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Christian Vidal, Medizinische Hochschule Hannover – Klinische ChemieCarl-Neuberg-Str. 1 – 30625 Hannover – [email protected]

Drogenscreening mittels Enzym-Immunoassays:

Möglichkeiten und Grenzen

Dr. Christian Vidal

Medizinische Hochschule Hannover, Klinische Chemie

2. Februar 2006, Gelsenkirchen


Das toxikologische Notfall-Labor der MHH


Das toxikologische Notfall-Labor der MHH

• 24 h-Betrieb

• Einzugsgebiet: Norddeutschland

• 8 TAs, je 1 Wissenschaftler in Rufbereitschaft

• Drogenscreeningspezielle toxikologische Analysen (Amanitin, Cyanid, ...)systematische Suchanalyse (GC/MS)BestätigungsanalysenTher. Drug Monitoring (z.B. Clozapin, Thiopental, Midazolam)


Der Vortrag im Überblick

Einsatzgebiete für Drogenscreening

Technik des Drogenscreenings

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Einsatzgebiete für Drogenscreening:Der Problemkreis

• Gesunde und Kranke nehmen eine Vielzahl von Pharmaka ein,die unterschiedlich stark metabolisiert und eliminiert werden

• Drogennachweis: - verschreibungspflichtige Arzneimittel (Benzodiazepine, Opiate) - illegale Drogen (nicht verkehrsfähige, nicht verschreibungsfähige Pharmaka)

• ca. 200 verschiedene Substanzen (+ Abbauprodukte/renal eliminierte Metabolite: besondere Rolle beim Drogennachweis im Urin!)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Drogenscreening im Urin

• Amphetamine

• Barbiturate

• Benzodiazepine

• Cannabinoide (THC)

• Cocain/-metabolit (Benzoylecgonin)

• LSD

• Methadon/-metabolit (EDDP)

• (Methaqualon)

• Opiate, 6-Acetylmorphin

• (Phencyclidin)

• (Propoxyphen)

• Trizyklische Antidepressiva

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Drogenscreening im Serum

• Trizyklische Antidepressiva

• Benzodiazepine

• Barbiturate

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Wo wird Drogenscreening eingesetzt?

• in stationären Einrichtungen: ZNA, Psychiatrie, Intensivmedizin

• bei niedergelassenen Ärzten/ambulanten Einrichtungen, z.B. Methadon-Substitutionsprogramm: Erkennung von Beigebrauch, Überwachung der Entzugsbehandlung)

• im Strafvollzug

• bei Verkehrskontrollen

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Technik des Drogenscreenings: Instrumentelle Verfahren

• CEDIA (ClonedEnzyme Donor Immunoassay)

• FPIA (Fluoreszenz-polarisations-immunoassay)

• KIMS(kinetic inter-action of micro-particles in a solution)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Drogenschnelltests („Streifentests“)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Funktionsprinzip

• qualitativer immunchromato-graphischer Test

• Kompetition um Gold-Anti-körper-Konjugat zwischen membrangebundener Droge und Droge im Urin

• Urin wird in Testkarte ge-sogenDroge bindet an Konjugat

• ist Konzentration > Cut-off, verbleibt kein Konjugat, um an membrangebundene Droge zu binden Testlinie fehlt

• Kontroll-Linie: spezifischer membrangebundener Anti-körper bindet Konjugat Quelle: Mahsan Diagnostika Vertriebsgesellschaft mbH, Produktinformation

fehlt vorhanden

vorhandenvorhanden

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Drogenschnelltests fehlerhaft - Polizei nutzt sie aber weiter Leipziger Volkszeitung,

02.12.2003

Drogenschnelltests müssen dringend zur Ausrüstung der Polizei gehören Gesamtverband der Dt. Versicherungswirtschaft, 07.09.2001

„Drogenschnelltests sollen flächendeckend eingeführt werden.“ Drogenbeauftragte der Bundesregierung, Juli 2003


Verfügbarkeit von Drogenschnelltests

• Teststreifen, die offizielles EU-Genehmigungsverfahren durchlaufen haben

• daneben im Internet erhältlich: Schnelltests ohne offizielle Zulassung, lückenhafte Informationen über Eigenschaften und Qualität, vom Einsatz abzuraten

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Drogenschnelltests:„schnell“, aber auch „gut“?

• Nachweis von Pharmaka mit Schnelltests scheinbar leicht durchführbar

ABER: falsch-positive und falsch-negative Befunde vermeiden!

• Präanalytik?

• Entscheidungsgrenze?

• Empfindlichkeit gegenüber Metaboliten?

• Qualitätssicherung der Resultate?

• Auswertung und Beurteilung?

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Beispiel: TCA-Schnelltest

„kalibriert“ auf Imipramin, Cut-off: 750 µg/l, abgelesen nach 10 min

1000 µg/l 750 µg/l 500 µg/l Blindprobe

negativnegativ?

1x „keine Linie“5x „schwache Linie“

?4x „keine Linie“

2x „schwache Linie“

positiv?5x „keine Linie“

1x „schwache Linie“

„Selbst wenn die Testlinie auch nur schwach erkennbar ist, ist der Urin negativ.“

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Schnelltests: Auswertung

• überwiegend subjektiv-visuell

• positive Befunde bei Fehlen einer BandeABER: auch bei schwach gefärbten Banden: „negativ“ an unerfahrenen Untersucher hohe Anforderungen gestellt

• Feldeinsatz mit ungenügender Beleuchtung (Verkehrskontrollen): Fehlablesungen möglich

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Schnelltests: Qualitätssicherung

• Kontroll-Linie: Auftreten zeigt, dass Analysenvorgang regelrecht abgelaufen ist

• Kontrollmaterial: arbeitstägliche Verwendung empfohlen, aber vom Untersucher selbst zu beschaffen (Kosten!)

• richtig-positive Kontrolle bedeutet lediglich, dass aktuell eingesetzter Streifen in Ordnung war

• nicht überprüfte Streifen könnten dennoch fehlerhafte Befunde ergeben (Produktionsmängel, unsachgemäße Lagerung)

• Ergebnis-Dokumentation: keine „Datenspeicherung“ möglich

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Instrumenteller Immunoassay

• CEDIA (ClonedEnzyme Donor Immunoassay)

• FPIA (Fluoreszenz-polarisations-immunoassay)

• KIMS(kinetic inter-action of micro-particles in a solution)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Instrumenteller Immunoassay

• liefert quantitatives Mess-Signal (Rohwert dokumentiert)

• Wert oberhalb der Entscheidungsgrenze (Cut-off-Wert) Probe gilt als verdächtig

• Verdachtsbereich („fraglicher“ Bereich): Messwert zwischen Cut-off und Nachweisgrenze

• Cut-off kann an die jeweilige Fragestellung angepasst werden:Akut-Toxikologie, Überwachung Drogenentzug, ...

• nach Rücksprache mit dem behandelnden Arzt weitere Untersuchung (Bestätigungsanalyse, Differenzierung)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


EDV-gestützte maschinelle Auswertung

» z.B. TCA aus Serum Cut-off: 20 ng/mL (Imipramin)

9986/04 (Blindprobe)9987/04 dotiert: 10 ng/mL9988/04 dotiert: 20 ng/mL9989/04 dotiert: 50 ng/mL

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Instrumentelle Verfahren:Qualitätskontrolle

• quantitatives Mess-Signal, Impräzision ca. 7-11%

• Richtigkeit mit Kontrollmaterial prüfen

• externe Qualitätskontrolle (Ringversuche):

DGKLINSTANDGTFCh

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Verfahren im Vergleich

Schnelltests Instrumentelle Tests Bestätigungs-analysen (GC/MS)

feldtauglich ortsgebunden ortsgebunden

keine Geräte nötig medizin. Labor Speziallabor

kein Hydrolyseschritt Hydrolyse möglich Hydrolyse möglich

subjektiv-visuelle Auswertung

maschinelle Auswertung

Auswertung über Datenbank

Dokumentation? EDV-Dokumentation EDV-Dokumentation

kurze Einarbeitungszeit

MTA, CTA speziell geschulte CTA/MTA

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Analytische Aspekte:Möglichkeit der Probenverfälschung

• Möglichkeit der Probenverfälschung in Betracht zu ziehen bei:

Drogenabhängigenarbeitsmedizinischen UntersuchungenVerkehrskontrollen

• Verfälschungs-“Techniken“:

Verdünnung des Urins (Kreatinin < 2,7 mmol/l !?) Kreatin-Zusatz (enzymat. Nachw. unspezif.; Jaffe-Rkt.!)

Zusatz von Fremdsubstanzen, die Analytik stören

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Möglichkeit der Probenverfälschung


Nachweis von Verfälschungsstoffen

• „Sample Check“ (microgenics)

Nachweis von Verfälschungsstoffen, die mit Testverfahren interferieren (Bleich-/Oxidationsmittel, Tenside, ...)

Test, ob immunchemische Reaktion in der Probenmatrix ablaufen kann.

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Präanalytik: Markersubstanzen

• Identifikation derProbe durch oraleGabe von Marker-substanzen(Polyethylenglykole)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Analytische Aspekte:Entscheidungsgrenzen

• Entscheidungsgrenze (Cut-off) Nachweisgrenze

• Cut-off : mehr falsch-positive ErgebnisseCut-off : mehr falsch-negative Ergebnisse

• Cut-off ist je nach Indikation adaptierbar:akute Intoxikation?chronischer Abusus?Überwachung des Drogenentzugs?

z.B. Opiatnachweis: üblich bisher 300 µg/L, in der Diskussion: 2000 µg/L (Verzehr von Mohnsamen kann zu positivem Opiatnachweis führen)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Entscheidungsgrenzen

Orientierung an Vorgaben von SAMHSA (Substance Abuse and Mental Health Services Administration, USA)

ABER:

• Vorgaben häufig nur für eine bestimmte Substanz der Gruppe realisiert

• Empfindlichkeit für andere Vertreter der Substanzgruppe (und Metabolite!) oft schlechter

• Unterschiede auch bei Tests verschiedener Hersteller!

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Spezifität: Mono-/Gruppentests

• nur wenige Immunoassays erfassen spezifisch nur eine Substanz, z.B. Benzoylecgonin (Kokain-Metabolit)Monotest

• überwiegend „Gruppentests“: erfassen verschiedene Vertreter einer Gruppe (z.B. Benzodiazepine) und deren MetabolitenGruppentest

hohe Anforderungen an Tests und an Untersucher!

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Kreuzreaktivitäten

• Kreuzreaktivität von Substanzen aus einer Gruppe kann sehr viel geringer (oder größer) sein als die der kalibrierten Substanz

• stark wirksame Substanzen in niedriger Konzentration können dem Nachweis leicht entgehen

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen

Kreuzreaktivität steht nicht in Beziehung zur Pharmako-

dynamik einer Substanz: wenig wirksame Substanz kann

ein hohes Mess-Signal erzeugen und umgekehrt


Beispiel: Benzodiazepine

therapeut. Bereich (Serum)200-1500 µg/l200-2000 µg/l 20- 800 µg/l200- 700 µg/l

• Schnelltest Mahsan® BENZOCut-off: 300 µg/l

„positiv“ ab Konzentration im Urin:

Oxazepam (Durazepam®) 300 µg/l Diazepam (Valium®) 700 µg/lNordazepam (Tranxilium®) 300 µg/lPrazepam (Demetrin®) 100000 µg/l


Beispiel:Europäische Besonderheiten

therapeut. Bereich (Serum)200-1500 µg/l200-2000 µg/l 20- 800 µg/l 5- 15 µg/l

• amerikanische (!) Vorgaben Europa: vielfach neuere Benzodiazepine mit viel stärkerer Wirkung eingesetzt

• z.B. Flunitrazepam: niedrig dosiert! niedrige Konzentration im Urin entgeht leicht dem Nachweis

• Urinkonzentrationen „positiv“Oxazepam (Durazepam®) 300 µg/l Diazepam (Valium®) 700 µg/lNordazepam (Tranxilium®) 300 µg/lFlunitrazepam (Rohypnol®) 700 µg/l


Hydrolyse: Erfassung von Glukuroniden

• z.B. Morphin, Benzodiazepine: überwiegend als Glukuronide ausgeschieden, automatisierte Hydrolyse empfohlen!

• viele Tests unempfindlich für Glukuronide

• Beispiel: Instrumenteller IA mit/ohne enzymatische HydrolyseCEDIA Benzodiazepine, Cut-off 300 µg/l

ohne Glukuronidase mit GlukuronidaseProbe A: 189 µg/l „negativ“ 588 µg/l „positiv“Probe B: 12 µg/l „negativ“ 395 µg/l „positiv“

Entscheidungsgrenzen gelten stets für die unkonjugierte Muttersubstanz

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Substanzgruppen:Amphetamine

• Nachweisbarkeit:Ecstasy – Urin: ca. 1-4 Tage, Serum: ca. 1 TagSpeed – Urin: ca. 2-4 Tage, Serum: ca. 2-4 Tage

• IA sollte spezifisch Amphetamine und Ihre gefährlichsten und am meisten genutzten Derivate erfassen (Amphetamin, Methamphetamin, „Ecstasy“ (MDA, MDMA, ...), ...)

• weitere Tests nützlich für weniger gefährliche Substanzen aus der Amphetamingruppe (z.B. Fenfluramin, Ephedrin)

• CAVE: einige Pharmaka (z.B. Selegilin, M. Parkinson) metabolisieren zu Methamphetamin

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Beispiel: Test auf Amphetamine

• Ringversuch Drogenscreening DS1/05 der DGKLProbe A: dotiert 1300 µg/l AmphetaminProbe B: dotiert 1300 µg/l 3,4-Methylendioxymethamphetamin MDMA

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Benzodiazepine

• Assays sollten missbräuchlich eingesetzte Benzodiazepine erfassen (z.B. Rohypnol® (Flunitrazepam))

• Messmethoden mit höherer Sensitivität erforderlich, z.B. für Flunitrazepam und renal eliminierte Metabolite (z.B. 7-Amino-Flunitrazepam)

• Assays sollten Hydrolyseschritt beinhalten, um Konjugate zu erfassen

• Antagonisten (z.B. Flumazenil/Anexate®) sollten nicht-reaktiv sein

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Cannabinoide

• Nachweisbarkeit:Urin – ca. 7-10 Tage, (häufiger Konsum: bis 8 Wochen)Serum – ca. 6 h, THC-COOH 2-3 Tage

• IA für Cannabinoide kommerziell verfügbar mit verschiedenen Cut-offs: 25, 50, 100 µg/l

• positiver Befund in der Regel nur für Raucher, nicht für Passivraucher

• Assays nicht geeignet für Entscheidung zwischen akutem und chronischem Missbrauch

THC/Kreatinin-Quotient zur Verlaufskontrolle einsetzen

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Cocain und Cocainmetabolit

• Nachweisbarkeit:Urin – ca. 2-4 Tage, Serum – ca. 1 Tag

• bevorzugt Assay einsetzen, der spezifisch einen Cocainmetaboliten (z.B. Benzoylecgonin) in Urin detektiert

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


LSD (Lysergsäure-Diethylamid)

• Nachweisbarkeit:Urin – bis ca. 3 TageSerum – bis ca. 12 h

• LSD-Konzentrationen eher niedrig

• verfügbare Assays bieten ausreichende Sensitivität, sind aber relativ unspezifisch

• Kreuzreaktivität mit anderen Drogen muss ausgeschlossen werden, da Bestätigungsanalyse im entsprechenden Konzentrationsbereich schwierig ist

• CAVE: z.Zt. sind positive Befunde eher auf eine Interferenz mit Ambroxol (auch Bromhexin, Fentanyl) zurückzuführen, da LSD-Missbrauch selten ist

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Methadon & Methadonmetabolit

• positiver Befund durch einen spezifischen Assay für einen Methadonmetaboliten (z.B. EDDP) ist ein starker Hinweis auf die Einnahme von Methadon

• spezifischer Assay für Methadon kann in die Irre führen: positiver Befund kann durch Zusatz einer kleinen Menge Methadons zur Urinprobe vom Probanden erzeugt werden, während der Hauptanteil in der Szene verkauft wird

• nur L-Methadon ist aktiv: Enantiomeren-Gemisch verabreicht? Unterschiedliche Kreuzreaktivität zwischen L- und D-Form im verwendeten Test?

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Opiate/Opioide

• verfügbare IA erfassen nur Opiate, nicht Opioide

• positiver Opiatassay sollte gefolgt werden von spezifischem Assay für 6-Acetylmorphin (Heroinmissbrauch?)CAVE: falsch-positiv bei hoher Morphinkonzentration

• Antidote (Naloxon, Naltrexon) sollten keine positiven Befunde liefern

• Opioide, die zur Behandlung von Süchtigen eingesetzt werden (z.B. Buprenorphin), sollten mit speziellen Assays nachgewiesen werden

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Tri-/Tetrazyklische Antidepressiva

• Assays für Serum und Urin kommerziell erhältlich

• Konzentrationen dieser Pharmaka meist gering, Assays sollten positiven Befund für viele Pharmaka mit sehr unterschiedlicher Struktur liefern Assays stark anfällig für Interferenzen

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Barbiturate

• toxikologische Bedeutung der Barbiturate stark gesunken

• Cut-off-Konzentration von 200 µg/l für alle Substanzen der Barbituratgruppe ist angemessen für die meisten Einsatzzwecke

• Hexobarbital, Methohexital und Thiopental werden nicht detektiert, da im Urin ausgeschiedene Menge gering und Kreuzreaktivität der gebräuchlichsten IA schwach

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


weitere Pharmaka

Pharmaka, für die Screeningtests dringend benötigt werden:

• Beta-Blocker (z.B. Metoprolol, Propanolol)

• Clozapin (Neuroleptikum, z.B. Leponex®)

• Diphenhydramin (Sedativum)

• Fentanyl (Narkotikum, Opioid)

• Tilidin (Opioidanalgetikum)

• Tramadol (Opioidanalgetikum)

• Zolpidem, Zopiclon (Hypnotika)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Schlussfolgerungen

• Präanalytik? Verfälschungen ausschließen!

• Kreuzreaktivitäten? keine quantitativen Befunde!

• Verhalten von Metaboliten? Hydrolyseschritt!

• Indikation? Cut-off adaptieren!

• Qualitätssicherung? instrumentelle Verfahren Schnelltests vorziehen!

• Bestätigungsanalysen? Zusammenarbeit mit kompetentem Labor suchen!

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen

leichte Durchführbarkeit von IA, dennoch:aussagekräftiger Befund bedarf umfassenden Know-Hows!


Literatur

• Külpmann, W.-R.; Deutsches Ärzteblatt 100 (17): A1138-A1140 (2003)(www.aerzteblatt.de)

• Külpmann, W.-R.; J. Lab. Med. 28 (4): 317-325 (2004)

Einsatzgebiete

Technik

Analytische Aspekte

Substanzgruppen

Schlussfolgerungen


Drogenscreening mittels Enzym-Immunoassays:

Möglichkeiten und Grenzen

Dr. Christian Vidal

Medizinische Hochschule Hannover, Klinische Chemie

2. Februar 2006, Gelsenkirchen


Bestätigungsanalysen

• Bestätigungsanalyse unterbleibt oft aus Kostengründen verlässliche Daten aus Feldversuchen über Zuverlässigkeit von Schnelltestbefunden fehlen!

• negative Befunde werden prinzipiell nicht überprüft, keine Angaben über Häufigkeit falsch-negativer Befunde

• negatives Screeningergebnis sollte in Zweifelsfällen ebenfalls bestätigt werden (kein juristischer Bestand alleiniger Ergebnisse von Schnelltests)


Umgang mit Messergebnissen

• Untersucher häufig analytisch unerfahren blindes Vertrauen auf Schnelltests falsch-negative Ergebnisse („Proband clean“) falsch-positive Ergebnisse („Proband drogenabhängig“)

messtechnische Grenzen der Tests bewusst machen!(mangelnde Kreuzreaktivität gegenüber Konjugaten, mangelnde Verfügbarkeit von Kontrollmaterial für Konjugate, ...)

• positive Ergebnisse begründen lediglich einen Verdacht! Bestätigungsanalyse: Absicherung, Mängel erkennen! muss empfindlicher/spezifischer als Screeningtest sein beruht auf anderem Messprinzip (GC/MS, nicht IA vs. IA!)

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