COM U NICAZIO N I

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ENZIMI

Un metodo cromatografico rapido per la valutazione degli isoenzimi mitocondriali e citoplasmatici della glutammico-ossalacetico transaminasi nel s iero umano

G. IDÉO, R. DE FRANCHIS, E. DEL NIN~O. P. SALVADf: e G. FIORELLI

Centro «Antonio ;)i[igliavacca », Istituto di Patolu~ia Speciale lU Pdica I T

<lell'Unit•ersillì di Milono

~ello studio comparativo dci livelli sierici di enzimi citoplasmatici e mitocondriali in corso d.i epatopatie, utile n el definire l'entità ed il tipo di le!'lione cellulare è particolarmente interessante la valutazione <h·llc com­ponent i mitocondriale e citoplasmat ica degli enzimi a doppia localizzazione, come la malato deidrogenasi (~IDH) e la glutaromico-ossalacetico transa­minasi (GOT) (1·2).

Tali componenti, o isocnzimi, infatti , hanno peso molecolare e velocit;t tli diffusione nel plasma molto simili, ma difl'criscono p er altre propriet<ì, come la car ica elettrica, che permettono ùi caratterizzarli separatamente.

Gli isoenzimi della GOT sono stati caratterizzati nel siero con vari metodi (3·7) che, tuttavia, sop rattutto per l e difficoltà tecniche ch e gcncral­mt nte presentano, sono di difficile attuazione nella routine del laboratorio clinico. Inoltre, quando l'attività enzimatica del campione in esame è bassa, 11uesti metodi danno r isultati poco attendibili sia p er la loro scar sa sensibi­lità, sia per la !abilità dcll'isoenzima mitocondriale della GOT (8•9).

Abbiamo cercato perciò ùi mettere a punto un metodo che unisse ad una sensibilità elevata la maggiore rapidi tà c scmplicitit di esecuzione po::­sibile. Come mezzo di separazione abbiamo scelto la cromatografia su colonna di resi na a scambio anionico (6) ed abbiamo stabilito le condizioni per una procedura completa di separazione c r ccupcro delle due attività GOT. I risultati ottenuti, sottoposti ad opportune verifiche, hanno con· sentit o di adottar e per analisi di routine nn m etodo semplificato.

1 campioni venivano sottoposti a dialisi continua per .t. ore a -1° C contro :!5 litri di tampone sodio fosfato 0,008 M, pii 7; nel frattempo \'Cnivano allestite, a t cmpcratura ambiente, le colonnine di resina DEAE Scphadcx A 50 Mcdium (0,9 cm <.li <liarndro e 7,5 cm di altezza); la resina veniva atti -

A nn. I st. Suver. Sanità (1971) 7, 363-366

3M f.O)!UNICAZIOXI

vata seguendo le is truzioni della ditta fornitri ce (Pharmacia, U ppsa la). Ter­minata la dialisi. l mi di campione veniva posto in colonnin a a tempt•ratura ambiente c lasciato ad sorbin· complctamrnte rlalla r r)lina. Si r:;cl-'ui,·a quindi una prim a eluzionr ron 13 m i di tamporw :;odio fo:o;fatn O.OOU \L p ii 7. rd u na flccomla duziont• con 1.~ mi eli t ampon e sotlio fo~fato 0.~ \1. c·nnl•·­

n<'ntc l\aCI 0,2 1\1. p H i . Entrumlti gli cluati n·nivano c·on;wnat i in frit-:o· rifcro. 11 p ri11111 eJnaiO COillt ' lll'\ a J'i . .;oenzima UlilOI'Oildrialc• dtl'. , .. ,.l' lido eli tipo cationil·o. 11011 ' eni,·a fissato dalla resina. nwnl r•• ,.,.] ;o.c ·eo••dn •·Inalo era pre,.,t·nte f'i ,.,ucnzima l'itoplasmntit·o c · l ~t• . c:-;s t·rHlo di tipn an inn i• .. _ .,-,·ni' ,, liberato ònlla r.· -; ina ,.vJIJ t'UII il passuggio Ji un tampout• a ntn~I!ÌIJrt' forz.a ionica. L' intt·ra t• roct·clurn rroJnatogralica dnra\'a dai ~O ai -J.) miuut i. J l dv~aggio della GOT sugli cbtati ' 'cni,•a c:;egui tu •·o11 l' U\'-T e,.;t Biorhemia (lll) o, in cal)o di ba:.,•· atlÌ\ itù. cun il Mono-Test. st'iogli!'ndo i reag•·nti dirclta­mcntt: ncU'elua to.

~cl mcttcn! a punto q uesto metoùo abbiamo prc~o in t•onsiùcrazimw l'inA.uenz.a d t: i vari fattori chl· possono alterare l'attendibilità dci risultati. Utilizzando campioni di fegato di ratto abbiamo vc.rificatu cht• i tamponi ad a lta concentrazione eser citano una certa inibiziom• ~-~ ulratti,;tà GOT ~>im ilmcntc a quanto osservato da altri AA. su campioni umani ( 11• 12) . P er quanto riguarùa il tipo di tampone, il pitt soddisfacente tH'r i campioni rlia­lizz.ati s i è rivelato il tampone soclio fosfato.

La dialisi c·omportn un'inatti,·azionc dj ambedue gli isoeuzimi , parti­colarmente marcata per la GOT rnitoeondrialc, che gi.J dopo 8 ore di dialisi seend<· a m eno d <' l 50 °{, del valore inizia le (Fig. l ). E ra quindi im­portante ridurre al minimo qu e!'ta inattivazione c cicì era rPali:r.:~;abilc con lo

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Fig. l. - Inattivazione percentuale degli isoenzimi della GOT. A ~ni~tra : campioni conservati n 4oC. A de&tra: campioni sottoposti a dialisi continua R 4°C.

.l nll. Ist . Supcr. Sanità (1971) 7, 363- 86&

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IDID, DE FliANCHIS, DEL NINNO, SALVADg E FIORELLI 365

impiego di un apparecchio che, consentendo il ricambio continuo del liquido di dialisi, permetteva di ottenere una buona dialisi in sole 4 ore, contro le 8-12 necessarie con altri metodi.

Abbiamo anche valutato l' influenza della t emperatura della colonna cromatografica sulla attendibilità dei risultati: nelle condizioni sperimentali adottate non abbiamo riscontrato alcuna perdita di attività nei campioni cromatografati a temperatura ambiente, rispetto agli stessi campioni croma­tografati su colonnine refrigerate.

Su diverse centinaia di cromatografie di campioni umani c animali contenenti . da un minimo di 5 ad un massimo di 2000 mU/ml di attività GOT, il r ccupero globale medio di attività negli eluati è s tato del 95 %, con un errore s tandard di ± 1,25% , rispetto al campione originale sotto­posto a dialisi e diluito come gli eluati (è noto infatti che la diluizione può causare variazioni deJle attività enzimatiche nei campioni).

Avendo ottenuto recuperi globali molto soddisfacenti, abbiamo in :;cguito vr rifirato l' cffrttiva ripartizione dei due isoenzimi nei rispettivi eluenti. A tale scopo abbiamo cromatografato su DEAE-Sephadex un cam­pione di isocnzima mitocoodriale ottenuto da fegato di ratto parzialmente purifi cato. La Tab. l most ra i risultati della cromatografia c successiva t·luzionr tli qur sto r ampionr. sottoposto a diverse diluizioni. Come si vede,

T j\QELL A l

Prova di recupero dcii 'isoenzima mitocondriule e dell ' it!oenzima citoplasmatico parzialmente purificati, sottoposti a cromatografia su DEAE-Sephadex e

a successiva eluzione con tampone di bassa forza ionica.

Att ivili COT j;,i~oì•le mUfml

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Jli(l COMUNICAZIONI

anche con campioni rontl'nenti solo 2.6 m U; ml di isoenzima mitocondriale, esso si t· ri trovato prr-~sorhè totalmente nd primo cluato. Abbiam o s uceess i· vamentr ~olloposto a li " lettroforcsi (7) il primo eluato. l tracciati elettro· fort>tit·i ottenuti per la GOT del campionr da noi usato, confrontati cnn

quelli di un omogenalo totale di fegato di ratto, hanno most rato eh(· il nos tro campion <· cont r-n .. , ·a soltanto l'isol'm:ima a migrazion t• ratodiea. c.:inì· mitoconclriak.

P er Ycrilicarr in\ t'l' t' chi' neanche una minim a quant itit di iscwnzima citoplasmatico si s taeca ~:>~c· dalla u >:ina durante la prima cluziorw. abbiamo cromatografat() tut ca mpione di isoenzima cit()plasmatico di fegato di ratto ottenuto per parzial1• purifìcazione su CM cellulosa (Whatman). l .a Tab. J mostra i ri suhati uegati\'i ottenut i dopo cromatografia cd r luzionP cii questo campioni' sottoposti> a diverse diluizioni. Anche con campioni c·ou­t enenti fino a 450 mU,Iml di isoenzùna citoplasmatico, n esstma attività ì·

stata ritrovata nel primv duato. I tracciati clettroforctici hanno dimo­strato che il campione da noi impiegato conteneva in qt~l'f' to caso soltanlll l'isoenzima a migrazione anodica, cior eitoplasmatiro .

In base a questi risultati abbiamo potuto semplificare la nòs tra m etodica. ed ora eseguiamo solo la prima cluzione. con tamponi' fosfato 0.008 l\l: sull'eluato ottenuto vicn(• do lc'ato l ' i so~·nzima mitocondria iP, ml'ntu l'attivitit della componl'ntl' ('Ìtopla,:malica è calcolata p~'r ,.;otlrmr.ioue dall'atti,·it;• totale.

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Un nuovo metodo cromogenico per la determinazione dell'~·amilasi. Parziale caratterizzazione dei prodotti di degradazione enzimatica e impiego del metodo

a scopo clinico

~I. CESKA

Dipartimento di Biochimica, Pharmacia AB, Upp.fala , Svez ia

Negli ultiwi anni Cl s1amo occupati della messa a punto di un metodo per la determinazione dell'a-amilasi basato sull' impiego di subs trati di nuovo tipo (1

•3

) . La sintesi di questi substrati comprende due passaggi p rincipali: il primo consis te nel determinare la conratenazione di macromoleeole dello amido soluhile m ediante aggiunta di etere l-4 butandiolglicicfico c il secondo nella colorazione delle particelle insolubili così formate meùian te Cibacron Blau F3G-A in ambiente alcalino. Le particelle insolubili, costituite da una r ete tridimensionale di macromolecole, si rigonfìano in acqua c il loro grado di rigonfiamento dipende dalla quantità del composto organico ag· giunto. Attualmente stiamo preparando il polimero sotto forma di perle.

L' idrolisi enzimatica del polimero insolubile d ell'amido dà luogo alla formazione di prodotti di degradazione solubili in acqua, cos tituiti da poli­saccaridi di diverse dimensioni contenenti l'indicatore colorato. L'assorbi­'ll<'nto ottico ùella soluzione contenente i prodotti eolorati di degrad azione •'- proporzionale all 'attività a-amilasica.

Le condizioni adottate per l 'idrolisi enzimatica del polimero colorato dell'amido mediante a-amilasi sono s tate descritte altrove (2) . Il metodo può essere riassunto come segue.

Le particelle del polimero vengono 5ospese, alla concent.ra..:ione di lO mg (o più) per mi, in soluzione tampone di fosfato 0,02 M, pH 7,0 conte· nente NaCI 0,05 M e NaN0 3 0,02 %- l ml della sospensione vien e aggi1111to a r iasruna prHvctta r.ontrn~ntP 2~ ,ul rli mater iale biologico (c: icro o urina) preincubato per 5 min alla t emperatura desiderata. L 'urina viene prediluita m ~·~co landone un volume con 5 volumi di soluzione d orosodica isotonica. Le provette sono quindi agitate e lasciate in incubazione per 30 min a 370C. P rr bloccare la r eazione r nzimatica si aggiungono 0,25 ml di NaOH 0,5 N,

.41w. l• t. Suoer. Sunità (1971) 7, 30~-S71

368 OOMUNICA2.IONI

:-; i agita e s i centrifuga per 5 m in a 7 J 5 g. Si misura infmc con uno sp <' ttro· fotometro rassorbimento ottico del surnatante a 620 nm .

Il mt' Lodo descri tto è s tato m esso a punto u ti]jzzando come sorgen te di a-amilas i i sieri s tandard d <•lla Ditta H ylaud. La Fig. l mostra la correla-

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Fig. l. - Curva di ~atnrnzi unt• òel sub!'trato di a-nmiln-i a una conccntrnziouc tl i 91 7c> 1.:.1.."1. Le n·aziuni sun" stat e effrltu:~tr a 370C pt•r un pcrinùo di 3tl min .

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zionc tra assorbimento oli icu e conccnlraziouc del suh,tralu per lUI s iero contenente 9176 U .I.fl. Com l' si vede, la saturazione dell' cuzirna da parli' del su.bs trato a\' iene con 25 mg del polimero colorato per mi di miscela ùi reazione. Nella routinr abbiamo impie~ato l O m~ di Htbs trato per ml, u na

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.Effetto del tempo di incu­bazione sulla liberazione rli prodotti idro~olubili di de­gradt\zione del polirnero co­lorato dell'amido a d iversi' concentrazioni di a-amilasi, in U.l.f l a 37oC.

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(Ripr. da Chim. Clin . Acta, 24,

«O, 1969)

concentrazione capace di saturare tm 'attività di circa 4500 U .I./l nelle condizioni di dosaggio prima descritte.

La Fig. 2 illustra l'idrolisi en~imatica di l O mg del p olimero colora to da parte di diversi sieri H yland in funzione del tempo d'incubazione.

A nn. lat. Sul)cr. Sanitc\ (1971) 7, S67-37l

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CESKA 369

La liberazione dei prodotti di degradazione dell'amido solubili in acqua è lineare fino a circa 4600 U.l./1 per un periodo d'incubazione di 30 min.

Si possono anche utilizzare altre condizioni di idrolisi ; se s i desidera, ad es., effettuare determinazioni dell'a-amilasi dopo un p eriodo di incuba­zione più breve, ovvero a temperatura più bassa. Occorre, in tal caso, alle­stire la curva standard n elle condizioni che si vogliono adottare p er la valu­tazion e dell' attività enzimatica n ei campioni sconosciuti (2).

La curva standard può essere preparata impiegando diversi campioni di riferimento di a-amilas i. In un lavoro precedente (2) è stato discusso l'im· piego di s ieri di controllo provenient i da tre diverse fonti commerciali: Hy­lan d, Versa to] E ed E nzatrol. È stato osservato ch e il Versa to! E idroliz­zav a il polim ero colorato ad una velocità più alta ch e non gli altri due cam· pioni. Si è anche osservato che i sieri Versa to! E pot evano essere quasi com· pletamentc inibiti median te anticorpi con t ro l'a-a milasi di origine batterica (B. subtilis) , ment re i s ieri H yland ed E nzat rol venivano in vece inibiti solo in scarsa misura dai pretlctti ant isieri. Viceversa gli antisier i preparati con· tro l 'a-am1lasi di mammifero n on inibivan o il Versa to! E, mentre inibivano in misura apprezzabile i sieri di controllo H yland ed E nzatrol. Ciò indica che l'a-amilasi dei sieri di controUo disponibili in commercio appar tengono a diverse varie tà molecolari, e che alcune di esse posson o essere facilmente distinguibili m ediante .il nostro metodo di analisi. V arie diluizioni di siero e di urin a umani normali idrolizzavano il polimero colora to dell' amido in modo simile a quello dei s ieri stan dar d della H yland. T utt avia con l'urina si è riscont rat a qualche d eviazione nei confronti della curva standard p er valori alti d f"ll' attività enzimatica (3). Questo fen om eno può essere dovuto a una certa instabilità dell'a-amilasi urinaria in seguito a diluizione.

L a precisione del nostro metodo è illustrata dalla Tab. l , n ella quale ~ono riporta ti i limiti fiduciari a l 95 % per tre diverse attività della a-amilasi .

TABELLA l

Valutazione della preciSIOne del metodo proposto per il dosaggio dell'a-amilasi con amido colorato

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Cf.$KA 371

Si è fatto un confronto fra il metodo dell'amido colorato e il metodo saccarogenico, e fra il metodo dell'amido colorato e il metodo amiloclastico di Street e Close, per valori normali e per valori elevati dell'a-amilasi nelle urine e nel siero. I dati sono raccolti nella Tab. 2 che mostra un alto grado òi correlazione fra il nostro met odo e gli altri due metodi.

I dati da noi ottenuti mostrano che il metodo dell'amido colorato è ap­p licabile a ricerche di routine, in quanto fornisce una buona stima della atti­vità enzimatica ed è utilizzabile per un'ampia gamma di atthità enzimati· che. Sulla base dei confronti con gli altri due metodi dell'a-amilasi spt'ri­mentati, l'intervallo dei valori normali per l'uomo sarebbe compreso tra 86 e 280 U.l.fl per il siero, e tra 125 e 1590 U.I./1 per l'urina.

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• ...o. .•

.~nn . /$t. Su per. Sanità (1971) 7, 367- 371

l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l

Una variante lecni<"a uperativa

nella determinazione della fosfatasi alcalina

Y. )JAI.:\CHlOA c \l. \. Sli. ·\ NOS

f,abnrntorio .Ii Anali,si Clinich•. O.•pC'dal•· (;,., ..,,/,• l'ror·inriuf,. d i Busto Arsi: iu

HlASSL \TU

Gli AA. de:;;crÌ\ ono una vari an 1 e di'l In L'lodo di l\ ing· \\ ' ootlo:t al fenil­

fosfato disodit·o pl·r la det erminazioHt' d ella fo.::: fatal-i al<'alina del sicru .

La variante descritta richicclc dut· :-;oli r ea t t i' i. ùi <· tu un o contit•nt· il suhstrato c raltro il eromogeno. Tali r eattiYi t·on..,entono non ~olu di sem ·

plificar e il metodo originale, ma anche di eliminar•· alrun t' pus• ibili cnust· di error e <· di ridurre la 'ariahilit;: tiri risultati.

A nn. lat. Super. Sanità (1971) 7, 372

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Contributo allo studio di due metodi di dosaggio dell'attività creatin-fosfocbinasica del siero

A. ALBERTINI e L. SPANDRIO

Istituto di Biologia e Biochimica, Spedali Civili di Brescia

RIASSUNTO

L'attività creatin-fosfochinasica di un vasto gruppo di s ieri normali c patologici è stata determinata uttlizzando in parallelo il metodo colorime­trico da noi descritto precedentemente ed un metodo spcttrofotometrico disponibile in commercio come « monotes t» con reattivi allo s tato liofilo.

Le reazioni utilizzate per il metodo colorimetrico sono le seguenti :

creatin-fosfochinasi ATP + creatina .,.... ~ ADP + creatin-fosfato

piruvato-chinasi ADP + fosfo-enol-piruvato .,.... ~ piruvato + ATP piruvato + 2,4 dinitro-fenil-idrazina • idrazone (colorato)

Il metodo spettrofotometrico è basato sulle reazioni : cr eatin-fosfochinasi

creatin-fosfato + ADP ~ creatina + ATP csochinasi

ATP + glucosio .,.... _ _ ___ _ _, glucosio-6-fosfato + ADP G -6-P -deidrogenasi

glucosio-6-fosfato + NADP .,.... --' fi -fosfo-gluconato + + NADPH + H+

I risultati ottc.nnti indicano rhc esiste una buona correlazion e fra il metodo colorimetrico cd il s is tema spettrofotometrico c ch e entrambi sono dotati di notevole prN:i,.: ione. I valori ottenuti dimostrano rhe il sccon1lo t\

più sensibile di quello da noi propos to in precedenza. I due test permettono l' uso di sieri conservati a + 4 0C c a - 200C c pn:;;­

sono trovare entrambi una buona utilizzazione pratica n el laboratorio di rou­tine, sembrandoci il metodo spettrofotometrico piit indicato per un numero giornaliero di dosaggi limitato ed il metodo colorimetrico piit adatto per le estese indagini di « scrccning ».

A nn. lat. Suver. Sanità (1971) 7, 373

Attività enzimatiche collaterali

m una prepat'aziont: di isocitrico deidl'ogenasi purificata

H. ~fOHATTI. \ . \fO~TA 'il t' A. RUFFU

Istituto d i Chimirn Biulo~ica cl ..Il' Univcrsittì di l'uvia

La uostra ind agine riguar<la un' i~>oeitril·O deiùrogena;;i (treo-D.-isoci­trato: NADP +("") ossidorrduttasi (decarhossilante): EC 1.1.1.42) comune· mente impiegata p <"r determin azioni quantitativc J cll 'acido isoeitrico o d el NADP ... . Si tratta di un enzima, preparato dal cuore di maiale, conservato in glicerolo al soc}'o. J ,a sospensione ha un contenuto di lO mg di proteine/mi e possied<• un'attiyjt?l specifica di circa ~ Ujmg nell•· seguenti condizioni di saggio: lunghezza d 'onda 340/366 nm, temperatura 25oC, spessor e delle cuvette l cm , volume finale di 3 ml contenente: tampone imidazolo 88,33 m M pH 8; MgCl2 3,33 mM; NADP .,. sale disodieo 0.381 ml\I ; isocitrato, sale trisodico, 0,516 mM.

N ella prt·parazione enzimatica sono presenti, secondo i dati illustrativi del prodotto, aconitasi ed isocitrico deidrogenasi NAD+ dipendente in ragione di meno dello 0,2 % rispf'tto all' isocitrico deidrogcnasi-~ADP+ .

I ristùtati riferiti nel prcsrnte l:woro ci permetlono di segnalare la pre· senza di altre attivit;\ enzimatich e tra l e quali una particolarmente eleYata, que1la malico deidrogenasica.

Materiali e m etodi

NAD+, acido libero, ull'87% ; NADP+, sale disodico, all'85% ; glucosio-6-fosfato, sale disodico, al 77% ; glucosio-6-fosfato deidrogenasi (ca. 140 U/mg) ed isocitrico deidrogenas i ci sono s tati forniti dalla C.F. Boehringer e Soehne GmbH (l\iannhcim, Germania). DL-isocitrato, sale trisodico, al

(•) Nel t esto sono state impiegate le seguenti abbreviazioni: ADP: adenosin-5'-difosfato; AMP: adenosin-5'-monofosfato; NAD+: nicotinammide-adenìn dinucleotide; NADP+: nìco· tinnmmide-ndenin dinucleotide fo sfnt o.

A nn. I st. Su per. Sani te\ (1971) 7, 374- 380

l l l l l l l l

MORATrl, MONTANI E RUFFO 375

99%; ADP, sale disodico grado I puro al 96% ; acido ossalacetico grado I; AMP, sale sodico, al 99% erano prodotti della Sigma Chemical Co. (St. Louie Mo., U.S.A.). Tutti gli altri reattivi erano della E. Merck A.G. (Darmstadt, Germania).

I saggi delle attività enzimatiche sono s tati effettuati con lo spettrofo· tometro Cary mod. 14 alla lunghezza d'onda di 340 nm, alla temperatura di 25°C in un volume finale di l ml con cuvette di quarzo dello spessore di l cm. Per la prova riguardante l' isocitrico deidrogenasi :NAD+ dipen· dente la miscela di incubazione era costituita da tampone di fosfati mono· e bipotassico 0,1 M, pH 7,6; l\IgC12 0,008 }f; NAD 0,002 M e DL-isocitrato variabile da 0,016 mM a 1,6 mM (miscela A) ( 1). Una miscela analoga (miscela B) è stata impiegata per determinare !'attività malico deidrogena· iìÌca; il ~AD~ era sostituito da :'llADH + H + 0,2 rnM e l' isocitrato da acido ossalacetico 0,2 mM.

In un secondo gruppo di rict•rche la mi cela d 'incubazione{' s tata variata in modo da ~o ostituire il tampone fosfato c gli ioni l\'lg++ con tampone Tris-HCl 0,025 l\1 r '\lnC11 0,0001> M (miscela C) ('); in quc:>to ca o l'iso· citrato rd il N ADP t erano presenti in concentrazioni rispettivamente 0,8 •• 0,1 tu~f. Tutte le reazioni venivano iniziate con l'aggiunta del :.ubstrato •lopo prrincubazionc in cuvctta degli altri rcatth·i pl' r un periodo di 3 minuti.

J.n tptantitù di proteina enzimatica impiegata nt•i vari gruppi di csvuri· ru•·nti 'i1·11c preci:-:na di ' olta in Yolta.

Risulwti

lsocitriro deidro,t;masi .V. LV f dipendmte (Fig. l). - Con l'irnpit•go della mi"('t•la trincubazionu \. rontenentc 100 ,ug di prote ina enzimatica, i· rileY,IIJill' una mode ta riduzione del :\fAD-r (la assenza di impurezze di

" "

Fig. l . - Effetto di concentrazioni cr~sccnti di DL-isocitrn­Lo ,ull' ntlÌ\ i t r. dridrogc• nasica ' •\ O + dipt>n· dente.

\ \DP ndla :-oluzionr di tale cncnzima ,· .... l a t a rontrullata •·cm il -. i,;tcmn gluco, io-G-fm .. J'ato (0,072 HL,l) 1ghu·osio-6· fo:-.fato d citi rogcna;,i (0. ~ ;tg ml) in

tnmponl' fos fato) .

.{ Rll, r.t. SUDfT. SuRitd (1971) 1, J;(-3110

376 Ctnl UNICAZIO:>;t

Soltanto con roncentrazioni inferiori a 0,8 mM di DL-isoeitrato si osserva un decremento di uttivitù, mentre l'aument o a l di sopra di questo valore non è accompagnato da Yariazioni della velodtù di reazione: Ycrosimilrnentc ciò è cla imputare alla scars ità di isocitriro tl•·idrogcnasi NAO+ rupcndentc, chr p ertanto ai 8UddPtti Yalori ùi cnnccn lrazimw di i:-;ocitrato 'ieur rompi•·· tnmente saturata dal substrato.

Con l'ag~iunta di ADP o di A.MP in conrenl razioni rnmprf'~f' trn <',~

e 2 mM non s i ossf'rvano apprez7.abili incrementi ddl'attivitù della isoritrico cl<'idrogrna8i ~AD+ dipenclc;ntc, comt· era invcer eia attendersi in ha~w ali•· hr n noi c propric tÌl allosterich<' d<· li' enzima (3-8).

Aggiungendo alla miscela di reazione arido ossalacetiro neutralizzato a pH 7 con KOJI si osservu una sensibile riduzione della vdocitit di r ra­zione; con una concentraziouc di acido ossalacctico 0,0 lO ru.M si cictermina un blocco prcssoch& total~ dclJ'nttività enzimatica. Riduccmlo la conc·cn­trazione dell 'acido ossalaceti(·o a 0,005 mM l' inibizione Ì' dd 40~l! ' Analogn risultato s i ottiene ripetendo l'esperimento con una isocitrito deidrogt' na;:i NAD + dipendente estratta da mitocondri di fegato di ratto c parzialmcntr purificata. Aumentando il grado di purificazionc della ·preparazione enzi­matica mitocon driale secondo il procedimento di Plaut c Aogaichi (9), l'ini­bizione da ossalacetato subisce notevoli diminuzioni. Con la prepara7.iont· parzialmente purificata abbiamo dimostrato che l'ini.bizion~ da ossalacrtatn può esser e di tipo competitivo poiehè tende ad rssere rimossa aumentando progressivaml•nte la con(·enlraziom• drll'acido iso<'Ìtrico: <'alcolamlo infatti i valori di l /v c di l 's !>econdo il proreùimento di Lincwca,·er c Burk (10), si ottiene, con ossalacetato 0,015 mM, la tipica rappresentazione grafica della inibizione competitiva con il substrato.

Siccome il processo di purificazionc era accompagnato da una sensi bil•· perdita deiJ'atti,·it à malico dcidrogenasica, l'effetto deH'ossalacetato è tatu messo in rapporto con l'interferenza di questa proteina enzimatica nel m ecca­nismo dell'isocit rico dcidrogrnasi. Infatti è possibile che il :'{AD .H -l H~,

prodotto daU'ossidazione dcll' isocitrato, sia riossidato a spese dcll'ossalacetato che in tal modo simula un effetto inibente. Di tale ipotesi viene data conferma documentando la presenza anche n ella preparazione enzimatica commer­ciale, di una cospicua atti,-ità n;.alico dcidrogcnasica .

Mnlico deidrogenasi (Fig. 2). -Utilizzando la miscela d'incubazione B, analoga a quella impiegata p er i saggi dell'attività isocitrico deidrogenasica, l'attività malieo deidrogenasica appare m olto elevata, corrispondente a 114 U.I.fmg. Come si vede, si tratta di una presenza quantitativamcnte notevole ch e permette di supporre una possibile interferenza con l'attività isocitrico deidrogenasica NAD+ dipendente, quando nella miscela di reazione ven· gano aggiunte piccole quantità di acido ossalacetico. D'altra parte i risultati

A nn. lat. Super. Sanit~ (1971) 7, 37•-380

MORA1TI, MONTANI E RUFFO 377

relativi all'azione isocitrico deidrogenasica-NADP+- in presenza di malico deidrogenasi, permettono di prospettare la presenza nella preparazione di un'ulteriore attività enzimatica.

fig. 2. - Attività malico deidrogenasica in presen za di XADH+ H + e di ossa­lacetato 0,2 m)f.

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v AHMTit MALICO OEIIRJC(~SICA

Transidrogenasi (Fig. 3). - lncubando 200 pg di proteina enzimatica nella miscela di reazione C si ottiene una rapida e completa riduzione del coenzima piridinico e quindi un arresto dcUa r eazione. Se dopo circa 2 min

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F ig. 3 . - Effetto dell'acido ossalacetico sull'isocitrico deidrogenasi NADP+ dipendente.

d nn. I et. SuveT. Sanit~ (1971) 7, 37~-380

15

378 CO~I l!NIOZIO:-il

dall'esaurimento del NADP + si aggiungono nella cuvetta 0.4 ftmoli di o:;,a ­lacetato {in un volume di 0,05 m l) si nota una serie eli m oclifieazioni della densità ottira (D.O.) preced entC'mr ntc raggitwta: s i ha immC'diatamenlt> una rapida caduta cui segue un decremento piìt lento ma progressi,·o. Dopu un intervallo di tempo chr è inversamente dipendente daUa quantitù tli proteina enzimatica impiegata. inizia una rapida a1·cd erazione aiJa qual t· fa seguito iJ ritorno ad UJJ valore di D.O. vicino n rptPIIo iniziale do\ ulu aJla ricouv~::r::;ione pressochè totale del NADP ridotlo allo stato ossidato. L ' ultcritll't· aggiunta ùi i"ocitrato (0.8 ,amoli) produce infatti lllt uno,·o inen·mt· nto tlella D.O. analogo a quello preceden te; anche in que.;; to l~a.;; o il vall)rt' Ùt·lla U.O. r.-gn·discc a ::.ua volta in prcsrnza di O..t. ,umoli ùi os:;aJacctato. Il prot·c"~u.

come si vede dalla Fig. 3, è ciclicamrntr ripc tibilt·. L'unira possibile Rpiegazionc di tale comportamento è quella di am·

mettere la presenza nella preparazion<· enzimatica Ji tma tran~iùrogt · ·

nasi (EC 1.6.1.1.) che catalizzi la trasformazione del NADPH + H + i11 ~ADH t-H + (1 1•1z); in presenza di ossalacetato c maJit·o deidrogena:; i qucs l o ultimo verrebbe poi complrtam.entc riosc;idato. V crosimilmentc per tale pro· cesso sono sufficienti tracce di NAD+ presenti nei r ealtivi impiegati. La contaminuziont• con NADH + II+ prcformato (· da escludere poichè i rclati,·i dosaggi preliminari hanno dato t•sito nt'gati' o.

Discussione l ' conclusion i .

La presenza di attività contaminanti in una preparazione enzimnlil'a può dar luogo a valutazioni erronee. sia nel caso di studi cinetici sia quand o si verificano particolari condizioni, nella determinazione quantitati vn tli substrati o di coenzimi. Di queste possibilito'L di error e abbiamo dato qual­che esempio con l' impiego dell 'isocitrieo deidrogenasi N ADP+ dipcndcntt·.

Infatti la preparazione emr.imatica e aminata risponde ottimamente non soltanto all'impiego per dosare l'isocitrato c iJ NADP+, ma anche a qucUo p er studiare i meccanismi di r egolazione metabolica del ciclo dell 'ac ido citrico, di cui ;Jcuni di noi si sono precedentemente occupati e·13) , purchù neUe miscele di reazione non siano presenti metaboliti capaci di interferire cou le attività enzimatiche collaterali di cui essa è dotata. Ci riferiamo alJ'cfl'cllo deU'ossalacetato che in tutte le condizioni capaci di provocare la forma· zione di NAD ridotto modifica l'attivitìt isocitrico d eidrogenasica impedendo la completa t rasformazione dell'isoritrato e del NADP+ nei rispettivi pro­dotti di reazione.

Di particolare interesse ci sembra il m eccanismo di formazione del ~ADH+H+ . E sso è ben evidente nel caso in cui venga utilizzata l'isocitrico tleidrogenasi NAD+ dipendente contenuta in minime quantità nella pr e· parazione studiata: infatti, data la presenza di malico deidrogen asi, il NAD

A nn. I•t. Super. Sanità (1971) 7, 87(..380

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M ORAlTI, MONTANi E RUFFO 379

ridotto viene riossidato ad opera di quest'ultimo enzima con il conseguente mancat o assorbimento spettrofotometrico che simula un'inibizione.

P er spiegare lo stesso risultato nel caso dell'isocitrico deidrogenasi :NADP+ si deve invece ammettere la presenza n ella preparazione di una transid.rogenasi che determina una trasformazione del NADPH+ H + in :NADH + H + qualora siano contenute anche tracce di NAD+. In altri t ermini entrerebbe in gioco lo s tesso m eccanismo proprio dcll'ossidazione mitocon­driale dell 'isocitrato ch e coinvolge la interconversione dei due coenzimi piridinici ridotti e la successiva riossidazione del NADH+ H + ad opera degli enzimi della catena respiratoria e dell'02 (6• 14-21) .

Un commen to merita anche l'isocitrico deidrogenasi NAD+ dipendente. È noto infatti che t ale enzima è soggetto a r egolazione allosterica, ma tale proprietà n on è piìt rilevabile nella preparazione enzimatica da noi esaminata. Infatti la curva che rappresenta il comportamento della v elocità di reazione in fwu;ione di concentrazioni crescenti di substrato non ha l'andamento tl i tipo sigmoidc proprio degli enzimi a llost erici (5·6) ma quello di un enzima l'he obbedisce alla classica cinetica di Michaelis-l\Ientcn (22) . Ntùlo è inoltre l'effetto di attivazione da parte dcll 'ADP c dell'AMP. Di ciò p uò essere individuata la spiegazione tenendo conto che le propr ietà allost erichc sono curatterizzate da particolarità strutturali che con molta verosimiglianza possono essere alterate nel corso di processi di purificazionc e di conserva· ;;: ione tlclla proteina enzimatica.

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380 OOMUNICAZIONI

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