 0,166 ns 0,980 3,946 ** - 2,4 ± 10,9 1

a Paramètres de corrélation linéaire des C-LDL obtenus par chaque couple méthode/analyseur (C-LDLx) avec ceux de la b-quantification (C-LDLbQ) : A :pente de la droite de régression, significativement différente de 1 pour *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ou non significativement différente (ns) ; IC95 :intervalle de confiance à 95 % de la droite de régression ; B : ordonnée à l’origine, significativement différente de 0 pour *p < 0,05, **p < 0,01 ou nonsignificativement différente (ns) ; r : coefficient de régression linéaire.b C-LDL moyen de chaque série ; écart par rapport à la valeur moyenne de référence (4,032 mmol/L) significativement différent de 0 pour *p < 0,05,**p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 (comparaison des moyennes appariées par test t).c Biais par rapport à la méthode de référence (C-LDLx -C-LDLbQ)/C-LDLbQ : m : moyenne des biais (biais moyen) de chaque série ; n : nombre des biaisde chaque série dépassant ± 12 %.



C-HDL ou la Lp(a) augmentent. En revanche nous avonstrouvé une relation négative entre la concentration en TGet les biais, non significative pour le Konelab 20 (r = – 0,17,p = 0,26) et l’Hitachi 911 [A] (r = – 0,27, p = 0,07) etsignificative pour les autres analyseurs (r varie entre – 0,30et – 0,32 avec des valeurs de p entre 0,04 et 0,03). Il existepour cette méthode, sur tous les analyseurs, une corréla-tion positive hautement significative (p < 0,001) entre lesbiais et le rapport C-VLDL/TG (r entre 0,51 et 0,56).À la différence des trois autres méthodes, les biais de laméthode Denka Seiken ne varient pas de façon significa-tive lorsque le rapport C-VLDL/TG augmente. Cepen-dant, on note une corrélation positive des biais de cetteméthode avec d’une part, la concentration en CT (r = 0,38à 0,48 ; p variant de 0,01 à 0,0008 et non significatif pourRXL et Konelab20 r = 0,24 et 0,25, p = 0,11 et 0,1 respec-tivement) et, d’autre part la concentration en TG (r = 0,30à 0,34 ; p entre 0,04 et 0,02), sauf sur les analyseurs RXLet Hitachi 911 [B] (r = 0,23 ; p = 0,13 et r = 0,22 ; p = 0,15,respectivement). Comme pour les trois autres méthodesnous ne retrouvons pas de variation significative des biaisen fonction de l’augmentation du C-HDL ou de la Lp(a),sur l’étendue des concentrations présentées par les 45 sé-rums de l’étude.À titre de comparaison, nous avons recherché également siles biais des C-LDL calculés selon Friedewald présen-taient des variations en fonction des paramètres cités. Iln’existe pas de variation significative de ces biais lorsque

le CT, le C-HDL ou la Lp(a) augmentent. Mais commeattendu (et malgré les concentrations peu élevées des TGdes échantillons de cette étude) apparaît une relation néga-tive significative entre les biais du C-LDL calculé et lesTG (r variant entre – 0,30 et – 0,41 avec p entre 0,04 et0,005), sauf pour l’Hitachi 917 [A] et l’Hitachi 911 [B] oùla corrélation négative n’atteint pas la significativité(r = – 0,23 ; p = 0,13 et r = – 0,22 ; p = 0,15) ainsi qu’unerelation positive hautement significative (p < 0,001) entreces biais et le rapport C-VLDL/TG (r entre 0,47 et 0,58)pour tous les analyseurs.

Études de linéarité des méthodes directesde dosage de cholestérol-LDL

Sur l’étendue de concentrations de C-LDL de 1,54 à 19,7mmol/L (0,6 à 7,7 g/L), obtenues par ajouts de LDL iso-lées par ultracentrifugation à un sérum hypocholestérolé-mique (figure 2A), les méthodes Daiichi et Denka Seikenapparaissent linéaires. En comparant les résultats desC-LDL directs et ceux des C-LDL attendus, les droites etcoefficients de régression sont les suivants : y = 0,977 x+ 0,105, r = 0,999 pour la méthode Daiichi et y = 1,068 x– 0,215, r = 0,999 pour la méthode Denka Seiken. Pourcette dernière méthode, il existe un faible surdosage dansles fortes concentrations (les taux de récupération varientde 100 à 106 %) alors que pour la méthode Daiichi, lestaux de récupération sont tous compris dans la fourchette97-102 %. Les méthodes Kyowa et Wako ne sont plus

Cholestérol-LDL β-quantification (mmol/L)

A B

C D

Bia

is c

ho

lest

éro

l-L

DL

dir

ect

(%)

20

10

0

- 10

- 20

20

10

0

- 10

- 20

2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7

Figure 1. Biais des méthodes directes par rapport à la méthode de référence. Méthodes : A : Daiichi ; B : Denka Seiken ; C : Kyowa ;D : Wako. Laboratoires [analyseurs] : ♦ Lab1 [CX4] ; M Lab2 [917 A] ; m Lab3 [RXL] ; * Lab4 [AU 600] ; n Lab5 [917 B] ; + Lab6[Koné] ; • Lab7 [911 A] ; C Lab8 [911 B].

article original


linéaires à partir de 13,7 mmol/L (taux de récupération< 90 %), ce qui est en accord avec la limite de linéaritéindiquée par les fournisseurs de ces méthodes (14,2mmol/L pour la méthode Kyowa, 10 mmol/L pour la mé-thode Wako).D’autre part, les quatre méthodes sont linéaires pour desconcentrations très faibles de C-LDL variant de 6,91mmol/L (2,7 g/L) à 0,35 mmol/L (0,14 g/L) obtenues endiluant un sérum hypercholestérolémique dans un SDLP(figure 2B). Les droites de régression sont respective-ment : y = 1,003 x – 0,025 pour la méthode Daiichi, y= 1,007 x – 0,051 pour la méthode Denka Seiken, y = 1,005x – 0,009 pour la méthode Kyowa et y = 1,015 x – 0,022pour la méthode Wako. Les coefficients de régression sonttous égaux à 0,999. Les résultats sont sensiblement lesmêmes lorsque les dilutions sont effectuées en sérum phy-siologique (résultats non montrés). Le bon comportementde ces méthodes (taux de récupération de 94 à 103 % pourl’ensemble) nous permet de valider les études de spécifi-cité où l’ajout de lipoprotéines à des sérums entraîne desdilutions plus ou moins importantes des LDL.

Études de la spécificité des méthodes directesde dosage de cholestérol-LDL

Interférence des HDL (figure 3A)Des surcharges progressives en HDL (HDL2 + HDL3) àun sérum normolipidémique faisant varier les concentra-tions de C-HDL de 1 à 3,82 mmol/L (0,39 à 1,49 g/L) ontété utilisées pour étudier l’interférence de ces lipoprotéi-nes sur les dosages directs de C-LDL. Seule la méthodeDenka Seiken ne montre aucune variation significative.Les trois autres méthodes surestiment la valeur de C-LDL.Pour la méthode Daiichi, la surévaluation reste inférieureà 5 %, même pour des concentrations très élevées deC-HDL. En revanche, les deux autres méthodes sont plussujettes à l’interférence des HDL. En ce qui concerne laméthode Wako, la surévaluation est nette (> 5 %) à partirde 3,36 mmol/L (1,3 g/L) de C-HDL. Quant à la méthodeKyowa, la surévaluation dépasse 5 % à partir de 2,91mmol/L (1,14 g/L) de C-HDL et augmente jusqu’à 16 %pour une concentration de cholestérol-HDL de 3,82mmol/L.Nous avons pu tester simultanément la deuxième versionde la méthode Kyowa (version qui ne comporte plus d’a-cyclodextrine dans le premier réactif). Les résultats mon-trent également une surévaluation variant de 7 à 27 %pour des concentrations de C-HDL de 2,91 à 3,82 mmol/L.

Interférence des chylomicrons (figure 3B)Les résultats de C-LDL, obtenus par les méthodes DenkaSeiken, Kyowa et Wako ne sont pas modifiés pour desconcentrations en TG variant de 0,7 à 11,5 mmol/L obte-nues par des ajouts successifs de chylomicrons à un sérum

normolipidémique. La méthode Daiichi surestime leC-LDL de façon proportionnelle à la quantité de triglycé-rides ajoutés dans le milieu. Cependant, la surévaluationreste inférieure à 5 % jusqu’à 7,3 mmol/L de TG et lesvariations des quatre méthodes sont comprises dans l’inter-valle 90-110 % jusqu’à 14 mmol/L de TG.

Interférence des VLDL (figure 3 C et D)Lors de surcharges progressives en VLDL à un sérumnormoLDLémique (C-LDL à 3,84 mmol/L soit 1,5 g/L)(figure 3C), nous observons un comportement différentdes quatre méthodes : les méthodes Daiichi, Denka Seikenet Wako surdosent le C-LDL alors que la méthode Kyowale sous-évalue. Jusqu’à 6 mmol/L de TG, la surévaluationde la méthode Daiichi reste inférieure à 5 %, alors quepour les méthodes Denka Seiken et Wako, dès 4 mmol/Lde TG la surévaluation est supérieure à 5 %. Les variationsde ces trois méthodes restent inférieures à 10 % jusqu’à7,5 mmol/L de triglycérides des VLDL. Pour des concen-trations supérieures à 10 mmol/L de TG, la techniqueWako montre la plus forte variation (118 % de récupéra-tion du C-LDL pour une triglycéridémie de 10,5 mmol/L).La méthode Kyowa, en revanche, montre une sous-évaluation proportionnelle au taux de TG. Le sous-dosagereste inférieur à 5 % jusqu’à 6 mmol/L de TG et inférieurà 10 % jusqu’à 8 mmol/L de TG des VLDL. Cependant, à10,5 mmol/L de TG, le taux de récupération du C-LDLn’est plus que de 84 %, dépassant les limites d’acceptabi-lité.Lorsque des VLDL sont ajoutées à un sérum fortementhypercholestérolémique (C-LDL à 7,7 mmol/L soit 3 g/L)(figure 3D), les variations des dosages de C-LDL directdeviennent négligeables sauf pour la méthode Kyowa aveclaquelle le taux de récupération du C-LDL est de 89 % à laplus forte concentration de TG (10,7 mmol/L).

Cholestérol-LDL attendu (mmol/L)

Ch

ole

stér

ol-

LD

L d

osé

(m

mo

l/L)

25 8

64

2

0 2 4 6 8

20

15

10

5

0 5 10 15 20 25

DaiichiDenka SeikenKyowaWako

B A

Figure 2. Linéarité des méthodes directes. A : surcharge d’unsérum hypocholestérolémique (C-LDL = 1,54 mmol/L) par ajoutsde LDL isolées ; B : dilution d’un sérum hypercholestérolémique(C-LDL = 6,91 mmol/L) par du sérum déplété en lipoprotéines(SDLP).



Ces études de surcharge ont été réalisées plusieurs fois surdes sérums différents afin de confirmer les résultats pré-sentés. Lors d’une de ces études, sur un sérum à 6,4mmol/L de C-LDL (2,5 g/L), nous avons pu étudier lecomportement de la deuxième version de la méthodeKyowa : les résultats obtenus sont superposables à ceuxdes méthodes qui surestiment le C-LDL. Avec cette ver-sion, les taux de récupération varient de 100 à 106 %lorsque les triglycérides des VLDL augmentent de 0,9 à10,4 mmol/L (résultats non montrés). Dans ce même es-sai, la première version de ce réactif se comportait commedans l’étude actuelle, en sous-évaluant le C-LDL.

Interférence des b-VLDL (figure 4)Lors des études de surcharge en VLDL, nous avons puétudier un cas de surcharge en b-VLDL. Le sérum prove-nait d’un patient atteint d’une hyperlipoprotéinémie detype III, dont le diagnostic biologique a été fait sur l’hyper-lipidémie mixte (CT : 19 mmol/L (7,4 g/L) ; TG : 16mmol/L (14,5 g/L)) et l’aspect de broad-band à l’électro-phorèse des lipoprotéines. La fraction VLDL(0,99 < d < 1,006 g/mL) a été isolée et montrait une majo-rité de b-VLDL (C-VLDL = 13,5 mmol/L (5,3 g/L) ; TG-VLDL = 15,4 mmol/L (14 g/L)) et un rapportC-VLDL/TG du sérum nettement supérieur à 0,68 (en

mmol/L) ou 0,30 (en g/L) caractéristique des hyperlipo-protéinémies de type III [26]. La fraction isolée redonnaittypiquement en électrophorèse un aspect de broad-band.Cette fraction a été ajoutée en quantités croissantes à unsérum normolipidémique (C-LDL = 3,28 mmol/L (1,28g/L) ; TG = 0,34 mmol/L (0,31 g/L)) et nous avons testétrois méthodes : Daiichi, Denka Seiken et Kyowa, ainsique la 2e version du procédé Kyowa. Comme le montre lafigure 4, les trois méthodes surévaluent à des degrés diversle C-LDL lorsque les b-VLDL sont ajoutées. La variationla plus importante est obtenue avec la méthode Kyowa quidose environ 30 % du cholestérol ajouté par les b-VLDL,provoquant ainsi, même pour de faibles quantités deb-VLDL dans le milieu, un biais important : en effet dèsl’ajout de 1,7 mmol/L (0,66 g/L) de cholestérol desb-VLDL le surdosage du C-LDL est de 19 %. Compte-tenu de la composition des b-VLDL, cet ajout n’entraînequ’une concentration de 2,2 mmol/L en triglycérides,concentration très nettement inférieure à 8 mmol/L qui estle niveau de TG à partir duquel nous avons noté une inter-férence importante des VLDL. La deuxième version decette méthode étudiée simultanément montre une variationencore plus forte puisque 36 % du cholestérol desb-VLDL ajoutées sont dosés par cette méthode (résultats

Cholestérol-HDL [A] ou triglycérides [B,C,D] (mmol/L)

A120 140

120

100

80

60

40

20

120

110

100

90

80

110

100

90

80

120

110

100

90

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Figure 3. Spécificité des méthodes directes. A : ajouts de HDL à un sérum normolipidémique ; B : ajouts de chylomicrons à un sérumnormolipidémique ; C : ajouts de VLDL à un sérum normoLDLémique (C-LDL = 3,84 mmol/L) ; D : ajouts de VLDL à un sérumhyperLDLémique (C-LDL = 7,7 mmol/L). Méthodes : ♦ Daiichi ; M Denka Seiken ; m Kyowa ; · Wako.

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non montrés). La méthode Daiichi surdose également leC-LDL en présence de b-VLDL et environ 15 % du cho-lestérol des b-VLDL sont reconnus. Enfin seule la mé-thode Denka Seiken est peu affectée en présence deb-VLDL puisque seulement 5 % du cholestérol apportépar ces lipoprotéines sont dosés par cette méthode.

Discussion

Comme le démontrent les nombreuses études cliniques etépidémiologiques, une concentration élevée de C-LDL estun facteur de risque majeur de maladies cardiovasculaires[1, 2]. Les recommandations nationales et internationalesplacent donc le C-LDL en première ligne pour la classifi-cation et le suivi des patients à risque [5, 27]. Puisque desvariations relativement minimes de la concentration deC-LDL peuvent entraîner des changements dansl’évaluation du risque d’athérosclérose, il est nécessaire dedisposer de mesures exactes de ce paramètre. Lesméthodes utilisées en référence (ultracentrifugation,b-quantification) pour la détermination du C-LDL sontparticulièrement laborieuses et nécessitent un équipementspécialisé, limitant leur utilisation en pratique de routine.D’un autre côté, la formule de Friedewald, qui peut êtreutilisée dans n’importe quel laboratoire, cumule la variabi-lité analytique et biologique de trois paramètres et souffre,de plus, de plusieurs limites bien établies. Ces argumentsont amené les différents experts à encourager le dévelop-pement de méthodes directes de dosage du C-LDL [5].Récemment, une nouvelle génération de méthodes direc-tes homogènes, entièrement automatisables est apparue.Leur principe repose sur l’utilisation de réactifs spécifi-ques de différents types qui exposent sélectivement et me-surent directement le cholestérol associé aux LDL [22].Nous rapportons la première évaluation multicentrique dequatre méthodes directes homogènes de dosage de C-LDLactuellement disponibles en France, testées sur des analy-seurs différents. À ce jour, une seule méthode a fait l’objetd’une étude multicentrique sur huit analyseurs identiqueset une autre a été testée sur deux analyseurs différents [28,29]. Cela ne permettait donc pas de juger de la transférabi-lité des résultats obtenus par ces nouveaux tests d’un auto-mate à un autre. Les faibles CV inter laboratoires des troisméthodes Daiichi, Kyowa et Wako rapportés dans notreétude démontrent une nette amélioration de la reproducti-bilité inter laboratoires de ces méthodes directes par rap-port aux méthodes de calcul et le bon agrément entre lesdifférents laboratoires pour le dosage du C-LDL par cha-cune de ces trois techniques quel que soit l’analyseur uti-lisé. Les CV inter laboratoires obtenus avec la méthodeDenka Seiken sont par contre comparables à ceux obtenuspar l’équation de Friedewald et ce résultat devrait encou-rager la reconsidération de certaines adaptations.

Nous avons volontairement limité l’étude d’exactitude àdes échantillons ne présentant pas d’hypertriglycéridémiemajeure afin de pouvoir appliquer le calcul de Friedewaldsans erreur notable et choisi comme méthode de référenceune b-quantification modifiée permettant de ne doser quele cholestérol lié aux LDL [23]. Bien que dans cette étudemulticentrique les différentes méthodes n’aient été testéesque sur un nombre relativement limité de sérums, nosrésultats sont conformes à ceux annoncés dans la littéra-ture [22] : les quatre méthodes présentent une excellentecorrélation avec la méthode de référence (r de 0,96 à 0,99 ;p < 0,0001) et avec le calcul de Friedewald dans chaquelaboratoire (r > 0,97 ; p < 0,0001 ; résultats non montrés).Cependant l’étude des paramètres de régression permet dedéceler quelques différences : en effet si pour les troisméthodes Daiichi, Kyowa et Wako, les pentes (sauf deux)sont significativement non différentes de 1, pour la mé-thode Denka Seiken elles sont significativement supérieu-res à 1 pour six automates sur huit. Les ordonnées à l’ori-gine ne sont pas significativement différentes de zéro pourles méthodes Daiichi et Kyowa, par contre elles le sontpour les méthodes Denka Seiken et Wako sur plusieursautomates.La détermination des paramètres de régression et des coef-ficients de corrélation pour comparer deux méthodes nereprésente cependant que des tests statistiques qui ne reflè-tent ni la magnitude des biais ni le nombre de biais inac-ceptables selon les critères des recommandations interna-tionales. En d’autres termes, une bonne corrélation peutnéanmoins masquer l’existence d’erreurs cliniquement si-gnificatives. En dehors de la comparaison des séries appa-riées par un test t de Student, une autre approche de l’exac-titude consiste à faire l’analyse des biais et leur imprécisionà 95 % (biais moyen ± 2 ET) et calculer le nombre (ou lepourcentage) de biais individuels dépassant ± 12 %,comme le préconisent Miller et al. [30]. Seules deux mé-

Cholestérol-β-VLDL ajouté (mmol/L)

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Figure 4. Spécificité des méthodes directes. Ajouts de b-VLDL àun sérum normolipidémique.



thodes, Daiichi et Wako, répondent de façon satisfaisanteà ces critères. En effet, pour la méthode Daiichi, les biaismoyens sont tous modérés, nettement inférieurs à �4 %�(tableau 3). Seulement avec l’analyseur RXL on constateune magnitude de biais importante (biais moyen ± 2 ET >�12 %�) et un nombre de biais individuels de la sériedépassant �12 %� égal à 4, soit 9 % des échantillons. Surtous les autres analyseurs, la magnitude des biais est modé-rée et le nombre de biais individuels inacceptables nedépasse pas 5 % de la population. Ce procédé d’analysemontre donc que le C-LDL mesuré par ce réactif est com-parable à celui déterminé par la b-quantification modifiée.La méthode Wako présente sur tous les analyseurs un biaispositif, déjà décrit dans d’autres études [29] et un écartsignificativement différent de zéro au test t de comparai-son de moyennes appariées. Cependant, la dispersion desbiais est modérée et le nombre de biais individuels supé-rieurs à �12 %� est compris entre 2 et 7 % de la populationtestée. Pour cette méthode, si nos résultats concordentavec ceux de certains auteurs qui considèrent que ses per-formances analytiques d’exactitude sont tout à fait accep-tables [29, 31], ils sont par contre très différents de ceuxrapportés dans l’étude récente de Miller [30] qui fait étatd’un biais moyen de 14 % par rapport à l’ultracentrifuga-tion. Cependant, si l’on ne prend en compte dans cetteétude que les sérums normotriglycéridémiques (TG< 1,5 g/L), le biais moyen de la méthode est de 4,4 %,similaire aux biais moyens que nous avons constatés.Les deux autres méthodes Denka Seiken et Kyowa présen-tent des résultats moins satisfaisants. En effet, même si lesbiais moyens de ces méthodes sont acceptables sur laquasi-totalité des analyseurs et nos résultats conformes àla plupart des évaluations de ces deux réactifs [22, 30, 32],les intervalles de confiance de ces biais sont plus élevésque pour les deux méthodologies précédentes (tableau 3).Le nombre de biais individuels inacceptables dépasse 5 %de la population testée sur tous les automates. Sur notreéchantillonnage, l’exactitude de ces deux méthodes n’ap-paraît donc pas meilleure que celle du calcul de Frie-dewald. Néanmoins l’excellente précision de ces nou-veaux dosages, rapportée dans toutes les étudesd’évaluation [22] et vérifiée préliminairement à l’étudemulticentrique par les huit laboratoires sur les différentsautomates, leur permet d’atteindre l’objectif d’une erreurtotale (CV × 2 + �biais moyen�) < 12 % exigé par leNCEP [25].Pour tenter d’expliquer les variations des biais mises enévidence lors de notre étude, nous avons recherché s’ilexistait une relation avec la concentration en C-LDL ouavec d’autres paramètres de l’exploration lipidique (TG,C-HDL ou Lp(a)).Pour les méthodes Daiichi, Kyowa et Wako, les biais obser-vés ne dépendent pas de la concentration en C-LDL,

comme le rapportent également d’autres études [28, 31,33]. Pour la méthode Denka Seiken, sur 6 analyseurs, ilexiste une relation positive significative entre les biais et lavaleur du C-LDL. Le peu de travaux réalisés avec ce réac-tif ne nous permet pas de conclure, cependant notre étudede linéarité va dans le même sens puisqu’elle montre unléger surdosage dans les fortes concentrations avec cetteméthode.Il n’existe pas non plus de variations des biais des quatreméthodes testées vis-à-vis de la b-quantification, lorsquela Lp(a) augmente. Cela indique que ces méthodes dosentprobablement le cholestérol lié à cette particule, au mêmetitre que la méthode de référence ou que le calcul par laformule de Friedewald. Cependant dans notre série, seuls17 échantillons avaient une Lp(a) > 0,30 g/L dont troisseulement une concentration supérieure à 0,80 g/L. Bienque le fait ne soit pas démontré, à cause de la difficultéd’isoler cette lipoprotéine des fractions LDL par ultra-centrifugation, la plupart des études concluent, comme lanôtre, à la prise en compte plus ou moins complète ducholestérol de la Lp(a) dans le dosage du C-LDL par cesnouveaux tests [34, 35].D’autre part, notre étude, pas plus que d’autres [29, 31],n’a pu mettre en évidence de relation entre les biais et laconcentration en C-HDL. Néanmoins, l’étude d’interfé-rence montre un manque de spécificité des méthodesKyowa et Wako vis-à-vis de HDL ajoutées : une partie ducholestérol contenu dans ces lipoprotéines est dosé par cesdeux tests et lors d’hyperalphalipoprotéinémie majeure (C-HDL > 3 mmol/L), la surestimation du C-LDL devientimportante. L’erreur par excès sur le dosage de C-LDLsemble limiter l’utilisation de ces deux méthodes aux do-maines de mesure habituels du C-HDL. Les tests effectuésavec la 2e génération du réactif Kyowa montrent que lasuppression d’a-cyclodextrine dans le nouveau réactifn’améliore pas la spécificité vis-à-vis du C-HDL.L’inexactitude du calcul de Friedewald lors d’hypertrigly-céridémie même modérée est connue depuis la publicationd’origine de cette méthode [6] et a été largement argumen-tée ces trente dernières années [10, 22]. Aucune corréla-tion ne peut être mise en évidence entre la concentrationen TG et les biais obtenus avec les méthodes Daiichi etWako dans notre étude, comme dans d’autres [15, 29]. Aucontraire, une relation positive est constatée avec la mé-thode Denka Seiken et une relation négative avec la mé-thode Kyowa. Plusieurs publications corroborent ce der-nier résultat [28, 31], suggérant une mesure incomplète duC-LDL lorsque les TG augmentent. Il faut souligner quenous avons observé une tendance identique pour les biaisobtenus avec la formule de Friedewald, ce qui était at-tendu. Pour vérifier l’effet des triglycérides sur les dosa-ges directs de C-LDL, nous avons étudié le comportement

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de ces nouvelles méthodes lors d’ajout de lipoprotéinesriches en TG (LRT).

L’ajout de chylomicrons ne modifie que peu les résultatsattendus et jusqu’à 10 mmol/L de TG de chylomicrons, lesdosages directs de C-LDL ne sont pas affectés. Ces résul-tats sont à mettre en parallèle avec ceux obtenus par diver-ses équipes lors d’ajout d’Intralipid [35, 36] et/ou de chy-lomicrons isolés [28]. Plus complexe est l’approche del’interférence des VLDL. Nous avons été amenés à répéterplusieurs fois les tests d’ajout de VLDL de façon à affir-mer la nature des anomalies constatées. Les résultats obte-nus lors de ces ajouts confirment les variations des biais enfonction des TG observées lors de l’étude multicentriquepour les méthodes Denka Seiken et Kyowa et mettent enévidence pour les méthodes Daiichi et Wako un surdosagedu C-LDL. Le test Kyowa de 2e génération, sansa-cyclodextrine, ne montre plus de sous-estimation maisun léger surdosage, similaire à celui constaté avec la mé-thode Daiichi. Malgré ce manque de spécificité, d’ailleursmoins évident lorsque le sérum est hypercholestérolémi-que, on peut conclure, comme plusieurs autres auteurs[33, 35] que les quatre méthodes testées restent accepta-bles pour des triglycéridémies inférieures à 8 mmol/L.Cette constatation n’est cependant vraie que lorsque lesajouts ne concernent que des VLDL larges isolées à partird’hyperlipoprotéinémie de type IV. Les LRT étant trèshétérogènes, nous avons également étudié le comporte-ment des différentes méthodes en présence de petitesVLDL ou b-VLDL isolées à partir d’une hyperlipoprotéi-némie de type III. Dans cette situation, deux des troisméthodes testées, Daiichi et Kyowa, montrent une nettesurestimation du C-LDL, qui est même majorée avec leréactif Kyowa 2e génération. Ces résultats également dé-crits dans d’autres études [34, 37] soulignent que l’enri-chissement en cholestérol des VLDL est une source d’in-terférence notable dans le dosage de C-LDL. La méthodeWako, ayant été retirée du commerce pendant l’étude, n’apas été testée, cependant d’autres auteurs constatent uneinterférence des b-VLDL du même ordre dans le dosagedu C-LDL par ce test [31]. Avec la méthode Denka Sei-ken, à l’opposé des précédentes, les b-VLDL n’entraînentpas d’interférence notable. Sakaue et al. rapportent égale-ment une faible réactivité de cette méthode vis-à-vis desVLDL et des IDL isolées d’un sérum de patient atteint dedyslipoprotéinémie de type III [34].

Les résultats obtenus lors de l’ajout de b-VLDL sontconfortés par l’analyse complémentaire des variations desbiais en fonction du rapport C-VLDL/TG observées dansl’étude multicentrique. Il s’avère, en effet, que cette appro-che est beaucoup plus informative de la composition desVLDL que le simple dosage des TG. Nous démontrons,comme d’autres équipes [31, 38], que plus ce rapport aug-mente (c’est-à-dire plus les VLDL sont enrichies en cho-

lestérol), plus le C-LDL dosé avec les méthodes Daiichi,Kyowa et Wako est surévalué par rapport à la méthode deréférence. Et comme attendu d’après les résultats de lasurcharge en b-VLDL, les biais du C-LDL dosé par laméthode Denka Seiken ne sont pas corrélés aux variationsdu rapport C-VLDL/TG. Enfin, à titre de comparaison, ilfaut souligner qu’une relation positive très significativeexiste entre les biais du C-LDL calculé par la formule deFriedewald et le rapport C-VLDL/TG, montrant nettementque même pour des concentrations modérées de TG, l’esti-mation du C-VLDL par le rapport TG/5 (en g/L) ou TG/2,2(en mmol/L) est loin d’être parfaite.Au terme de cette étude de spécificité vis-à-vis des LRT,nous pensons que les méthodes testées sont utilisables enprésence d’hypertriglycéridémie jusqu’à 8 mmol/L de TG.Une attitude beaucoup plus réservée doit être la règle dansle cas de dysblipoprotéinémie de type III ou de tableauxdyslipidémiques évoquant la présence de LRT enrichiesen cholestérol (b-VLDL, IDL ou remnants).Enfin, l’étude de linéarité démontre que ces nouveaux testssont utilisables sur un large domaine de mesure pour lesméthodes Daiichi et Denka Seiken. La linéarité est pluslimitée pour les méthodes Kyowa et Wako conformémentà ce qui est annoncé par les fournisseurs et la littérature[28, 31], mais suffisamment étendue pour mesurer la plusgrande majorité des concentrations de C-LDL rencontréesen pratique quotidienne.

Conclusion

Les quatre méthodes de dosage direct du C-LDL évaluéesdans cette étude ont apporté une satisfaction générale.Dans le domaine de la lipidologie courante, elles sontprécises et suffisamment exactes, et pour trois d’entre ellesamènent une réelle amélioration de la reproductibilité in-ter laboratoires. Ces dosages peuvent être utilisés pour deséchantillons modérément hypertriglycéridémiques (entre4,5 et 8 mmol/L de TG) pour lesquels le calcul de Frie-dewald n’est plus applicable et la méthode de référence estlongue et onéreuse. Cependant l’étude de spécificité etcertains résultats individuels de l’étude multicentriquenous amènent à émettre quelques réserves. Certaines adap-tations méritent d’être revues et surtout il semble néces-saire d’être prudent lors d’hyperlipoprotéinémie de typeIII, où au moins trois de ces tests ne sont plus applicables.Nous regrettons que la protection industrielle de ces pro-cédés nous ait privés des éléments nécessaires à la com-préhension utile de leurs principes d’efficacité ou de spé-cificité, qui nous aurait permis d’analyser finement lesanomalies constatées dans cette étude et dans d’autres.Quoi qu’il en soit, la mise au point de ces nouveaux testsreprésente une réelle avancée technologique, permettant le



dosage en laboratoire du C-LDL sur un grand nombred’échantillons à l’aide d’automates multiparamétriques etdevrait constituer une bonne alternative à la méthode deréférence.

Remerciements. Ce travail a été réalisé grâce aux compé-tences des techniciens des différents laboratoires et plusparticulièrement de Marie-Christine Federspiel et ValérieFesel-Fouquier. Nous remercions les différentes sociétéspour les fournitures gracieuses des réactifs, étalons etcontrôles nécessaires à cette étude. Les dépenses de fonc-tionnement ont été exclusivement assurées par l’Arcol etles laboratoires concernés.

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