concentración de vacuna antirrábica de segunda generación ...concentración de vacuna...
TRANSCRIPT
Concentración de vacuna antirrábica de segunda Concentración de vacuna antirrábica de segunda Concentración de vacuna antirrábica de segunda Concentración de vacuna antirrábica de segunda generación por ultrafiltración generación por ultrafiltración generación por ultrafiltración generación por ultrafiltración tangencialtangencialtangencialtangencial
Matías A. Micucci1,2; Javier De Filippo1; Débora P. Garanzini1,2; Guillermo Fernández1; Rosana Jurado1; Diego A. Riva2; Fernando
Raibenberg2; Matías Fingermann3; Oscar R. Pérez1,2.
1- Servicio Vacuna Antirrábica – Instituto Nacional de Producción de Biológicos – Administración Nacional de Laboratorios e
Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán” (SVAR). [email protected]
2- Programa Académico de Investigación e Innovación en Biotecnología (PAIIB) - Departamento de Ciencias Aplicadas y
Tecnología – Universidad Nacional de Moreno (UNM).
3- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).
IntroducciónIntroducciónIntroducciónIntroducción
La rabia es una enfermedad zoonótica de evolución aguda, habitualmente mortal. Es causada por el virus
de la rabia (VR), que se transmite entre la mayoría de especies de sangre caliente y el hombre. La
principal herramienta para su prevención es la vacunación. Actualmente se utilizan vacunas basadas en
VR amplificado sobre células e inactivado químicamente. Las modernas tecnologías de producción de
vacunas involucran escalado de cultivo masivo de células animales y métodos de downstream process.
Estos son críticos a la hora de disponer biomoléculas de uso terapéutico, no solo referido al grado de
pureza sino también, a la productividad del proceso. El SVAR tiene vasta experiencia en el desarrollo de
vacunas contra la rabia. Tomando como modelo este biológico de uso veterinario, el objetivo de este
trabajo se focalizó en concentrar el VR inactivado por ultrafiltración tangencial (UFT) para mejorar su
inmunogenicidad y, de esta forma, aumentar su valor antigénico.
MaterialesMaterialesMaterialesMateriales yyyy métodosmétodosmétodosmétodos
Muestra: 2L de VR cepa CVS-Malbrán amplificado en células BHK mantenidas con medio sintético + SFB e inactivado químicamente (vacuna de 2º generación).
Sistema: membrana de fibra hueca (cut off 300 Kda) de 30 cm de longitud, diámetro de canal 1 mm y área 110 cm2; bomba de diafragma de 4 pistones.
Metodología
Correlación entre potencia de bomba, caudal de recirculación (caudal de permeado más retenido) y diferencia de presión entre ingreso y egreso de columna (ΔP), utilizando
agua purificada.
Optimización de condiciones: caudal de recirculación de alto valor de cizalla (16.000 seg-1), registrando el flujo de permeado experimental (Fp) a cada presión media
transmembrana (TMP), para pasos consecutivos de trabajo a diferentes concentraciones (Gráfico Nº 1). Relacionando Fp y TMP se determinó la mejor condición de TMP. El
valor de Fp se transformó en su equivalente de caudal de permeado (Jp), tomando en cuenta el área de membrana.
Concentración: se equilibró la membrana con buffer PBS 1X pH 7,4 (400 mL, 10 minutos). Finalmente, con un volumen aproximado de 400 ml de suspensión vacunal, se
optimizó el proceso, analizando la performance de la membrana de idéntica manera a como se procedió con agua pura (Gráfico Nº 2). Luego de este paso, se definieron las
condiciones finales para realizar la concentración.
Controles
SDS-Page en gel de poliacrilamida 12.5% para comprobar la presencia de proteínas virales y no virales en las distintas fracciones.
Western Blott con suero policlonal antirrábico hecho en ratón, revelado con IgG antiratón comercial, conjugada a peroxidasa.
Cuantificación de proteína (Bradford).
Potencia relativa en modelo murino.
ConclusionesConclusionesConclusionesConclusiones
Se cumplió el objetivo propuesto.
El proceso downstream utilizado permite una optimización de la plataforma de producción de vacunas antirrábicas desarrollada por el SVAR e integra a la UNM como
partícipe de la misma, demostrando los beneficios de la interacción entre dos instituciones públicas.
La novedad de la incorporación de esta tecnología se basa en la concentración de VR inactivado, con la consecuente disminución de las condiciones de bioseguridad
necesarias para trabajar.
El ensayo de potencia comparativa no muestra una certera correlación con el grado de concentración antigénica obtenida estimado, pero sí indica un aumento de la eficacia
de la vacuna.
Muestra Potencia (UI/mL)
Bulk 1,1
Concentrado 1,9+79%+79%+79%+79%
Grado concentración
Volumen 4X
Bradford 3X
SDS-Page 3X
RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS
Gráfico Nº 1 Gráfico Nº 2
SDS-Page Western Blot
Proteína G VR (60 Kda)