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UNIVERSIDAD ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA

ACTIVIDAD:14

TRABAJO PRÁCTICO

SIMULADOR HPLC

ESTUDIANTE:

ELIZABETH MUÑOZ

LUCY VIVIANA DUQUE

DORIS ADRIANA VEGA. 46453711

TUTORA:

JENNY PAOLA ORTEGA

INGENIERIA DE ALIMENTOS

JUNIO 2014

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INDICE

pag

SECCION A. Reconocimiento de los parámetros cromatograficos en

cromatografía liquida de alta eficiencia (CLAE)

Factor de separación………………………………………………………………….3

Resolución………………………………………………………………………………3

Eficiencia…………………………………………………………………………………4

Factor de retención………………………………………………………………………4

Tiempo de retención……………………………………………………………………..5

Tiempo muerto…………………………………………………………………………….5

Ancho de banda…………………………………………………………………………5

Cromatografía liquida en fase normal………………………………………………….6

Cromatografía liquida en fase reversa…………………………………………………6

Gradiente de elución…………………………………………………………………….7

Elución socrática…………………………………………………………………………..7

SECCION B. efecto de la estructura e los compuestos (solutos) y de la

composición de la fase móvil sobre la retención y la resolución.

Dibujos de las estructuras de los compuestos indicados……………………………8

Usos de cada uno de estos compuestos indicados…………………………………9

Registro para cada compuesto…………………………………………………………12

Sección c: Efecto por porcentaje del modificador en la composición de la fase

móvil sobre la retención y la resolución.

Regustro datos obtenidos de los compuestos Acetophenone (acetofenona) y

Ethylparaben (etilparabeno)……………………………………………………………15

Bibliografíag………………………………………………………………………………..

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SECCION A. Reconocimiento de los parámetros cromatograficos en

cromatografía liquida de alta eficiencia (CLAE)

Defina y explique cómo se relacionan los siguientes conceptos. Incluya cuando

corresponda, el símbolo y ecuación que representa al concepto

1. Factor de separación. (α)

Define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. La columna

puede ser selectiva a una separación, que se identifica por un valor alto de este

factor.

En términos tomados a partir de un cromatograma α se puede calcular:

2. Resolución. (Rs)

La resolución de una columna constituye una medida cuantitativa de su

capacidad para separar dos analitos, en este término si se toma en cuenta el

ensanchamiento de los picos, así que la magnitud de este valor si permite

asegurar la separación de dos picos.

Donde WA y WB son los anchos de banda de A y B respectivamente

La resolución expresada en términos teóricos es:

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3. Eficiencia. (N)

Para realizar una separación cromatografica optima, debe evitarse en lo posible, el

ensanchamiento de las bandas debido a la dispersión; en efecto cuanto más

anchas sean las bandas, menor número de ellas podrán ser resueltas en un

espacio de tiempo dado; es decir cuánto más agudos sean los picos que emergen

de una columna mejor estará actuando dicha columna. Las anchuras de las

bandas cromatograficas dependen de las características de la columna (tamaño

de las partículas del lecho estacionario, homogeneidad de este, velocidad de la

fase móvil, etc.). Se expresa como el número de platos teóricos:

El número de platos de una columna depende de su longitud, por lo que se debe

tener en cuenta la altura equivalente de un plato teórico, que relaciona la eficacia

de una columna con su longitud y se define como el cociente entre la longitud de

la columna y su número de platos teóricos

4. Factor de retención.

Este factor ( ) es adimensional expresa la retención de un compuesto por la fase

estacionaria, independiente del caudal de la fase móvil.

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5. Tiempo de retención.

Es el tiempo que transcurre después de la inyección de la muestra para que el

pico del analito alcance el detector y se le da el símbolo . O en otras palabras es

el tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el sistema cromatografico

6. Tiempo muerto.

Es el tiempo para que la especie no retenida alcance el

detector

Ancho de banda (sigma total)

Corresponde al intervalo de longitudes de onda comprendido entre los puntos en

donde la transmitancia (de la radiación emitida por la fuente y que llega a la rendija

de salida) alcanza la mitad de su máximo de transmisión o el intervalo de

6

longitudes de onda que contiene el 75% de la energía radiante que proviene del

monocromador. La anchura de banda se puede expresar en términos de la

apertura o amplitud de las rendijas, S, y la dispersión lineal recíproca del

monocromador como:

SBW = S.D-1

Cromatografía liquida en fase normal.

La fase estacionaria es polar (gel de sílice, grupos ciano, amino y diol) y la fase

móvil es no polar (hexano o isopropileter). El componente menos polar es el que

eluye primero

Cromatografía liquida en fase reversa

La fase móvil es polar (agua, metanol o acetonitrilo). El componente más polar es

el primero en eluir y la fase estacionaria es no polar (cadena hidrocarbonada que

puede ser:

Cadena larga: C:18

Cadena intermedia: C:8

Cadena corta: C:2

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7. Gradiente de elución.

Se utilizan dos o más disolventes de distinta polaridad y se varía la composición

de forma continua o mediante etapas escalonadas

8. Elución socrática.

Es la separación con disolvente de composición constante

SECCION B. efecto de la estructura e los compuestos (solutos) y de la

composición de la fase móvil sobre la retención y la resolución.

Dibuje estructuras de los siguientes compuestos utilizando las convenciones de

cuña/slash representando los ángulos de enlace

Nombre Imegen propiedades fisicas Formula

molecular

8

Acetofenona

Benzofenona

Butilparabeno

C11H14O3

Propiofenona

Etilparabeno

Propilparabeno

9

Ketoprofeno

3-nitrofenol

C6H5NO3

4-nitrofenol

C6H5N

O3

b. ¿Cuáles son los principales usos de cada uno de estos compuestos

Acetofenona

Se usa como precursor en la preparación de fragancias que se asemejan a

la almendra, la cereza, la madreselva, el jazmín y la fresa.

También se usa para preparar resinas y como aditivo en las gomas de

mascar y en cigarrillos.

A finales del siglo XIX se vendía como hipnótico y anti convulsionante con el

nombre hipnona (Hypnone™). Sus efectos sedantes se consideraban

superiores a los del paraldehído y a los del hidrato de cloral.

Benzofenona

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La benzofenona es una cetona aromática que ayuda a filtrar las

radiaciones. Esta cetona absorbe la radiación y la disipa en forma de calor.

Por esa principal característica es utilizada en la producción de perfumes,

jabones y protectores solares.

En el caso de los perfumes y jabones, la benzofenona provoca que ni el olor

ni el color, pierdan sus propiedades debido a la exposición con los rayos

UV, mientras que en los protectores solares tienen como función absorber

la radiación y transformarla en energía no nociva para la salud de la piel.

Fabricación de productos farmacéuticos (antihistamínicos, hipnóticos,

pantallas solares), cosméticos e insecticidas, en análisis, química fina, etc.

Butilparabeno

Se utiliza muchísimo en muchos productos del cuidado de la piel e incluso

en medicinas tan comunes como el ibuprofeno.

Es el anti fúngico más potente de entre los parabenos. De hecho, su

potencial microbiano es mayor que el del metilparabeno, el propilparabeno

o el etilparabeno. Es particularmente eficaz contra mohos y levaduras, y

menos contra bacterias. En cuanto a cómo funciona, parece que inhibe la

capacidad de síntesis del ADN y el ARN y con ello la capacidad de

transporte de sustancias entre membranas, lo cual retarda el crecimiento

microbiano porque les impide desarrollarse al ritmo habitual. Aún así, es

frecuente encontrárselo combinado con otras sustancias biocidas como

liberadores de formaldehido, isotiazolinonas y fenoxietanol para aumentar

sus capacidades conservadoras, así como con otros tipos de parabenos.

Propiofenona

Se utiliza en la síntesis de efedrina y derivados de propiofenona tales como

metcarinona y catinona.

Es un intermediario útil para la preparación de medicamentos que actúan

sobre el sistema nervioso central tales como los hipnóticos, ansiolíticos

Se puede también utilizar en la síntesis de alquenos arilo tales como

fenilpropanoides

Etilparabeno

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Son utilizados como conservadores protegiendo a los productos de las

levaduras y los hongos. No obstante, no son muy efectivos contra las

bacterias. Su actividad es independiente de la acidez, y adicionalmente, son

poco solubles, lo que limita sus aplicaciones (antimicrobianos y ciertas

propiedades antioxidantes) en formas farmacéuticas liquidas como jarabes,

soluciones, suspensiones e inyectables.

son usados en una gran variedad de alimentos y cosméticos.

Propilparabeno

se usa con frecuencia en cosméticos, productos de cuidado para la piel y

comida. Tiene una toxicidad generalmente baja por ingestión

Es muy poco soluble en agua fría, por lo que se trabaja en procesos con

calor. Es anti fermentativo, tiene amplio espectro antimicrobiano es

bacteriostático y antioxidante, combate mohos y levaduras. Es muy utilizado

en cosméticos (es el segundo producto de este tipo más utilizado), pero

también es empleado en la industria alimenticia, se recomienda utilizarlo del

0,05 al 0,1%; en la preservación de grasas en una proporción del 0.1%.

Ketoprofeno

El ketoprofeno de prescripción se usa para aliviar el dolor, sensibilidad,

inflamación (hinchazón) y la rigidez causada por la osteoartritis (artritis

causada por un deterioro del recubrimiento de las articulaciones) y la artritis

reumatoide (artritis causada por la hinchazón del recubrimiento de las

articulaciones). También se usa para aliviar el dolor, incluyendo el dolor

menstrual (dolor que se presenta antes o durante el período menstrual). El

ketoprofeno sin prescripción o de venta libre se usa para aliviar dolores

leves causados por cefaleas (dolor de cabeza), períodos menstruales, dolor

de muelas, resfrío común, dolores musculares, dolor de espaldas y para

reducir la fiebre. Pertenece a una clase de medicamentos llamados

antiinflamatorios sin esteroides. Funciona al detener la producción de una

sustancia que causa dolor, fiebre e inflamación.

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El ketoprofeno por vía oral es efectivo y bien tolerado como tratamiento

agudo en los ataques de migraña.

3-nitrofenol

Se utiliza en peletería como fungicida,

4-nitrofenol

Es usado principalmente en la manufactura de medicamentos, fungicidas, tinturas

y para oscurecer el cuero.

3. Abra el HPLC simulador (http://www.hplcsimulator.org/)

4. configure el simulador así:

c. posteriormente, registre para cada compuesto:

Tiempo de retención ( )

Factor de retención (K’)

Ancho de banda (sigma total – )

Adjunte imagen del cormatograma obtenido

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5. cambie la composición de la fase móvil de metanol a acetonitrilo

e. posteriormente, registre para cada compuesto:

Tiempo de retención ( )

Factor de retención (K’)

Ancho de banda (sigma total – )

Adjunte imagen del cormatograma obtenido

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f. explique por que se da el cambio en los tiempos de retención y en la

separacion de los compuestos cuando el metanol es sustituido por el

acetonitrilo.

Los solventes polares arrastran mas eficazmente los compuestos mas

retenidos en la fase estacionaria

Los solventes menos polares, arrastran muy lentamente a los compuestos los

compuestos más polares estarán menos retenidos que los menos polares.

Los tiempos de retención disminuyen cuando menor sea la proporción de

agua, cuando menos polar sea el disolvente empleado.

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El tiempo de retención aumenta con la adición de disolvente polar a la

fase móvil y disminuye con la introducción de disolventes más

hidrológicos.

En que caso se obtiene una mejor separación

En el primer caso, cuando utilizamos metanol, ya que se observan 8 de las 9

muestras y con picos bien definidos y separados, solo encontramos un

compuesto que sale al mismo tiempo con otro. Mientras que en el segundo

caso, utilizando acetonitrilo, vemos 7 de 9 compuestos y en algún caso están

integrados varios picos en 1

g. ¿Cuál es la importancia del agua en la composición de la fase móvil?

El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido

trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos

La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las

interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre

un disolvente relativamente polar (el agua es altamente polar) , un

compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar.

Sección c: Efecto por porcentaje del modificador en la composición de la

fase móvil sobre la retención y la resolución.

1. En el listado de compuestos, elimine 7 solutos dejando solo a

Acetophenone (acetofenona) y Ethylparaben (etilparabeno).

2. Fije las condiciones del simulador de acuerdo con las indicaciones de la guía: a) Registre el tiempo de retención, el factor de retención y el sigma total para

los dos compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.

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Compuesto 95% Tiempo de retención (Tr)

factor de retención K’

sigma total

Acetofenona

1,1185 0,0516 0,5485

Etilparabeno

1,1196 0,0526 0,5490

b) Calcule el tiempo muerto.

El tiempo muerto es de 65 seg.

c) Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.

3. Cambie gradualmente el porcentaje de metanol en intervalos de 10% iniciando en

95% y terminando en 5% (95%, 85%, 75%, 5%).

3. Registre el tiempo de retención, el factor de retención y el sigma total para los dos

compuestos. Adjunte una imagen del cromatograma obtenido.

% Compuesto Tiempo de retención (tR)

factor de retención K’

sigma total

Imagen

95 Acetofenona

1,1185 0.0516 0.5485

Etilparabeno

1,1196 0.0526 0.5490

85 Acetofenona

1.1802 0.1096 0.5654

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Etilparabeno

1.1987 0.1270 0.5739

75 Acetofenona

1.3109 0.2325 0.6243

Etilparabeno

1.3897 0.3066 0.6601

65 Acetofenona

1,5885 0,4935 0.7571

Etilparabeno

1,8506 0,7399 0.8785

55 Acetofenona

2,1774 1,0472 1,0401

Etilparabeno

2,9628 1,7856 1,4101

45 Acetofenona

3,4272 2,2222 1,6380

Etilparabeno

5,6471 4,3094 2,6934

35 Acetofenona

6,0793 4,7157 2,8960

Etilparabeno 12,1254 10,4002 5,7717

25 Acetofenona

11,7073 10,0070 5,5334

Etilparabeno 27,7601 25,0997 13,1177

15 Acetofenona

23,6504 21,2358 11,0663

Etilparabeno 65,4928 60,5755 30,6429

5 Acetofenona

48,9946 45,0642 22,7749

Etilparabeno 156,5566 146,1926 72,7735

e) Calcule el tiempo muerto. Podemos darnos cuenta que el tiempo muerto va disminuyendo, con el cambio del porcentaje del metanol, en el 95% el tiempo muerto es de 65 seg, y baja gradualmente con el cambio de porcentaje, para el 5% el tiempo muerto es de o,8 milicimas de segundo. f) Calcule la resolución, α, para los dos compuestos.

WA y WB son los anchos de banda de A y B respectivamente.

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Resolución Acetofenona

Resolución Etilparabeno

4. Repita el mismo proceso cambiando el metanol por ACETONITRILO.

Tiempo de retención ( )

Factor de retención (K’)

Ancho de banda (sigma total – )

Adjunte imagen del cromatograma obtenido

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4. Repita el mismo proceso cambiando el metanol por acetonitrilo

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5. Con los hallazgos realizados en esta sección, elabore una conclusión

sobre el efecto del porcentaje del modificador en la composición de la fase

móvil sobre la retención y la resolución.

A medida que se va utilizando mayor cantidad de solvente menos polar los

tiempos de retención son menores, es decir a menor cantidad de agua como

solvente menor tiempo de retención.

Si fuera contratado en un laboratorio para separar, por medio de

cromatografía liquida, de una mezcla los compuestos acetofenona y

etilparabeno. Cual seria la mejor composición de fase móvil a emplear?

Justifique?

Considero que la mejor composición de fase móvil es la mezcla de agua: metanol

en las condiciones 5 ( 45:55 ) y la 6 (55:45) porque los compuestos salen con

diferencia de tiempo prudencial, los picos están bien definidos, y gastaríamos

menos solventes que en otras condiciones. Los dos reactivos tienen el mismo

riesgo de inflamabilidad (3), igual riesgo de reactividad (0) pero tiene menor riesgo

de salud el metanol (2) y el acetonitrilo (3)

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BIBLIOGRAFIA

http://www3.uah.es/mol_play/1.htm http://www.quiminet.com/productos/butilparabeno-6373322859.htm http://www.madrimasd.org/blogs/remtavares/2009/02/20/113222 http://www.hplcsimulator.org/http://www.youtube.com/watch?v=wYEDJu0pJy4 http://www.hplcsimulator.org/index.php http://www.ulpgc.es/hege/almacen/download/39/39360/separaciones_po r cromatografia_1.pdf http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatogr afia/principios_de_cromatografia.pdffile:///D:/DATOS/Downloads/file.pdfhttp://ocw.uv.es/ocw-formacio-permanent/2011-1-35_Manual.pdf