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Células madre pluripotentes y medicina regenerativa

Begoña Aran

Células madre pluripotentes y medicina regenerativa

• Conceptos generales: presente y futuro• Posibilidades• Marco legislativo• Terapia celular

CÉLULAS MADRESe trata de células indiferenciadas que se han localizado en la masa celular interna del blastocisto, en algunos tejidos fetales, en el cordón umbilical y la placenta y en varios tejidos adultos.Son células pluripotentes (o en algunos casos totipotentes) que dan lugar a células y tejidos especializados.Su utilidad estriba en la utilización para tratamientos de patologías con pérdida de función celular

Hochedlinger, Development 2009 (adapted from Waddington, 1957)

CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES

• Las células madre pluripotentes pueden obtenerse de la masa celular interna del blastocisto (hESC) o mediante reprogramación nuclear (SCNT o iPS)

• Células madre • CM embrionarias• CM fetales• CM adultas

• Células pluripotencia inducida (iPS)

células madre adultas• son células indiferenciadas que se hallan

en tejidos adultos diferenciados y que son capaces de renovarse a sí mismas y diferenciarse en todos los tipos celulares del tejido del que provienen.

• algunas pueden ser pluripotentes.• se encuentran en hígado, médula osea,

pancreas, piel, cerebro, sangre…

células madre adultas

su frecuencia es baja, son difíciles deidentificar y purificar, su proliferación eslimitada y son difíciles de mantener en un estado indiferenciado.

células madre fetales• se trata de tipos celulares primitivos que se

hallan en el feto y que pueden desarrollarse en células madre neuronales, células madre hematopoyéticas (cordón umbilical y placenta), progenitoresde islotes pancreáticos.

células madre embrionariasson las que derivan de la masa celular interna(MCI) de un blastocisto (día +5/6 de desarrollo, ± 150 células). Las células de la MCI dan lugar a las 3 líneas del embrión: ectodermo, mesodermo y endodermo. MCI

In vitro

In vivo

CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

Modelo de enfermedadesy desarrollo de fármacos

Terapia celular

Estudio del desarrollo y organogénesis

ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM

Alteraciones neurodegenerativasAccidentes vascularesLesiones medularesFallo cardíacoDiabetes mellitus

Derivación de líneas de células madre embrionarias

• Consentimiento informado de las parejas• Aprobación del Comité Ético• Aprobación de la Comisión de Seguimiento y Control de la Donación de Células y Tejidos Humanos del Instituto de Salud Carlos III (Madrid)

Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona CMR[B]Centros de RA

Proyecto: Derivación de CME en condiciones libres de xenobiòticos in caracterización in vivo de su pluripotencialidad

• Embriones sobrantes de los programas de FIV donados por las parejas para investigación

Consentimiento de los Progenitores para la Utilización de Preembriones con Fines de InvestigaciónLos abajo firmantes progenitores de preembriones conservados en el Servei de Medicina de la Reproducció, Institut Universitari Dexeus, MANIFESTAMOS libremente nuestra opción por la iniciativa marcada X:

--- 1. Mantener la criopreservación de los preembriones.--- 2. Donar los preembriones a otras parejas que lo soliciten sin ánimo de lucro y con fines de reproducción.--- 3. Ceder los preembriones para que las estructuras biológicas obtenidas en el momento de la descongelación puedan ser

utilizadas en la investigación que abajo se indica (*) y bajo las condiciones que se reseña (**), sin que en ningún caso se proceda a la reanimación

--- 4. Descongelación sin otros fines.(*) Investigación a realizar con los preembriones descongelados

La investigación consistirá en la derivación de líneas de células madre embrionarias en condiciones que permitan su uso tanto en investigaciones posteriores como en terapias clínicas y que se realizará en el Centro de Medicina Regenerativa de Barcelona bajo la dirección del Dr. Juan Carlos Izpisúa BelmonteTítulo del proyecto de investigación: DERIVACIÓN DE LÍNEAS DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS EN CONDICIONES LIBRES DE XENOBIOTICOS Y CARACTERIZACION IN VIVO DE SU PLURIPOTENCIALIDAD

(**) Con la firma de este compromiso se renuncia a cualquier derecho de naturaleza económica, patrimonial o potestativa sobre los resultados que pudieran derivarse de manera directa o indirecta de las investigaciones que se lleven a cabo.En a de de 200Fdo.: Doña Fdo.: DonDNI: DNI:

Derivación células madre embrionarias• Descongelación de los embriones (centros RA)• Cultivo embrionario*

los embriones en distinto estadío embrionario deben cultivarse hasta blastocisto

* Deben seguirse los protocolos utilizados en el laboratorio de FIV.

Eliminación de la zona pellucida

- 5mg/ml pronasa- Ac. Tyrode’s

Eliminación del trofectodermo

Monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados (CCD1112SkATCC), en placas cubiertas de gelatina (0.1%)Feeders cells

Descongelación embriones

Cultivo hasta blastocisto

D+5/6

Derivación células madre embrionarias

Siembra y cultivo del blastocisto o MCI sobre monocapa de fibroblastos humanos (HFF-1) irradiados, en placas cubiertas de gelatina (0.1%)

Derivación células madre embrionarias

CULTIVO

KO-DME Medium supplementado con:2 mmol/l Glutamax 0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol 8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF)1% non-essential amino acids20% KO-Serum Replacement 0,5% penicillin-streptomycin

Derivación ES[2]

p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)

p1 d2 (4x) p1 d6 (4x)p0 d12 (10x)

CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

DERIVACIÓN Y CULTIVO• Es imprescindible para poder utilizar las

líneas celulares establecidas que los cultivos se lleven a cabo con métodos libres de soporte animal (anticuerpos y complemento inmunocirugia, feeders, suero, etc)

Células madre de pluripotencia inducida

Tuj1-GFAP AFP-FOX2 actinina-GATA41 - AFP-FOX2- AFP-FOX2 -GATA4

Células somáticas de pluripotencia inducida (IPS)

• Paciente-compatible• No problemas éticos• Disponible en humanos• Pluripotentes • Integración medianter vector

(virus)• Segura? Activación oncogenes,

transmisión línea germinal?

Fibroblastos

CélulasES-like

Takahashi et al., 2007Nakagawa et al., 2007Park et al., 2007

Integración genes (virus)

iPS

• Método reprogramación• Factores de reprogramación• Tipo celular de origen• Caracterización

Método reprogramación

Lentivirus/retrovirus mediated reprogramming methods are stillmajor approaches for generation of iPS

iPS:métodos reprogramacióntowards safe generation

• Plasmid transfection (Yamanaka, 2008)• piggyBack transposition (Kaji 2009; Woltjen 2009)• Cre-recombinase-excisable viruses (Soldner 2009;

Chang 2009)• Non integrating episomal vectors (Yu, 2009)• Direct protein transduction (Zhou 2009)• Adenoviral gene delivery (Zhou 2009)

iPS


Factores de reprogramación

• 1as iPS fibroblastos ratón: 24 genes implicados (Takahashi y Yamanaka 2006)

• OCT4, Sox2, Klf4, c-Myc (Yamanaka, 2007)• OCT4, Sox2, Nanog, Lin28 (Thompson, 2007)• OCT4, Sox2, Klf4 (Nakagawa et al., 208)• OCT4 y Sox2 (Giorgetti et al., 2009)• OCT4 (Kim et., 2009)

iPS


Tipo celular de origen

• Fibroblastos• Keratinocitos• C. pancreáticas• Progenitores neuronales• C. hematopoyéticas• C. sangre de cordón

edad

KeratinocytesDay 0

Small ES-like colony10 Days post-infection

Typical IPS colony20 Days post-infection

IPS colonies AP positive



iPS


Caracterización

• Unificación de criterios entre laboratorios• Expresión génica• Diferenciación variable • Condiciones de cultivo óptimas

IPS CELLS AS MODELS FOR HUMAN DISEASE

From Nishikawa SI et al, Nat Rev Mol Cell Biol, 2008

Fosfatasa alcalina

cariotipo

Microsatélites & HLA

Actividad Telomerasa

Diferenciación In vitro

Formación de cuerpos embrioideos

Diferenciación In vivo(Formación de Teratomas)

Caracterización

Inmunocitoquimica para marcadores de pluripotencialidad

• Banqueo

• Registro en el Banco Nacional de Líneas Celulares

DIFERENCIACIÓN

Proceso mediante el cual una célula madre indiferenciada se transforma en células especializadas (diferenciadas) de un determinado tipo celular.

Diferenciación de los tejidos humanos

DIFERENCIACIÓN• Cambios en la expresión de genes mediante mecanismos epigenéticos

• Cambios fisiología: tamaño, forma, polaridad, actividad metabólica…

• capacidad proliferativa diferenciación

c.madre c precursora c. diferenciada

Characterization: In vitro Differentiation3 germ layers:

- Ectoderm: neurons

- Endoderm:glandular tissue

- Mesoderm:cardiomyocytes

7 days

Deattaching the colonies

Colonies in suspension

Embryoid Bodies

24 h in hESm on Ultra-Low attachment plates

CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro

• Embryoid bodies• 3-4 dias cultivo standard• Siembra gelatina o matrigel• Distintos medios con distintos factores según el tejido

a diferenciar• Co-cultivo con otros tipos celulares

Ectodermo Endodermo Mesodermo

DMEM/F 12Neural basal mediumN2B27GlutamaxP/S

KO DMEMFBSGlutamaxAmino acidos no-esencialesP/Sβ-mercaptoetanol

KO DMEMFBSGlutamaxAmino acidos no-esencialesP/Sβ-mercaptoetanolAc. Ascórbico 0,5 mM

3 days in suspension in differentiation media

PA6 Gelatine14-16 days 15-20 days

Diferenciación in vitro

Ectodermo: beta-tubulina

Inmuno-stainings for ectodermal markersEctoderm

Beta-tubulin & TH


Mesodermo: alfa-actinina y GATA4


Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2

Diferenciación de las CME

• ADIPOCITOS• ASTROCITOS• CARDIOMIOCITOS• CONDROCITOS• CÉL. HEMATOPOYÉTICAS• CÉL. DENDRÍTICAS• CÉL. ENDOTELIALES• KERATINOCITOS• HEPATOCITOS

• PRECURSORES LINFOCITOS• MASTOCITOS• NEURONAS• OLIGODENDROCITOS• OSTEOBLASTOS• ISLOTES PANCREÁTICOS• MÚSCULO LISO• MÚSCULO ESTRIADO• TROFECTODERMO• GAMETOS

DIFERENCIACIÓN Quedan por establecer los factores genéticos y/o ambientales que controlan el desarrollo de las CME y su importancia durante los distintos estadíos de diferenciación

TERAPIA CELULAR CON CM

Transplante de células diferenciadas, obtenidas a partir de CM, destinado a reparar tejidos en los que se ha perdido la funcionalidad.

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y

purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos

PROBLEMAS TÉCNICOS



RECHAZO INMUNOLÓGICO

Como evitarlo?• iPS• CM procedentes de embriones clonados mediante

transferencia nuclear• Uso de fármacos inmunosupresores• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM• Inducción de inmunotolerancia: administración previa

de material embrionario o hematológico del donante

PROBLEMAS TÉCNICOS



Formación de tumores

• Riesgo transplante células indiferenciadas• Varias propuestas:

terapia génica y oncología (?)• iPS: riesgo oncogénico potencial:

uso c-Myc, virus integrativos…

PROBLEMAS TÉCNICOS



Optimización de protocolos de diferenciación y purificación

• Necesidad poblaciones puras• Mejora protocolos diferenciación• Mejora protocolos separación y purificación

(”etiquetas” genéticas, genes suicidas…)

PROBLEMAS TÉCNICOS



Funcionalidad y viabilidad post-transplante

• Es necesaria la integración y realización de conexiones necesarias para restablecer la funcionalidad del órgano.

• Estudio mecanismos control del crecimiento, migración, destino y diferenciación celular

• Estudios de restauración de la funcionalidad en modelos animales

• Órgano: varios tipos celulares

Estudios funcionalidad• Páncreas endocrino, ratones diabéticos. Soria, 2000;

Kroon, 2008.• Neuronas, enfermedad de Parkinson. Sonntag, 2007; Cho,

2008.• Precursores neuroectodérmicos, lesiones medulares.

Cummings, 2005; Keirstead, 2005; Nakamura, 2005; Kumagai, 2009.

• Precursores miocárdicos, accidentes vasculares. Kehat, 2004; Menard, 2005; Laflamme, 2007; van Laake, 2009.

• Epitelio pigmentado de retina. Retinitis pigmentosa. Idelson, 2009.

• Neuronas estriadas. Enfermedad de Huntington. Aubry, 2008.

PROBLEMAS TÉCNICOS

• Rechazo inmunológico• Formación de tumores • Optimización de protocolos de diferenciación y purificación• Funcionalidad y viabilidad post-transplante• Aspectos metodológicos

Aspectos metodológicos

• Estandarización protocolos: procedencia material, métodos de cultivo, preparación, almacenaje, banqueo, transporte.

• Eliminación xenobióticos• Condiciones GMP• Control de calidad• Supervisión por comités externos de protocolos y ensayos

clínicos. Valoración riesgos.• Consentimiento informado

ISSCR: guidelines for clinical translation of stem cells.http://www.isscr.org/clinical_trans/pdfs/ISSCRGLClinicalTrans. pdf

Primeros ensayos clínicos con CME

• Geron corp.: Oligodendrocitos derivados de CME, lesionados medulares

• Advanced Cell Technologies: Epitelio pigmentado de retina derivado de CME, distrofia macular de Stangerdt’s y DMAE.

Células madre pluripotentesRegulación

Derivación y InvestigaciónSubdirección General de Investigación en Terapia Celular y

Medicina Regenerativa. Instituto de Salud Carlos III.• Comisión de Garantías para la Donación y Utilización de

Células y Tejidos Humanos• Banco Nacional de Líneas Celulares

Terapia ClínicaSiempre TAs AEMPS

Legislación Española Investigación

• Ley 45/2003 por la que se modifica la Ley 35/1988 sobre Técnicas de Reproducción Humana Asistida

• Ley 14 /2006 sobre Técnicas de Reproducción Asistida

• ORDEN SCO/393/2006, por la que se establece la organización y funcionamiento del Banco Nacional de Líneas Celulares

• REAL DECRETO 1301/2006 por el que se establecen las normas de calidad y seguridad para la donación.Transposición Directiva Europea de Tejidos y Células

• Ley 14/2007 de Investigación Biomédica

Objetivo

Banco Nacional de Lineas Celulares

Imprescindible registro en el BNLC.

Estructura en red con 4 nodos, coordinados por un central.

Garantizar la disponibilidad de líneas celulares pluripotentes y adultas para la investigación biomédica.

http://www.isciii.es/ISCIII/es/contenidos/fd-investigacion/fd-ejecucion/fd-programas-investigacion/fd-investigacion-terapia-celular-medicina-regenerativa/banco-nacional-lineas-celulares.shtml

28 hESC24 iPS

6 adultas

Criterios mínimos• Consentimiento informado• Trazabilidad• Aprobación Comité Ética

• Datos derivación (origen, métodos, etc)• Disponibilidad• Cariotipo• Modificación genética• Marcadores celulares de pluripotencia • Diferenciación a las 3 líneas germinales (in vitro y/o in vivo)

Qué son las Terapias Avanzadas?

Forman parte de la Medicina Regenerativa, que ofrece nuevas oportunidades para el tratamiento de algunas enfermedades producidas por la pérdida de la función celular.

Las TA comprenden:– Terapia celular– Terapia génica– Ingeniería de tejidos


• Terapia celular: consiste en la utilización de células vivas (ya sean células madre, progenitoras o adultas) para restablecer o mejorar la función celular perdida en un tejido o un órgano como consecuencia de una enfermedad degenerativa o una lesión traumática.

Directiva 2009/120

Modificaciones no substanciales,

permitidas en células y tejidos que NO se

consideran medicamento


• Terapia génica: técnica que permite tratar una enfermedad mediante la sustitución de un gen ausente o defectuoso por una copia funcional, o mediante la silenciación de un gen perjudicial.Su efecto terapéutico, profiláctico o diagnóstico depende del ac. nucleico recombinante que contenga o del producto de la expresión génica de dicha secuencia.


• Ingeniería de tejidos: producto de ingeniería tisular contiene o está formado por células o tejidos manipulados por ingeniería y que tiene propiedades, se emplea o se administra a las personas para regenerar, restaurar o reemplazar un tejido humano.


• Medicamentos de TAs combinados: combina la utilización de células y materiales (biomateriales, biomoléculas, matrices…) para la reconstrucción o reemplazamiento de órganos. Se utilizan células incorporadas a una estructura tridimensional o matriz parecida al tejido u órgano a reemplazar.

Aspectos legislativos

• Las condiciones que determinan si un tejido/célula es o no medicamento de TA son:

– La manipulación o transformación del mismo en función de si se alteran las características biológicas, funciones fisiológicas o propiedades estructurales.

– La función esencial es o no la misma en donante yreceptor.

Aspectos legislativos

• En función de ser considerados o no medicamentos, se debe remitir los proyectos de ensayos clínicos para su aprobación a la OCATT (ONT) o a la AEMPS y en ambos casos los trámites son diferentes.

• La Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios (AEMPS) es la responsable de aprobar tanto los ensayos clínicos (EC) con TA como la producción industrial de los productos resultantes.

Ámbito

• Células madre pluripotentes- Células madre embrionarias- Células madre de pluripotencia inducida (iPS)

• Células madre fetales: SCU• Células madre adultas

- c. progenitoras hematopoyesis- c. mesenquimales - c. progenitoras tejido-específicas

• Células diferenciadas

Consideraciones en TAs

• Clasificación: producto/manipulación/aplicación.

• Balance: producción industrial/E.C.caso-a-caso.

• Análisis riesgos: origen células, habilidad de proliferar,

migrar y/o diferenciarse, respuesta inmune,

funcionalidad a largo plazo, oncogénesis…

• Trazabilidad: donación obtención evaluación

procesamiento almacenamiento

distribución trasplante

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