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生化科技學系微生物學組專題討論

題目: An Engineered Yeast Efficiently Secreting Penicillin 作者：Loknath Gidijala, Jan A.K. W. Kiel, Rutger D. Douma, Reza M. Seifar, Walter M. van Gulik, Roel A. L. Bovenberg, Marten Veenhuis, Ida J. van der Klei 文章來源： PLoS ONE, 4(12):e8317, 2009. 演講人：Ya-Ching Tsai 蔡雅晴 B96B02027 指導老師：Ching-Tsan Huang, PhD 黃慶璨 博士 演講日期：November 23rd, 2010 演講地點：The 6th Classroom

摘要

目前工業上生產 β-內胺類抗生素(β-lactam antibiotics)以絲狀真菌 Penicillium chrysogenum 為主要來源，本研究欲以 Hansenula polymorpha 作為另一種 β-lactam抗生素的生產系統。作者逐步地將基因轉形到 H. polymorpha，以重建盤尼西林合成途徑：先將 ACVS(一種 NRPS)轉形到 H. polymorpha，經過異源表現的 PPTase活化後，合成中間產物 ACV，經過 IPNS 的催化變成 IPN，IPN 進入過氧化體(peroxisome)後，藉由 PCL 與 IAT 的催化，最後生成 PenG 並外泌，實驗中 HpPen4菌株帶有全部合成所須酵素的基因，該菌株盤尼西林的產量和工業用的 P. chrysogenum NRRL1951 菌株相當，可見以 H. polymorpha 大量生產盤尼西林是可行的。另外作者也做了缺乏過氧化體的△pex3 HpPen4 突變株，該菌株盤尼西林的產量比正常 HpPen4 減少了 50%以上，可見 IAT 和 PCL 這兩種酵素在過氧化體內作用對盤尼西林的生產是非常重要的。本研究成功建立了一個 β-內胺類抗生素新的生產系統，甚至可以應用於生產其他須 NRPS 參與的胜肽。 Keywords：β-lactam antibiotics、Hansenula polymorpha、genetic engineering、non-ribosomal peptide synthetase(NRPS)、δ-(L-a-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase (ACVS)、isopenicillin N synthase (IPNS)、isopenicillin N acyl transferase (IAT)、phenylacetyl CoA ligase (PCL)

前言

本研究之重要性 β-內胺類(β-lactam)抗生素如盤尼西林是醫藥上常用的臨床用藥，佔抗

生素市場 40% 的產值[1]。由於工業上用絲狀真菌 Penicillium chrysogenum 大量醱酵生產盤尼西林有一些先天缺點，因此發展一個新的 β-內胺類抗生素生產平台，以降低生產成本。

前人作過的研究

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盤尼西林 G 的生合成途徑如圖一所示： ACVS 經過 PPTase 活化後，以 AAA、L-Val 和 L-Cys 為原料合成出 ACV，ACV 再經過 IPNS 的催化生成 IPN，IPN進入過氧化體(peroxisome)後，藉由 PCL與 IAT的催化，最後得以合成出 PenG並外泌，其中 ACVS 和 IPNS 在細胞質作用，而 PCL 和 IAT 在過氧化體中作用[3]。ACVS 屬於非核醣體合成機制的胜肽合成酶(NRPS, non-ribosomal peptide synthetase )。

酵母菌是常用的異源表現系統之一，具有轉譯後修飾、方便操作、花費少 等優點，其中 H. polymorpha 可以以甲醇誘導其生產出異源蛋白質，目前已經有一些醫藥蛋白質成功的在H. polymorpha中被表現出來[2]。之前研究亦顯示 PEX3對 H. polymorpha 生產 peroxisomal enzyme 很重要[4]。

作者為何要作本研究 酵母菌比 P. chrysogenum 有更好的醱酵製程，其中 H. polymorpha 因為有強而容易調控的啟動子、可高密度培養與可大量誘導的過氧化體(peroxisome)，因此作者選用 H. polymorpha 作為一個新的生產平台，希望可以大量發酵生產目標產物 PenG。

本研究欲完成之項目 1. 在 H. polymorpha 成功表現非核醣體合成機制的胜肽合成酶(NRPS)。 2. 在 H. polymorpha 重建完整的 PenG 合成途徑，並且可以成功外泌。 3. 確認生合成中最後兩個步驟所須的酵素 IAT 和 PCL 在過氧化體中作用與

PenG 合成的關係。

材料與方法

菌株與培養基 本實驗所用的H. polymorpha菌株列於表一，轉形株全部以NCYC495 ade11.1 leu1.1加以改良。 P. chrysogenum strain DS17690、NRRL1951與H. polymorpha轉形株皆以是否能抑制Micrococcus luteus ATCC9341來判定是否生成抗生素。

質體建構 1. pZ4-pcbAB：帶有 ACVS gene(pcbAB)和 AOX promoter。 2. pG4U-pcbAB：帶有 ACVS gene(pcbAB)、AOX promoter 和 G-418R。 3. pA7-Sfp.His6：帶有 PPTase gene(sfp.His6)和 TEF1 promoter。 4. pBM4-IAT.PCLSKL：帶有 PCL gene、penDE gene 和 AOX promoter。

建構 H. polymorpha 菌株 1. HpPen1：將 pG4U-pcbAB 質體轉形到 H. polymorpha NYNC495 ade11.1leu1.1

ura3 met6，以 uracil 營養缺陷和 G-418 抗性篩選的轉形株，會生合成 ACVS。 2. HpPen2：將 pA7- Sfp.His6 質體轉形到 HpPen1，會生合成 ACVS 及 PPTase。 3. HpPen3：pZ4-pcbAB 質體轉形到 HpPen2，以 zeocin 抗性篩選的轉形株，會

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生合成 ACVS、PPTase 和 IPNS。 4. HpPen4：pBM4-IAT.PCLSKL質體轉形到 HpPen3，以 blasticidine 抗性篩選的

轉形株，會生合成 ACVS、PPTase、IPNS、PCL 及 IAT。 5. △pex3 HpPen4：將 pSNA04 質體(pex3::nat deletion)轉形到 HpPen4。

生化方法 取 H. polymorpha 和 P. chrysogenum 的細胞粗萃物，用 Bio-Rad Protein Assay測蛋白質濃度，以 BSA 為標準品。再用 anti-IPNS、anti-ACVS、anti-IAT、anti-PCL及 anti-His6 tag 的抗體進行西方點墨分析。

生物檢定 膠體過濾後的 H. polymorpha 和 P. chrysogenum 粗萃物塗在含 M. luteus 的培養基，於 30oC 培養過夜後觀察是否有抑制環，以確定是否有生成 β-內胺類抗生素。

代謝物檢測 取胞內外萃取物，以 IP-LC-ESI-ID-MS/MS 分析[5]。

以質譜儀(Mass spectrometry)分析 β-lactams 樣品經過液相層析(LC)，以 IPN 和 PenG 的標準品相對停滯時間為依據。直接對 LC 的流洗液和 IPN 和 PenG 的標準品進行 MS fragment 分析。

結果與討論

在 H. polymorpha 表現 NRPS ACVS HpPen1 菌株為帶有 P. chrysogenum ACVS 基因(pcbAB)的 H. polymorph 轉

形株，細胞免疫染色(Immunocytochemistry)結果顯示 ACVS 的確位於 HpPen4 細胞質中(圖二)。ACVS 需要原本 HpPen1 沒有的 PPTase 活化，HpPen2 菌株是將把 Bacillus subtilis PPTase 基因(sfp)轉形到 HpPen1 所得的轉形株。在含有 AAA的培養基，HpPen2可以將AAA、L-Val及L-Cys合成出ACV，ACVS的確因PPTase活化。

本實驗成功的在 H. polymorpha 表現非核醣體機制合成的胜肽合成酶 (NRPS)，將來可以應用於生產一些須 NRPS 參與的高價值胜肽，例如某些抗生素、抗癌藥物、免疫抑制劑。

在 H. polymorpha 生產 PEN 為了在 H. polymorpha 中模擬盤尼西林的合成途徑(圖一)，本實驗逐一將

四種 P. chrysogenum 基因(生合成 ACVS、IPNS、PCL、IAT)與一種 B.subtilis 基因(sfp.His6，生合成 PPTase)轉形到 H. polymorpha，轉形株 HpPen1~HpPen4 分別以不同抗體去進行西方點墨分析，確定各自生合成出不同的酵素(圖三)。

取 HpPen4 的上清液，塗在含合成盤尼西林原料和 M. luteus 的培 養基上，結果 HpPen4 的確分泌高活性的 PEN 到胞外，而且表現量與目前工業用的 NRRL1951 相當(圖五)。

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以 LC-MS/MS 分析 HpPen4 的上清液，顯示 PenG 和 IPN 的生成，經過 MS fragment 分析後，碎裂的片段與 PenG 和 IPN 標準品一樣(圖六)。

HpPen4 有效的分泌 PEN 用 IP-LC-ESI-ID-MS/MS 分析 HpPen3 和 HpPen4 胞內外的代謝物，結果

HpPen3 胞內的 IPN 很多而幾乎無 PenG，HpPen4 則是胞外的 PenG 產量很高而胞內的 IPN 比較少(圖七)，對照圖一的合成途徑，可知 HpPen4 將大多數的 IPN轉錄成 PenG 並分泌到胞外，而 HpPen3 因為沒有 PCL 和 IAT，因此 IPN 無法生成 PenG，造成大量的 IPN 在細胞內累積。

酵素的正確區域化對 PEN 的有效生產影響很大 為了確認生合成中最後兩個步驟所須的酵素 IAT 和 PCL 在過氧化體中作用與 PenG 合成的關係，作者做了一個缺乏 PEX3 的 HpPen4 突變株，稱為△pex3 HpPen4，該轉形株的 PEN 產量比 HpPen4 少，抑制環明顯比 HpPen4 小(圖八)。MS 分析顯示 HpPen4 的產量是 1.1 μg/ml 而△pex3 HpPen4 只有 0.4 μg/ml，證明了 IAT 和 PCL 在 peroxisome 內對 H. polymorpha 生產 PenG 很重要。

參考文獻

1. Kresse H, Belsey MJ, Rovini H (2007) The antibacterial drugs market. Nat Rev Drug Discov 6: 19–20.

2. Stockmann C, Scheidle M, Dittrich B, Merckelbach A, Hehmann G, et al. (2009) Process development in Hansenula polymorpha and Arxula adeninivorans, a reassessment. Microb Cell Fact 8: 22.

3. Evers ME, Trip H, van den Berg MA, Bovenberg RA, Driessen AJ (2004) Compartmentalization and transport in beta-lactam antibiotics biosynthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol 88: 111–135.

4. Baerends RJ, Rasmussen SW, Hilbrands RE, van der Heide M, Faber KN, et al. (1996) The Hansenula polymorpha PER9 gene encodes a peroxisomal membrane protein essential for peroxisome assembly and integrity. J Biol Chem 271: 8887–8894.

5. Seifar RM, Zhao Z, van Dam J, van Winden W, van Gulik W, et al. (2008) Quantitative analysis of metabolites in complex biological samples using ion-pair reversed-phase liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 1187: 103–110.

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圖表

表一、本實驗使用的 H. polymorpha 菌株

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圖一、Penicillium chrysogenum 合成 Penicillin G(PenG)的生化途徑

在細胞質中，ACVS-OH 須經過 PPTase 的活化，活化的 ACVS-SH 以 AAA、L-Cysteine 與 L-Valine 為原料生合成出 ACV，接著 IPNS 催化 ACV 生合成 IPN，IPN 進入過氧化體後，過氧化體中的 PCL 催化 PAA 生成 PAA-CoA，進一步與 IAT一起催化 IPN 生合成 PenG 並分泌到胞外。 圖二、H. polymorpha 細胞內 ACVS 的位置

用 anti-ACVS 的抗體進行細胞免疫染色，去測 HpPen4 中 ACVS 的位置，結果HpPen4 生合成的 ACVS 在細胞質中。 M - Mitochondria P - Peroxisome V - Vacuole

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圖三、在 H. polymorpha 細胞內表現合成 Penicillin G 所須的酵素

轉形株進行西方點墨分析，確定不同的轉形株各自表現不同的酵素，其中 ACVS、 IPNS、PCL 與 IAT 是用該蛋白質的抗體去辨認，只有 sfp 是用 anti-His6 的抗體去辨認。 圖四、HpPen2 生合成 ACV

PPTase 可以活化 ACVS，進而催化 ACV 的生合成。HpPen2 有 sfp 基因，在原料AAA 存在時會合成出 ACV，而 HpPen1 沒有 sfp 基因，不論有沒有 AAA 都不會生合成 ACV。

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圖五、以 H. polymorpha 表現 PenG

HpPen4 對 Micrococcus luteus 產生抑制的效果，確定其的確生合成 PenG，其抑制環和工業上用來生產盤尼西林的 NRRL1951 相當，可見以 H. polymorpha 大量生產 PEN 是可行的。 圖六、以 LC MS/MS 分析 H. polymorpha 生產的 PEN

以 LC-MS/LC 分析 HpPen4 的上清液。進行液相層析後，IPN 和 PenG 分別在第3.45 和 11.76 分鐘被收集到(A 圖和 C 圖)。接著拿 LC 收得之 IPN 與 PenG 的流洗液進行 MS fragment 分析(B 圖和 D 圖)，表格是 IPN 和 PenG 標準品的 MS fragment數據，對照m/z和 relative abundance，確定HpPen4的產物是 IPN和PenG。

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圖七、比較 HpPen3 和 HpPen4 生產的 β-lactam antibiotics 的量

HpPen3 沒有 PCL 和 IAT，因此中間產物 IPN 無法生合成 PenG 而累積在細胞質中，所以只見 HpPen3 胞內有大量的 IPN。HpPen4 有 PCL 和 IAT，因此中間產物 IPN會生合成PenG並分泌到胞外，故胞外有很多PenG而胞內的 IPN比HpPen3少。 圖八、PEX3 基因缺陷造成 PEN 產量的減少

過氧化體的生合成需要一群 PEX 蛋白質，PEX3 是其中之一，沒有該蛋白質的H. polymorpha 將無法合成過氧化體，會影響 PCL 和 IAT 的正常作用，進而影響PEN 的生合成。實驗中△pex3 HpPen4 的抑制環明顯比較小，證明了合成盤尼西林時，PCL 和 IAT 在過氧化體的作用很重要，