CNR - Istituto di Bioscienze e Biorisorse, Perugia

Luciana Baldoni

Composizione varietale

degli oli di oliva mediante analisi del DNA

I Metodi di Controllo – Il Controllo dei Metodi Torino, 9-10 Novembre 2017

L’ampia gamma di oli extra

vergine di oliva è conseguenza:

del grandissimo numero di

varietà ancora in coltivazione,

dell’area geografica di

produzione e delle condizioni

pedo-climatiche locali

delle tecnologie di

produzione, estrazione e

stoccaggio

Gli oli extra vergine di oliva

L’olio di oliva è il prodotto alimentare sottoposto

al maggior numero di contraffazioni in Europa

Le più diffuse contraffazioni degli oli extra vergine di oliva si

basano sulla diversa reputazione, notorietà e prezzo di certi oli

rispetto ad altri (es. Olio Italiano 100%, DOP e IGP)

Il principale bersaglio di questo tipo di contraffazioni sono

le varietà impiegate per costruire l’olio

Le analisi chimiche e fisiche classiche

non sono in grado di rilevare le miscelazioni

improprie degli oli

Il patrimonio varietale dell’olivo

Italia 538 42% del patrimonio mondiale

Spagna 183 14%

Francia 88 7%

Grecia 52 4%

Turchia 45 3,5%

Tunisia 44 3,5%

Algeria 41 3,2%

Portogallo 24 1,9%

Altri paesi 260 20%

TOTALE 1.275

Cloni?

Popolazioni varietali?

Sinonimia (Frantoio-Raggiola)

Omonimia (Rosciola)

Toponimia (Nostrale di Rigali,

Moraiolo dei Monti Martani)

Morfonimia (Pendolino, Limona)

Perchè la caratterizzazione molecolare è necessaria?

Cultivar,

Ecotipi locali,

Genotipi rari,

Selvatici

Varietà locali

Varietà cosmopolite

Varietà migranti

Presenza di virus o altri

microrganismi non patogeni

Confusione sull’identità varietale

dovuta a diverse ragioni

Principali varietà del Mediterraneo

PicholineMarocaine, Haouzia, Menara

Picual, Hojiblanca, Picudo, Lechinde Sevilla, Manzanilla, Gordal,

Arbequina, Cornicabra, Blanqueta, Empeltre, Villalonga, Farga

Galega, Azeiteira, Cordovil, Cobrancosa

Sigoise, Chemlal

Koroneiki, Adramitini, Amigdalolia, Chalkidiki, Kalamon, Konservolia, Mastoidis Zaity, Sorani, Kaissy

ChemlaliSfax, Chetoui, Oueslati

Ayvalik, Domat, Gemlik, Izmir Sofralik, Memecik,

Zutica, BugaKalinjot, Bardi Tirana

Oblica, Levantinka, Lastovka,

Toffahi, Hamed

Aglandau, Bouteillan, Grossane,Lucques,Picholine,Tanche

Nabali, Barnea, Kadesh, Merhavia,

Soury

Bianchera,

Ad ogni paese / regione / territorio di coltivazione corrispondono

varietà locali specifiche e ben diverse da quelle coltivate altrove

Taggiasca, Moraiolo, Olivastra, Bianchera, Rasara, Casaliva, Gargna’,Nostrana Brisighella, Frantoio, Leccino, Dritta, Canino, RajaSabina, Gentile Chieti , Raggiola, Piantone Mogliano,

Nera di Collotorto, Cima Melfi, Carolea, Cassanese, Ottobratica, OgliarolaLeccese,Coratina, Peranzana, Cima Bitonto, Cellina Nardò,

Rotondella, Pisciottana, Gentile Larino,Biancolilla, Cerasuola, Tonda Iblea, NocellaraBelice, Nera Di Gonnos,

Bosana

Strutturazione geograficadelle varietà di olivo in Italia

Diffusione geografica di alcune varietà di olivo

Solo poche varietà hanno raggiunto una diffusione molto

ampia, interessando diversi paesi e continenti (es.

Arbequina, Arbosana, Koroneiki)

Marker molecolari ‘regionali’

Le varietà locali sono fortemente

imparentate tra loro e quindi si possono

distinguere come gruppi separati

Ciascun gruppo è discriminato da marcatori

regione-specifici

Collection Mondiale de l’Oliviere - Marrakech, Marocco

Olive Germplasm Bank - Cordova, Spagna

Collezione Germoplasma di Olivo CNR – Regione Umbria - Lugnano in Teverina (TR), Italia

Altre collezioni di Grecia, Libano, Giordania, Argentina

Disponibilità di una banca dati dei profili DNA

delle principali varietà di olivo

Progetto Europeo BEFORE

Coordinamento scientifico:

CNR-ISAFOM-IBBR Perugia, Italia

Obiettivi

Stabilire protocolli comuni di identificazione

molecolare e morfologica delle varietà di olivo

L’analisi del DNA applicata

agli oli di oliva extra vergine

Il DNA caratterizza in maniera

inequivocabile ciascun individuo,

varietà o specie diversa

Consente di stabilire a posteriori

quali sono la/le varietà da cui l’olio è

stato estratto

E’ utile per verificare se sono state

operate miscelazioni o sostituzioni

con oli di altre specie

Solo l’analisi del DNA è in grado di identificare le varietà e/o

specie che hanno contribuito alla preparazione di un olio

Potenzialità applicative

Identificare le cultivar usate per

la preparazione dell’olio

Dimostrare l’assenza di varietà

diverse da quelle attese

Verificare l’assenza di oli di

specie oleaginose diverse da

olivo (nocciolo, girasole, colza,

mais, o soia)

Rilevare l’assenza di olive

danneggiate dalla mosca

(Bactrocera oleae) o da altri

patogeni

Testare l’assenza di OGM

Presupposti dellarintracciabilità molecolare

(Budker et al., 2002)

Il DNA si conserva in tracce nell’olio

per lungo tempo (1-3 anni)

Il DNA si degrada

progressivamente, rimanendo in

frammenti sempre più brevi ma

rilevabili

Le tracce di DNA si possono

estrarre dall’olio, purificare e

rendere analizzabile

Dopo 1 ciclo PCR:

2 copie

Dopo 2 cicli PCR:

4 copie

Dopo 3 cicli PCR:

8 copie

Dopo 4 cicli PCR:

16 copie

Da 1

frammento

di DNA Frammento di DNA originale

Nuovo frammento

Si ottengono

milioni di

copie per

PCR

(Polymerase

Chain

Reaction)

Il DNA è l’unica molecola che può essere moltiplicata in vitro tramite PCR

15.000 SNP ottenuti da

approccio Genotyping-By-

Sequencing

3.000 SNP ottenuti dal

sequenziamento dei geni

espressi

NGS, GBS

RNA-seq

Breeding,

Selezione

assistita

Mappatura

genetica

Analisi del

DNA degli oli

Genotyping

Altre applicazioni Applicazioni

Sviluppo di nuovi marcatori varietà-specifici basati su

Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)

G

A

A

A

Mutazione su varietà target

Sequenza comune a più varietà

SNP nella sequenza del gene SUT1

Cultivar 1

Cultivar 2

Cultivar 3

Heterozygous AG

Homozygous AA

Homozygous GG

I marcatori SSR usati per l’analisi del DNA degli oli

145 160

183 210

145 148

190

154

190 198210

1 2 3

210

148

156

154

190198

4 5 6

190 183

160156 145156

210

210

156

A quali varietà

corrispondono quegli

alleli nella bottiglia?

Profilo SSR di 6 varietà

I marcatori SNP varietà-specifici

1 2 3

4 5 6

A G T

G C T

8 9

A CT

L'olio è stato fatto

con le cv. 1, 4, 7

7

Profilo SNP di 8 varietà

cv. MORAIOLO

DNA da foglia

cv. MORAIOLO

DNA da olio

Confronto tra profili di DNA estratto da foglia e da olio

ACP1 alleli 1-3C

304 316 bp

304 316 bp

ACP1 alleli 1-3C

378 426 bp

350 378 bp

350 378 bp 426 bp

Olio delle cv. Moraiolo e Coratina

cv. MORAIOLO alleli 350-378 bp

cv. CORATINA alleli 378-426 bp

DNA da miscela di olio

MORAIOLO/CORATINA

alleli 350-378-426 bp

Marcatori plastidiali specie-specifici (bar-coding)

SSR plastidiali polimorfici tra specie

oleaginose diverse (nocciolo, mais, olivo)

ccSSR-11 ccSSR-12 CCMP1

NO

CC

IOL

O

LD 100 bp LD 100 bp

NO

CC

IOL

O

OL

IVO

MA

IS

OL

IVO

MA

IS

NO

CC

IOL

O

MA

IS

MA

IS

OL

IVO

OL

IVO

NO

CC

IOL

O

Mediante Real Time PCR è possibile quantificare il contributo

percentuale di ciascuna varietà in una miscela di oli

PCR Cycles

Delt

a R

n

Quantificazione del contributo di ciascuna

varietà in un blend di oli

PCR Cycles

Ma va tenuta in

considerazione la

possibile diversa

storia di ciascun olio

componente il blend

Nuovi sistemi di amplificazione-detection ad alta

sensibilità, rapidità, portabilità, quantificabilità

LAMP: Loop-mediated isothermal AMPlification

Digital PCR

Microfluidics

NALF (Nucleic Acid Lateral Flow)

Point-of-Care methods

CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE

Istituto di Bioscienze e Biorisorse, Perugia

www.cnr.ibbr.it

luciana.baldoni@ibbr.cnr.it

Tel. (+39) 075 5014866

Mob. (+39) 328 3760912

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Roberto Mariotti

Nicolò Cultrera

Saverio Pandolfi