clase 16 espectroscopias
TRANSCRIPT
Técnicas Espectroscópicas
•La espectroscopia estudia la interacción entre la radiación y la materia.
• Un espectro es una representación gráfica de la distribución de intensidades de la radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia, en función de la longitud de onda de dicha radiación.
Es una radiación electromagnética Consta de un campo eléctrico y un campo
magnético los cuales oscilan en fase de manera perpendicular uno al otro y perpendicular a la dirección de propagación
Se la clasifica de acuerdo a la frequencia de su onda
Exibe propiedades tanto de onda como de partícula
2
Que es la Luz?
¿Cómo interactúa la luz con la materia?
• La radiación EM transporta energía y momento los cuales pueden ser transferidos a la materia con la que interactúa
• La energía que posee una molécula en un momento dado es la suma de varias contribuciones:
E = Eelectrónica + Evibracional + E rotacional + Etranslacional
Eelectrónica = energy transitions of electrons (UV-vis)
Evibracional = atomical vibrations about the mean center of chemical bonds (IR)
E rotacional = tumbling motion of molecule (microwave)
Etranslacional = displacement of molecules due to normal thermal motions of matter
E=ch/λ E=hν
Espectroscopía UV-VIS
GENERALIDADES:
basada en la medición de transiciones vibracionales entre el estado basal y el primer estado vibracional
∆E = E2- E1 = hυ
ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN EN EL INFRARROJO
son activas aquellas vibraciones que ocurren con cambio en el momento dipolar de la molécula
la región del espectro de infrarrojo comúnmente utilizada es la comprendida entre 1000-4000 cm-1
la unidad utilizada comúnmente es el número de onda (cm-1), la cual es proporcional a la frecuencia.
Interaction of IR radiation with matter
11
Assymmetric stretching Symmetric stretching
Twisting Wagging
Scissoring Rotation
-CH2vibrations
las vibraciones características de átomos unidos covalentemente son: “stretching” y “bending”
la frecuencia de vibración varía de manera inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la masa reducida de los átomos que vibran por una constante de fuerza
donde 1/µ = 1/MA + 1/MB
el número de modos normales puede calcularse como
3N-6
ESPECTROSCOPÍA DE IR APLICADA AL ESTUDIO DE PROTEÍNAS
* el espectro de IR de proteínas presenta un número de bandas características denominadas Amida que son debidas a la vibración de los átomos involucrados en el enlace peptídico
* la más utilizada para el estudio de la estructura de proteínas es la Amida I (C=O stretching)
Espectro de absorción al infrarrojo de B-FABP
Wavenumber (cm-1)
145015001550160016501700
Abso
rban
ce
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
t(0)t(3 hs)Amida I (')
Amida II (y cadenas laterales)
Amida II'
El problema del solventecondiciones fisiológicas: solución acuosaagua tiene una fuerte banda de absorción en el infrarrojo que coincide
con la banda Amida I
en H2O: films muy finos, para no saturar el detector (problemas para sustraer el buffer)
en D2O: la banda del solvente se corre a menor frecuencia. La Amida I´ se corre pocos cm-1, y la Amida II´lo hace unos 100 cm-1, superponiéndose con el DOH
Otros inconvenientes:vapor atmosféricocontraiones u otros contaminantes que absorban en el infrarrojo, distorsionando
los espectros (trifluoroacético)
de acuerdo a los distintos arreglos de puente hidrógeno (distintas estructuras secundarias) aparecerán bandas en distintas posiciones dentro de la Amida I
Asignación de bandas (cm-1) Conformación
en solución
de H2O en solución de
D2O hélice alfa 1653 1650 cadena beta antiparalela
1632 1632
1690 1675 cadena beta paralela
1630 1632
1645 1648 desordenadas 1656 1643
ν (cm-1)1600161016201630164016501660167016801690
Abs
orba
nce
B-FABP
ν (cm-1)
16001610162016301640165016601670168016901700A
bso
rba
nci
a
BSA α-lactalbumina
ν (cm-1)
16001610162016301640165016601670168016901700
Abs
orba
nce
* el proceso de deconvolución aumenta la resolución, me muestra como separadas dos bandas que antes aparecían juntas* ventajas: no modifica el área original de las bandas* desventajas: amplifica el ruido, problemas con el vapor atmosférico
* las distintas bandas componentes de la Amida I aparecen superpuestas, es necesario aumentar la resolución para poder resolverlas como bandas separadas:
Autodeconvolución:el espectro observado sería la convolución de dos funciones, la del espectro real
(E(υ)) por un factor (G(υ)) debido a distorsión, filtro, función forma de línea)M(υ) = G(υ) * E(υ)
Deconvolución del espectro de FABP: aplicando un factor k=2, bandas que originalmente son de 20 cm-1
aparecen con un ancho de 10 cm-1
* el área de las distintas bandas corresponde de manera bastante directa al porcentaje de las distintas estructuras secundarias presentes en la proteína
Análisis cuantitativo del espectro de proteínas:
Autodeconvolución, derivación y espectros diferencia
número y posición de las bandas que componen el espectro de la proteína
Espectro artificial: variando la proporción de los distintos componentes hasta lograr el mejor ajuste al espectro original
Derivación:Desventajas: * rápida degradación de la relación señal/ruido a medida que aumenta el orden de derivación* No mantiene el área de las bandas componentes.
Espectros Diferencia:* Utilizado principalmente para remover el solvente* Muy útil para estudiar cambios sutiles en la estructura de la proteína
Cambios conformacionales (estructura secundaria y terciaria) por efecto de:- fuerza iónica del medio- interacción con membrana- interacción con ligando- distintas condiciones desnaturalizantes (pH, urea, temperatura, etc)
ν (cm-1)
1500155016001650170017501800
Abs
orba
nce
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
α-lactalbumina pH 7α-lactalbumina pH 2
ν (cm-1)
160016201640166016801700
Abs
orba
nce
-0.05
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
B-FABP (alta fuerza iónica)B-FABP (baja fuerza iónica)
Efecto de la fuerza iónica del medio sobre el espectro de L-
BABP (pérdida de ligando)
Efecto del pH sobre el espectro de α-lactalbumina
Espectro de absorción al infrarrojo de B-FABP
Wavenumber (cm-1)
145015001550160016501700
Abso
rban
ce
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
t(0)t(3 hs)Amida I (')
Amida II (y cadenas laterales)
Amida II'
Cambios en la cinética de deuteracióndebida a distintos factores (interacción con membranas, interacción con ligandos, condiciones desnaturalizantes) implican cambios en la estructura terciaria de la proteína.
Efecto de la interacción con membranas sobre la velocidad de intercambio de protones amida
(pérdida de la estructura terciaria)
Amida I: se corre unos pocos cm-1.Amida II: se corre unos 100 cm-1. Está muy afectada por la banda de DOH (1400-1500 cm-1). Se superpone con cadenas laterales de aspártico y glutámico.
Los protones amida del enlace peptídico pueden intercambiarse con protones del solvente (deuterones en D2O).
Si estos protones están formando puentes hidrógeno, sólo intercambiarán en la fracción de tiempo en que estos estén disociados.
La péridda de estructura terciaria aumenta la velocidad con la que estos se intercambian.
Intercambio isotópico: frecuencia de vibración depende de la masa de los átomos que vibran
Cambios en la Amida I por Deuteración
ν (cm-1)
16001610162016301640165016601670168016901700
Abso
rban
ce
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
ν (cm-1)16001610162016301640165016601670168016901700
5 min15 min30 min60 min90 min180 min300 min360 min
Tiempo (min)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 100011001200130014001500
dife
renc
ia a
162
0 cm
-1
0
1
2
3
4
5
B-FABP B-FABP + POPG
Métodos para determinar la velocidad de deuteración• miden corrimiento de la amida I.• miden la relación banda Amida I/AmidaII.
Espectro de absorción al infrarrojo de B-FABP
Wavenumber (cm-1)
145015001550160016501700
Abso
rban
ce
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
t(0)t(3 hs)Amida I (')
Amida II (y cadenas laterales)
Amida II'
ESPECTROSCOPÍA DE IR APLICADA AL ESTUDIO DE LÍPIDOS
* Un espectro de lípidos puede separarse:- bandas debidas a los grupos polares
o 1700-1750 cm-1: C=O stretching (es la más intensa)o 1170 cm-1: C-O stretching (se puede acoplar con C-C stretching)o 1250 y 1085 cm-1: P=O stretchingo 900-800 cm-1: P-O stretchingo además, dependiendo si el lípido es una colina, una etanolamina, etc, aparecerán distintas bandas.
- bandas debidas a las cadenas hidrocarbonadas:o 2920 y 2850 cm-1: CH2 stretching (banda muy sensible a la relación trans-gauche)o 2956 y 2870 cm-1: CH3 stretching (sensible a esta relación)o 3010 cm-1 =C- stretch: (insaturados)o 1530-1350 cm-1: bending metilos y metilenos: el número y la posicion de las bandas depende de la conformacióno 1380-1190 cm-1: brinda información del largo de la cadena hidrocarbonada. En fosfolípidos se superpone con la banda del grupo fosfato (1220 cm-1)
El espectro del H2O se superpone con algunas bandas del lípido, pero todas las regiones se hacen accesibles comparando los espectros en H2O con los espectros en D2O. El D2O no afecta las posiciones de las bandas del lípido (no hay deuteración)
La utilización de lípidos completa o parcialmente deuterados permite el estudio de mezclas de lípidos (las bandas aparecerán a distintas posiciones debido a diferencias en la masa reducida)
Estudios de transiciones de fases: los cambios observados en la figura 2 son debidos a un aumento de conformaciones gauche
Fig 2Fig 1
How can light be manipulated?
By using polarisers the light can be reduced to propogate in planes and controlled states
23
Polariser
Light source
Target
Polarisers commonly used in sun glasses
24
s-polarised
p-polarised
ReflectionFresnel equations: Tells us the amount of reflected and refracted light
25
0 0/r ir E E=
[ ] [ ]0 0/ cos( ) cos( ) / cos( ) cos( )r i i i t t i i t tr E E n n n nθ θ θ θ⊥ = = − +
[ ] [ ]|| 0 0/ cos( ) cos( ) / cos( ) cos( )r i i t t i i t t ir E E n n n nθ θ θ θ= = − +
S-polarised:
P-polarised:
2R r=
reflexion coefficient
Reflectance
S-polarised: electric field of the light perpendicular to the plane of the diagram
P-polarised: electric field of incident light is polarised in the plane of the diagram
0 20 40 60 800.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
RsRe
flect
ivity
Angle of incident light / degree
Rp
θB = 53.57o
• Reflectividad calculada por las ecuaciones de Fresnel
Interfase Aire-vidrio Interfase Aire-agua
27
Positive point charge near a surface:pulls the free electrons toward the surface
Net result is a small buildup of negativecharge at the surface of the metal
The electric field is perpendicular to thesurface at all points, and ends right atthe excess charges at the surface.
Note that can not be any electric field withinthe interior of a conductor!
Outside of the surface, the electric fieldproduced by this redistribution of charges isidentical to what would be produced bya single negative charge equal in magnitudeand located a distance “R” beneath the surface of the metal. This fictitious charge is calledthe “image” charge.
El efecto ”imagen”
28
Right at the interface, the electric field parallel to the surface is zero everywhere! The image dipole cancels the “real” dipole
Dipole parallel to the surface plane
Real dipole
Image dipole
µimage
µ0
El efecto ”imagen”
29
Dipole perpendicular to the surface plane
µeffective=2µ0
µ0
µimagen
Image dipole is oriented in the same direction as the original dipole Total effective dipole moment is twice what would otherwise be expected – the presence of the metal enhances the molecular dipole
Dipolo Real
Dipolo imágen
El efecto ”imagen”
30
Sólo los modos vibracionales que poseen un dipolo de transicion perpendicular a la superficie puede ser observado sobre superficies metálicas
• Esto no se aplica a moleculas adsorbidas a materiales aislantes o semiconductores• Solo se aplica a moleculas adsorbidas directamente a la interfase
Regla de Seleccion superficial
Reflectividad del haz de luz IR (2900cm-1) en la interfase sólido-aire
0 20 40 60 800.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 20 40 60 800.00000.00050.00100.00150.00200.00250.00300.0035
<E(z
=0)>
2 /<E
0>2
Angle of incident light / degree
S-
p-
φ = 80ointerfase Air-oro
Angle / degree
<E(x
y)>2 /<
E 0>2 p (xy)
0 20 40 60 80
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
s-p(xy)-
p-
<E(z
=0)>
2 /<E
0>2
Angle of incident light / degree
Si-air interface φ = 60o
p(z)-
Material φmax / degree <E(z=0)>2/<E0>2
Au 80.4 1.83Pt 73.0 1.56Ge 59.4 0.69Si 60.2 0.61
ZnSe 58.5 0.48
Reflectividad del haz de luz en la interfase agua-aire
0 20 40 60 80
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
s-p(xy)-
p-<E
(z=0
)>2 /<
E 0>2
Angle of incident light / degree
Air-water interface
p(z)-
Modulación de la intensidad a lafrecuencia ωi introducido por elinterferómetro:
Modulación de la polarización a ωminducido por el modulador fotoelástico.
PM-IRRAS(Espectroscopia de absorción-reflexión infrarroja con modulación de la polarización)
))(()())((
00
02
spsp
sp
RRJRRRRJ
CS−Φ++
−Φ=
)0(
)0()(
SSS
S d −=∆
)2cos()()])(([ 002 tIRRJCI misp ωω−Φ= −−
)()])(()[( 000 ispsp IRRJRRCI ω−Φ++= ++
-0.004
0.000
0.004
0.008
0.012
5mN/m15mN/m35mN/m
∆S/S O -0.02
0.00
0.02
0.04
5mN/m15mN/m35mN/m
νsCO1743
νasPO-21253
νsPO-21084
δCH21460
PE-PEG1000
-0.010
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
5mN/m15mN/m30mN/m
Número de Onda (cm-1)
10001200140016001800
-0.004
0.000
0.004
0.008
0.012
0.016
5mN/m15mN/m32 mN/m
PE-PEG 5000
PE-PEG350
dpPE
νsC-O-C1095
1273
νasPO-21280
1280
νasC-O-C1126
νasPO-2
1273
1273
νasPO-21265
νb(NH3+)1540
νas(COC) + rs(CH2)
νas(COC) νs(COC)
ν(CC) − νas(COC)
1100 1000
Monocapas de PE-PEGs:análisis por PM-IRRAS
Resonancia Magnética Nuclear
De Mayor a ……
LES HOUCHES, France, 1000 MHz, 23.5 T
Pacific Northwest National Laboratory, Washington 800 MHz, 18,8 T
Pacific Northwest National Laboratory, Washington 800 MHz, 18,8 T
Yokohama Research Institute900 MHz, 18,8 T
…… a menor!
I Nucleídos
0 12C 16O
½ 1H 13C 15N 19F 29Si 31P
1 2H 14N3/2
11B 23Na 35Cl 37Cl5/2
17O 27Al
3 10B
Núcleos con momentos cuadrupolar
Átomos plausibles de ser estudiados por RMN
ω0 = frecuencia de Larmorµ = vector de magnetización nuclear
I= Momento angular
Cuantización Espacial
I = ½ , 2 estados Posibles I = 2, 5 Estados Posibles
Números cuánticos de Spin I
Números de Estados Posibles 2I + 1
I = (I (I + 1) (h/2π))1/2
Todo núcleo atómico poseeun momento angularintrínseco I y un momentomagnético asociado μ Laimagen clásica de unnúcleo es de una esferacargada rotando sobre uneje. Ambos momentos sonmagnitudes vectoriales
Magnetización Nuclear
µ = γ . I E = - µ . H E = - µz . Hz
z
H µµz
Elemento
γ (107T-1s-1) ν (MHz)9,4 T
Abun. (%)
1H 26,75 400 99,9852H 4,11 61,4 0,01513C 6,73 100,6 1,10814N 1,93 28,9 99,6315N -2,71 40,5 0,3717O -3,63 54,3 0,03719F 25,18 376,5 10029Si -5,32 79,6 4,731P 10,84 162,1 100
MomentoMagnético
RazónMgtogrica
MomentoAngular
z
xy
H0 µ
z
xy
H0µ
Efecto del campo Magnético
Ec. de Larmor (ω = γH)
SUVsEgg PC MLVs
Tip Sonication
Egg PC film D2O
Vesicle Formation
pNP
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
abO-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
abO-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
abO-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
abO-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
O-
O2N
HH
H H
ab
1D 1H-NMR (Chemical Shift)
Rotating Frame Overhauser Effect
Spectroscopy (ROESY)
Longitudinal relaxation time (T1)
Varian Inova 500 mHz
Materiales y Métodos
PPM 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0
Assigment PNPH (pH 4.4)
PNP-
(pH 10.2)
Ha(CH)2≈C-O- 7.253 7.21
Hb(CH)2≈C-NO2 6.065 5.68
a b
PNPH
PNP-
PPM 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0
b a
PNPH
PNP-
Assigne_ment
Chemicalgroup
PNPH(pH 4.4)
PNP-
(pH 10.2)
1Ha (CH)2≈C-O- 7.253 7.211Hb (CH)2≈C-NO2 6.065 5.68
ASIGNACIÓN PARA LOS PICOS DE 1H DE PNP-
Asignación de Picos
Desplazamiento Químico (ppm)
A CH3 0
B (CH2)n 0,40
C β-CH2 0,70
D CH2C=C 1,14
E Α-CH2 1,48
F =C-CH2-C= 1,88
G N+(CH3)3 2,35
H CH2N+ 2,79
I O3POCH2C 3,13
J O3POCH2CHO 3,40
K CH2OCO 3,53
L CH=CH, CHOCO 4,41
TABLA 1: Asignación de picos de resonancia a los hidrógenos de la EPC en el espectro 1H-RMN del PNP
Fig. A
1H-NMR spectra (500 MHz) of EPC 65 mM (SUVs) and PNP:EPC (1:1.6mol % in the membrane) and PNP, pH10.2, 37ºC
a b
SEPARACIÓN ESPECTRAL ENTRE EL EPC Y PNP
MO
Tiempo
Medidas de tiempos de relajación longitudinales (T1s)
Hidrogen peack assignemtent
G H I J K E C B D L F A
C.S
. (p.p.m.)
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
T 1 (s
eg)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 C.S.T1 EPCT1 EPC+pNPH
**
* *
*
* *
EFECTO DEL PNPH EN EL DQ Y EN LOS VALORESDE T1 EN LOS 1HEPC
The C.S. showed a preferential location at the glycerol level. The T1 onlyshowed a significant change for a CH2 (C) located near the carbonyl groups.
Hidrogen peack assignemtent
G H I J K E C B D L F A
C.S
. (p.p.m.)
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
T 1 (s
eg)
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4C. S.T1 EPCT1 EPC+pNP-
EFFECT PNP- ON CS AND T1 VALUES OF 1HEPC
C.S. didn’t show significant information. But the T1 of protons in the outerpolar head-group region became more restricted/immovilized.
Espectroscopia de Fluorescencia
Esquema de un Espectrofluorómetro
• Anisotropía de fluorescencia. Aplicación al estudio dedinámica de membranas
• Transferencia de energía inducida por resonancia. Medida dedistancias moleculares
• Microscopía de fluorescencia.
• Inmunofluorescencia
Efecto de la polaridad del solvente
Exposición al solvente de Trp en una proteína
FLUORESCENCIA EN MODELOS DE MEMBRANA
Efecto de la temperatura y el contenido de colesterol
Espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica
EPR
Microondas (GHz) ⇒ Energía = transiciones rotacionales moleculares
Sustancias Paramagnéticas con espines electrónicos desapareados:Radicales LibresSólidos cristalinosIones de metales de transición y tierras rarasSistemas en estado triplete
Resonancia: moléculas o iones paramagnéticos = e- desapareados
e- + H (campo magnético) = momento magnético, con las componentes orientadas en la dirección del campo.
El espin electrónico asume sus dos estados permitidos ⇒ (±1/2)
La energía entre los 2 estados permitidos = Energía de Zeeman E= ±1/2 g β H
La separación entre los niveles de Zeeman aumenta linealmente con H.
∆E= g β H
Entonces, la transición entre niveles puede ser inducida por un H de ν adecuada
∆E= h ν = g β H
Resumiendo: Los electrones desapareados poseen un momento magnético de espín que se orienta en presencia de un campo magnético.Si la energía es la adecuada para la resonancia, podrá haber absorción y transición entre los subniveles.
Fuente de microondas Cavidad
Imán
Marcador de Espín: molécula que posee un grupo paramagnético, cuyo comportamiento frente al H se ve afectado por el ambiente en donde se encuentra.
El más usado es el Nitróxido Posee un espín nuclear del nitrógeno (I) = 1Se produce una interacción entre el espín electrónico y el espín nuclear ⇒ la absorción se desdobla según 2I+1=3 y el espectro muestra 3 lineas, esto es el desdoblamiento hiperfino. Estas 3 líneas corresponden a las 3 posibles orientaciones del momento magnético nuclear del nitrógeno m = +1, 0, -1
MEDIDAS ESPECTRALES
A|| - A⊥
Azz - ( Axx + Ayy ) / 2S =
Parámetro de OrdenParámetro Empírico de Orden y Movilidad
h+1 /h0
POPC 5 mM
12-SASLO
5-SASL2 mol%
MLVs marcados
+ Buffer Acetato5 mM, pH 5
Filme
Ejemplo: Efecto de Mentol en Membranas Sinaptosomales
Colesterol25 mol%
Mentol
Mentol mM
0 5 10 15 20 25 30
S
0.5
0.6
Mentol mM
0 5 10 15 20 25 30
% ∆
h+1/
ho
0
10
20
30
Espectro de EPR de 16-SASL en una dispersión acuosa de citocromo oxidasa (0.24 mg fosfolípido / mg proteína) a 24°C. (Adaptado de Jost et al., 1973a)
Interacción β-ciclodextrina (40mM) - spin label (0.15 mM)
Temperatura (ºC)
0 10 20 30 40 50
a 0
13.8
14.0
14.2
14.4
14.6
14.8
15.0
15.2
15.4
5-SASL 12-SASL
)2)(3/1( ||0 ⊥+= AAa eff
Ejemplo: Interacción β-ciclodextrinas con marcadores de espín.Polaridad del entorno del marcador de espín.
H (Gauss)
3.25e+7 3.30e+7 3.35e+7
Inte
nsid
ad
-1e+10
0
1e+10
2e+10
β−CD Buffer