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GENOMA E NUTRIÇÃO
CLAUDIA MARIA MEIRELLES MARCHINI
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Genoma
• É a informação genética
pertencente a uma célula ou
um organismo
• Genoma humano apresenta
aproximadamente
25 mil genes
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Projeto Genoma humano
• Mapeamento do genoma humano
• Identificação dos nucleotídeos
• Aproximadamente 1,5% do genoma codificam proteínas
• Seqüências genoma que não codificam proteínas consistem
RNA, seqüências regulatórias, íntrons e “junk” DNA
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Ômicas: novas ciências* Genoma
* Transcriptoma
* Proteoma
* Metaboloma
* Nutrogenoma
* Lipidoma
Outras Ômicas…
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Interação Nutriente – Gene• Objetivo: estabelecer dietas personalizadas com base no
genótipo para promover a saúde diminuindo os riscos de
doenças crônicas (cardiovasculares, diabetes, câncer...)
• É fundamental a aplicação na área da nutrição das
ferramentas da genômica funcional para a análise do
transcritoma, do proteoma e do metaboloma.
• Aplicabilidades: cultura de células, modelos
experimentais em animais, estudos pré-clínicos e clínicos
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Ciências Nutricionais• Galactosemia é um defeito genético na enzima GALT, levando a um
acúmulo de galactose no sangue
• Fenilcetonúria é um defeito genético na enzima fenilalanina-
hidrolase, levando a um acúmulo de fenilalanina
• Deficiências de vitaminas como a B12, ácido fólico, B6, C, E, ferro
ou zinco causam dano no DNA quebrando a dupla-fita
• A deficiência de nutrientes pode explicar porque ¼ da população
dos Estados Unidos que não consome as 5 porções diárias
recomemdadas de vegetais e frutas tem um risco 2 X maior de
desenvolverem câncer
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Nutrigenômica
“Caracteriza uma nova visão do estudo de alimentos e da pesquisa
nutricional na qual a avançada tecnologia funcional genômica é
usada, ao lado de técnicas nutricionais e bioquímicas, para
determinarem os mecanismos pelos quais os alimentos e seus
componentes individuais modulam processos que ocorrem nos
tecidos do corpo humano”.
Instituto de Pesquisa de Alimentos, 2001
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Abordagem molecular: Estudo entre as interações dos nutrientes com os genes e o efeito na saúde do indivíduo
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Nutrientes atuam em transdução de sinal
Chá verde
Polifenol
11-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)
Inibe NF-kappaB fator de transcrição
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Porque individuais respondem de forma
diferenciada a uma dieta especifica?
Variabilidade genética!
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Antes
* Durante as cercas de 1016 mitoses possíveis durante uma vida
humana, em cada LOCUS podem ocorrer 108 a 1010 mutações
Mutações
Antes Depois
Luzultra-violeta
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Mutações* Alteração permanente e transmissível na seqüência de nucleotídeos
em um gene que pode causar a alteração ou a perda da função normal.
| | | | | | | | |A T C G T A C G G
T A G C A T G C C
T A G C C T G C C
T A G C A T G C CA T C G T A C G G
A T C G G A C G GT A G C C T G C C
A T C G T A C G G
U A G C C U G C CU A G C A U G C CTranscrição
Replicação
RNA:
A T C G T A C G G
Proteína:
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Tipos de Mutação
Sem Sentido
TAC CAC GTG ATA
AUG GUG CAC UAU
MET VAL HIS TYR
TAC CCC GTG ATT
AUG GGG CAC UAA
MET GLY HIS STOP
... !
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Tipos de Mutação
Sentido Trocado
TAC CAC GTG CAC
AUG GUG CAC GUG
MET VAL HIS LEU
TAC CCC GTG CAC
AUG GGG CAC GUG
MET GLY HIS LEU
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A estrutura da proteína permite que sua função seja executada. Alteração em sua estrutura afetará sua especificidade ou atividade.
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Radiação Ionizante
* Formação de dímeros de Pirimidina
* Interrupção da replicação
* Seqüências truncadas
Modificações das Bases Nitrogenadas
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Mutagênicos Químicos
* Alguns mutagênicos químicos modificam a estrutura molecular das bases.
* No caso dos agentes alquilantes, são adicionados grupos etil ou grupos metil
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Mutagênicos Químicos
Ferguson & Philpott. The annual Review of Nutrition, 28:12.1-12.17, 2008.
Structures of dietary mutagens
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Aflatoxina B1
* Produzida pelo fungo Aspergillus flavus
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Aflatoxina B1
* Populações expostas a esta molécula tem alto índice de hepatocarcinoma
* 50% dos casos de hepatocarcinoma apresentam mutação no gene p53
GC TA
Transversão
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Polimorfismo
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
* Variação em uma seqüência de DNA em um único nucleotídeo
* Deve ocorrer em ao menos 1% da população
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Como são detectadas as diferenças entre os indivíduos?
• O brócolis possui algum efeito na expressão genética na dieta?
• Experimento por um mês utilizando a Dieta A (enriquecida por Brócolis) e Dieta B (ausência de Brócolis outras hortaliças semelhantes)
• Sujeitos: gêmeos idênticos saudáveis
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Microarranjo
• DNA microarray, DNA chip, genome chip,
expression chip e gene array
• São vendidos comercialmente por empresas
de biotecnologia
Aproximadamente 10.000 pontos/cm2
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DNA Microarray
Cada ponto representa um gene distinto
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Extração RNA
• O RNA é separado com auxílio de uma centrífuga , a
velocidade alta separa os componentes da solução
dependendo do tamanho ou densidade
RNA
Proteína, DNA e outros componentes
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RNA total
•RNA mensageiro
•RNA transportador
•RNA ribossômico
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Isolamento do mRNA
• Colunas contendo pequenas esferas recobertas por
poli-T que se ligam somente com mRNA que
possuem cauda poli-A
Pequenas esferasconstituem a coluna
Aumento de uma esfera
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Retenção do mRNA na coluna
• As fitas de mRNA
ficaram retidas nas
esferas poli-T por meio
das caudas poli-A
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Recuperação do mRNA
• Como liberar o mRNA das esferas?
– O pareamento de bases entre moléculas de DNA
é comprometido por concentrações de sais e pH
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Produção de uma cópia de cDNA fluorescente
• Montagem de uma fita complementar de
DNA oposta a molécula de mRNA
Solução Fluoresncente verde
Solução fluorescentevermelha
Dieta BDieta A
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Conteúdo da solução fluorescente
• Primers Poli-T: unem-se as
cadeias poli-A dos mRNA
• Transcriptase reversa: uma
enzima que sintetiza a fita de
cDNA
• Nucleotídeos fluorescentes:
serão incorporados na nova
molécula de cDNA
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Aplicação do cDNAs marcados com fluorescência
• Transcriptase reversa produz cDNA fluorescente e
moléculas de mRNA foram degradadas com RNAses
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cDNAs vermelhoshibridaram comeste ponto
cDNAs verdeshibridaram comeste ponto
cDNAs que não hibridaram
cDNAs vermelhose verdes hibridaram Com este ponto
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Leitura da placa de microarray
• O scanner lê um fluoróforo
por vez;
• O programa faz uma
sobreposição das imagens;
• O importante são os pontos
verdes e vermelhos isolados
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Exemplo de aplicação do microarray
• Uma linhagem celular de carcinoma de cólon
foi tratada com sulforafona
• Composto bioativo de brócolis
Resultado:
• Indução da expressão do 106 genes
• Inibição da expressão de 63 genes
– Atividade anticarcinogênica
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Limitações• Necessidade de quantidades significativas de tecido para o
isolamento de mRNA.
• Necessidade de repetições para obter valor significativo
• Alto custo da técnica
• O tratamento com nutrientes específicos promovem,
geralmente, pequenas alterações na expressão gênica,
dificultando a análise dos resultados
• Baixa reprodutibilidade utilizando-se plataformas de
diferentes fabricantes
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Doença inflamatória intestinal (IBD)
• Inflamação crônica do trato gastrointestinal
– Colite ulcerativa (UC)
– Doença de Crohn (CD)
• Sintomas: diarréia, cólica abdominal, febre e sangramento
• Tratamento: remédios que controlam os sintomas, mas não
curam a doença; dieta controlada
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Doença inflamatória intestinal (IBD)
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Genes envolvidos no estabelecimento da IBD
• Reconhecimento de bactérias
• Na modulação da resposta inflamatória
• No transporte de moléculas na mucosa
intestinal
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Proteína NOD2
Proteção contra bactérias invasivas
I) Genes envolvidos no reconhecimento de bactérias
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Afetam Resposta Imune
Autoimunidade
II) Genes envolvidos na modulação da resposta imunológica
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Transdução de Sinal Intracelular
III) Genes envolvidos no transporte de moléculas na mucosa intestinal
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Dieta na doença inflamatória intestinal
• A IBD pode ser controlada com uma dieta elemental, que
parece modular a ação de citocinas e mudar a microbiota do
intestino
• Desafios: não existe um grupo de alimentos que seja
benéficos ou causem danos a todos os pacientes. A dieta de
eliminação é usada para se verificar as necessidades
individuais
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Perspectivas IBD
• Omega-3 pode reduzir os sintomas da inflamação; Chá verde pode regular a expressão de proteínas transportadoras
• Porém o gene de interesse deve estar funcionando normalmente no paciente
• A identificação dos genes levam ao desenvolvimento da doença e assim permitir uma abordagem mais específica
• Dietas específicas poderiam aliviar os sintomas e curar até 90% dos pacientes
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Concluindo
• Nutrientes alteram processos moleculares, expressão
genética e metabolismo
• Variações genéticas individuais podem influenciar como os
nutrientes são assimilados
• Ferramentas moleculares estão sendo empregadas para
examinar a resposta individual aos nutrientes
• A nutrigenômica irá desenvolver dietas personalizadas para
prevenir o surgimento de doenças e manter a saúde humana
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OBRIGADA PELA ATENÇÃ[email protected]