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REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD EXPERIEMTAL DE CIENCIAS DIVISION DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS

MAESTRIA DE MICROBIOLOGIA

COMPORTAMIENTO DEL VIRUS DEL SÍNDROME DEL TAURA EN CAMARONES (Litopenaeus vannamei) CULTIVADOS CON AGUA DEL LAGO DE MARACAIBO

DURANTE UN CICLO DE PRODUCCIÓN

TRABAJO PRESENTADO ANTE LA DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS DE LA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS PARA OPTAR AL

GRADO DE MAGISTER SCIENTIARUM EN MICROBIOLOGÍA

Autor: Ing. Agr. María Isabel Montiel Villalobos C.I.V.- 15.009.544

Tutora: Dra. Zoraida Medina

Maracaibo, marzo 2011

DEDICATORIA

A mi familia en especial a

mis padres, hermanos y sobrinos,

quienes me apoyaron en

todo momento con su palabra

de aliento y llenando de alegría

todos los días de mi vida

AGRADECIMIENTOS

A Dios y la Virgen, por estar presentes en todos los momentos y circunstancias de

mi vida abriéndome las puertas que debo seguir para ser la persona que soy hoy en

día.

A mis padres y hermanos, a mi tutora, a mi cotutor, al personal del Standard Sea

Food, y a todas aquellas personas que colaboraron con una montaña o un granito de

arena en la realización de esta investigación; guiándome con su apoyo, consejo y

paciencia; colaborando de esta manera en mi formación y crecimiento tanto personal

como profesional

A los Laboratorios de Sanidad Acuícola (LASA) y de Anatomía Patología,

pertenecientes al Instituto Tecnológico de Sonora (ITSON) por su apoyo y formarme

académicamente para la realización de esta investigación.

A la Unidad Técnica Fitosanitaria (UTF), al Laboratorio de Anatomía Patológica de la

Policlínica Veterinaria y al Laboratorio de Referencias Virológicas de la Facultad de

Medicina, todos pertenecientes a la Universidad del Zulia; gracias por su colaboración

Al FONACIT, por el financiamiento otorgado a través de su programa de becas de

Formación de Talento Humano de Alto Nivel.

A todos mis más sinceros agradecimientos !

ÍNDICE DE CONTENIDO

Dedicatoria……………………………………………………………………………….. 4

Agradecimiento………………………………………………………………………….. 5

Índice General…………………………………………………………………………… 6

Índice de Tablas…………………………………………………………………………. 7

Índice de Gráficos……………………………………………………………………….. 8

Resumen…………………………………………………………………………………. 10

Abstract…………………………………………………………………………………... 11

Introducción……………………………………………………………………………… 12

Metodología……………………………………………………………………………… 20

Resultados y Discusión………………………………………………………………… 27

Conclusiones…………………………………………………………………………….. 44

Recomendaciones………………………………………………………………………. 45

Referencias Bibliográficas……………………………………………………………… 46

Anexos……………………………………………………………………………………. 53

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1.- Distribución de los animales por Muestreo……………………………….. 20

Tabla 2.- Proporción de animales infectados / no infectados según la zona de

muestreo dentro de las PP mediante el diagnóstico histológico…………………… 27


muestreo dentro de las PP mediante el diagnóstico molecular……………………. 28

Tabla 4.- Proporción de animales infectados / no infectados por TSV en cada

una de las fases de la enfermedad en relación a la época de muestreo

empleando el diagnóstico molecular…………………………………………………

31

Tabla 5.- Proporción de animales infectados / no infectados según la época de

muestreo dentro de las PP empleando el diagnóstico histológico………………… 32

Tabla 6.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases

de la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico

histológico………………………………………………………………………………...

33

Tabla 7.- Proporción de animales infectados según la zona de muestreo dentro

de las PP mediante el diagnóstico histológico……………………………………….. 34

Tabla 8.- Identificación de las diferentes fases de una infección causada por

TSV……………………………………………………………………………………….. 40

ÍNDICE DE GRÁFICOS

Gráfico 1.- Proporción de animales infectados según la zona de muestreo

dentro de las PP empleando el diagnóstico histológico……………………………..

29

Gráfico 2.- Proporción de animales Infectados según la época de muestreo

dentro de las PP empleando el diagnóstico histológico……………………………..

33

Gráfico 3.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las

fases de la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico

histológico, Piscina “A…………………………………………………………………...

35


fases de la enfermedad según la zona dentro de la PP empleando el

diagnóstico histológico, Piscina “A”……………………………………………………

35



por histológico, Piscina “C”……………………………………………………………..

36


fases de la enfermedad según la zona de muestreo empleando el diagnóstico

histológico, Piscina “C…………………………………………………………………..

37



histológico, Piscina “D…………………………………………………………………..

38


fases de la enfermedad según la zona de muestreo empleando el diagnóstico

histológico, Piscina “D…………………………………………………………………..

38

Gráfico 9.- Prevalencia del TSV en cada época de muestreo empleando el

diagnóstico histológico………………………………………………………………….. 42

Gráfico10.- Prevalencia del TSV en cada época de muestreo empleando el

diagnóstico molecular…………………………………………………………………...

43

Montiel-Villalobos, María I. COMPORTAMIENTO DEL VIRUS DEL SÍNDROME DEL TAURA EN CAMARONES (Litopenaeus vannamei) CULTIVADOS CON AGUA DEL LAGO DE MARACAIBO DURANTE UN CICLO DE PRODUCCIÓN. Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. 2011. 56p.

RESUMEN

El cultivo de camarones (Litopenaeus vannamei), es considerada una alternativa de producción para los países en vías de desarrollo, debido a los ingresos que esta actividad puede generar; pero el crecimiento tan vertiginoso de la misma trajo consigo consecuencias irreparables, que provocó la aparición de problemas causados por distintos agentes (bacterias, hongos, parásitos y virus); estos últimos reportan pérdidas muy importantes (90%). En Venezuela a mediados del 2004 nuestras zonas productoras se vieron afectadas por la presencia del Virus del Síndrome del Taura (TSV), se piensa que el establecimiento de este ha impedido el desarrollo adecuado de esta actividad en el país. Por lo que estimar su prevalencia es fundamental, para aplicar los correctivos que sean necesarios, esta se determino a través de dos métodos de diagnóstico (Molecular e Histológico), en 240 muestras de camarones provenientes de piscinas de producción (PP) que utilizan el Lago de Maracaibo para cubrir sus requerimientos de agua. Los resultados indicaron que el TSV esta presente en la zona estudiada con prevalencias que van del 5 al 40% aproximadamente, el mismo se identifico desde la realización del primer muestreo (30 días de ser colocadas la post-larvas en las PP), se tiene que la mayor proporción de individuos infectados se ubico a las salidas de las PP, siendo esta la zona con mayor concentración del virus. La PP mas enferma fue la “A”; la misma es la primera en recibir el agua, con lo que podemos inferir que esta juega un papel fundamental en el establecimiento y diseminación del virus. En el análisis de las muestras se identificaron las diferentes fases de una infección causada por TSV, la distribución de cada una de ellas fue variable en relación, a la época de muestreo y a posición dentro PP, por lo que se recomienda tratarlas individuamente. Palabras Clave: comportamiento, TSV, camarones, métodos de diagnóstico, histología, PCR, Lago de Maracaibo.

Correo electrónico: [email protected]

mailto:[email protected]�

Montiel-Villalobos, María I: TAURA SYNDROME VIRUS BEHAVIOR ON CULTIVATED SHRIMP (Litopenaeus vannamei) WITH WATER IN LAKE MARACAIBO DURING A PRODUCTION CYCLE. Degree Thesis submitted to the Division of Graduate Studies, Faculty Experimental of Sciense, La Universidad del Zulia, eligibility for the Title of Magister Scientiarum in Microbiology. Maracaibo, Venezuela, 2011. 56p.

ABSTRACT

The cultivation of shrimp (Litopenaeus vannamei), is considered a production alternative for developing countries, due to revenues that this activity can generate; But such rapid growth brought the same irreparable consequences, which led to the emergence of problems caused by different agents (bacteria, fungi, parasites and virus), the latter reported major losses (90%). In Venezuela in mid-2004 our production areas were affected by the presence of Taura Syndrome Virus (TSV), there is thought that the establishment of this one has prevented the suitable development of this activity in the country. For what to estimate his prevalence is fundamental, to apply the corrections that are necessary, this was determined by two diagnostic methods (Molecular and Histological), in 240 samples of shrimp from pools of production (PP) using the Maracaibo Lake to cover their water requirements. The results indicated that TSV is present in the study area with prevalence ranging from 5 to 40% approximately, it was identified since the realization of the first sampling (30 days of being placed post-larvae in the PP), had that the major proportion of infected individuals is located to the exits of the PP, being this the zone with major concentration of the virus. The sicker PP was the "A"; the same one is the first to receive the water, with what we can infer that this one plays a fundamental paper in the establishment and dissemination of the virus. In the analysis of the samples there were identified the different phases of an infection caused by TSV, the distribution of each one of them was variable in relation,To the epoch of sampling and to position inside PP, so it is recommended to treat individually. Keywords: behavior, TSV, shrimp, methods of diagnosis, histology, PCR, Lake Maracaibo. Email: [email protected]

mailto:[email protected]�

11

Comportamiento del Virus del Síndrome del Taura en camarones (Litopenaeus vannamei) cultivados con agua del Lago de Maracaibo durante un ciclo de producción. Realizado por Ing. Agr. María Isabel Montiel V. 2011

INTRODUCCIÓN

Al tratar de definir el término acuicultura, muchos de los investigadores tienen una

definición diferente, que va desde la más sencilla hasta la más compleja, sin embargo,

todas emplean la misma base o idea central: la cría de organismos acuáticos (peces,

moluscos, crustáceos y plantas) en confinamiento, implicando la intervención humana

en el proceso, con lo que se mejora el nivel de producción para la obtención de

beneficios económicos y sociales (FAO, 2008). Adicionalmente, la acuicultura ha sido

considerada como una actividad multidisciplinaria, ya que depende de conocimientos

específicos de biología pesquera, fisiología, genética, botánica, zoología, ecología,

patologías, así como de química de suelos y aguas para lograr su adecuado desarrollo

y control (Juárez y Palomo, 1985). A partir de estas premisas podríamos definir a la

camaronicultura como una actividad productiva, multidisciplinaria, en la cual se crían

camarones en confinamiento con el objetivo principal de producir un beneficio

económico, social y alimentario.

La producción camaronícola a nivel mundial tiene un gran auge, siendo ésta la única

industria primaria que ha logrado un crecimiento constante desde sus inicios en la

década de los setenta (Josupeit y Lem, 2000), La misma ha tomando importancia

mundial debido principalmente, a que la pesquería industrial y artesanal son

sumamente costosas, haciéndolas poco atractivas para los pescadores artesanales e

industriales (Álvarez, 1998). Y si adicionalmente consideramos que para el año 1993 ya

se reportaba una sobreexplotación de las zonas de producción, con lo cual estas

estaban llegando a su limite de extracción, la acuicultura surge como una nueva

alternativa para suplir la demanda de productos de origen pesquero a una población

que crece exponencialmente día tras día (García, 1993). Además, considerando que la

demanda mundial de productos pesqueros, y más específicamente del camarón, es de

aproximadamente el 20% de todas las exportaciones pesqueras, la camaronicultura

representa una alternativa de producción para países en vías de desarrollo (Brock,

1997).

INTRODUCCIÓN 12


La camaronicultura en Latinoamérica aún no se ha establecido completamente,

aunque la misma ofrece una tasa interna de retorno muy alta; se requiere de elevados

costo de producción, y si los insumos no son utilizados racionalmente, no se garantiza

cubrir los gastos de instalaciones, materia prima, personal, alimento, entre otros

(Cervigon,1983). Sin embargo, no hay duda de que puede llegar a establecerse como

una industria sólida y proveer el camarón de mejor calidad que pueda ser puesto en el

mercado, además de hacerlo de una forma sostenible tanto social como

medioambientalmente; ya que la misma a sido catalogada como actividad conciliadora

con el medio ambiente porque en ella pueden ser utilizados suelos de baja

permeabilidad y con alto contenido de sales, los cuales, bajo otras condiciones no

podrían ser incorporados en algún tipo de actividad agrícola (Alpuche y col., 2005).

En Venezuela, las primeras prácticas a nivel experimental que se dieron con la

producción de camarones fueron en el año 1974, pero no fue hasta los ochentas que se

logró la domesticación y desove de las especies (Cervigon, 1983). De esta manera, en

los años noventa se da inicio a un crecimiento pausado pero constante de la industria

camaronera venezolana, con un futuro promisorio debido a las características

biogeografías y condiciones ambientales favorables del país, por lo que ya para

mediados del año 2000 la industria se desarrollaba de manera sostenible; y si se

compara la producción de camarón en Latinoamérica con la industria camaronícola

Venezolana esta superaría la producción de otros países establecidos y reconocidos

como grandes productores (Aguirre, 2001).

En los últimos años la camaronicultura ha logrado un desarrollo importante, a pesar

de los problemas biológicos, tecnológicos y económicos que han impedido su óptimo

desarrollo (FAO, 2006). A escala global, la industria del camarón ha experimentado

pérdidas devastadoras ocasionadas por la aparición de enfermedades, que en su

mayoría son de índole viral (Pendini, 1984; Rodríguez, 1998). La presencia de

enfermedades bacterianas, micóticas y protozoarias entre otras, son fácilmente

INTRODUCCIÓN 13


controlables con adecuadas medidas de bioseguridad (Lotz, 1997; Lightner, 2005); ya

que en la mayoría de los ocasiones son causadas por agentes que forman parte de la

microflora normal de ecosistemas en las piscinas de producción, que bajo condiciones

de estrés del hospedador se vuelven patógenas, cuando se afectar el equilibrio natural

de estos (Guzmán y col., 2004; Gómez, 2006; Gullian y Rodríguez, 2002).

Caso contrario sucede con las enfermedades virales ya que cuando éstas se

establecen su diseminación es abrumadora y si no se maneja adecuadamente pueden

llegar a reportarse mortalidades de hasta el 100% (Brock, 1997; Alvares, 1998;

Morales, 2004). Por esta razón las enfermedades de origen viral se consideran como

uno de los mayores problemas de la industria, hasta la fecha se han identificado más de

20 tipos de virus que afectan la producción camaronícola a nivel mundial (Lightner y

Redman, 1998; Aguirre, 2001); a las enfermedades virales se le atribuyen perdidas

estimadas en billones de dólares y el colapso de grandes industrias productoras como

es el caso de Taiwán en 1987, China en 1992, Ecuador en 1994 y 1999 y Venezuela en

el 2004, entre otras (Chávez y Montoya, 2004; Conroy, 2005).

El TSV fue identificado por primera vez en la región del río Taura del Ecuador, de allí

su nombre “Virus o Síndrome del Taura” (TSV) (Morales, 2004; Brock y Main, 1994), y

hasta 1996 se pensó que la distribución del virus se limitaba a las zonas productoras de

América (Lightner, 1996); esta teoría fue rechazada cuando el virus fue aislado por

primera vez en Taiwán, donde causó grandes pérdidas económicas (Yu y Song, 2000);

se estima que las pérdidas o mortalidades causadas por este virus son acumulativas y

van desde un 40% pudiendo llegar alrededor del 95% (OIE, 2009). El TSV es un virus

de ARN que se replica en el citoplasma de la célula huésped, el tamaño promedio de

una partícula de TSV es 30 - 32nm (Pantoja y Lightner, 2008; Morales, 2004) de

morfología icosaédrica; clasificado dentro del género Dicistroviridae y se ubica entre los

virus que no tienen familia asignada, (ICTV, 2008; Mayo, 2005).

INTRODUCCIÓN 14


Esta infección viral es típica de la fase de engorde y ocurre aproximadamente entre

los 14 y 40 días después de que son introducidas las postlarvas (PLs) en los estanques

o piscinas de producción (OIE, 2009; Lightner y Pantoja, 2005, Morales, 2004); en

campo puede ser identificada por una coloración rojiza de los apéndices y del cuerpo en

general, también se muestra zonas de melanización y necrosis en el exoesqueleto

además de dificultad para endurecerlo, pérdida del apetito y debilitamiento que conlleva

a una muerte segura (Lightner y Pantoja, 2005; Conroy, 2007; Morales, 2004). Esta

sintomatología puede ser confundida con una vibriosis la cual es una enfermedad de

origen bacteriano (Lightner y Pantoja, 2005). Razón por la se tiene que confirmar la

presencia o ausencia de cualquier patógeno a través de los distintos métodos de

diagnóstico existente, la utilización de uno o el conjunto de ellos dependerá de

diferentes factores como sensibilidad, especificad, experiencia requerida y costo (Vélez

y Bonami, 2006), mientras para el caso especifico de los virus dependería del que se

desea identificar (Lightner, 2005).

El cuerpo del camarón (exoesqueleto) por sí solo ya crea una barrera física que

impide la entrada de patógenos, ya sean los que tratan de penetrar a través de la

superficie externa, o los que intentan hacerlo a través del intestino anterior y posterior

(Jiravanichpaisal y Miyazaki, 1997; Alday - Sanz y col., 2002; Lightner y Pantoja, 2005);

cuando se supera esta barrera inicial y se da la exposición inicial la respuesta celular es

variada, que en el caso especifico de una infección por TSV las reacciones celulares se

traducen en infiltraciones hemocitarias y en la formación de esferoides en el órgano

linfoide, el cual tiene como función principal limpiar la hemolinfa de las partículas virales

circulantes (Hasson y col., 1999a). En este punto el desarrollo de una infección por TSV

es inevitable ya que se dispersaran las partículas virales a través del hemoceloma

(cavidad que contiene al hemolinfa) del camarón.

Durante los estadios previos a la ecdisis (la cual ocurre aproximadamente cada 15

días). Las células del epitelio cuticular son altamente activas siendo un blanco ideal

INTRODUCCIÓN 15


para el desarrollo del virus, el TSV comienza a replicarse a expensas de las funciones

normales de estas células; en este punto nos encontramos en la etapa aguda de una

infección por TSV, esta se manifestara con mayor intensidad en los estadios críticos de

la ecdisis, muchos de los camarones mueren durante esta etapa; los que sobreviven a

la muda entran en la fase crónica o de transición de la enfermedad y generalmente

exhiben lesiones melanizadas en la cutícula, los camarones afectados en estas fases

pueden sufrir otro episodio agudo de la enfermedad durante la siguiente muda o bien

puede que lleguen a mudar normalmente y recuperarse. Durante la etapa crónica de la

infección los camarones pueden ser portadores del virus pero se ignora por cuanto

tiempo, se creer que la persistencia del virus podría llegar a ser de hasta 12 meses

(Hasson, 1999b; Pantoja y Lightner, 2008).

Mediante el diagnóstico histológico se pueden identificar las diferentes fases de una

infección por TSV: Fase aguda: en ella visualizaran áreas multifocales de necrosis en el

epitelio cuticular y en la superficie general del cuerpo, los apéndices, las branquias y en

la parte caudal-anterior del tubo digestivo, las células del tejido conectivo subcuticular y

las fibras basales del músculo estriado adyacentes al a este están ocasionalmente

afectadas. En algunos casos graves de la fase aguda del TSV, el epitelio de la glándula

antenal también está destruido, generalmente se evidencian numerosos focos de

células afectadas que muestran una aumentada eosinofilia en el citoplasma y núcleos

picnóticos y cariorréticos, a menudo estas lesiones son muy en la fase aguda. Los

restos citoplasmáticos de las células necróticas presentaran por lo general cuerpos

esféricos (1–20μm de diámetro) cuya tinción varía de eosinófila a débilmente basófila,

estas estructuras, junto con los núcleos picnóticos y cariorréticos, son consideras como

patognomónica para la enfermedad, y es utilizada para la identificación cuando no hay

necrosis concurrente de las células parenquimales de los túbulos del órgano linfoide.

Por otra parte la ausencia de infiltración hemocítica y de otros signos de una respuesta

inflamatoria importante del hospedador distingue la fase aguda del TSV de la fase de

transición. (Morales, 2004; OIE, 2009; Hasson y col., 1999a; Lightner y Pantoja, 2005).

INTRODUCCIÓN 16


Fase de transición o de recuperación:

En la fase de transición del TSV, las

lesiones cuticulares disminuyen tanto en cantidad como en gravedad, y son

reemplazadas por una abundante infiltración e acumulación de hemocitos en los lugares

de necrosis. Las masas de hemocitos pueden melanizarse dando lugar a manchas

negras irregulares que caracterizan la fase de transición de la enfermedad (OIE, 2009).

El órgano linfoide en esta fase de una infección por TSV, presentara esferoides tipo B,

así mismo se puede evidenciar una mayor destrucción celular con los que se supone

una mayor replicación viral (Hasson y col., 1999a).

Fase crónica

; en esta fase los animales no manifiestan síntomas generales, e

histológicamente el único signo de infección es la presencia de numerosos esferoides

Tipo C en el órgano linfoide, que pueden permanecer asociados al cuerpo principal del

órgano linfoides, o que pueden independizarse y convertirse en los esferoides

prominentes (OIE, 2009; Hasson y col., 1999a).

La utilización de métodos de detección moleculares ha facilitado el estudio de los

virus, con ellos se han logrado identificar la secuencia del TSV, con lo que se ha

conseguido definir las diferentes variantes de este (Côte y col., 2008), así como facilitar

los diagnósticos confirmatorios, disminuyendo el tiempo de respuesta. Además con la

utilización de estos métodos también se pueden identificar las diferentes fases de una

infección causada por TSV ya sea a través de la utilización de sistemas de diagnósticos

comerciales (IQ2000 TSV), o el uso de primer preparados (Aguado y col., 2008; Cuéllar,

2008).

En Venezuela los principales problemas de enfermedades identificadas en camarón

eran los causados por protozoos epibiontes, hongos, bacterias filamentosas,

gregarinas, rickettsias, bacteria del genero vibrio, parásitos metazoos y algunos virus

como es el caso de Baculovirus penaei (BVP) y el virus de la Necrosis Infecciosa

Hipodérmica y Hemocítica (IHHNV). A finales del año 2004, se identificó la presencia

INTRODUCCIÓN 17


del TSV en las zonas de producción, este virus había sido reportado en otras zonas a

nivel mundial pero no en Venezuela (Conroy, 2005). Muchos factores influyen en la

diseminación de una enfermedad viral como: el movimiento de organismo acuáticos

(vivos o muertos), el tráfico de organismos (reproductores o postlarvas) sin la adecuada

certificación sanitaria, aguas contaminadas, presencia en especies silvestres, entre

otros (Chávez y Montoya, 2004).

Luego de la confirmación de la presencia del TSV, se implementaron medidas de

bioseguridad con la finalidad de evitar más diseminación, algunas de estas medidas

fueron: 1) la prohibición del movimiento de animales dentro y fuera del país, y 2) la

importación de larvas. Actualmente, no se llevan reportes acerca del estatus sanitario

de las zonas de producción Venezolanas, sin embargo, los productores afirman que sus

problemas de altas mortalidades con bajos porcentajes de supervivencia, baja talla y

peso al momento de la cosecha, se deben en gran medida a esté desconocimiento, y

por esta razón consideran que la industria no se está desarrollando adecuadamente

(Conroy, 2007).

Por todas estas razones, es necesario evaluar la presencia del TSV en zonas de

producción venezolanas, lo cual permitirá conocer la prevalencia del virus, con lo cual

se puede inferir posteriormente sobre la situación sanitaria de las granjas camaroneras

que utilizan el agua proveniente del Lago de Maracaibo, para realizar su actividad, y

establecer algunas pautas sobre lo que está sucediendo en la industria camaronera

Venezolana, la cual no ha logrado recuperarse de lo sucedido en el año 2004 con la

entrada y establecimiento del TSV en el país.

INTRODUCCIÓN 18


Objetivo general:

Evaluar el efecto de la presencia del Virus del Síndrome del Taura durante el

crecimiento de camarones (L. vannamei) en un ciclo de producción.

Objetivos específicos:

• Determinar la zona con mayor nivel de Virus del Síndrome del Taura en las

piscinas de producción.

• Determinar el comportamiento del Virus del Síndrome de Taura dentro de la

piscina de producción durante un ciclo.

• Establecer las diferentes fases de infección del Virus del Síndrome del Taura

mediante el diagnóstico histopatológico en camarones (L. vannamei) durante un

ciclo de producción.

• Determinar la prevalencia del Virus del Síndrome del Taura en camarones (L.

vannamei) durante un ciclo de producción.

19


METODOLOGÍA

Población de Estudio

La población objeto de estudio estuvo compuesta por camarones (L. vannamei) de

una población cultivada con aguas del Lago de Maracaibo, específicamente en una

granja situada en la costa occidental, Municipio La Cañada de Urdaneta en el estado

Zulia. Los muestreos se realizaron durante un ciclo de producción, pasados 30 días de

la siembra de las postlarvas (PLs) en las piscinas de producción (PP) hasta la cosecha,

la cual ocurrió aproximadamente a los 120 días.

Colección, fijación y preservación de las muestras

Se empleó una atarraya para recolectar los animales en cada una de las zonas

seleccionadas dentro de las PP (Anexo 1). La muestra estuvo constituida por 240

organismos seleccionados aleatoriamente dentro de las PP. Los muestreos se iniciaron

pasados 30 días de la siembra de las PLs. Se realizaron cuatro muestreos, separados

entre sí por 30 días aproximadamente y se evaluaron cuatro piscinas, en ellas se

establecieron tres zonas de muestreo: 1) compuerta de entrada a la PP, 2) parte media

de la PP, y 3) salida de la PP (Anexo 2). Se colectaron 60 individuos por muestro,

distribuidos como lo indica la (Tabla 1).

Tabla 1.- Distribución de los animales por Muestreo.

Posición dentro de la piscina de producción (PP)

Piscina de Producción Entrada Medio Salida

A 5 5 5

B 5 5 5

C 5 5 5 Total D 5 5 5 60

METODOLOGÍA 20


Los camarones extraídos de cada una de las PP se colocaron en cestas plásticas

que facilitaban el manejo de las muestras, de allí se seleccionaron aleatoriamente los

cinco animales que conformaron esa zona de muestreo, estos se colocaron en una

cubeta con suficiente agua (proveniente de la misma piscina). Se procuró generar el

menor estrés posible a los animales, este procedimiento se repitió en cada una de las

zonas dentro de la PP y en cada una de las piscinas seleccionadas.

Para fijación de las muestras empleadas en el diagnóstico molecular se utilizaron los

pleópodos de los animales ya seleccionados, separados en dos grupos: 1) el “pool” de

la posición correspondiente a cada punto en la PP: el cual estaba constituido por

pleópodos de los cinco animales colectados en esa zona; y 2) muestras individuales:

conformada por pleópodos de cada individuo. Todas las muestras fueron colocadas en

viales con etanol al 95% los cuales se organizaron en cajas plásticas debidamente

identificadas, y se conservaron el laboratorio en un lugar limpio y fresco hasta el

momento de su procesamiento (Anexo 3).

Luego de la fijación de las muestras que fueron empleadas para el diagnóstico

molecular, se procedió a fijar el material que se utilizaría en el diagnóstico histológico,

utilizando como solución fijadora (Davidson), la cual debe ser preparada con

anterioridad utilizando: 330 ml de etanol al 95%, 220 ml de Formalina al 36%, 115 ml

de Acido Acético Glacial y 335 ml de agua destilada (Bel y Lightner, 1998).

Para realizar un fijado adecuado, se utilizó una cantidad de solución fijadora

equivalente al 10% del peso del animal y se inyectó en diferentes puntos del cuerpo.

Iniciando por el área lateral, directamente en el hepatopáncreas (en sus laterales y en

su parte anterior y posterior); todo signo de vida debe cesar, luego se inyecta la

solución fijadora en diferentes puntos de la región abdominal, el tejido muscular debe

hacer un cambio en la coloración como si hubiese sido cocido el camarón, para asegura

un fijado adecuado; Se debe tener especial cuidado con el hepatopáncreas y la región

METODOLOGÍA 21


cefalotorácica. Luego de inyectar la solución fijadora, se cortó la cutícula con unas

tijeras de disección desde el sexto somite abdominal hasta la base del rostrum, con

especial cuidado de no cortar profundamente en el tejido subyacente. Esta incisión se

realizó en la región del cefalotórax justo en la línea media-dorsal; cuando los camarones

tuvieron un peso mayor de 12 gramos se cortó además en forma transversal sobre la

unión del abdomen y el cefalotórax. Posteriormente cada camarón fue debidamente

identificado antes de ser colocado en un envase contenedor, estos envases poseían la

cantidad necesaria de la solución fijadora para cubrir los camarones, transcurrido un

período de 24 horas se transfirieron a una solución de etanol al 70% (Bel y Lightner,

1998). Estos envases plásticos se conservaron en cajas de cartón el laboratorio en un

lugar limpio y fresco hasta su procesamiento (Anexo 4).

Procesamiento de las Muestras

Este se realizo a través de dos técnicas diferentes: a) diagnóstico molecular, y b)

diagnóstico histológico. Es importante resaltar que el diagnóstico molecular se realizó

inicialmente sobre cada “pool”, y en los que resultaron positivos se aplicó la

identificación de cada uno de los animales que conforman dicho “pool” para de esta

manera identificar así a los individuos enfermos.

a) Diagnóstico molecular: se utilizó el kit comercial “IQ2000 TSV” para la

determinación del TSV, de la casa comercial Farming IntelliGene, (2008), el diagnóstico

molecular del TSV por RT-PCR se completó tras la realización de las siguientes etapas

(Anexo 5).

Extracción del ARN: se colocó la muestra (pleópodos) en tubos de 1.5ml con 500ul

de solución de extracción. La muestra en el tubo fue macerada con un dispositivo

desechable y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Posteriormente, se

METODOLOGÍA 22


adicionaron 100ul de cloroformo y se mezcló en vortex por 20 segundos. Se dejó a

temperatura ambiente durante 3 minutos y luego se centrifugó a 12000rpm durante 15

minutos. Seguidamente se transfirieron 200ul de la fase acuosa superior a un tubo

nuevo de 0.5ul conteniendo 200ul de isopropanol. Se mezcló con en vortex por 3

segundos y luego se centrifugó a 12000 rpm durante 10 minutos. El pellet se lavó con

0.5ml de etanol 75% y luego se centrifugó a 9000rpm durante 5 minutos para aislar el

ARN del pellet. Posteriormente, se desechó el etanol y se dejó secar el pellet a

temperatura ambiente durante 10 minutos. Finalmente, el pellet se disolvió en 500ul de

DEPCddH2

O. Esta fue la solución stock, la cual fue dividida en alícuotas de trabajo

(100ul c/u aproximadamente).

Amplificación por RT-PCR:

se aplicaron dos recetas y perfiles térmicos para la

amplificación del TSV.

- Receta y perfil térmico 1 (RT-PCR): Por cada muestra se preparó un coctel con un

volumen total de 8ul, constituidos por 7ul de la mezcla Pre RT-PCR, 0.5ul de la

ADN polimerasa IQzyme y 0.5ul de la mezcla de RT enzima, todos los reactivos

incluidos en el kit “IQ2000TSV”. Posteriormente, se añadieron 2ul del ARN extraído,

el cual se amplificó bajo el siguiente perfil térmico: 1 ciclo 42°C (30 min); 1 ciclo

94°C (2min); 15 ciclos 94°C (20seg), 62°C (20seg), 72°C (30seg); 1 ciclo 72°C

(30seg); 1 ciclo 20°C (30seg); ciclo final de tiempo indefinido a -4°C.

- Receta y perfil térmico 2 (PCR anidado): El coctel para esta receta fue preparado

con 14ul de la mezcla Pre Nested PCR y 1ul de la ADN polimerasa IQzyme,

obteniendo un volumen total de 15ul y amplificando bajo el siguiente perfil térmico:

30 ciclos 94°C (20seg), 62°C (20seg), 72°C (30seg); 1 ciclo de 72°C (30seg); 1 ciclo

de 20°C (30seg); ciclo final de tiempo indefinido a -4°C.

METODOLOGÍA 23


Finalmente, los tubos con los productos amplificados fueron colocados en una

gradilla sobre hielo, añadiendo a cada tubo 5ul de 6X LoadingDye y mezclando

suavemente.

Visualización en geles de agarosa 2%:

Los geles fueron preparados mezclando

0.3gr de agarosa normal con 30ml de buffer TBE 1X. En cada pozo del gel se cargaron

de 5 a 10ul aproximadamente de cada producto amplificado y en el último pozo se

cargaron 5ul del marcador de peso molecular. Las condiciones de corrida fueron 100-

150 voltios durante 15 minutos. Posteriormente, se tiñó el gel sumergiéndolo en 500ml

aproximadamente de una solución 10mg/ml de Bromuro de Etidio, y se dejó a oscuras

completamente por 10 minutos a temperatura ambiente. El gel se transfirió a un envase

plástico con agua destilada para lavarlo durante 10 minutos y finalmente fue colocado

sobre el transiluminador UV para visualizar los productos amplificados.

b) Diagnóstico histológico: se empleó la metodología descrita por Bell y Lightner,

1988 en el Manual para Histología del Camarón Penaeido normal, siguiendo los pasos

(Anexo 6 y 7).

Preparación para el embebido: los camarones preservados en etanol 70%, fueron

colocados en una tabla de plástico. Se removió el 80% de los apéndices de la cabeza, y

luego se corto transversalmente entre la unión del cefalotórax y el abdomen.

Seguidamente, el cefalotórax fue cortado longitudinalmente justo al lado de la línea

media, y a la porción de cefalotórax que quedó fuera de la línea media se le extrajo la

región branquioestegal (branquias) a través de un corte diagonal. Del abdomen se

cortaron los segmentos abdominales (# 1, 3 y 6) y se removieron las terminaciones

distales (urópodos). El segmento # 6 fue cortado longitudinalmente, de la misma

manera que el cefalotórax. Las porciones de tejidos no excedieron a ¼ pulgada de

espesor en su dimensión más ancha para garantizar el cierre total del “casette de

embedido”.

METODOLOGÍA 24


Embebido en Parafina:

según la metodología descrita por Bel y Lightner, 1998; las

cajas de embebido se procesaron con un Histoquinette, cargado con las siguientes

soluciones: etanol al 70% (por duplicado 1 hora cada baño), etanol 80% (por duplicado

1 hora c/u), etanol al 95% (por duplicado 1 hora c/u), etanol al 100% (por duplicado 1

hora c/u), agente clarificador [xileno] (por duplicado 1 hora cada uno), y Parafina

[ParaplastTissueEmbeddingMedium, de la casa comercial McCormick] (por duplicado 1

hora cada uno); totalizando 12 horas de procesamiento.

Formación de Bloques:

luego que los tejidos son sacados del procesador se colocan

en moldes, los tejidos se orientan dependiendo de cómo se requiera en corte del tejido

(vertical u horizontal), para la realización de este paso empleo una pinza, un baño de

maría para derretir la parafina, y un molde cuadrado para formar los bloques.

Corte de los tejidos:

se realizaron con un micrótomo marca Leica número RM

2125TR. Se ajustó el grosor del corte a 3.5micras, se inició con el desbastado del

bloque y cuando el listón comenzó a salir completo, se conservó colocándolo en el porta

objeto y distendiéndolo con ayuda del baño de maría (a temperatura media). Cuando el

corte era seleccionado se mantuvo en el porta objeto y este colocó en la plancha

caliente por un período de media hora; esto secara y fijara el tejido para posteriormente

realizar la tinción de las laminillas.

Tinción:

Se empleó la tinción estándar según H&E Mayer-Bennet, con los siguientes

períodos de tinción:

- Hemo De – 5 min

- Hemo De – 5 min

- EtOH al 100% - 10 inmersiones


- EtOH 95% - 10 inmersiones

METODOLOGÍA 25






- Agua destilada – 6 lavadas (con cambio de agua por cada enjuague)

- Hematoxilina – de 4 a 6 minutos

- Enjuague al chorro de agua – de 4 a 6 minutos

- Floxina/eosina – 2 minutos





- Hemo De – 10 inmersiones




- Cubierta con Permount® (Fisher Scientific)

- Etiquetas

Los datos obtenidos de las muestras procesadas, se transformaron a frecuencias y

analizados mediante una prueba de Chi-cuadrado, para determinar así las diferencias

existentes entre ellos, mediante el programa SigmaPlot versión 11.0.

27


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos mediante el diagnóstico histológico y molecular sugieren

que la definición de un área o punto de muestro es fundamental para toda investigación

realizada en camarones, tal como lo sugiere Morales (2004). Menciona que la definición

del área se realiza dependiendo del diagnóstico requerido: 1) Conocer la presencia o

ausencia de una enfermedad (mediante un muestreo dirigido sobre animales enfermos

en las salida de la Piscina de Producción) y/o 2) Un monitoreo de sanidad (mediante un

muestreo aleatorio en distintos zonas de la Piscina de Pkkroducción, considerando una

prevalencia mínima y un nivel de confianza definido).

En la Tabla 2 se observa que el diagnóstico histológico presenta una diferencia

estadísticamente significativa (p<0,001), en la proporción de animales infectados y no

infectados entre las zonas de muestreo; mientras que en el diagnóstico molecular solo

se consiguieron animales enfermos a la salida de la PP (Tabla 3).


muestreo dentro de las PP mediante el diagnóstico histológico.

Condición Zona dentro de la PP X P 2 Piscina de Producción Entrada Medio Salida

Infectados 30 45 70 32,620 <0,001 A

No Infectados 70 55 30 Infectados 15 20 10

3,922 0,141* B No Infectados 85 80 90

Infectados 40 20 60 33,333 <0,001 C

No Infectados 60 80 40 Infectados 15 0 20 28,800 <0,001 D No Infectados 85 100 80

*El poder de la pruebas realizada (0.394) es inferior a la potencia deseada de 0.800, indicando que las probabilidades de detectar una diferencia, cuando realmente existe, son menores y los resultados deben ser interpretados con cautela.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 28



muestreo dentro de las PP mediante el diagnóstico molecular.

Condición Zona dentro de en la PP Piscina de Producción Entrada Medio Salida

Infectados 0 0 6,67 A No Infectados 100 100 93,33

Infectados 0 0 3,33 B No Infectados 100 100 96,67

Infectados 0 0 8,33 C No Infectados 100 100 91,67

Infectados 0 0 0 D No Infectados 100 100 100

Esta distribución desigual de animales infectados y no infectados detectados en

ambos métodos sugieren que la salida de la PP es el lugar idóneo para muestrear,

cuando se sospeche de la presencia del TSV, estos resultados coinciden con lo

reportado por Conroy (2007) que menciona que toda situación de estrés dentro de la PP

va a contribuir al debilitamiento general de los organismos, el cual va a permitir que

estos sean fácilmente arrastrado con ayuda del movimiento natural de las aguas a la

compuerta de salida de las PP.

Esta información debe ser considerada en los manejos dentro de las granjas

producción para modificar algunas de sus prácticas, como por ejemplo, la de los

recambios de aguas de fondo, basados en la creencia que el patógeno que mas afecta

a los camarones son las bacterias del género vibrio, apoyados en el hecho de utilizar

organismos libres de patógenos (SPF) y resistentes a TSV. Los trabajadores

responsables de las granjas de producción consideran que un recambio de agua de

fondo ayudaría a disminuir la carga bacteriana presente en el ecosistema y así la

enfermedad de manera temporal. En el caso de las infecciones virales esta práctica no

es adecuada debido a que disemina el virus a otras granjas productoras vecinas (Lotz,

1997; Chávez y Montoya, 2004), corriendo el riesgo de causar una epizootia como la

que paralizó la industria camaronera de Venezuela en el año 2004 (Conroy, 2005).



En el Gráfico 1 se logra observar como se concentran los animales infectados en

las compuertas de salida de las distintas PP estudiadas, y como ya se menciono, este

fenómeno podría estar asociado al movimiento típico de las aguas.

Gráfico 1.- Proporción de animales infectados según la zona de muestreo dentro de

las PP empleando el diagnóstico histológico.

Enfocándonos en la proporción de animales infectados en cada una de las PP

estudiadas; la piscina “A” muestra el mayor porcentaje (70%) de animales infectados; y

según la distribución de las piscinas con relación a la entrada de agua, en esta granja

de producción, ella seria la primera en recibirla. Si la calidad de esta no es la adecuada,

todo el ecosistema podría verse afectado, ya que en ocasiones el agua funciona como

el mejor vehículo diseminador de los agentes patógenos (Lotz, 1997; Lightner, 2005).

Así mismo se observa que ha medida que las piscinas se alejan del punto de

entrada de agua, la proporción animales infectados disminuye. Lo cual podría estar

asociado a que la calidad del agua tendería a ir mejorando a medida de que las piscinas

se alejan de la fuente de entrada, debido a la sedimentación natural de las partículas a

lo largo del recorrido por el canal. Esto no se cumple en la piscina “C” y podría estar

asociado a una mala desinfección de la piscina luego de ser cosechada, o a

Prop

orci

ón d

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imal

es

infe

ctad

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Piscinas de Producción



condiciones muy especificas dentro ella que deben ser definidas en posteriores

investigaciones; ya que según los registros históricos de la granja esta piscina en

repetidas oportunidades ha presentado problemas de altas mortalidades.

Al comparar los resultados del diagnóstico histológico y el molecular, se puede

afirmar que el histológico mostró mayor sensibilidad que el molecular en la detección

del TSV, esto difiere de lo reportado por Lightner, (2005) ya que considera que ambas

técnicas proporcionan el mismo grado de sensibilidad en cuanto a la detección de este

virus. Además, si tomamos en cuenta que el sistema de detección IQ2000 (Farming

IntelliGene, 2008); de TSV indica que existe un limite de carga viral para funcionar

adecuadamente, el cual está asociado al tipo de órgano utilizado del camarón (Nunan y

col., 2004),

Por esta razón consideramos que el análisis molecular por sí solo no mostro

resultados concluyente; es decir deberían ser confirmados utilizando otro método de

detección como en este caso, del diagnóstico histológico. Esto pudiera explicar el hecho

de que parte de las muestras analizadas quedaron por debajo del límite que requiere el

sistema para detectar la carga viral; debido a que algunas de las muestras que

resultaron negativas utilizando el diagnóstico molecular, al ser analizadas mediante en

diagnóstico histológico mostraron cambios característicos de la presencia del TSV en

branquias, epitelio cuticular, músculo así como esferoides en el órgano linfoide;

coincidiendo con lo reportado por Lightner, (1996); Hasson y col., (1999a); Morales,

(2004); Pantoja y Lightner, (2008); OIE, (2009).

Para establecer el comportamiento del TSV en las piscinas y durante el ciclo de

producción los resultados se muestran en la Tabla 4 y 5. En ellas se observa que el

virus se detectó desde el primer muestreo, a través de los dos métodos de diagnóstico

empleados. Estos resultados coinciden con lo reportado por Morales, (2004), quien

estimó que la aparición de una infección causada por TSV podría ocurrir entre los 14 y



40 días después de colocar las PLs en las PP. Durante los diferentes muestreos se

observaron signos clínicos característicos de una infección por TSV, tales como: a)

incremento en la tasa de mortalidad, b) anorexia, c) coloración roja del telson, urópodos

y pleópodos, d) áreas necróticas en el exoesqueleto coincidiendo con lo reportado por

la OIE, (2009); Hasson y col., (1999b); pero según Lightner y Pantoja, (2005) estos

signos clínicos son fácilmente confundibles con una vibriosis; la cual ésta fue

confirmada mediante simultáneos análisis de laboratorio (Oroño, 2009; Gil, 2009),

definiéndose una infección mixta causada por bacterias del género vibrio y virus TSV.

Tabla 4.- Proporción de animales infectados / no infectados por TSV en cada una de las

fases de la enfermedad en relación a la época de muestreo empleando el diagnóstico

molecular.

Época de muestreo Sanos Fases de Infección

PP Infección Muy Ligera

infección Ligera

Infección Moderada

Infección Severa

Treinta 93,33 0 0 0 6,67*

A Sesenta 100 0 0 0 0 Noventa 100 0 0 0 0

Ciento veinte 100 0 0 0 0 Treinta 96,67 0 0 0 3,33*

B Sesenta 100 0 0 0 0 Noventa 100 0 0 0 0

Ciento veinte 100 0 0 0 0 Treinta 91,67 0 0 8,33* 0

C Sesenta 100 0 0 0 0 Noventa 100 0 0 0 0

Ciento veinte 100 0 0 0 0 Treinta 100 0 0 0 0

D Sesenta 100 0 0 0 0 Noventa 100 0 0 0 0

Ciento veinte 100 0 0 0 0 * Estos resultados se ubicaron solo en las salidas de las Piscinas de Producción



Tabla 5.- Proporción de animales infectados / no infectados según la época de

muestreo dentro de las PP empleando el diagnóstico histológico.

En la Tabla 5 se evidencian las diferencias significativas (p<0,001) entre la

proporción de animales infectados en cada uno de los muestreos, observándose que en

las piscinas “B” y “C” tal proporción fue mayor en el muestreo realizados a los 30 días.

La tendencia general de las PP fue una presencia elevada del TSV, la cual va

disminuye progresivamente entre los 60 y 90 días, aumentando nuevamente a los 120

días (Gráfico 2). Tal comportamiento pudiera sugerir una reinfección por el TSV, sin

embargo, éste es el ciclo normal de la enfermedad, es decir cuando un organismo se

encuentra infestado en fase crónica o de transición y entra en muda, pueden recaer en

una infección en fase aguda y morir siendo así fuente de inoculo para organismos que

estén sanos por medio del canibalismo o superar la enfermedad (Pantoja y Lightner,

2008; Hasson y col., 1999b).

Condición de los Animales

Días de siembra de las PLs en las PP X P 2 Piscina de

Producción Treinta Sesenta Noventa Ciento veinte

Infectados 30 50 20 50 28,800 <0,001 A

No Infectados 70 50 80 50 Infectados 50 0 10 10 102,165 <0,001 B No Infectados 50 100 90 90 Infectados 70 30 20 50

60,358 <0,001 C No Infectados 30 70 80 50

Infectados 10 0 10 30 43,429 <0,001 D No Infectados 90 100 90 70



Gráfico 2.- Proporción de animales Infectados según la época de muestreo dentro de

las PP empleando el diagnóstico histológico.

Tabla 6.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de la

enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico histológico.

Época de muestreo

Fases de Infección X P 2 PP Sano Agudo Transición Crónico Treinta 30 30 30 10

105,619 <0,001 A Sesenta 50 10 20 20 Noventa 80 0 0 20

Ciento veinte 50 10 10 30 Treinta 50 0 10 40

-- -- B Sesenta 100 0 0 0 Noventa 90 0 0 10


144,224 <0,001 C Sesenta 70 10 10 10 Noventa 80 10 0 10


62,276 <0,001 D Sesenta 100 0 0 0 Noventa 90 10 0 0

Ciento veinte 70 10 10 0 -- No se realizó ninguna prueba debido a que al menos uno de los valores esperados en la tabla de contingencia es menor que 1 y más del 20% de los valores esperados en la tabla de contingencia es menor que 5, por lo que en esta situación la prueba de Chi-cuadrado puede ser inadecuada.

Piscinas de Producción

Prop

orci

ón d

e an

imal

es

infe

ctad

os



Tabla 7.- Proporción de animales infectados según la zona de muestreo dentro de

las PP mediante el diagnóstico histológico.

Con base en el estudio del comportamiento del TSV, fueron analizadas las fases de

infección establecidas por medio del diagnóstico histológico, en el se observaron

diferencias significativas (p< 0,001), tanto en la proporción de animales infectados en

cada una de las épocas de muestreos (Tabla 6), como en cada una de las zonas

estudiadas (entrada, medio y salida) dentro de la PP (Tabla 7).

Piscina “A”: Durante los muestreos, se observó que la mayor proporción de

animales presentes en las fases aguda y de transición de una infección por TSV se

ubicó a los 30 días, mientras que a los 60 días tal proporción cambió hacia animales en

una fase de infección crónica y de transición; mientras que para los 90 y 120 la fase de

infección por TSV predominante fue la crónica (Gráfico 3).

Si analizamos la distribución del TSV en las diferentes zonas estudiadas dentro de

las PP se observa que la entrada de la PP fue donde se concentró la mayor proporción

Zona de muestreo dentro de la PP

Fases de Infección X P 2 Piscina de Producción Sano Agudo Transición Crónico

Entrada 70 0 15 15 80,390 <0,001 A Medio 55 5 10 30

Salida 30 35 20 15 Entrada 85 0 0 15

-- -- B Medio 80 0 5 15 Salida 90 0 0 10

Entrada 60 5 15 20 61,083 <0,001 C Medio 80 15 5 0

Salida 40 20 30 10 Entrada 85 15 0 0

49,953** <0,001 D Medio 100 0 0 0 Salida 80 5 10 5

-- No se realizó ninguna prueba a que al menos uno de los valores esperados en la tabla de contingencia es menor que 1 y más del 20% de los valores esperados en la tabla de contingencia es menor que 5, por lo que en esta situación la prueba de Chi-cuadrado puede ser bastante inadecuada. ** Estos resultados deben ser interpretados con cautela dado que más del 20% de los valores esperados en la tabla de contingencias menor que 5, y la prueba de Chi-cuadrado puede ser inadecuada



de animales en fase crónica y en transición, mientras que en la media fueron más

frecuentes los animales en poseían la infección en su fase crónica, y en cuanto a la

salida en la salida se concentraron los animales infectados en fase aguda (Gráfico 4).

Gráfico 3.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de

la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico histológico,

Piscina “A”.

Gráfico 4.- Proporción de animales infectados por TSV en cada una de las fases de la

enfermedad según la zona dentro de la Piscina de Producción (PP) empleando el

diagnóstico histológico, Piscina “A”.

Prop

orci

ón d

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es

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ctad

os

Zona dentro de la PP

Prop

orci

ón d

e a

nim

ales

In

fect

ados

Época de Muestreo



Piscina “C”: La mayor proporción de animales infectados por TSV se observó a la

30 días, los mismos presentaban la enfermedad en la fase aguda, a que a los 60 días la

distribución de ellas fue homogénea, mientras que a los 90 días la proporción cambia a

animales infectados en fases aguda y crónica, en cuanto al ultimo muestreo se tiene

que las fase de infección predominante es la de transición (Gráfico 5).

Al analizar la zona de muestreo dentro de la PP, se observa que tanto la entrada

como la parte media concentran animales en la fase crónica de la enfermedad y en

cuanto a la salida la mayor proporción es de animales en fase aguda de una infección

causada por TSV (Gráfico 6).


la enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico por histológico,

Piscina “C”.

Época de Muestreo

Prop

orci

ón d

e an

imal

es

infe

ctad

os




la enfermedad según la zona de muestreo dentro de la Piscina de Producción (PP)

empleando el diagnóstico histológico, piscina “C”.

Piscina “D”: en cuanto a la realización de los muestreos se tiene que la mayor

proporción de animales infectados por TSV se concentro a los 90 y 120 días, a los 90

días se observo una mayor proporción de animales en una fase aguda, mientras que a

los 120 días tal proporción estuvo compartida por animales tanto en a fase aguda como

de de transición (Gráfico 7).

Según la ubicación por zona dentro de la PP se observa que en la entrada se

concentró la mayor proporción de animales infectados en fase aguda, mientras que en

la zona media y en la salida se observaron principalmente animales en fase crónica de

la infección por TSV (Gráfico 8).


Prop

orci

ón d

e an

imal

es

infe

ctad

os




enfermedad según la época de muestreo empleando el diagnóstico histológico, Piscina

“D”.


enfermedad según la zona de muestreo dentro de la Piscina de Producción (PP)

empleando el diagnóstico histológico, Piscina “D”.

Época de Muestreo

Prop

orci

ón d

e an

imal

es in

fect

ados

Pr

opor

ción

de

anim

ales

in

fect

ados




Los resultados expuestos anteriormente sugieren que la distribución de los animales

enfermos en cada una de las PP es variable, por lo que definir un área o punto de

muestro es fundamental al momento de iniciar cualquier investigación con relación al

TSV (Morales, 2004).

Los resultados igualmente resaltan la importancia de que cada PP debe ser

monitoreada individualmente ya que las interacciones entre los diferentes factores (pH,

salinidad, temperatura, microbiota, etc) determinan cambios que pueden romper el

equilibrio, permitiendo el desarrollo de enfermedades (Guillian y Rodríguez, 2002;

Guzmán y col., 2004; Gómez, 2006).

Es importante destacar que en la Piscina de Producción “D” se observó la menor

proporción de animales infectados, sugiriendo que la posición de dicha piscina dentro

del sistema de distribución del agua fue un factor clave para favorecer una infección

posterior. Por lo tanto, el establecimiento de prácticas para la desinfección de las aguas

en los canales de distribución podría ayudar a la exclusión de los patógenos que entran

por esta vía (Lotz, 1997; Chávez y Montoya, 2004; OIE, 2009).

La realización del estudio histológico en los camarones enfermos analizados en esta

investigación se logró identificar las diferentes fases de una infección causada por el

TSV. El órgano linfoide representó una estructura anatómica esencial para el

establecimiento de dichas fases, este forma tres tipos de esferoides denominados: Tipo

A, Tipo B y Tipo C (Tabla 8), cada uno de ellos muestra características únicas que los

relacionan estrechamente con cada una de las fases de infección causada por TSV

(Hasson y col., 1999a); así mismo durante la realización del análisis histológico, se

evidenciaron áreas multifocales de necrosis en el epitelio cuticular, así como presencia

de núcleos picnóticos y cariorréticos, en distintos órganos coincidiendo con los

reportado por Morales, (2004); OIE, (2009); Hasson y col., (1999a); Lightner y Pantoja,

(2005).



Tabla 8.- Identificación de las diferentes fases de una infección causada por TSV

Según la bibliografía Identificados en el presente estudio

Órgano Linfoide Normal

Imagen tomada de: Bell y Lightner, (1998)

Órgano Linfoide Normal

Simbología: Lum: Lumen Smc: Matriz Estromal Cnf: Tejido Conectivo Fibroso End: Células Endoteliales Sin: Senos Hemales

Esferoides Tipo A, en el Órgano Linfoide

Imagen tomada de: Hasson y col., (1999a)

Esferoides Tipo A, en el Órgano Linfoide

Observe como los túbulos del órgano linfoide forman una masa homogénea, no se evidencian inclusiones



Esferoides Tipo B, en el Órgano Linfoide

Imagen tomada de: Hasson y col., (1999a)

Esferoides Tipo B, en el Órgano Linfoide

.- Las flecha gruesa señala áreas de vacuolización .- Las flechas delgadas señalan inclusiones.

Esferoides Tipo C, en el Órgano Linfoide

Imagen Tomada de: Hasson y col., (1999a).

Esferoides Tipo C, en el Órgano Linfoide

.- La flecha gruesa señala núcleos condensados. .- La flecha delgada destaca algunas inclusiones.

Branquias infectadas por TSV

Tomado de: Hasson y col., (1995)

Branquias infectadas por TSV

La flecha indica Inclusiones



Enfocándonos al estudio de las prevalencias del TSV estimadas mediante los dos

métodos de diagnósticos empleados: a) histología (Gráfico 9), y b) PCR (Gráfico 10),

donde se evidencia la presencia del TSV desde el primer muestreo; lo que podría

sugerir que el virus está presente de forma endémica en la granja estudiada. La OIE

(2009) establece que la prevalencia de una infección por TSV puede variar de 0 al

100%. En este trabajo el intervalo estimado para la prevalencia del TSV se estableció

del 5 al 48.33% por época de muestreo para los dos métodos diagnósticos utilizados. El

intervalo de prevalencia máxima fue de 18 a 48.33% encontrado a los 30 días de

muestreo para el método molecular e histológico, respectivamente. Se demuestra una

vez más que el diagnóstico histológico representa un método que evidencia

tempranamente la presencia del TSV así como el mayor número de animales enfermos.

Gráfico 9.- Prevalencia del TSV en cada época de muestreo empleando el

diagnóstico histológico.



Gráfico10.- Prevalencia del TSV en cada época de muestreo empleando el

diagnóstico molecular

44


CONCLUSIONES

La mejor zona de muestreo para establecer la presencia del TSV es la ubicada en la

salida de las Piscinas de Producción.

El TSV tiene un comportamiento variable durante un ciclo de 120 días, estando sus

máximos entre los 30 y 120 días con menores proporciones a los 60 y 90 días.

Durante el ciclo de 120 días de crecimiento y engorde del camarón no se logró

establecer de manera precisa la fase de infección (agua, transición y crónica) del TSV

debido al comportamiento variable durante los días de muestreo y las zonas estudiadas.

La prevalencia del TSV en la granja de producción estudiada fue de 18.33% y

48.33% para los métodos molecular e histológico, respectivamente.

El TSV es endémico en la granja de producción estudiada.

45


RECOMENDACIONES

Realizar un estudio ampliado en las zonas productoras del país, incluyendo

muestreos en individuos silvestres que permita definir el estatus sanitario de las

mismas, estableciendo la presencia y asociaciones de las enfermedades causadas por

los distintos agentes (virus, bacterias, hongos, protozoos, etc).

Concientizar a la industria camaronera Venezolana en la implementación de

prácticas que permitan la exclusión de patógenos, como son: desinfección y

reutilización de las aguas, aplicación de cero recambios de agua; para de esta manera

evitar la entrada de patógenos provenientes de organismos silvestres o de agua

contaminada.

Establecer convenios entre el Sector Privado, el Gobierno Nacional y la Academia,

en los cuales se promuevan la capacitación de profesionales que luego puedan ser

incorporados en la investigación, para así darle soluciones a los problemas sanitarios

que tanto afectan a la producción camaronera del país.

46


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Aguirre, M. (2001). “La Cadena Agroalimentaria de Alimentos Balanceados para

Acuicultura en Venezuela”. Tesis de Postgrado. Universidad Simón Bolívar. 29pp.

• Aguado, N.; Boada, M.; Donato, M. (2008). “Detección del Síndrome del Virus del

Taura (TSV) en Litopenaeus vannamei (Boone) del Occidente de Venezuela. Revista

Científica de la Facultad de Ciencias Veterinarias. LUZ. Vol. XVIII, Nº 2, 134-141pp.

• Alday-Sanz. V.; Roque, A. y Turnbull, J. (2002). “Clearing mechanisms of

Vibriovulnificus biotype I in the black tiger shrimp Penaeusmonodon”. Diseases of

Aquatic Organisms (48): 91–99pp.

• Alpuche, J.; Concepción, A.; Solórzano, C.; Pereyra, A. (2005). “Lectina en L.

setiferus una alternativa en el cultivo ante enfermedades que afectan al cultivo de

camarones”. Revista Electrónica de Veterinaria (VI): 12

Disponible en: http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n121205/120511.pdf

[Consultada en Enero del 2011].

• Álvarez R. (1998). “Enfermedades virales de Crustáceos peneidos con especial

referencia al Continente Americano”. Veterinaria Tropical (13): 103-126pp.

Disponible en:

http://www.ceniap.gov.ve/pbd/RevistasCientificas/VeterinariaTropical/vt13/texto/juliad.ht

m [Consultada en Enero del 2011].

• Brock, J. A. (1997). “Taura syndrome, a disease important to shrimp farms in the

Americas”. World Journal of Microbiology and Biotechnology (13): 415–418pp.

Disponible en: http://www.springerlink.com/content/jq3r853813w23304/fulltext.pdf

[Consultada en Noviembre del 2008].

http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n121205/120511.pdf�

http://www.ceniap.gov.ve/pbd/RevistasCientificas/VeterinariaTropical/vt13/texto/juliad.htm�

http://www.ceniap.gov.ve/pbd/RevistasCientificas/VeterinariaTropical/vt13/texto/juliad.htm�

http://www.springerlink.com/content/jq3r853813w23304/fulltext.pdf�

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 47


• Brock, J. y Main, K. (1994). “A guide to the Common Problems and Diseases of

Cultured Penaeus vannamei”. Oceanic Institute, Makapuu Point. P.O. Box 25280,

Honolulu, HI. Publ. by Floe Oceanic Institute, USA. 241pp.

• Bell, T. y Lightner D. (1998). “Manual de Histología del camarón penaeido Normal”.

University of Arizona. USA. World Aquaculture Society. 221pp.

• Cervigon, F. (1983). “La acuicultura en Venezuela. Estado actual y perspectivas”.

Caracas, Venezuela. 121pp.

• Chávez, S. y Montoya, R. (2004). “Medidas de Bioseguridad para evitar la Introducción

y Dispersión de Enfermedades Virales en Granjas Camaronícolas”. Unidad Mazatlán en

Acuicultura y Manejo Ambiental del CIAD, A.C. Av. Sábalo Cerritos s/n, Apdo. Postal

711, Mazatlán, CP. 82010, Sinaloa, México.

• Conroy, G. (2005). “The Taura Syndrome Virus has Appeared in Venezuela”.

Panorama Acuícola Magazine. Noviembre/Diciembre. Disponible en:

http://panoramaacuicola.com/ediciones/PAM-11-1/42-45.pdf

[Consultado en Diciembre del 2010].

• Conroy, G., (2007). “Estatus Sanitario de la Camaronicultura en Venezuela y su

impacto en el producción”. Pharma-Fish SRL. Conferencia de presentada en la ciudad

de Maracaibo.

• Côté, I.; Navarro, S.; Tang, K.; Noble, B.; Lightner, D. (2008). “Taura syndrome virus

from Venezuela is a new genetic variant”. Aquaculture (284): 62-67pp.

• Cuéllar-Anjel, Jorge (2008). “Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en

Camarones Marinos de Cultivo”. pp. 19–54. Morales, V. y J. Cuéllar- Anjel. (2008). Guía

http://panoramaacuicola.com/ediciones/PAM-11-1/42-45.pdf�



Técnica-Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. Programa CYTED Red II-

D: Red Vannamei, Panamá, República de Panamá. 270 pp.

• Farming IntelliGene Technology Corporation. (2008). “Detection and Prevention

System for Taura Syndrome Virus (TSV)”. NO. 2-1,7th Taichung Industry Park, Taichung

407, Taiwan. www.iq2000Kit.com

• García, S. (1993). “Acuicultura en Venezuela”. Día de Campo. Caracas.

• Gil, Lerexis. (2009). Presencia de especies de Vibrio y su incidencia en la alteración

hemocita en Litopenaeus vannmei en condiciones de cultivo. Trabajo Especial de Grado

LUZ. Datos no publicados. Edo. Zulia, Venezuela. 73pp.

• Gómez, B.; Roque, A. y Guerra, F. (2006). “Enfermedades infecciosas más comunes

en la camaronícultura en México y el impacto del uso de antimicrobianos”. CIAD, A.C.

Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental. AP. 711 Mazatlán, México. 315-

346pp.

• Gullian, M. y Rodríguez, J. (2002). “Estudio de las Cualidades Inmunoestimulantes de

nuevas Bacterias Probióticas Asociadas al cultivo de Litopenaeus vannamei”. En:

CENAIM. Manejo de Enfermedades en Camarones. Ecuador. 47-50pp.

Disponible en: http://www.cenaim.espol.edu.ec/publicaciones/boletin81/12.pdf

[Consultado en Diciembre del 2010].

• Guzmán, A., Valle, A., Valle, G., Valle, F. (2004). “Infectious disease in shimp species

with aquaculture potential”. Resent Res. Devi. Microbiology. 333-348pp.

• Hasson, K.; Lightner, D.; Mohney, L.; Redman, R.; White, B. (1999a). Role of

lymphoid organ spheroids in chronic Taura syndrome virus (TSV) infections in Penaeus

vannamei. Diseases of Aquatic Organisms (38): 93-105pp.

http://www.iq2000kit.com/�

http://www.cenaim.espol.edu.ec/publicaciones/boletin81/12.pdf�



• Hasson, K.; Lightner, D.; Mohney, L.; Redman, R.; Poulos, B.; White B. (1999b).

“Taura syndrome virus (TSV) lesion development and the disease cycle in the pacific

white shrimp Penaeus vannamei. Diseases of Aquatic Organisms (36): 81-93pp.

• Hasson, K. ; Lightner, D.; Poulos, B.; Redman, R.; White, J.; Brock, J.; Bonami, J.

(1995). Taura syndrome in Penaeus vannamei: demonstration of a viral etiology.

Diseases of Aquatic Organisms. (23):115-126pp

• International Committee on Taxonomy of Viruses. (ICTV). (2008). Disponible en:

http://www.ictvonline.org/index.asp?bhcp=1[Consultada en Enero del 2008].

• Jiravanichpaisal, P. y Miyazaki, T. (1997). “Histopathology, biochemistry and

pathogenicity of Vibrioharveyi infecting black tiger shrimp Penaeusmonodon”. J. Aquat.

An. Health (6):27-35pp.

• Josupeit, H y Lem, A. (2000). “Aquaculture products, quality, safety, marketing trade”.

In: International Conference on Aquaculture in the Third Millenium. The Network of

Aquaculture Centres in Asia-Pacific and the Food and Agriculture Organization of the

United Nations. 173-176pp.

• Juárez, P. y Palomo, M. (1985). “Acuicultura Bases Biológicas”. Consejo Nacional para

la enseñanza de la Biología (CECSA). Primera Edición. Editorial Continental. México.

• Lightner, Donald V. (1996). “A Handbook of pathology and diagnostic procedures for

diseases of penaeid shrimp”. World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana, USA.

• Lightner, Donald V. (2005). “Biosecurity in Shrimp Farming: Pathogen Exclusion

through use of SPF Stock and Routine Surveillance. World Aquaculture Society (36): 3

http://www.ictvonline.org/index.asp?bhcp=1�



• Lightner, D. y Redman, R. (1998). “Shrimp diseases and current diagnostic methods”.

Aquaculture (164): 201-220pp.

• Lightner, D. y Pantoja, C. (2005). “Manual para el Diagnóstico de enfermedades del

Camarón”. United States Department of Agriculture (USDA). Programa de

ReconstrucciónhuracánMicht. EEUU. 92pp.

• Lotz, J. (1997). “Special topic review: Viruses, biosecurity and specific pathogen-free

stocks in shrimp aquaculture”. World Journal of Microbiology & Biotechnology (13): 405

– 413pp.

• Mayo M. (2005). “Changes to virus taxonomy”. Virology Division News (150): 189-

198pp. Disponible en:

• Morales-Covarruvias, María Soledad. (2004). “Enfermedades del camarón: Detección

mediante análisis en fresco e histopatología”. México. Editorial Trillas. 122pp

• Nunan, L.M.; Tang-Nelson, K.; Lightner, D.V. (2004). “Real-time RT-PCR

determination of viral copy number in Penaeusvannamei experimentally infected with

Taura syndrome virus”. Aquaculture (299): 2-10pp.

• Organización de las Naciones Unidad para la Agricultura y la Alimentación. FAO.

(2006). “State of world aquaculture”. Inland Water Resources and Aquaculture Service,

Fishery Resources Division FAO Fisheries Department Food and Agriculture

Organization of The United Nations. Rome. Disponible en:

http://www.fao.org/docrep/009/a0874e/a0874e00.htm

[Consultada en Diciembre del 2010].

http://www.fao.org/docrep/009/a0874e/a0874e00.htm�



• Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. FAO. (2008) Disponible en: http://www.fao.org/index_es.htm [Consultada en Noviembre del 2010].

• Organización Mundial de Sanidad. OIE. (2009). Manual of Diagnostic Tests for

Aquatic Animals. Chapter 2.1.4. Taura Síndrome. Disponible en:

http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/2010/2.2.04_TAURA.pdf

[Consultada en Noviembre del febrero 2011]

• Oroño, Manuel A. (2009). “Alteraciones provocadas por bacterias del género Vibrio en

el camarón (Litopenaeus vannamei) cultivado con aguas del Lago de Maracaibo durante

un ciclo de crecimiento. Trabajo especial de grado. Universidad del Zulia. Venezuela,

Estado Zulia. Datos no publicados. 58pp.

• Pantoja, C y Lightner, D. (2008). “Enfermedades virales”. pp. 55 -114. En Morales, V y

Cuéllar-Anjel, J. (2008). Guía Técnica – Patología e Inmunología de camarones

Penaeidos. Programa CYTED Red II-D: Red Vannamei, Panamá, República de

Panamá. 270 pp.

• Pendini, M. (1984). “Informes nacionales sobre el desarrollo de la acuicultura en

América Latina”. FAO. Informe de Pesca. Suplemento (294): 138pp.

Disponible en: http://www.fao.org/DOCREP/005/AD020S/AD020s00.htm[Consultada en

Diciembre del 2010].

• Rodríguez, M. (1998). “Síndrome de Taura” Boletín del Programa Nacional de Sanidad

Acuícola y la Red de Diagnóstico”. PRONALSA. Universidad Autónoma Metropolitana-

Xochimilco (I): 1.

Disponible en:http://www.xoc.uam.mx/pronalsa/boletin/boletin%201.pdf[Consultada en

Enero del 2011].

http://www.fao.org/index_es.htm�

http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/2010/2.2.04_TAURA.pdf�

http://www.fao.org/DOCREP/005/AD020S/AD020s00.htm�

http://www.xoc.uam.mx/pronalsa/boletin/boletin%201.pdf�



• Vélez, J. y Bonami, J. (2006). “Detección molecular de enfermedades virales que

afectan el desarrollo del cultivo del camarón”. Universidad Autónoma Metropolitana –

Iztapalapa. Distrito Federal, México. Hidrobiología (16): 275-293pp.

• Yu, C. y Song, Y., (2000). “Outbreaks of Taura Syndrome in Pacific white shrimp

Penaeusvannamei cultured in Taiwan”. Fish Pathology, (35): 21-24Ppp.

53


ANEXOS Anexo 1.- Zonas de muestreo dentro de las piscinas de producción.

Anexo 2.- Colección de los animales dentro de las piscinas de producción.

ANEXOS 54


Anexo 3.- Preservación de las muestras para el diagnóstico molecular.

Anexo 4.- Preservación de las muestras para el diagnóstico histológico.

ANEXOS 55


Anexo 5.- Diagrama del proceso del diagnóstico molecular.

Anexo 6.- Preparación para el embebido en parafina y formación de los bloques

ANEXOS 56


Anexo 7. Corte de los bloques de parafina y tinción de las láminas.

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