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Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones, Clínica, Investigación y Cáncer T.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile. Concepción, 16 de Agosto de 2004

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Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones, Clínica,

Investigación y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.

Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

Concepción, 16 de Agosto de 2004

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¿Qué es la Citometría de Flujo?

Aplicaciones

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Flow Cytometry Publications/year

YEARS

00

300300

600600

0 13 28 79113

223

480611

811940

2,332

1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1991 19921989 1990 1993 1994

(*) Data taken from Medline search using the keywords: “flow Cytometry”(Agost 15th: 20:30 hrs)

1995 1996

3,483

3,479

2003: 5.588 2004: 3.205 (*)

1999: 4.2561998: 3.8891997: 3.613

2002: 5.3232001: 5.0252000: 4.771

3345

2899

2,713Papers2,4452700

2400

21002100 1,855

180018001,494

15001500 1,232

1,07812001200

900900

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¿QUE ES LA QUE ES LA CITO / METRIACITO / METRIADE FLUJODE FLUJO??

La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la “medición simultánea de

múltiples características físicas y químicas de células en

suspensión”

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¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA

CELULA?

1.- Su tamaño.2.- Su granularidad o complejidad

interna.3.- Evaluación de características químicas:

• Fluorocromos

• Anticuerpos conjugados con fluorocromos

FACS: Fluorescence activated cell sorter

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Relative Sizes of Biologicals

AmoebaLymphocyte

S.aureus5-8 µm

1 µm

15-30 µm

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Componentes• Sistema de Fluidos

• Sistema Optico:

• Fuente de luz

• Separación espectral

• Sistema Electrónico:

• Control mecánico, de luz y detectores

• Colección y análisis de pulsos

• Sistema Informático:

• Análisis y presentación de datos

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Flow Cell

Injector Tip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

Focused laserFocused laserbeambeam

Sheathfluid

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SISTEMAS DE UN CITOMETRO SISTEMAS DE UN CITOMETRO DE FLUJODE FLUJO

Sistema Optico:•Consta de uno o varios láseres, filtros, lentes y fotomultiplicadores.

•El láser produce una luz monocromática utilizada para la excitación de los fluorocromos.

Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

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PMT

PMT

PMT

PMT

DichroicFilters

BandpassFilters

Laser

1

2

3

4

Flow Cytometry OpticsFlow Cytometry Optics

Flow cell

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Lasers• Argon laser• He-Ne Laser

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Optical Collection systems

He-Cd Laser Argon Laser He-Ne Laser2nd Argon Laser

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Elite Cytometer with 4 Lasers

Water cooled argon laser

He-Cd laser

Air-cooled argon laser

Santa clause

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ANTICUERPOS MONOCLONALES

• Gran disponibilidad comercial

• Gran variedad de fluorocromos

• Precios accesibles• Pedidos vía Internet• Gran Calidad

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FLUOROCROMOSFLUOROCROMOS

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Fluorescein (FITC)EmissonExcitation

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Wavelength300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relat

ive In

tens

ity

Protein

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Phycoerytherin (PE)Excitation Emisson

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Protein

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Propidium IodideEmissonExcitation

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Relat

ive In

tens

ity

DNA

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Allophycocyanin (APC)Protein 632.5 nm (HeNe)

300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Excitation Emisson

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CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO

PREPARACIONDE LA MUESTRA

OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR

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CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOPREPARACION DE LA MUESTRA

Procedimiento St.:• 100 µL de sangre total • 10 µL del Ac. conjugado • Incubar por 10-15 minutos RT • Añade el lisador • Leer en un citómetro de flujo

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PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRA

• CALIBRACION• ADQUISICION• ANALISIS

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FITC Fluorescence

Mo1

CD4 CD8

CD8

CD45

leu11a

CD20 Tube

ID

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FORMA DE PRESENTACION DE DATOS

• Histograma• Gráfico de Puntos (Dot Plot)• Gráfico de Contorno (Countour Plot)• Gráfico Isométrico (3D)• Gráfico de Densidad (Density Plot)

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Citometría de flujo: mediciones

“GATE”

LM

G

SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN

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Density Dot Plot Contour Plot

Color of dots can give indication Identify subpopulationsof frequency of events with proper contour lines

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HISTOGRAMA(Un Parámetro)

coun

ts

Autofluorescenciay/o

control isotipo

M1

0 FL1

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One parameter frequency histogram

# of events forparticular parameter

establish regions and calculate coefficient of variation (cv)cv = stdev/mean of half peak

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ESTADISTICA DE CUADRANTES

(Dos Parámetros)

Autofluorescenciay/o

control isotipo

FL2

0 FL1

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ESTADISTICA DE CUADRANTES

(Dos Parámetros)

+,-

4

+,+

2

-,+

1FL

2

-,-

3

0 FL1

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CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES

• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . .

• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología

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EVOLUCION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Inmunología Celular

Aplicaciones enPatología

AnticuerposMonoclonales

Citometría deFlujo

CITOMETRIA CLINICA

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CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,

fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

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SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS

• Linfocitos T totales :CD3(+)• Linfocitos T Helper :CD3(+)CD4(+)• Linfocitos T Sup/Citot :CD3(+)CD8(+)• Linfocitos B :CD3(-)CD19(+)• Linfocitos Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)

• Relación Linfocitos T CD4/CD8

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Infección VIH-SIDA

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File: 111.003Acquisition Date: 23-Apr-Gate: G6Gated Events: 12430Total Events: 15000

Quad Events % Gated % TotalUL 20 0.16 0.13UR 1496 12.04 9.97LL 2028 16.32 13.52LR 8886 71.49 59.24

RELACION CD4/CD8 = 0.17File: 111.004Acquisition Date: 23-Apr-Gate: G6Gated Events: 12512Total Events: 15000

Quad Events % Gated % TotalUL 600 4.80 4.00UR 8866 70.86 59.11LL 1499 11.98 9.99LR 1547 12.36 10.31

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EXAM EN R ESU LTAD O R AN G O R EFER EN CIA

LE U C O C ITO S TO TA LE S 8.500 x m m 3

LIN FO C ITO S A B SO LU TO S 2.295 x m m 3

LIN FO C ITO S T (C D 3) 1.91683.50

x m m 3

% 59.4 - 84.6 %

LIN FO C ITO S B (C D 19) x m m 3

% 6.4 - 22.6 %

LIN FO C ITO S T (C D 4) 12.04276

%x m m 3

28.5 - 60.5 %

LIN FO C ITO S T C IT/SU P (C D 8) 70.861.626

%x m m 3

11.1 - 38.3 %

R E LA C IO N T C D 4 / C D 8 0.17 1.2 - 2.1

C E LU LA S LIN FO ID E S N K(N A TU R A L K ILLE R )

x m m 3

%

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INFECCION VIH SIDA

ACTIVACION DE LINFOCITOS T: CD38

• El aumento en la expresión de moléculas CD38 en LT CD8 es un fuerte indicador pronóstico de progresión hacia SIDA y muerte.

• Superior a:• Rto. LT CD4• Marcadores solubles• Combinación HLA-DR+ CD38+

J. Acquir Immune Defic Syndr Retrovirol 16:83-92, 1997Cytometry 26:1-7, 1996Cytometry 33:115-122, 1998

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INFECCION VIH SIDA

GIORGI et al.

• Carcaterizaron el número de moléculas CD38 en LT CD8:

1.- < 2.470 =======> PROGRESOR LENTO2.- 2.470 - 3.899====> PROGRESOR BAJO3.- 3.900 - 7.250====> PROGRESOR ALTO4.- > 7.250 =======> PROGRESOR RAPIDO

• Basado en la probabilidad de desarrollar SIDA dentro de 3 años

Cytometry 33:123-132, 1998J. Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 16:83-92, 1997

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Copyright Dennis Kunkel

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Copyright Dennis Kunkel

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CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,

fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

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INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS

“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos

celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”

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HEMATOPOYESISSTEM CELL

CFU-MLCFU-GEMM

LINFOCITO B LINFOCITO TCFU

ERITROIDEMEGACARIOCITO

CFUBASOFILO

CFUEOSINOFILO

CFU-GM

ERITROCITO BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO

CFU-L

PLAQUETAS MONOCITO

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RETENCION DE ANTIGENOS

• Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados

CD19 CD19

Transformación

MalignaCELULA

PRE-B NORMALCELULA

LEUCEMICA

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CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)

•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg

•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb

•LMA : -LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)

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Características normales

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• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda

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Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II:Común)

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CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,

fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

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Cellular Function

• Phagocytosis• Killing index of phagocytes• Intracellular cytokines• Calcium flux• Oxidative burst• Membrane potential

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Phagosome

O2

O2-

H2O2

NADPH + H+

NADP+

HMP

NADPHOxidase

GSSG

GSHGR GP

H2O2SOD

O2-

H+

H2O

Catalase

H2O + O2

PCB

SOD

PCB(Reduced GSH level)

PKC(PMA)

?

?+

O2-

OH.

Lipid Peroxidation

Phospolipase A2 activityLeukotrienes

H2O2

Human Neutrophil

Stimulant

PCB

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DCFH-DA DCFH DCFDCF

COOHH

Cl

O

O-C-CH3

OCH3-C-O

Cl

O

COOHH

Cl

OHHO

Cl

O

COOHH

Cl

OHO

Cl

O

Fluorescent

Hydrolysis

Oxidation

2’,7’-dichlorofluorescin

2’,7’-dichlorofluorescin diacetate

2’,7’-dichlorofluoresceinCellular Esterases

H2O2

DCFH-DA

DCFHDCFH--DADA

DCFHDCFH

DCF

H OH O2 22 2Lymphocytes

Monocytes

Neutrophils

log FITC Fluorescence.1

1000100101

0

20

40

60

coun

ts

PMA-stimulated PMNControl

80

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• Adulto normal• No estimulado :• Estimulado con PMA :

25.86 %76.98 %

Estallido respiratorio en Granulocitos

No estimulado

Estimulado

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Estallido respiratorioCaso clínico:

• Paciente de sexo femenino• 8 años• Infecciones dérmicas recurrentes por S.aureus.• Granulomas fríos en cara y piernas• Déficit parcial de IgA.

• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos.

• Inicio de terapia antibiótica con claritromicina 250 mg/12 hrs por 30 días.

• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos, post terapia.

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DCFA DCFADespués de terapia antibiótica

Estallido respiratorio en Granulocitos

No estimulado: 33.35 %

Estimulado: 42.66 %

No estimulado: 68.97 %

Estimulado: 57.48 %

DCFA DCFA

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DCFA DCFA

DCFA

Estallido respiratorio en Monocitos

No estimulado: 25.97 %

Estimulado: 57.06 %

No estimulado: 76.26 %

Estimulado: 76.81 %

Después de terapia antibiótica

DCFA

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CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes

• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,

fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares

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Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo.

Bacterias: Uso de Microesferas (beads)

*

*+

Anti Ig humana conjugada

*

Ag

+bead

Suero paciente

Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806Cytometry 1994;18:103-108

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Aplicaciones en Microbiología

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Aplicaciones en Microbiología clínica

Detección directa:

• Bacterias

• Hongos

• Parásitos

• Virus

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Light Scatter of Bacterial Spores

B.anthracis

B.subtilis

irradiated B.anthracis

SS

FS

Light scatter signals from a mixture of live B.anthracis spores, live B. subtilis spores and gamma irradiated B. anthracis spores.

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Microbial Identification Using Antibodies

Enumeration & identification of target organisms in mixed populations

Examples include:• Legionella spp. in water cooling towers• Cryptosporidium & Giardia in water reservoirs• Listeria monocytogenes in milk• E.coli O157:H7 in contaminated meat• Bacillus anthracis & Yersinia pestis biowarfare agents

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Agentes antibacterianos:• Microbiología tadicional (18-24 horas)• Citometría de flujo (pocas horas)• Evaluación de parámetros metábolicos:

• Potencial de membrana• Tamaño celular• Cantidad de ADN• Pruebas de suceptibilidad:

• Efecto bacteriostático• Efecto bactericida

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Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC

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Universidad de Concepción, ChileHospital del Trabajador Concepción, Chile

In vitro STUDIES OF pH EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND SIZE OF Helicobacter pylori: EPIFLUORESCENCE AND FLOW CYTOMETRY STUDIES.

pH 3

pH 7

pH 10

pH 3

pH 7

pH 10

Strain ATCC43504 Strain 747LO-Skolen, Helsingør, Denmark, July 4-7, 2002

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Susceptibilidad bacteriana

Combinación de:• Tamaño (FSC)• Granularidad (SSC)• Fluorescencia:

• Fluorocromos para ADN y ARN• Fluorocromos para ensayos metabólicos:

• Unión a proteínas• Potencial de membrana

Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195Cytometry 1997;27:169-178

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dep.

pol.

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dep.

pol.

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pol.

dep.

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• S. aureus

• Depolarizaciónen 1 hora.

• Potencial demembranapermanece disminuido.

Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834

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CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer

• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:

• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes

• Cáncer de Esófago• Linfoma

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ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINALEspectro de presentación.

Enfermedad de CrohnColitis ulcerosa

Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente

GranulomatosaCongestión ulcerativa

Cáncer

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ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

Enfermedad de CrohnColitis ulcerosa

Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):

• Células epiteliales C.P.A.

• Macrófagos Moduladores

• Linfocitos: TCD4 Perpetuación

Induction and Modulation of Gastrointestinal InflamationFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

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ENFERMEDAD DE CROHN COLITIS ULCEROSA

Proceso inflamatorio difuso continuo, limitado al colon

Afecta a todo el tracto digestivo

Inflamación superficial de la mucosa

Proceso transmural y granulomatoso

Presencia de pseudopólipos

Compromiso de mucosa discontinuo

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Colon normal

CrohnCrohn

C.U.

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Macrófagos intestinales:

• Están localizados en la región subepitelial de la mucosa.• Constituyen entre 10 a 20% de las células mononucleares

de la lamina propia. • Detección de su fenotipo:

• Inmunohistoquímica• Citometría de Flujo

• Existe diferencia entre las poblaciones de macrófagos encontrados en mucosa de EII y en personas que no la presentan

Fiocchi C. Am J Physiol.1997,273:G769-75 Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44

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Pacientes:

UNIVERSO (n=70)

SOSPECHA CLINICA (+)ENDOSCOPIA (+) (n = 52) GRUPO

TESTIGO(n = 18)

HISTOLOGIA NO ESPECIFICA

(n = 38)

EII POR BIOPSIA (n = 14)

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Método

Dgto. de EII: Clínico, endoscópico

e histológico Grupo de EII

Controles clínicos regulares Grupo testigo

Criterio de Exclusión

Consentimiento informado

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Endoscopía

HLA-DRCD33

CD16CD33

Materiales y Métodos

Biopsia2 x 2 mm Disgregación

mecánica

30` oscuridad

FACSCalibur Software Cell-Questv.3.3

Mínimo de 10000 eventos

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Pacientes según fenotipo HLA-DR en MI y diagnóstico de EII

Fenotipo MIEII-CH

100 (14)

0 (0)

100 (14)

p<0.001

Testigo

11.11 (2)

88.89 (16)

100 (18)

Total

65.71 (46)

34.29 (24)

100 (70)

HLA-DR(+)

HLA-DR(-)

Total

Sospecha Clínica

HNC

78.94 (30)

21.06 (8)

100 (38)

p<0.001

Subtotal

84.61 (44)

15.39 (8)

100 (52)

p<0.001

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación Histológica

Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.001

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Fenotipo MIEII-CH

85.71 (12)

14.29 (2)

100 (14)

P>0.05

Testigo

55.55 (10)

44.45 (8)

100 (18)

Total

74.28 (52)

25.72 (18)

100 (70)

CD16 (+)

CD16 (-)

Total

Pacientes según fenotipo CD16 en MI y diagnóstico de EII

HNC

78.94 (30)

21.06 (8)

100 (38)

p<0.05

Subtotal

80.76 (42)

19.24 (10)

100 (52)

p<0.05

Sospecha Clínica

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación Histológica

Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.05

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Especificidad

88.9

88.9

88.9

VPN

66.7

66.6

100

VG

85.7

82.0

93.7

Sospechaclínica

HNC

EII-CH

Indices de validación para HLA-DR en EII

Sensibilidad

84.6

78.9

100

VPP

95.7

93.7

87.5

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación HistológicaVPP: Valor predictivo positivoVPN: Valor predictivo negativoVG: Valor Global

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Especificidad

44.4

44.4

44.4

VPN

44.4

50.0

80.0

VG

71.4

67.85

62.5

Sospechaclínica

HNC

EII-CH

Indices de validación para CD16 en EII

Sensibilidad

80.8

78.9

85.7

VPP

80.8

75.0

54.5

HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación HistológicaVPP: Valor predictivo positivoVPN: Valor predictivo negativoVG: Valor Global

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CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer

• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:

• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes

• Cáncer de Esófago• Linfoma

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ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

•Tejido fresco o congelado.

•Tejido fijado en formalina -desparafinado.

Concordancia : 90 %.

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ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

TEJIDO FRESCO

Ventajas :

- Células enteras ( ADN, Ags. de membrana y citoplasma ).- Menor debris ( mejor resolución del histograma ).

Desventajas :

- No es posible la localización histológica de áreasde interés.

- Proceso inmediato o congelación.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

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ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

TEJIDO FIJADO EN FORMALINA Y DESPARAFINADO

Ventajas :

- Selección histológica de áreas de interés.- Permite estudio retrospectivo en individuos de curso clínico conocido.

Desventajas :

- Núcleos “desnudos”.- Fijación en formalina o microondas.- Mayor debris.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

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ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR

• Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica.

• Se obtiene una estimación de las fases delciclo celular.

• Se utilizan sustancias fluorescentes que tiene afinidad con el ADN (PI, DAPI, BrEt).

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999 J.L.C.N.

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CICLO CELULARCICLO DE VIDA DE UNA CELULA (24HRS)

MITOSISM

1 hrG2(4n) G0 (2n)

9 hr

4 hrPost Síntesis DNA

10 hrs

Síntesis ADN S G1 (2n) Pre-síntesis ADN

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

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HISTOGRAMA DE ADN OBSERVADO

4n2n

FASES G0G1

NU

ME

RO

DE

CE

LU

LA

S

FASE S FASES G2+M

CONTENIDO DE ADN

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

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Histograma Diploide o “Normal”

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Histograma Aneuploide

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Conferencia de Consensos en Citometría del ADNOctubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.

La ploidía del ADN se expresa como Indice de ADN ( IA ):

IA = G0G1 población en estudioG0G1 población de referencia

Población de referencia : tejido normal del cual se origina el tumor en estudio.

Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999

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Conferencia de Consensos en Citometría del ADNOctubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.

IA = 1 ADN diploide.IA > 1 ADN aneuploide.

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ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

ANEUPLOIDIA

•Grado de malignidad

•Pronóstico

Invasión

Metástasis

Evolución natural

Respuesta a tratamiento

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ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS

PROLIFERACION CELULAR

•Tiempo libre de enfermedad.

•Sobrevida.

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Conferencia de Consensos en Citometría del ADNOctubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.

Proliferación Celular :

Fracción Fase S tiene valor predictivo positivo

S+G2M no debería usarse.

Fracción Fase S específica de células tumoraleses el parámetro citométrico más relevante como

factor pronóstico independiente.

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ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR

• Estudio del comportamiento biológico de poblaciones celulares dentro de un tumor.

• Determinación de Fracción proliferativa (Fases S + G2M) de una población celular.

• Pronóstico y sobrevida de pacientes afectados de cáncer.

• Estudios de viabilidad.• Apoptosis.

Aplicaciones:

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MUESTRAS USADAS PARA ANALISIS DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR POR

CITOMETRIA DE FLUJO

I Suspensiones Celulares:• Líneas Celulares.• Sangre Periférica• Médula Osea• Fluídos con alta celularidad (Liq. ascítico,

peritoneal, etc.)II Tumores Sólidos:

• Tejido sólido• Aspirado Celular

III Tejidos Embebidos en Parafina

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Resultados en Cáncer Gástrico Avanzado :

PLOIDIA

FASE S

Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174

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Fase Ses un factor pronóstico independiente

en Cáncer gástrico Avanzado

Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174

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ESOFAGO

• Mucina 1• Ciclo celular• Ploidía de ADN• p53

Carcinoma superficial de

células escamosas

Marcadores pronósticos

• Endoscopy 2001;33(1):1-7• Int J Cancer 1999;84(3):251-7• Cancer 1999:85(11):2322-8

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LINFOMA

• Poblaciones Linfoides T• Poblaciones Linfoides B:

• Expresión de cadenas livianas tipo kappa• Expresión de cadenas livianas tipo lambda

• Ausencia de otros marcadores (CD5, CD10, CD34)

Helicobacter pyloriMALT

• Hematology 2001• BMC Gastroenterology 2 (WWW.biomedcentral.com/1471-230x/2/6)

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¿?

Disponible en:

www.oncoinmun.co.cl

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Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones, Clínica,

Investigación y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.

Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo

Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

Concepción, 16 de Agosto de 2004