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Clonaggio funzionale (Functional cloning)
Clonaggio posizionale (Positional cloning)
Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua funzione
Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua posizione
MALATTIA MALATTIA
FUNZIONE (proteina)
GENE
MAPPATURA
FISICA
GENETICA
MAPPATURA
CLONAZIONE
GENE
FUNZIONE
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Functional cloning
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma:
sulla base del prodotto proteico
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strategia utilizzata per la clonazione del gene del fattore VIII della coagulazione, responsabile dell’emofilia A
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Functional cloning
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma:
mediante l’uso di anticorpi specifici
sulla base del prodotto proteico
oppure
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trascrizione in vitro
mRNA
proteine nascenti
anticorpi specifici
immunoprecipitazione del complesso polisomiale
purificazione dell’mRNA specifico
reverse-transcription per produrre il cDNA specifico
utilizzo del cDNA per selezionare cloni specifici da cDNA libraries
estrazione mRNA totale
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Functional cloning
L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma:
mediante l’uso di anticorpi specifici
sulla base del prodotto proteico
oppure
mediante la sua similitudine a un gene umano paralogo o un gene ortologo di altre specie
oppure
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Positional cloning
Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua posizione
Il primo stadio consiste nel restringere il più possibile (<2Mb) la regione candidata.
Raccogliere numerose famiglie affette dalla stessa malattia (possibilità di errore può essere l’eterogeneità genetica)
Analizzare molti marcatori informativi ben mappati sul genoma
La penetranza della malattia deve essere ben conosciuta. Se la malattia ha penetranza completa sono informative anche le ricombinazioni trovate negli individui sani, altrimenti sono utili solo quelle trovate negli individui affetti
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8 6 3 2 1 8
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1 4 1 3 7 5
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7 4 4 2 5 4
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1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
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8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
3 6 5 5 7 8
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2 5 2 6 2 2
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
6 5 2 6 2 2
8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
7 5 4 6 6 2
6 5 2 6 2 2
6 5 2 6 2 2
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
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8 6 3 2 1 8
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2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
2 5 2 6 2 2
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
6 5 2 6 2 2
8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
7 5 4 6 6 2
6 5 2 6 2 2
6 5 2 6 2 2
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
2 2 1
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2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
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8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
2 5 2 6 2 2
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
6 5 2 6 2 2
8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
7 5 4 6 6 2
6 5 2 6 2 2
6 5 2 6 2 2
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
2 2 1
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
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8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
2 5 2 6 2 2
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2
5 2
6 5 2 6 2 2
8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
7 5 4 6 6 2
6 5 2 6 2 2
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3 6 5 5 7 8
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8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
7 5 4 6 6 2
6 5 2 6 2 2
6 5 2 6 2 2
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
2 2 1
2 5 2 6 2 2
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2
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7 5 4 6 6 2
8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2 5 2 5 5 5
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
8 6 3 2 1 8
6 5 2 6 2 2
7 5 4 6 6 2
6 5 2 6 2 2
6 5 2 6 2 2
3 6 5 5 7 8
7 4 4 2 5 4
2 2 1
8 3 8 2 7 9
9 4 6 4 1 6
8 3 8 2 7 9
9 3 2 3 5 8
8 3 8 2 7 9
5 3 5 3 1 7
8 3 8 4 2 3
9 3 2 3 5 8
4 2 3
2 5 2 6 2 2
1 4 1 3 7 5
6 5 2 6 2 2
2 2 1 9 5 5
2
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Raccolte numerose famiglie si stima la verosimiglianza della mappatura mediante il calcolo del LOD SCORE (logaritmo della probabilità relativa di linkage)
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I
II
III
1 2
1
1
2
2
3
3 4
A1 A1
B1 B1
A2 A2
B2 B2
A1 A2
B1 B2
A2 A2
B2 B2
A1 A2
B1 B2
A1 A2
B2 B2
A2 A2
B2 B2
A2 A2
B2 B2
A1 A2
B1 B2
1a famiglia
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I
II
III
1 2
1
1
2
2
3
3 4
A1 A1
B1 B1
A2 A2
B2 B2
A1 A2
B1 B2
A2 A2
B2 B2
A1 A2
B1 B2
A1 A2
B2 B2
A2 A2
B2 B2
A2 A2
B2 B2
A1 A2
B1 B2
cr. parentali 3
cr. ricombinanti 1
1a famiglia
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I
II
III
1 2
2
1
3
2
4
3 4
A1 A1
B2 B2
A2 A2
B1 B1
A1 A2
B2 B1
A1 A1
B2 B2
A1 A2
B2 B1
5
A1 A1
B2 B2
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
1
A1 A2
B2 B1
cr. parentali 5
cr. ricombinanti 0
2a famiglia
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I
II
III
1 2
1
1
2
2
3
3 4
A2 A2
B2 B2
A1 A1
B1 B1
A1 A2
B1 B2
A1 A1
B1 B1
A1 A2
B1 B2
3a famiglia
5 6
A1 A1
B1 B1
A2 A1
B2 B1
A1 A1
B1 B1
A1 A1
B1 B1
A2 A1
B2 B1
A2 A1
B2 B1
cr. parentali 6
cr. ricombinanti 0
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I
II
III
1 2
2
6
3
7
4
8 9
A2 A2
B1 B1
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
A2 A2
B1 B1
A1 A2
B2 B1
A2 A2
B1 B1
A2 A2
B1 B1
A1 A2
B2 B1
A1 A1
B2 B2
1 2 3 4 5
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
A2 A1
B1 B2
A2 A1
B2 B2 A1 A1
B2 B2
1
A2 A1
B1 B2
4a e 5a famiglia
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I
II
III
1 2
2
6
3
7
4
8 9
A2 A2
B1 B1
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
A2 A2
B1 B1
A1 A2
B2 B1
A2 A2
B1 B1
A2 A2
B1 B1
A1 A2
B2 B1
A1 A1
B2 B2
4a e 5a famiglia
1 2 3 4
A1 A1
B2 B2
A2 A1
B1 B2
A2 A1
B1 B2
A2 A1
B2 B2
5
A1 A1
B2 B2
1
A2 A1
B1 B2
cr. parentali 4+4 = 8
cr. ricombinanti 1+0 = 1
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IN TOTALE
5 famiglie - 24 meiosi ricombinanti 2
parentali 22
secondo l’ipotesi dell’indipendenza ricombinanti 12
parentali 12
invece
Riassumendo
1a famiglia 4 meiosi = 3 cr. parentali + 1 cr. ricombinante
3a famiglia 6 meiosi = 6 cr. parentali + 0 cr. ricombinanti 4a famiglia 5 meiosi = 4 cr. parentali + 1 cr. ricombinante 5a famiglia 4 meiosi = 4 cr. parentali + 0 cr. ricombinanti
2a famiglia 5 meiosi = 5 cr. parentali + 0 cr. ricombinanti