clonado (17 de marzo)
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BiotecnologiaTRANSCRIPT
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1-Aislamiento de genes-(Clonado molecular)
2015
Salvador Domingo Felipe Jacinto Dal i Domnech (1904-1989)
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GENES AISLADOS
Clulas eucariotas(cultivo)
Clulas procariotas (cultivo)
Animales Vegetales
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GENES AISLADOS
Clulas eucariotas(cultivo)
Clulas procariotas (cultivo)
Animales Vegetales
VECTOR
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GENES AISLADOS
Clulas eucariotas(cultivo)
Clulas procariotas (cultivo)
Animales Vegetales
VECTOR
Plasmido Virus
----SISTEMA BIOLGICO----
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3COMO SE OBTIENE UNGEN AISLADO ???
Clonado Molecular
~1973Reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR)1983
Sntesis Qumica~ 1980
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
1983
COMO SE OBTIENE UNGEN AISLADO ???
Clonado Molecular
~1973
Sntesis Qumica~ 1980
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4Deteccin, qu sonda usamos
???
Cromosoma
Proteina
Gen
vector
Clula
LIBRERAS GENMICAS
Eucariota
ProcariotaIntrones ?
A B C D E
Clonar en un vector
A B C D E
Digerir cromosoma
Cromosoma
Introducir el vector en E. coli
Librerias en colonias (o fagos)
Cpsula de Petri
SISTEMA BIOLOGICO ?
Cmo detecto ??el gen
( el DNA)
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5LIBRERAS DE cDNA
A B C D E
Clonar en un vector
Introducir el vector en E. coli
Libreria en colonias
Clula
Aislar mRNA
mRNA cDNATranscripcin reversa
Cpsula de Petri
Eucariota
ProcariotaIntrones ?
SISTEMA BIOLOGICO ?
Cmo detecto ??el cDNA
LIBRERIAS DE EXPRESION
A B C D E
Cada colonia produce una proteina diferente
mRNA cDNATranscripcin Reversa
Fragmento de cDNAPromotor
Introducir el vector en E. coli
Cpsula de Petri
region codificante sin intrones, mayoritariamente bacterias
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Paul Berg, es considerado el padre de la rama de la bioqumica conocida como: ingeniera genticaBioqumico estadounidense. Recibi el premio Nobel de Qumica en 1980 por sus estudios sobre los cidos nucleicos, en especial por el cido desoxirribonucleico (ADN) recombinado, galardn que comparti con Walter Gilbert y Frederick Sanger. Paul Berg fue testigo de primera mano en la historia de la investigacin sobre el ADN recombinado, de la que ha sido uno de sus protagonistas desde joven. Se granje muy pronto el reconocimiento de la comunidad cientfica al describir los pasos clave en los que el ADN produce las protenas.
Premio Nobel en Qumica, 1980
Paul Berg (1926)
A mediados de la dcada de los 70 la Academia Nacional de las Ciencias de USA le encomend revisar la seguridad de la tecnologa del ADN recombinado. La respuesta fue la denominada "Carta Berg", donde se peda una moratoria en la investigacin sobre el ADN recombinado hasta que se consiguiese resolver los problemas de seguridad. Fue uno de los organizadores de la Conferencia Asilomar (foro internacional sobre la tecnologa del ADN recombinado, celebrada en febrero de 1975) que reuni a cien cientficos relevantes para discutir los riesgos potenciales de los experimentos para ensamblar genes. Como resultado de estas discusiones se public, un ao ms tarde, la Directiva de los Institutos Nacionales de Salud, un hito en la autorregulacin de los investigadores cientficos. No obstante, el grupo de investigacin de Berg sigui trabajando con las tcnicas de ADN recombinado
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Cortar el DNA
Separar los fragmentos de DNA
Producir cantidad de c/u de ellos
Identificar el fragmento que contiene el gen
Pasos para el clonado molecular de genes:
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7ENZIMAS DE RESTRICCIN TIPO II
EcoRI: gives sticky ends EcoRV: gives blunt ends
Cortan en sitios especficos dentro de secuencias palindrmicas
EcoRI EcoRIV
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8Sitios de reconocimiento y corte de algunas enzimas de restriccin Tipo II
Enzima Secuencia de reconocimiento Microorganismo AluI AGC*T Arthrobacter luteusBamHI GGATC*C Bacillus amyloliquefaciens HBglI GCCNNNNNNGGC Bacillus globigiiBglII A GATCT Bacillus globigiiEcoRI G AA*TTC Escherichia coli RY13EcoRII CC*(TA )GG Escherichia coli R245EcoRV GA*T ATC Escherichia coli J62P4G74HaeII RGCGC Y Haemophilus aegyptiusHaeIII GG C*C Haemophilus aegyptiusHindIII A* AGCTT Haemophilus influenzae MspI
C* CGG Moraxella speciesPstI CTGCA* G Providencia stuartii 164PvuII CAG C*TG Proteus vulgarisSalI G TCGAC Streptomyces albus GTa q I T CGA* Thermus aquaticusXhoI C TCGAG Xanthomonas holcicola
(A* is N 6 -methyladenine and C* is 5-methylcytosine). R, Y, and Nrepresent a purine nucleotide, a pyrimidine nucleotide, and any nucleotide, respectively.
DNA ligasa
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9VECTORES DE CLONADO
Vector Max. tamao del inserto (kb)
Plsmido 10 - 15Fago l 25Csmido 35 - 45Fago P1 80 - 100BAC 50 - 300YAC 300 - >1500
Cunto DNA puede llevar ?
Cmo ingresa a la clula?
Qu destino intracelular ?
Cmo se selecciona ?
Qu cantidad (Nro de copias) ?
DNA
DNA
PLASMIDOS
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10
Plsmido
Amp
E. Coli
Ampicilina
Ampicilina
Enz
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BACTERIFAGO LAMBDA
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BACTERIOFAGO LAMBDA (l)
secuencias cos
El DNA puede ser empaquetado in vitro para formar partculas virales
PLASMIDOS FAGOS
Fcil manipulacin
Acomoda hasta 10 Kb
Transformacin relativamente eficiente
Colonias
Manipulacin complicada
Acomoda 20-40 Kb
Transfeccin muy eficiente
Placas
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CONSTRUCCIN DE UN BANCO DE CLONES (GENOMICO) (a)
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CONSTRUCCIN DE UN BANCO DE CLONES (b)
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RASTREO DEL BANCO PARA DETECTAR EL GEN DE INTERES
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Aislar el clon deseado
Infectar bacterias frescas
Membrana
Cpsula original
Aislar DNA del fago
Anlisis del DNA
Enz. restriccin
OBTENCION DEL FRAGMENTO CLONADO
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El nmero de clones requeridos para tener 99% de probabilidad de encontrar un detrminado fragmento de DNA en el banco de clones depende del tamao de los insertos y del tamao del genoma.El # de clones necesarios para tener una dada probabibilidad de encontrar un fragmento de DNA es:
N = ln(1-P) / ln(1-f)
N = # de clones,
P es la probabilidad de obtener un dado fragmento.
f es la fraccin del genoma en cada clon.
Ej. Genoma humano = 3 x 106 kb DNA
Tamao promedio de insertos en el vector = 17 kb
Probabilidad = 0.99
Se calcula que 8 x 105 fagos son requeridos para tener el 99% de probabilidad de obtener un fragmento determinado.
CUANTOS CLONES HAY QUE RASTREAR????
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DNA genmico y cDNA
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Sntesis de cDNA
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CONSTRUCCIN DE UN BANCO
DE CLONES (cDNA)
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RASTREO
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Fago l
BANCO DE CLONES DE EXPRESIN (cDNA)
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RASTREO
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NO EXPRESION
PROMOTOR
EXPRESION
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Ac
Secuencia aa (parcial)
Oligonucletido
Funcin
Peptido Ac
DNA (homologo)
Si la protena posee capacidad de unirse especficamente a otra protena celular o unir un ligando o unir DNA se puede utilizar alguna de estas propiedades para utilizar identificar un clon que contenga el cDNA o gen.
(requiere cantidad)
Banco de clones
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-galactosidasa
CLONADO POR COMPLEMENTACIN
E. coli -gal (-) glucosa
lactosa
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CLONADO POR COMPLEMENTACION
DNA library(E. coli)
E. Coli mutantes (gal-)
Transformacin de la cepa mutante con la libreria de DNA
Seleccin en lactosa como nica fuente de carbono
Crecimiento de la cepa complementada y asilamiento del plsmido para el anlisis del gen clonado