CITRÁTOVÝ CYKLUS (Cyklus trikarboxylových kyselin, Krebsův cyklus).

Trocha historie

Hans KREBS (1932) studoval rychlost oxidace malých organických molekul ledvinovou a jaterní tkání. Zjistil, že oxidovány jsou jen sukcinát, fumarát, acetát, malát a citrát. Později zjistil, že tkáně tvoří oxalacetát z pyruvátu a oxalacetát je dále oxidován.

Albert Szent-Györgyi (Maďarsko) studoval totéž na holubích létacích svalech (měřil spotřebu O2). Zjistil, že přidáním kterékoliv z výše uvedených 4 C dikarboxylových kyselin se spotřebuje mnohem více kyslíku než je třeba k oxidaci jen přidané kyseliny. Závěr: tyto sloučeniny jsou v buňce limitující. Dále zjistil, že malonát (kom. inhibitor sukcinátdehydrogenasy) inhibuje oxidaci – kritický stupeň oxidace.

Trocha historie II

Carl Martius a Franz Knoop – citrát je převáděn na isocitrát a poté na -oxoglutarát.

Významný objev, neboť již bylo známo, že -oxoglutarát lze enzymově převést na sukcinát.

V tomto momentě byla objasněna dráha od citrátu k oxalacetátu – ne cyklus !!

Katalytický efekt sukcinátu a dalších dikarboxylových kyselin zůstával hádankou.

H. Krebs v roce 1937 – citrát se tvoří v suspenzi svaloviny po přidání oxaloacetátu, pyruvátu nebo acetátu.

Dráha propojena v CYKLUS !! H. Krebs se svým studentem mediciny Kurtem

Henseleitem objevil již v roce 1932 – močovinový cyklus.

Nobelovy ceny

Hans Adolf KREBS, 1953 za lékařství a fyziologii spolu F. A. Lipmannem, (objev koenzymu A).

Albert von Szent-Györgyi Nagyrapolt, 1937 za lékařství a fyziologii, ("for his discoveries in connection with the biological combustion processes, with special reference to vitamin C and the catalysis of fumaric acid„).

Charakteristika cyklu trikarboxylových kyselin

Lokalizován v matrix mitochondrie Probíhá za aerobních podmínek Amfibolický – katabolický i možnost

anabolických (syntetických) pochodů. Vstupuje dvouuhlíkatá sloučenina, která je

oxidována (dehdrogenována) za tvorby redukovaných koenzymů a oxidu uhličitého.

Z cyklu se uvolňuje jediná skladovatelná energie ve formě GTP.

Tvorba acetylCoA

Z pyruvátu – produkt glykolýzy. Z proteinů, resp. některých aminokyselin Z acylglycerolů (tuků) – odbouráváním

mastných kyselin tzv. -oxidací. Cyklus trikarboxylových kyselin je

ústředním metabolickým dějem. Spojují se v něm toky všech zdrojů

energie a jeho komponenty slouží jako základní kameny biosyntéz různých látek jako např. sacharidů.

Tvorba acetylCoA z pyruvátu

Za aerobních podmínek je pyruvát transportován do mitochondrie výměnou za OH- pyruvátovým nosičem (aniporter).

Pyruvát je v matrix oxidativně dekarboxylován pyruvátdehydrogenasovým komplexem.

Pyruvát + CoA + NAD+ = acetylCoA + CO2 + NADH

Ireversibilní reakce spojuje glykolýzu a cyklus trikarboxylových kyselin.

Uniport, symport a antiport

Pyruvátdehydrogenasový komplex z Escherichia coli

Citrátsynthasa, EC 4. 1. 3. 7 (lyasa)

Tvorba citrátu z oxaloacetátu a acetylCoA – aldolová kondenzace

Savčí enzym je homodimer (2 x 49kd). Poznámka: Synthasa je enzym katalyzující

spojení dvou molekul (jednotek) bez spotřeby ATP (ani jiného nukleosidtrifosfátu).

Synthetasy – starý název – nyní ligasy (spojení dvou molekul za spotřeby ATP), jako např. acetylCoA-ligasa.

Prevence hydrolýzy acetylCoA

Citrátsynthasa má dva substráty, uspořádaný sekvenční mechanismus. První se váže oxalacetát, který vytvoří vazebné místo pro acetylCoA.

Katalytické místo pro hydrolýzu thioesteru se vytvoří až po tvorbě citrylCoA.

AKONITASA, EC 4. 2. 1. 3systematicky: citrát (isocitrát)hydro-lyasa Izomerace citrátu na isocitrát přes cis-

akonitát. Akonitasa je protein obsahující železo

a síru (nehemový železnatý protein). Obsahuje čtyři železnaté atomy, která jsou komplexovány čtyřmi anorganickými sulfidy (4 Fe – 4 S) a třemi cysteinovými atomy síry. Tyto komplexy prochází oxidačněredukčními procesy bez výměny protonů. Jeden atom železa váže citrát nebo isocitrát přes karboxyl nebo hydroxyl.

Isocitrátdehydrogenasa EC 1. 1. 1. 41 (první oxidačněredukční reakce cyklu).

Produkuje první sloučeninu s vysokým potenciálem přenosu - NADH.

– Oxoglutarátdehydrogenasový komplex.

Enzymový komplex je homologní s pyruvátdehydrogenasovým. Úplně shodná je dihydrolipoyldehydrogenasová komponenta.

Sukcinyl-CoA-ligasa EC 6. 2. 1. 4

Sukcinyl-CoA je energeticky bohatá thioesterová sloučenina. Změna standardní volné (Gibbsovy) energie je – 33, 5 kJ.mol-1.

Štěpení je spojeno s fosforylací GDP. Savčí enzym přenáší fosfát na GDP, E. coli

na GDP i ADP. GTP je významný pro přenos signálu a

dále může být nukleosiddifosfokinasou převeden na ATP.

GTP + ADP = GDP + ATP

Regenerace oxaloacetátu

SUKCINÁTDEHYDROGENASA EC 1. 3. 5. 1 systematicky: sukcinát:ubichinonoxidoreduktasa. Katalyzuje oxidaci sukcinátu a ubichinonu za tvorby fumarátu

a ubichinolu. Je to železo-síra flavoprotein (FAD) Enzym je stejně jako akonitasa protein obsahující železo a síru.

Obsahuje tři druhy komplexů: 2Fe – 2S, 3Fe – 4 S, 4 Fe – 4 S. Složen ze dvou podjednotek – heterodimer

( 70 kD a 27 kD) Další odlišností od ostatních enzymů cyklu je, že je vázán ve

vnitřní mitochondriální membráně, hlavní část komplexu II dýchacího řetězce.

Je tak přímo včleněn do elektronového transportního řetězce. FADH2 nedisociuje z enzymu, ale je oxidován přímo kyslíkem. Enzym je kompetitivně inhibován např. malonátem.

FUMARASA, EC 4. 2. 1. 2 Systematicky: fumaráthydratasa

Katalyzuje stereospecifickou adici vody na fumarát za vzniku L – malátu.

Malátdehydrogenasa EC 1. 1. 1. 37

Reakce má pozitivní změnu volné energie. Oxidace L-malátu je poháněna spotřebou oxaloacetátu citrátsynthasou.

Stechiometrie citrátového cyklu

AcetylCoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O =

2 CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2 H+ + CoA

Rekapitulace cyklu

Do cyklu vstupují 2 C (acetylCoA), uvolňují se 2 CO2. Vytváří se čtyři páry vodíkových atomů při čtyřech

oxidacích. Uvolňuje se jedna molekula s vysokým potenciálem

přenosu fosfátu (obvykle GTP) Spotřebují se dvě molekuly vody. Jedna při syntéze

citrátu(hydrolýza citrylCoA) a druhá při hydrataci fumarátu.

Při další oxidaci NADH se získají 2, 5 ATP a z FADH2 1, 5 ATP.

Jedna molekula acetátu vytvoří 10 ATP !!! Do cyklu nevstupuje přímo kyslík, ale redukované

koenzymy musí být bezprostředně v mitochondrii reoxidovány přenosem elektronů na kyslík.

Regulace pyruvátdehydrogenasového komplexu.

Syntéza acetyl-CoA je klíčovým ireversibilním stupněm v metabolismu glukosy. Allosterická regulace + reversibilní fosforylace.

Acetyl-CoA nelze převést na glukosu. Acetyl-CoA inhibuje transacetylasovou

komponentu komplexu NADH inhibuje dihydrolipoyldehydrogenasu. Klíčovou regulací u eukaryot je fosforylace

komponenty E1 pyruvátdehydrogenasy pyruvátkinasou, odblokování fosfatasou.

Pyruvátdehydrogenasový komplex je vypínán při dostatku energie a biosyntetických meziproduktů.

Regulace citrátového cyklu

Primárně regulovanými enzymy jsou isocitrátdehydrogenasa a -oxoglutarátdehydrogenasa.

Isocitrátdehydrogenasa je allostericky stimulována ADP (ATP a NADH inhibují).

-Oxoglutarátdehydrogenasa – podobné s pyruvátdehydrogenasou, dále inhibují ATP, NADH a sukcinyl-CoA.

Citrátsynthasa – ATP je allosterický inhibitor, který zvyšuje Km pro acetyl-CoA. .

Citrátový cyklus jako zdroj biosyntetických prekurzorů (další snímek – schéma).

Oxaloacetát se využívá k syntéze aminokyselin a poté proteinů.

Jak se nahrazuje ? Savci nemají enzym pro přímý převod

acetyl-CoA na oxaloacetát. Anaplerotická reakce – pyruvátkarboxylasa. Při vyoké hladině energie probíhá

glukoneogeneze, při nízké, citrátový cyklus.

Důsledky přerušní metabolismu pyruvátu.

Nedostatek vitaminu B1 – thiaminu – nemoc beri-beri, také alkoholici (podvýživa). Nemoc má neurologické a srdeční symptomy.

Thiamindifosfát (TPP) je prosthetickou skupinou pyruvátdehydrogenasy,

-oxoglutarátdehydrogenasy a transketolasy.

Proč nedostatek TPP ovlivňuje v prvé řadě nervový systém ? Ten je závislý pouze na glukose, jiné tkáně mohou k zisku energie získávat energii např. z tuků.

Dalšími silnými inhibitory systému PD jsou arsenitan a rtuťnaté ionty. Příčinou je jejich afinita ke skupinám – SH. Mají stejné patologické projevy jako beri-beri.

Jako antidota se používají sloučeniny jako 2-merkaptoethanol nebo hlavně 2, 3-dimerkaptopropanol. Vyvinut po I. Světové válce jako antidotum proti lewisitu a nazván BAL podle British anti lewisite.

GLYOXYLÁTOVÝ CYKLUS

Cyklus umožňuje bakteriím a rostlinám růst na acetátu.

Dva odlišné enzymy od citrátového cyklu: Isocitrátlyasa, EC 4. 1. 3. 1 a malátsynthasa, EC 4. 1. 3. 2

U rostlin probíhá tento cyklus v glyoxysomech. Kombinací citrátového cyklu a glukoneogeneze může být sukcinát převeden na glukosu.

Bakterie a rostliny (např. E. coli, houby, řasy a prvoci) mohou tedy syntetizovat acetyl-CoA z acetátu a ATP za katalýzy acetát-CoAligasou, EC 6. 2. 1. 1

Zdroje energie některých bakterií

OH CH2

COO

NH3 CH2

COO+

OOC COO

[H]

COOH

O

[H]

Glykolát

Glycin

Oxalát

Transaminace

- 2

Oxalyl-CoA

Glyoxylát

2

-

-

--

-

Rovnice glyoxylátového cyklu a tvorby acetyl-CoA z acetátu u rostlin a mikroorganismů.

Acetát + CoA + ATP acetyl-CoA + AMP + PPi

Difosfát se hydrolyzuje na 2 orthofosfáty (ekvivalent 2 ATP).

-aminobutyrátová neboli GABA cesta (shunt).

Varianta cyklu trikarboxylových kyselin ve které je převeden -oxoglutarát na glutamát, buď transaminací nebo reduktivní aminací ( NH4

+ + -oxoglutarát + NADPH + H+ = Glu + NADP+ + H+ ). Glu je poté dekarboxylován za vzniku GABA, která se vrací do citrátového cyklu po oxidaci na sukcinát.

Tato metabolická cesta probíhá v mozku, pravděpodobně za účelem syntézy GABA. Dále je prominentní u rostlin.

CYKLUS DIKARBOXYLOVÝCH KYSELIN

CYKLUS DIKARBOXYLOVÝCH KYSELIN

Některé bakterie se živí výhradně glykolátem, glycinem nebo oxalátem, které převádí na glyoxylát. Ten je poté oxidován na CO2 a vodu za tvorby energie pro pohyb a biosyntézy.

V cyklu vznikají dvě NADH, které poskytují při oxidativní fosforylaci ATP.

V glyoxylátovém cyklu je glyoxylát hlavním substrátem a acetylCoA se regeneruje !!!

CYKLUS DIKARBOXYLOVÝCH KYSELIN

CH3

O

S CoA

OCOO

H

OH CH

COO

CH2

COO

Malátsynthasa

Malát

O COO

CH2

COO

O COO

CH3

Oxaloacetát

CO2

CO2

CO2

COO

CHOH

OH

COO

CH2OHH

OH

[H] + 2

COO

CH2-O-PH

OH

ATP

COO

CH2OHH

P - O

- [H]2- [H]2

Glyoxylát (2 moly)

Oxidativnídekarboxylace

Glyoxylátkarboligasa

-štìpení

Semiladehyd kys. tartronové

D-Glycerát

3-Fosfoglycerát

Syntéza sacharidù

2-fosfoglycerát

Syntéza regenerujícího acetylCoA