Reacciones de deterioro de semillas: aspectosfisiológicos, químicos y ultraestructurales

Maroder, Horacio Luis2008

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires

www.digital.bl.fcen.uba.ar

Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar

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I

�

UNIVERSIDADDEBUENOSAIRES

FacultaddeCienciasExactasyNaturales

DepartamentodeIndustrias

�

REACCIONES��DE��DETERIORO�DE�SEMILLAS�DE�SAUCE:�ASPECTOS�FISIOLÓGICOS,��QUÍMICOS�Y�

ULTRAESTRUCTURALES��

�

��������������������� ��� ���������������������������������������������

�������������������������

LICENCIADOHORACIOLUISMARODER

Dirección:Dras.MaríadelPilarBueraySaraMaldonado

Lugares�de�trabajo:

DepartamentodeIndustrias&FCEN&UBA

InstitutodeRecursosBiológicos&INTA&Castelar

Año2008

II

II

Agradezcoaquienesdeunauotramanera,hanhechoposibleestetrabajo:

LasDirectorasdelatesisDras.MariadelPilarBueraySaraMaldonado,

ElDirectordelCentrodeRecursosBiológicosDr.RobertoCasas

GonzaloyEster,delLaboratoriodeConservacióndeGermoplasma(IRB&INTA&Castelar).

MaríadelCarmendelDepartamentodeQuímicaBiológica,FCEN&UBA

CarolinaySilviadelLaboratoriodePropiedadesFísico&QuímicasyConservacióndeBiomoléculasdel

DepartamentodeIndustria,FCEN&UBA.

Emilio,MonicayGracieladelaCátedradeFísicadelDepartamentodeFisicomatemática,FFyB&UBA.

DedicoestetrabajoaImelda,porsuapoyodesdeloafectivoysuayudadesdelointelectualparaalcanzar

esteobjetivo.Ellainicióconmigoelcaminodelasinvestigacionessobreconservacióndelassemillas,entre

tantosotroscaminosdelavida,

LodedicotambiénaFlorencia,Fernando,Victoria,Guillermo,SantiagoyValentinaporqueelafectode

todosellos,mealientaacontinuar,yaGustavoyJaviersiemprepresentesenmimemoria.

III

III

Algunavez,enalgúnlugar,JorgeLuisBorgesdijo“Publicaresdejardecorregir”.Recuerdoestaspalabras

cadavezquedecidodarlepuntofinalaunestudio……

IV

IV

ÍNDICE�

RESUMEN……………………………………………………………………………………………..……………1

PALABRASCLAVESYABREVIATURAS...……………………………………………………………………..2

ABSTRACT………………………………………………………………………………………………………….3

KEYWORDS……………………………………...…………………..………………………................................4

Capítulo1.INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………............5

Capítulo2.MATERIALYMÉTODOS…………………………………………………………………………......10

Capítulo3.RESULTADOSYDISCUSIÓN

3.I.&ELCOMPORTAMIENTODELASSEMILLASDESAUCEENRELACIÓNALSECADO,LA

TEMPERATURAYLAHUMIDIFICACIÓN..................................................................................………..….28

3.II.&ESTUDIOSHISTOQUÍMICOSYSUBCELULARESENSEMILLASDE������������������

����� ��������� �����Y��������� �����……………………………………………………………39

3.III.&REACCIONESQUÍMICASDEDETERIOROENLASSEMILLASSECAS……………………………52

3.IV.&REVERSIONDELDETERIORODURANTELAIMBIBICIÓNDELASSEMILLASENVEJECIDAS..76�

3.V.&CARACTERÍSTICASFÍSICASDELCONTENIDOCELULAR…………………………………...………87

� TRANSICIONES

VÍTREAS……………………………………………………………………………………….88

� MOVILIDADMOLECULAR…………………………………………………………..……...95

� ISOTERMASDESORCIÓNDEAGUAYNITROGENO……………………………..…100

Capítulo4.CONCLUSIONES……………………………………………………………………..…………...…..111

Capítulo5.BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………...113

- 1 -

RESUMEN

Lassemillasdelasespeciesdesaucetoleranladeshidrataciónacontenidosdeaguasimilaresalosdeuna

semillaortodoxa,peropierdenlaviabilidadenunaspocassemanasatemperaturaambiente.Otracaracterísticaatípica

esqueloscloroplastosdelostejidosembrionariosdelassemillasmadurasconservanelsistemadeendomembranas

(tilacoides)aparentementeintactoyretienenlaclorofila.Enelmarcodelasinvestigacionesqueserealizaronenel

transcursodeestatesissurgieron,juntoalosresultadosmencionados,otrosquemuestranlosmecanismosque

podríanestarinvolucradoseneldeterioroysureparación:

1. Laluz,atravésdelaclorofilainduceunintensodañofotooxidativomediadosporradicaleslibresqueseevaluó

poreldañoaácidosgrasos,proteínas,pigmentosloqueprodujoprincipalmenteladestruccióndelasmembranas

tilacoides.

2. Sepostulaquedichasmembranasquecontienenclorofila,proteínasypigmentosseríaellugarenelquese

iniciaelataquefotooxidativo,elquesepropagaríaaotrasestructuras,loquesecomprobóporevaluaciónde

alteracionesenlapermeabilidaddelamembranaplasmática.

3. Sibienelataquefotooxidativoesimportanteestequedamayormenterestringidoalostejidossuperficialesde

lasemilla,sinafectarsensiblementelayemaapical.

4. Eldañoalostejidossuperficialesdeterminaqueenlaspruebasdegerminación,elporcentajedeplántulas

anormalesseainusitadamenteelevado(disminucióndelagerminaciónnormal),mientrasqueelporcentajedeplántulas

vivasresultósóloligeramentemenorqueelqueocurreenoscuridad.

5. Lassemillasqueoriginanplantasanormalescomoconsecuenciadelataquefotooxidativomuestranuna

notablerecuperacióndelagerminaciónnormalydelosdañosmetabólicosyestructuralesantesmencionados,cuando

sesometenahumidificación.

6. Descartadalapresenciadeclorofilacomocausaimportantedelamortalidad,quedansólodosreaccionesalas

queseconsideranprincipalesresponsablesdeldecaimientodelassemillassecascomosonlasreaccionesdeMaillard

ydeautooxidación.Laprimeranoacompañóeldescensodelagerminacióntotal,perosilasegunda,porloque

quedaríalaautooxidacióncomocausadelrápidodeterioro.

7. Elítem6llevaaconsiderarquelaautooxidaciónenestassemillasdebesermasactivaqueenotrasquecomo

estas,toleranladesecación,perosonmuchomáslongevas.

8. Ellopodríadeberseaqueelestadodelcontenidocelularpresentóunamayormovilidadmolecularyseamás

poroso,loquefacilitaríaladifusióndeloxígeno,unodelosreactantesdelaautooxidación.Lamayorporosidadal

facilitarladifusióndeloxígenoyunamayorsuperficielipídicaatacableporeseagentedebidoaladesdiferenciación

incompletadelasmembranas,seríanlascausasinicialesdelrápidodeteriorodeestassemillas.

- 2 -

��������������:clorofila,cloroplastos,endomembranas,especiesreactivasdeoxigeno(ROS),fotooxidación,

germinaciónanormal,germinaciónnormal,germinacióntotal,isotermasdesorción,longevidad,membranastilacoides,

movilidadmolécular,permeabilidaddemembranaplasmática,peroxidaciónlipídica,porosidad,�������,radicaleslibres,

resonanciadeespínelectrónico(ESR),resonanciamagnéticanuclear(NMR),�����������,����������,������

���������,� �����������,sauce,semillasortodoxas,semillasrecalcitrantes,tilacoides,transiciónvítrea

������������

GN:germinaciónnormal

GT:germinacióntotal

EDX:energíadispersivaderayosX

ESEM:microscopíaelectrónicadebarrido(modoambiental)

MET:microscopíaelectrónicadetransmisión

RL:radicaleslibres

ROS:especiesreactivasdeoxígeno

TMG:tiempomediodegerminación

- 3 -

ABSTRACT�

Willowseedstoleratedehydrationatwatercontents(WC)equivalenttothoseoforthodoxseeds,buttheylose

viabilityinfewweeksatroomtemperature.Similarlyunusualisthefactthatthechloroplastsofembryonictissuesin

matureseedsconservetheirendomembranesystem(thylakoids)apparentlyintact,inadditiontoretainingchlorophyll.

Duringtheinvestigationscarriedoutinthecourseofthisstudy,thereemergedresults,inadditiontothose

aforementionedthatrevealthemechanismspossiblyinvolvedinthedeteriorationprocessanditsreparation:

1. Lightproduces,bymeansofchlorophyll,intensephotooxidativedamage,asmediatedbyfreeradicals(FR),

whichwasevaluatedfordamagetofattyacids,proteinsandpigments,andlargelyproducedthedestructiontothe

thylakoidmembranes.

2. Thephotooxidativeattackisbelievedtooriginateinthosemembranescontainingchlorophyll,proteinsand

pigments,tolaterspreadtootherstructures.Thishypothesiswasprovenbytheevaluationofalterationsinplasma

membranepermeability.

3. Whileimportant,thephotooxidativeattackismainlyconfinedtothesuperficialtissuesoftheseed,without

sensiblyaffectingtheshootapicalmeristem.

4. Thedamagetosuperficialtissuesisevidentingerminationtests,causingthepercentageofabnormalseedlings

tobeunusuallyhigh(decreaseinnormalgermination(NG)),whilethepercentageofliveseedlings(normal+abnormal=

totalgermination–TG&)turnsouttobeonlyslightlylessthanthatwhichoccursinthedarkness.

5. Theseedsthatoriginateabnormalplants,asconsequenceofphotooxidativeattackexhibitsignificantrecovery

ofNGandofthemetabolicandstructuraldamagesaforementioned,whensubmittedtohumidification.

6. Oncethepresenceofchlorophyllisdiscardedasasignificantcauseofmortality,onlytworeactionsremainas

potentialcausesofthedecayindryseeds,thatis,theMaillardandautooxidationreactions.Astheformerdoesnot

occursimultaneouslywiththedecreaseinTG,autooxidation,whichdoescoincide,ispresumedtobethecauseofthe

rapiddeterioration.

7. Item6leadstotheconsiderationthattheautooxidationthatoccursintheseseedsmustbemoreactivethanin

othersthat,likethese,toleratedesiccationbutlivemuchlonger.

8. Thiscouldbeduetothefactthatthestateofthecellularcontentpresentsagreatermolecularmobilityand/oris

moreporous,whichwouldfacilitatethediffusionofoxygen,oneofthereactantsinautooxidation.Theincreasedporosity

whichfacilitatesdiffusionofoxygenandthegreaterlipidsurfaceattackablebythatagentduetotheincomplete

dedifferentiationofthemembranes,areproposedastheinitialcausesofrapiddeteriorationintheseseeds.

- 4 -

�!�"#�$�%�chlorophyll,chloroplast,freeradicals(FR),electronicspinresonance(ESR),embryomembraneintegrity,

glasstransition,endomembranes,lipidperoxidation,molecularmobility,N2sorptionisotherms,NMR,photooxidation,

�����������,����������,���������������,� �����������,orthodoxseed,porosity,priming,reactiveoxygenspecies

(ROS),recalcitrantseeds,thylakoids,willow�

�

- 5 -

CAPÍTULO�1�

INTRODUCCIÓN�

El �!�� ������ vegetal se conserva fundamentalmente como semilla. Las semillas constituyen

sistemasdeshidratadosyporestarazónmuchasherramientasparasuestudiohansidolasmismasconlas

queseencararon losestudiosrelativosa laestabilidadde losalimentosyotrosbiomateriales.Temastales

como:propiedadesdesorcióndeagua,estadovítreo,pardeamientonoenzimático, reaccionesdeMaillard,

reaccionesdeauto&oxidaciónsehanabordadoparacaracterizarypredecirlaestabilidaddealimentosyson

tambiénrelevantesenlaconservacióndesemillas.Enelcasode losalimentos,elobjetivoesconservarsu

valornutritivo y suscaracterísticasorganolépticas.Enel casode lassemillas, suconservación tienecomo

objetivo principal el mantenimiento de la viabilidad, es decir, que el sistema deshidratado conserve la

capacidad de sustentar vida. Si bien esto implica una exigencia extra con respecto a la conservación de

alimentos, como compensación conlleva la posibilidad de revertir cierto grado de envejecimiento y así

aumentarlacalidaddelasemillaquefueramantenidaenalmacenamiento,porprocedimientos���" #.

Hasta hace poco tiempo la información sobre longevidad de las semillas o de la capacidad de

almacenamiento era escasa y difícilmente cotejable por dos motivos: a. Surgía de trabajos en que las

condicionesdealmacenamientodiferían(locualaúnocurreconfrecuencia)yraravezsehabíanmantenido

constantes y b. Se conocían semillas tolerantes y otras susceptibles a la desecación. Roberts en 1973

introdujo los términosortodoxoyrecalcitranteparadefinirestadicotomía,yenunaprimeraclasificación las

separóendoscategorías:tolerantesa ladeshidratación(u �� � ���$�y�notolerantesaladeshidratación(o

�!#��#������!�$.Lassemillas#��#$#&��sonlasquenaturalmentesedeshidratanhastaalcanzaruncontenido

deaguaenequilibrioconlahumedadambiente(10&12%decontenidodeagua)ypuedentolerarunposterior

secadoartificialhastaaproximadamente5%sinperder laviabilidad.Existenmarcadasdiferenciasentre las

semillasortodoxasdedistintasespeciesencuantoallapsoduranteelcualsemantienenviables,elquevaría

desdealgunosañoshasta,enalgunoscasos,centurias.Lalongevidadresultamayorcuantomenorsontanto

- 6 -

elcontenidodeaguacomola temperaturaen laqueseencuentran.EllisyRoberts (1980ayb;1981)han

establecido una relación que permite predecir la viabilidad al cabo de determinado período de

almacenamiento, siempre que durante el mismo tanto la temperatura como el contenido de agua se

mantenganconstantes(ecuacióndeprediccióndeviabilidad).Enlosbancosdegermoplasmaserecomienda

almacenar lassemillasconuncontenidodeaguade5%yaunatemperaturade–20ºCdadoqueestase

puede mantener con equipo de refrigeración relativamente poco costosos, accesibles a los bancos de

germoplasmaanivelmundial.(Cuadro1).

Las semillas ����������'��� en cambio, pierden la viabilidad antes de que su contenido de agua se

equilibre con la humedad del ambiente.El contenido de agua por debajo del cual pierden la viabilidad se

alcanzarelativamenteenpocotiempo,deahíqueseanmuypocolongevas.Selaspuedemantenerviables

porlapsosrelativamentecortosaaltashumedades,atemperaturasligeramentesuperioresa0ºC,ytratadas

conbiocidas.Lacrioconservación(Cuadro1)eslasoluciónalproblemadeunaconservaciónprolongada.

A medida que mayor número de especies se fueron incorporando a estos estudios, se detectaron

casos en los que el comportamiento se apartaba de aquellas dos categorías iniciales, por lo que, más

recientementese incluyóunaterceracategoría llamada ���!��!���.Estacategoríaabarcaaquellassemillas

que, si bien toleran la deshidratación natural, resultan afectadas en diferente grado por una posterior

deshidrataciónartificialy/omuestranalgunasusceptibilidadalfríoenestadodeshidratado.Tambiénincluyea

semillasquepierdenlaviabilidadconcontenidosdeaguarelativamentebajosaunquenotantocomoelque

alcanzaríandeshidratándosenaturalmente.

La etapa de deshidratación de las semillas ortodoxas, última fase del desarrollo programado de la

semilla, se inicia con la acumulación de reservas en los tejidos del embrión y del endosperma (este es el

tejido de las semillas cuya finalidad es la acumulación de reservas) y continúa con la des&diferenciación

general de la compleja estructura de las células de esos mismos tejidos. La desdiferenciación implica la

desorganización del citoesqueleto y la reducción general de membranas que acompañan la progresiva

deshidratación y conducen a una drástica reducción del metabolismo. En el nivel subcelular, la

- 7 -

desdiferenciacióndecloroplastosymitocondriassevisualizaporlareduccióndelasmembranasinternas.La

desdiferenciación de los cloroplastos y la consecuente degradación de la clorofila hacen que las semillas

pierdan el color verde (�!��!!����). Las restantes organelas citoplásmicas también se desdiferencian. Se

consideraque ladesdiferenciaciónde lasestructurasocomponentescelularesconstituyeun requisitopara

que se toleren bajos niveles de contenido de agua sin pérdida de la viabilidad. En contraposición, en las

semillas�!#��#������!�lasorganelasnodesdiferencianyelmetabolismonocambia.

La familia de las Salicáceas comprende aproximadamente 350 especies que se agrupan en dos

géneros� �����(losálamos)y�����(lossauces).Enlaprácticaforestal,lasespeciesdesauceyálamose

propaganporestacasdadolafacilidaddeéstasparaenraizar,ynoporsemillas.Obviamente,lapropagación

porestacasacortasensiblementeeltiemporequeridoparaquelaplantaalcanceeltamañoquesedesea.Por

otraparte, lasemillapresentael inconvenientedelarápidapérdidadeviabilidad.Sinembargo, lassemillas

resultanimprescindiblesenlostrabajossobremejoramientogenéticodirigidosamejorarlaaptitudpapeleray

madererade lasSalicáceas,yasídiversificarsuuso,elqueseencontrabarestringidohastanohace tanto

tiempoa la fabricaciónde cajonescomocombustible.Estasactividadescobran relevanciadebidoaque el

paíscuentaconunadelaszonasecológicasmásaptasparaelcultivodeestasespecies,comoeselDelta

del Paraná.Es probable que, al quedar el uso de las semillas limitado almejoramiento, ésta haya sido la

causaporlaquefueranpocoestudiadas,existiendomuyescasainformaciónsobrelasmismasenelnivelde

suspropiedades físicas, químicas y suestructura y fisiología, como tampoco laqueconciernea su rápida

pérdidadeviabilidad.

La corta longevidad de estas semillas determinó que en un principio se las clasificara como

presuntamente �!#��#������!� (King y Roberts, 1979). Esta categorización se mantuvo hasta hace

relativamentepocotiempo(Pence1995).Posteriormenteseconsideróquecorrespondíana lacategoríade

semillasdecomportamientoortodoxoporquetoleranladeshidratación(Hongetal.,1996;Maroderetal.1996)

aunquequedabasinexplicarlacausaporlacualesatolerancianoestabaasociadaaunalongevidaddepor

lomenosalgunosaños,comoocurrecon lasortodoxas típicas.Enestasúltimasseconsideraqueel lento

- 8 -

envejecimientoestáproducidoprincipalmenteporreaccionesdeautooxidaciónydeMaillardqueporocurrir

en estado deshidratado, donde la movilidad molecular es baja, son precisamente lentas. Dado que estas

semillas también toleran la deshidratación, el proceso de envejecimiento debería ser similar. Cabe

preguntarse,entonces,porqué,siestassemillastoleranladeshidratación,decaenentanbrevetiempo.Para

contestar esta pregunta se encararon estudios sobre los aspectos señalados anteriormente con el fin de

explicaresecomportamientoatípicoytambiénconocersucomportamientogerminativo.

Todo lo que antecede, presenta a las semillas de sauce como un modelo de biomaterial que se

caracterizaporconstituirunsistemadeshidratadoderápidodeterioronodeterminadoporlapérdidadeagua,

loqueconvierteenunmodelodeinteréseneláreadelaConservacióndeBiomateriales.Resultansistemas

adecuadosparaanalizarlarelaciónentrereaccionesdedeterioroylascaracterísticasfísicasdelmedioenlas

quelasmismasocurren.

OBJETIVOS�ESPECÍFICOS�E�HIPÓTESIS�DE�TRABAJO�

Unacaracterísticadeestassemillasquediferenciaestassemillasdelasotrasquetambiéntoleranla

desecaciónperosonlongevas,esquecontienenclorofila.Poresemotivo,sepostulaquelaactivacióndeese

pigmentoporlaluztendríaunpapelimportanteenlarápidapérdidadelaviabilidadyenelcomportamiento

germinativo.

- 9 -

Cuadro�1.1.-�Estudios�en�Salicáceas�

� ��!����� ��!���!��������!����#!�%�&��� �'(�����������#&#!��$�� ���!�!)���!��� �*�!�

'�$ # � ��!�������������+ ���#�,��*�!��!��!�!�!����!����� �����������!�!���%�����!) ���� #!����!�� ���!�# ��!�)�#�,���#�!���,����� �����!������� �������- ���!�!- ����!�� �!����!��!�.���!�/��#���!�������#����� # ����!���� � *�!� " %� ����!��!#�!���!�����#&#!��� ��!�!�� ����� ��� ����#��� !�� ��������!# � �.����!�� ���!�0�1���!�����!�������&�!�����2 ���!# �,��#���&����������!�#������������������!��#����) ��!�!�����!��!#�!��%�# ������%!�!����% ���3#�! �� ���#� �����!�����#&#!���!�����!�����0�

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- 10 -

CAPÍTULO�2�

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES

Lassemillasde����������L.,�0����������Koidzy�����������L.fueronobtenidasdeárbolescrecidos

enINTA&Delta,queesunaestaciónexperimentaldelINTA&Delta.Lassemillasfueroncoleccionadasentrelos

años 1997 y 2007 en el período del año que va desdemediados de octubre a principio de diciembre. La

colección se realizó según el siguiente protocolo: las ramas cargadas de amentos (espigas péndulas) se

cortaron de los árboles en el tiempo en que las cápsulas (frutos) se tornaban amarillentas y las semillas

comenzabanaliberarsedelfruto.Yaenellaboratorio,atemperaturaambiente,losamentossesepararonde

las ramas y se distribuyeron sobre rejillasmetálicas.Periódicamente, cada 4 horas (aproximadamente) se

recolectaron lassemillas liberadasporexplosiónde lacápsulaysesepararonde lamatrizalgodonosaque

las contiene, usando aire comprimido y se almacenaron a &70º C hasta ser usadas en los diferentes

experimentos.Elcontenidodehumedaddelassemillas,queesaproximadamente40%(basehúmeda)enel

momentodesu liberacióndel fruto,despuésdeaproximadamente3ha temperaturaambientesereducea

11±12%.Todaslasoperacionesseñaladasserealizaronencondicionesdeiluminacióndebajaintensidad.

�

MÉTODOS�

(1)�Determinación�del�contenido�de�agua.�

Elcontenidodeaguadelasmuestrassedeterminógravimétricamenteysecalculóenbasealamasa

antesydespuésdelsecadoenestufa(1ha130ºC±2C),expresándosesobrebasesecaohúmeda,según

losexperimentos(ISTA,1999).

- 11 -

(2)�Pruebas�de�germinación�

Entodos loscasos laspruebasdegerminaciónsehicierondeacuerdoconelsiguienteprotocolo:se

colocaronlassemillassobrepapelhumedecido(3hojas)con3.5cm3deaguadestilada&desionizadaencajas

de Petri de 6&cm de diámetro a 25 ± 1º C y 16 h bajo luz fluorescente /8 h de oscuridad por 6 d. La

germinaciónseconsideranormalsilaplántuladesarrollaloscotiledones,elhipocótiloylaraízyestáerecta;

lasplántulasquenoreúnenestoscriteriossonclasificadascomoanormales.Lagerminaciónnormal(GN)fue

evaluadausandocuatroréplicasde25semillasparacadatratamiento.Enalgunosexperimentostambiénse

estimaronlagerminaciónanormalylagerminacióntotal(semillascongerminaciónnormalmássemillasno&

germinadas).Aunquelassemillasfrescasgerminandentrodelperíodode12a24h(hasta72hparasemillas

convigorbajo),elrecuentodefinitivosellevóacaboelsextodíadesdeelmomentodelasiembra,demodo

de poder reconocer sin dudas las plántulas anormales.En algunos experimentos se determinó además el

tiempomedio de germinación (TMG), que fue calculado según la fórmula:Σ (niti) / Σ ni, en laque niesel

númerodesemillasgerminadaseneltiempotidesdeelcomienzodelaimbibición.

Lagerminacióna24hdesdeelmomentodelasiembraesconsideradacomounindicadordelvigor;en

estecasoelcriteriodegerminaciónfuelaprotrusióndelhipocótilo,teniendoencuentaque(adiferenciade

otrassemillas)elprimersignovisibledelagerminacióndelassemillasdesauceeslaextensióndelhipocótilo

(Pólya,1961).

�

�(3)�Deshidratación�de�las�semillas�y�tratamiento�con�nitrógeno�líquido�

Los lotes de semillas de ������ ���� con 100 y 75% de germinación y 12% de humedad fueron

deshidratadas a diferentes contenidos de agua. Las semillas fueronmantenidas a 5º C durante 24 h en

atmósferas equilibradas con soluciones saturadas de K2CO3 (aproximadamente 43% de humedad relativa,

HR) y LiCl (aproximadamente 15% HR) o con H2SO4 concentrado (aproximadamente 1% HR). Los

contenidos de agua después de la deshidratación fueron 9% (K2CO3), 6.7% (LiCl) y 4.3% (H2SO4). Las

semillas fueron luegopuestasencrio&vialese inmersasennitrógeno líquido(NL)durante1h;unamuestra

- 12 -

con100%degerminacióny12%decontenidodehumedad fuemantenidaennitrógeno líquidodurante11

meses. Inmediatamente después del tratamiento con nitrógeno líquido los crioviales con semillas fueron

transferidosaunbañodeaguaa36ºCdurante1min.Elefectodelostratamientossobrelagerminaciónfue

evaluado.Un procedimiento similar fue seguido con un lote de semillas de�0���������� que tenía 100%

germinacióny11%decontenidodehumedad.Ladeshidrataciónfuellevadaacabosolamenteensoluciones

saturadasdeLiClyH2SO4concentrado.Loscontenidosdeaguadespuésdeladeshidrataciónfueron6.5%

(LiCl)y4.4%(H2SO4).

(4)�Almacenamiento�a�diferentes�temperaturas�

Unlotedesemillasde����������con75%germinacióny9%decontenidodeaguafuemantenidoa–

20º,5ºy25ºC.Enotroexperimentounlotedesemillasde�0����������con100%degerminacióny10.5%

de contenido de humedad fue puesto a –70º C. Las semillas se colocaron en contenedores sellados y,

muestras de las mismas fueron periódicamente tomadas para evaluar su germinación. Para el lote

almacenadoa–70ºC,lagerminacióna24hdesdeelmomentodelasiembrafueincluidacomounindicador

delvigor.

(5)�Tratamiento�de�humidificación

Se evaluó el efecto de la humidificación sobre la germinación de las semillas de �0� ����� y y �0�

���������. Para ello se usaron tres lotes de semillas de �0� ���� (9% contenido de humedad), dos con

aproximadamente 43% y uno con aproximadamente 16% de germinación y dos lotes de semillas de �0�

���������(10.5%contenidodeagua)con90y46%degerminación.Lassemillassemantuvieronen100%

HR:�0� ���� a 25ºC y�0���������� a 17ºC. Lasmuestras fueron removidas en intervalos de 3 h y su

germinación,evaluada.Enlasmuestrasdesemillasde�0����������,elcontenidodeaguayelporcentajede

germinaciónfuerontambiéndeterminadoscadahoradurantelasprimeras3hdehumidificación.

- 13 -

(6)�Microscopía�de�campo�claro,�de�fluorescencia�y�microscopía�electrónica�de�transmisión

Semillasenteras(diámetro10x0.5x0.3mm)fueronfijadasenglutaraldehído2.5%en��++!���fosfato

0.1M,pH7,5a4°C,durante2h.Paralosestudiosdemicroscopíadecampoclarolostejidosfijadosfueron

deshidratadosmedianteunaseriedeetanolhastallevarlosaacetona,luegotratadosenunaseriecreciente

de acetona&resina y finalmente embebidos en esta última (resina JB4 (2&butoxiethanolmethacrylate&

Polyscience,Warrington,Pa).Para realizar losestudiossubcelulares, lassemillas fijadasenglutaraldehído

fueronpost&fijadasenOsO41%enelmismobufferdurante1h,deshidratadasenunaserieetanol&acetonay

embebidasenresinaSpurr(Sigma–Aldrich,USA)segúnelprotocolodescritoenMaldonadoyLott (1991).

Los tejidos frescos, los tejidos embebidos en JB4 y en resina Spurr. fueron usados para los análisis

histoquímicos.Lasseccionessemi&finasse tiñeron conácido fucsínicoy toluidinablueO (FederyO´Brien

1968), floroglucinol y azul brillante coomassie (Pearse 1985), fase green FCF (Fulcher et al. 1972), iodo&

iodurodepotasioyácidoperiódico&Schiff(O´BrienyMcCully1981),sudanblackB(Bronner1975)ysulfato

férrico (Leigh y Sanders 1997). Las secciones se montaron sobre grillas cubiertas con Formvar y luego

carbón,teñidasenacetatodeuraniloseguidoporcitratodeCuyanalizadasconmicroscopíaelectrónicade

transmisión(ZeissM109).

�

(7)�Determinación�de�proteínas�

La técnica de cuantificacióndenitrógeno total ómicro&Kjeldahl (Kjeldahl, 1883) fue realizadaconun

analizadorKjeltecAuto1030.(Tecator,Höganäs,Sweden)ensemillasenteras(proteínastotales),lafracción

de extractos solubles (proteínas solubles) y la fracción insoluble (proteínas insolubles). La fracción de

extractossolublesfueronobtenidascomosedescribióanteriormente,exceptoporelagregadodelcombinado

inhibidor deproteasas (yaqueagregaríanitrógenonoprovenientede lassemillas)ycombinando loscinco

extractosporcuadruplicado(LS,HS,E,H),conelobjetivodeobtenereltotaldeproteínasoluble.Lafracción

insoluble fue obtenida a partir de los correspondientes precipitados obtenidos luego de la extracción de

solubles,porcuadruplicado.

- 14 -

Elcontenidodeproteínasfueestimadoporlaecuación(2.5):

( )100

25,61410 3

××××××−

=

−−

m

gml

lNfVV

PHClblankHClHCl

dondePeselcontenidodeproteínas(g/100gsemillas);meslamasademuestradesemilla(g);VHCl,

es el volumen del ácido estándar (mL) (ácido clorhídrico), VHCl&blank, es el volumen del ácido estándar

necesarioparalatitulacióndelreactivoblanco(mL);NHCl,eslanormalidaddelácidoestándar;yf,factorde

normalidaddelácidoestándar;6,25eselfactorutilizadoparatransformarlosvaloresdenitrógenoorgánico

totalenvaloresdeproteínasy14geslamasamolardelnitrógeno.

(8).�Determinación�del�contenido�de�lípidos�por�RMN�

La determinación del contenido de lípidos se realizó por medio de resonancia magnética nuclear

mediante una técnica estandarizada que emplea ecos de espín mediante la aplicación absoluta

correspondiente, provista por el software (absolute\seoi). Para la realización de la curva de calibración se

empleóelmateriallipídicodesemillasdesauceextraídoconhexanoenunextractorsoxhletdurante6h.Se

pesaronenunabalanzaanalítica(±0.00001g)entre0.01gy0.1gdedichomaterialdentrodecapilaresquea

suvezseintrodujeronentubosdeRMNdevidriode10mmdediámetrodemaneradenosuperarlos2.5cm

dealtura.SeempleóunespectrómetroBrukerNMS120(20MHz).Latécnicasebasaenlacuantificaciónde

laseñalderelajacióndelosnúcleosdehidrógenopresentesenaceitealos7msdebidaalaaplicaciónde

pulsoscortosderadiofrecuencia.

Luegosecolocaronsemillasdesauceenlostubosdevidrio(tambiéncuidandodenosuperarlos2.5

cmdealtura)yserealizólalecturacorrespondiente,quearrojóunacantidaddelípidosdel20%sobrebase

seca.

- 15 -

LaFigura2.1muestra lacurvadecalibraciónyelpuntocorrespondientea lamuestradesemillasde

sauce.Comolamuestrarepresentadacorrespondea0,3gdesemillassecas,elcontenidodelípidosen las

mismasseestimóen20,6%,apartirdelacurvadecalibracióndescripta.Losresultadosgravimétricamente

obtenidos,luegodelaextracciónporsoxhletdieronresultadosmenores(15%),loquerevelaríalaextracción

incompletadeloslípidos.Laobtencióndecurvasdefusiónmuymarcadasenlostermogramasobtenidospor

DSC,tambiénindicanunaltocontenidolipídico.

0 1 2 3 40.00

0.02

0.04

0.06

0.08

L = 0.025 s + 0,0002

r2= 0,9992

señal (s)

g de

lípi

dos

(L)

Fig.�2.1.-�Curvadecalibraciónypuntocorrespondientealamuestradesemillasdesauce

�

(9)�Análisis�EDX�

Elestudiodelacomposiciónelementaldeloscristalesgloboidessehizoutilizandoseccionesgruesas

(1mm)detejidofresco.ElmaterialfueexaminadoenelmodoambientaldeunmicroscopioelectrónicoPhilips

XL 30 ESEM.El análisis EDX fue realizado rutinariamente con un voltaje de aceleración de 20 kV, en un

tiempodeanálisisde60s,yunrangodeconteoentre1500y2000.

(10).�Tratamiento�con�luz�

- 16 -

Lassemillasfueronexpuestasadiferentescondicionesdiferentesdeiluminación:oscuridad,140lux,y

1300lux,durante3díasa25ºC.Entodosloscasoslassemillasfueronmantenidasa45%HR,enatmósfera

enequilibrioconsoluciónsaturadadeK2CO3,estabilizandoelcontenidodeaguaa9%.

Lostratamientosserealizaronenun incubador(CooledIncubatorMIR&153SANYO),enatmósferade

aireonitrógeno.

(11)�Análisis�de�resonancia�de�espín�electrónico�(Electron�Spin�Resonance�-ESR)��

Se realizaron cuatro réplicas de 150 mg de semillas para cada tratamiento. Las semillas fueron

transferidasauntubodecuarzoESR.LosespectrosdeESRfueronrealizadosa20ºCenunespectrómetro

ESR (X&band ESR Spectrometer Bruker ECS 106&Brucker Instruments, Inc., Berlin, Germany). Las

condicionesdelespectrómetrofueron:poderdemicroonda1mW,campocentral3445,amplituddebarridode

1000G, tiempo de conversión 5.12 min, constante de tiempo 5.12m, frecuencia de modulación 50 KHz,

amplituddemodulación0.1G,ganancia2.104,yresolución1024puntos.Elnúmeroderegistrosvarióentre

100a400dependiendode la intensidadde laseñal.La intensidadde laseñal radical fuemedidacomo la

altura total del pico de radical libre en la intensidad de la señal del primer espectro derivativo. Todos los

espectrosESRtuvieronformaslinealesyamplitudde líneaequivalentes,conla intensidadde laseñalESR

fueron considerados proporcionales a las concentraciones radicales. Por lo tanto, las concentraciones

radicalesfueronestimadasapartirdelasalturastotalesdelospicosrespectivosyexpresadascomomedidas

relativas, relacionando dentrode cada espectro la interrelación entre la alturadel picode radical libre y la

alturadelpicodecampobajodemanganeso.

�

(12).�Extracción�de�lípidos�y�análisis�de�ácidos�grasos�analizados�por�GLC�

Elanálisisdelosácidosgrasossellevóacabousandosemillasliofilizadas.Elmaterialfuetransferidoa

tubos!��!�� �+de1,5mlyloslípidostotalesfueronextraídosusandolamezclacloroformo–metanolusando

elprocedimientodescritoporFolch!����0(1957).Losextractosde lípidostotalesfueronsecadosypesados,

- 17 -

suspendidosen2mldeunasoluciónfrescade10%KOHenetanolysaponificadosdurante60mina80ºC

usandotubosdevidriocontapaesmerilada.Seagregaron2mldehexanoylosácidosgrasosseextrajeron

por agitación. La fase superior orgánica (no&saponificable) fue descartada. La capa acuosa fue acidificada

+con1.5mldeHClconcentradoylosácidosgrasosseextrajerondosvecescon1.5mlhexano.Losextractos

conteniendolosácidosgrasoslibresfueronsecadosbajounacorrientedenitrógeno,disueltosen1.5mlBF3

(10%enmetanol)y1.5mldebencenoyesterificadosporcalentamientoyagitacióna100ºCdurante1h.Los

ésteresdeácidosgrasos(FattyAcidMethylEsters&FAME)seextrajerondosvecesconhexanoylavadoscon

aguadestilada.Despuésdeun lavado, la faseorgánica fueevaporadabajounacorrientedenitrógeno, re&

disueltaenhexano,yanalizadaporGas&LíquidoCromatografía(GLC).Luego,1`ldelasoluciónFAMEfue

inyectadaenunacolumnacapilar(30mx0.25mm,0.25`mfilm)(OmegawaxX250&SupelcoInc.,Bellefonte,

Pennsylvania)enuncromatógrafoHewlettPackardHP&6890equipadoconundetector flame ionization.La

temperaturadelacolumnafueprogramadaparaun incrementolinearde3ºC/mindesde175a230ºC.Los

picos cromatográficos de FAME fueron identificados por comparación de sus tiempos de retención con

estándaresbajolasmismascondiciones.

�

(13).�Determinación�de�clorofilas�y�carotenos�

Elanálisisdeclorofilasycarotenossehizosegún lossiguientesprotocolos: lassemillaspulverizadas

fueronembebidasencloroformo:metanol(2:1envolumen)(Arnon1949)yLichtenthaler(1987).Lamezclafue

sonicadadurante10minyluegocentrifugadaa8000xg.Laextracciónserepitiótresvecesyelextractofue

secadoencorrientedenitrógeno,re&disueltoenN,N&dimetilformamidaycentrifugadodurante10mina8000x

g. Laabsorbancia fue leídaconunespectrofotómetro.Para la conversiónde las lecturasa contenidosde

clorofilaycarotenos,seutilizaronlasecuaciones(2.3)delestudiodeInskeepyBloom(1985)yLichtenthaler

(1987),quesonlassiguientes:

- 18 -

Chl�(`g/mgdepesoseco)=12.70A664.5–2.79A647

�

Chl��(`g/mgdepesoseco)=20.70A647–4.62A664.5

TotalChl(`g/mgdepesoseco)=17.90A647–8.08A664.5

Carotenostot(`g/mgdepesoseco)=(1000.A470–1,82.Chl�–85,02.Chl�)/198

��5���� ��6�#���

�

(14).�Determinación�de�proteínas�oxidadas�

LamedicióndelasproteínasoxidadasserealizódeacuerdoalatécnicadescritaenReznickyPacker

(1994). Esta técnica cuantifica espectrofotometricamente la formación de dinitrofenilhidrazona unida a

proteínasatravésdelareaccióndel la2,4&dinitrofenilhidrazina(2,4&DNPh)yloscarbonilosdelasproteínas

oxidadas.Estecompuesto tieneunpicodeabsorciónentre355y390nmysu coeficientedeextinciónes

22.000M&1xcm&1.

Lassemillassehomogenizaronenunasolucióndebufferdefosfatodepotasio50mMph7,6EDTA

disódico1mM. Elhomogenatosecentrifugó15.000xgdurante20minutos.Seextrajoel sobrenadanteel

cualseincubó15minutoscon10%desulfatodeestreptomicinaatemperaturaambienteparaeliminarrestos

de DNA los cuales interfieren en el reacción. Nuevamente las muestras fueron centrifugadas 15.000 x g

durante 20minutos. El sobrenadante fue incubado 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad con 2,4&

DNPh 10 mM + HCl 2,5 N. Al cabo de ese tiempo se agregó TCA 20% y se dejó 10 minutos en hielo

permitiendoasí laprecipitaciónde lasproteínas.Secentrifugó lamuestra (15.000xgdurante10minutos)

conservándose esta vez el pellet que es donde se encuentran las proteínas. El pellet se lavó con

Etanol:Acetato de Etilo (1:1) hasta que el sobrenadante perdió el color. Por último se disolvió el pellet en

clohidratodeguanidina6M.Laabsorbanciaseleyóconunespectrofotómetroa370nm.

- 19 -

�

(15).�Determinación�de�productos�de�Maillard�

Previoa ladeterminacióndelospigmentospardos,seprocedióa laeliminacióndeclorofila,segúnla

metodología de Arnon (1949) ya que la presencia de lamisma enmascara la determinación de color. Se

analizó la fluorescencia de las fracciones solubles proteicas obtenidas a partir de semillas de sauce. Las

proteínas fueron fraccionadas utilizando una modificación del procedimiento tradicional de extracción

secuencialdeproteínasdeOsborne(Osborne,1924).�

Aproximadamente30mgdesemillasmolidasfueronincubadascon1,5mLdeunaseriesecuencialde

solucionesdeextracción:50mMTris&HCl(Sigma),200mMNaCl(Merck)��++!�(pH8.3)(LowSalt,LS)por

20 minutos en hielo (dos veces). Los sobrenadantes obtenidos luego de 10 minutos de centrifugación a

15000g (Eppendorf 5424, Hamburg, Alemania) fueron guardados en freezer (&18ºC) hasta su posterior

análisis.Lasproteínasqueseextraensonalbúminas(Aluko,2004).

Lasfraccionessolublesfuerondiluidasdemanerataldeobtenerunaabsorbanciaa380nmmenorque

0,1(Skoogycol.,2001).Estoesparaevitarelefectodefiltrointerno,yaquelospigmentosabsorbenalaλ

deexcitacióndeloscompuestosfluorescentes.

Laintensidadmáximaobtenidadelespectrodeemisión(excitacióna380nm)fuecalculadasiguiendo

lasiguienteecuación(2.4)(MatiacevichyBuera,2006):

gm

bdfUFUF x

⋅−⋅⋅

=

Donde UFx fue lamedida de intensidad de fluorescencia obtenido para cada fracción soluble; f, el

factordesensibilidaddelinstrumento;d,elfactordedilución;b,ordenadaalorigendelacurvadecalibración

realizadadesulfatodequininaen0,1NH2SO4(BDH);m,lapendientedelacurvadecalibración;yg,elpeso

delassemillas(g)utilizadasparalaextraccióndelasproteínas.Todoslosreactivosfuerondegradoanalítico.

- 20 -

Losespectros informadoscorrespondenalbarrido realizadoporelequipoapartirdedosmediciones

pormuestra,yhabiendorealizadoautomáticamentelacorrecciónmatemáticaporlapotenciadela lámpara

encadalongituddeonda.

Las mediciones de emisión de fluorescencia, se realizaron en un espectrofluorímetro Ocean Optics

USB 2000,OceanOptics Co., U.S.A., con tiempo de integración de 30mseg, promedio de 50. Programa

OOibase32.

�

(16).�Determinación�de�malondiadehido�(MDA)�

Estecompuestoseevalúapormediodeunatécnicacolorimétricadondeelácidotiobarbitúrico(TBA)se

unealMDAformandounabasedeSchiffqueabsorbea532nm(Yagi1976).

Conunmorterosehomogenizaronlassemillasenunbufferfosfato30mMph7,4KCl120mMyPVP.

Elhomogenizadosecentrifugóa3000xg10minutosysedescartóelpellet.Paralelamentesepreparaun

blanco el cual contiene buffer en vez demuestra. Se tomó una alícuota del sobrenadante a la cual se le

agregóBHT100mMyTCAal20%p/vloqueluegodeunaincubaciónde20minutosyunacentrifugación

produjo laprecipitaciónde lasproteínas.ElsobrenadantesecolocóentubosherméticoyseadicionóTBA

0.7%.Lostubostapadossepusieronabañomaría100ºCdurante1hora,pasadoesetiempo,seenfriaron

enhieloyserealizólalecturaespectrofotometrica.

(17).�Prueba�de�conductividad�eléctrica

La conductividad del filtrado se determinó según el siguiente protocolo: 300 mg de semillas se

sumergieronen8mldeaguadestilada,durante3ha20°C.Sehicierontresréplicas.Laconductividaddel

medio acuoso semidió con un Conductivímetro AltronixModelo CTX&II. Para la calibración del equipo se

empleóunasolucióndeKCl3M.LosresultadosseexpresaroncomoµSmg&1desemillassecas.Losvalores

correspondieronalosvalorespromedio±DS.

- 21 -

(18).�Estudios�de�sonda�de�espín�(Spin�probe�ESR)�

La detección de los espectros de resonancia de ESR usando la técnica de SpinProbe y un agente

amplificante,conelobjetodeestudiarloscambiosenlaspropiedadesdebarreradelasmembranas,hansido

descriptosenGolovinayTikhonov(1994)yenGolovinaetal.(1997).

Brevemente, lassemillasfuerontratadasconunasolucióndeTEMPONE(4&oxo&2,2,6,6&tetramethyl&1&

piperidyneloxy)(Sigma).TEMPONEesunradicalnitróxidoanfifílicoyestablequepermeabilizalamembrana

plasmática y separa las fases hidrofílica e hidrofóbica del citoplasma, dando a cada fase una señal ESR

específica.El ferrocianuro es soluble en aguay no atraviesa lamembrana plasmática excepto cuando las

áreasdañadasestánpresentesdecreciendolaamplituddelaseñal(amplificante)correspondiendoalafase

hidrofílica,siendoeldecrecimientodelaseñalproporcionalaldañodelamembrana.Larazónentreamplitud

de ambas señales cuantifica el daño de la membrana. Ambas sustancias actúan como sondas

paramagnéticas,permitiendosudetecciónporresonanciadeespínelectrónico.

Paracadatratamiento,tresréplicasde150mgdesemillascadaunafueronembebidasdurante6ha

4°Cen 1mL deagua.Después deeso,O,5mLseextrajeronde aguay se agregó2mL de la solución

TEMPONE,semezclóyluegoseagregaron0,5mldeferrocianurodepotasiohastaunaconcentraciónfinal

de120mMylassemillasincubadasdurante15min.Despuésdeesto,seextrajoelsolventeylassemillasse

secarona20°Cdurante2hahumedadrelativaambiente.Lassemillassecasfueronselladasenuncapilar

de 2 mm de diámetro. Las mediciones de ESR fueron realizadas a temperatura ambiente con el

espectrómetro X&band ESR arriba mencionado. Las condiciones estándar del espectrómetro para los

radicalesnitróxidos fueron:campocentral3483Gauss;amplituddebarrido80Gauss; poderdemicroonda

6,35.10&1mW;frecuenciadelamicro&onda9,62GHz;eltiempodeconversión2,56min;constantedetiempo

2,56min,frecuenciademodulación50KHz;amplituddemodulación9,52.10&2Gauss;yganancia1,12.104.

Seacumularon20espectrosparamejorarlarelaciónseñal/ruido.

�

(19).�Calorimetría�diferencial�de�barrido�(DSC�)-�Transiciones�vítreas�

- 22 -

Latransiciónvítreapuedeserdetectadayestudiadapordistintosmétodos.Elmétodocalorimetríade

barridodiferencial(DSC)eselmásutilizado,yescapazdedetectarlatransiciónvítreaenbasealcambioen

elcalorespecíficocuandoelmaterialpasadelestadosólidoamorfoalíquidosobreenfriado.Acontinuación

semuestrauntermogramatípico(obtenidoporDSC)deunazúcarliofilizadoquemuestrasustransicionesde

fase y cambios de estado (Adaptado de Roos, 1992). El calor específico es otra de las propiedades que

cambianenlascercaníasdelatransiciónvítrea.

Se produce un cambio escalonado en el calor específico a medida que un sistema es calentado y

atraviesalatransiciónvítrea.

Fig.�2.2.-Termogramatípicodeunazúcarliofilizado(AdaptadodeRoos,1992).

Endichotermogramaserepresentaelflujocalóricoenfuncióndelatemperaturaobiendeltiempode

calentamientodelamuestra.Lamuestrasecalientaaunavelocidadconstanteenunacápsulasellada,yen

generalseutilizaunacápsulavacíacomoreferencia.

Temperatura/tiempo

Flu

jo d

e ca

lor

Formación de cristales

Fusión de cristales

Región sobreenfriada

TRANSICIÓN VÍTREA

Región vítrea

- 23 -

Elflujodiferencialdecalorsemonitoreaduranteelcalentamientode lamuestrayde lareferencia.El

cambioenel calor específicodelsólidoque ocurrea la temperaturade transiciónvítreade lamuestra,se

evidenciacomouncambioenlalíneadebasedeltermogramaamedidaquelamuestraescalentadaauna

velocidad constante desde una temperatura inicial menor que Tg hasta temperaturas mayores. A

temperaturas más altas que Tg, el azúcar se transforma en un líquido sobreenfriado. A medida que la

temperaturaylamovilidadaumentan,ylaviscosidaddisminuye,lasmoléculasdeazúcarpuedenreorientarse

hasta alcanzar un estado termodinámicamente más estable como lo es la estructura cristalina. La

cristalizaciónsemanifiestacomounpicoexotérmicoeneltermograma.Alaumentaraunmáslatemperatura,

elazúcarfundeproduciendounpicoendotérmico.Untermogramacomoeldescrito,demuestraelefectodela

temperaturasobreelestadofísicodeunalimentoliofilizadoquecontieneazúcares.

Se utilizó un calorímetro diferencial de barrido (DSC)Mettler 822 con software para análisis térmico

Starev6.0.UnafotografíadelequipamientoutilizadosemuestraenlaFigura2.1.Elbarridodecalentamiento

se realizó en el rango desde &140ºC a 120ºC. El enfriamiento del equipo se obtiene por utilización de

nitrógenolíquidoaunapresióneneltanquede150kPa.

Elequiposecalibróconindio(puntodefusión156,6°C),plomo(puntodefusión327,5°C)yzinc(punto

de fusión 419,6°C). Las muestras se colocaron en cápsulas ó crisoles de aluminio (Mettler, 40 µl)

herméticamentecerradas,sepesaronparadeterminarlamasa(7&15mg/cápsulasegúneltipodematerial)y

se midieron utilizando como referencia una cápsula de aluminio cerrada pinchada y vacía en todas las

mediciones.Unacorrientecontinuadenitrógenogaseosode200mL/minmedidoconuncaudalímetro(Bruno

Shillig,Argentina)fueutilizadaparaevitarcondensacióndeaguasobrelascápsulasysobreelsensor.Todas

lasdeterminacionesserealizaronporduplicadoyseinformóelvalorpromedio.

Sedeterminaronlastemperaturasdetransiciónvítrea(Tg)ylastransicionesentálpicas(cristalizaciones,

fusiones, etc.) de los sistemas estudiados en forma dinámica durante el calentamiento, utilizando una

velocidaddecalentamientode10°C/minapartirdelasdiscontinuidadesdetectadasenlascurvasdeflujode

calorversustemperatura.LaTgseconsiderócomola temperaturaalacualcomienzaelcambioenelcalor

- 24 -

específico (valor“onset”)quesedetectaenel termogramacomouncorrimientoendotérmicoen la líneade

base. Los valores de entalpía (∆H) se obtuvieron calculando el área de la transición exotérmica o

endotérmica,enrelaciónalamasademuestra(J/g).

Fig.�2.2.-�Fotografíadelequipodecalorímetriadiferencialdebarrido(DSC).

�

(20).�Resonancia�nuclear�magnética�(RMN)�

Para distinguir poblaciones de agua con distintamovilidad se empleó resonanciamagnética nuclear

resueltaeneltiempo(1H&NMR).SeutilizóunequipoBrukerMinispecmq20(20MHz)(Figura2.2).

Seanalizaronmuestrasde3mLdecadasistema(glicina&glucosa,glicina&trehalosaóglicina&sacarosa)

enbuffer fosfatopH5, líquidaso liofilizadas equilibradasadistintashumedades (en el rango11&97%HR),

tratadasadistintostiemposdealmacenamientoa70±1°C.Semidióeltiempoderelajacióntransversalespín&

espín(T2)(FiguraI.8)utilizandoelmétododeCarr&Purcell&Meiboom&Gill(CPMG)(MeiboomandGill,1958).

Previamente a lasmediciones lasmuestrasseequilibrarona25ºCenunbañodeagua termostático

(HaakePhoenexIIC35P,Alemania).Losdatosobtenidosfuerondeunpromediodecuatroadquisicionesde

Tanque de N2 (l)

Tanque de N2 (g)

DSC

caudalímetro

- 25 -

256 puntos, con ciclado de fases, usando una ganancia de 68 y un tiempo de interpulso (τ) de 0,5. Se

registraronsuficientesecosdemaneraquea líneadebasefueraceroyqueelT2 fueradeterminadoporel

envolventedeldecaimientodelecoutilizandoelprogramaexponencialprovistoporelproveedordelequipo.

Fig.� 2.3.-� Equipo de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), Minispec 20 (Brucker) y PC

(H.P).Resonancianuclearmagnéticaresueltaeneltiempo.

�

�

(21).�Isoterma�de�adsorción��

(a)�De�agua�

Para la determinación de la isoterma de adsorción se utilizó el método gravimétrico con registro

discontinuodecambiosdepesoyelsistemaestático,elqueconsistióencolocarelmaterialendesecadores

avacíoconteniendosalessaturadas,lascualesproporcionaronunaciertahumedadrelativaenelequilibrio.

Lassolucionessalinassaturadasdehumedadrelativa tabuladaempleadas fueron:LiCl,KH2COOH,MgCl2,

K2CO3, Mg(NO3)2, NaCl, KCl, KSO2 para humedades relativas de 11, 22, 33, 43, 52, 75, 84 y 97%

(Greenspan,1977);ysemantuvierondurantedurante15díasa20°C.

Para obtener la isoterma de adsorción y el valor de humedad residual correspondiente al valor de

monocapa (mo) se ajustaron los datos obtenidos de contenidos de humedad correspondientes a cada

- 26 -

actividaddeagua,alaecuacióndeG.A.ByaladeB.E.T.LasecuacionesdeG.A.B.ydeB.E.T.utilizadasse

presentanenlasexpresiones2.1y2.2,respectivamente:

A

mAw AwW = + +α β ε2 �

Donde:

α = −

Kb

m co

11 β = −

1

12

m co

ε = 1

m K co b

α β ε, , :parámetrosdeajuste

�7�������:actividaddeagua

8���y#:constantesdelaecuacióndeGAB

���:humedadenbaseseca(gH2O/gsemillassecas)

� �������:humedaddelamonocapa(gH2O/gsemillassecas)

Aw

Aw m m c

c

m cAw

o o( )1

1 1

−= + −

Donde:

#: eQ

R Ts

:constantecalóricasuperficialdeBET

9������:calordesorcióndeBET(cal/molH2O)

RyT:constantedegasesytemperaturarespectivamente.

ParaladeterminacióndelaisotermayparámetrosdelaecuacióndeGABseutilizóunaregresiónno

linealdesegundoorden,mientrasqueparalosdelaecuacióndeBET,unaregresiónlineal.

- 27 -

ParaelajustededatosseempleóunsoftwaredelabibliotecaGraphPadPrism.

�

(b)�De�nitrógeno�

Con el fin de evaluar la porosidad del contenido celular de las semillas de sauce en estado

deshidratado,sedeterminólacapacidaddeadsorcióndenitrógenodesemillassecas.Seemplearontambién

semillas de trigo para comparar la porosidad de ambos tipos de semillas demuy distinta longevidad. Las

muestras se congelaron bajo nitrógeno líquido (77k, &196º C). Las isotermas se determinaron a esta

temperaturaempleandounequipoautomáticodeadsorcióndegas(SorptometerGemini2360V2.00)luego

de desgasificar lasmuestras a vacío, en el rango deP/Po de 0.09 a 1 (multipunto). Se realizó también el

cálculodelasáreassuperficialesporpuntoúnicoaP/Po=0.03.Apartirdelosresultadosobtenidossecalculó

eláreaespecíficadeporción(SBET)porelmétodoBrunauer&Emmett&Teller(BET)yelvolumentotaldelporo

(TPV)estimadoapartirdelaecuacióndeBarret&Joyner&Halenda(BJH).

(22).�Análisis�estadístico�

Todos los resultados losvalorescorrespondena lamedia±eldesvíoestándar (DS).Lasdiferencias

entretratamientossedeterminaronusandoeltestdeTukeyconα≤0.05.

- 28 -

CAPÍTULO�3.I�

EL�COMPORTAMIENTO�DE�LAS�SEMILLAS�DE�SAUCE�EN�RELACIÓN�AL�SECADO,�LA�

TEMPERATURA�Y�LA�HUMIDIFICACIÓN�

�

INTRODUCCIÓN�

Lassemillasdesauce(�����sp.)tienencortavidayatemperaturaambientesuviabilidadsepierdeen

pocas semanas (Teng y Yu, 1948; Arya y col., 1988); por ello, no es posible encontrarlas a la venta

(Brinkman,1974). Inicialmenteseconsideróquese tratabadesemillasrecalcitrantes(KingyRoberts,1979;

Pence, 1995). Más recientemente, Hong y col. (1996) clasifican las semillas de 28 especies de sauce

encontrandoque27correspondíanalacategoríaortodoxasylarestante,�0�#���!��aladecomportamiento

intermedio. Estos últimos autores tienen en cuenta que las semillas de aquellas 28 especies se habían

mantenido sin pérdida de la viabilidad por algunos años en condiciones de temperaturas bajo cero y bajo

contenidodehumedad(Crocker,1938;Sato,1955;ZasadayDensmore,1977,1980;Simak,1982;Densmore

yZasada,1983;Bol'shakow,1988).�0�����,�0�����������y�0��������noseincluyenenestare&clasificación.

Amedidaquelassemillasdeunlotevanenvejeciendo,yantesdequepierdanlaviabilidad,losdañosalos

componentescelularesasociadosaeseprocesodeenvejecimientosereflejanenunaprogresivadisminución

de la calidad fisiológica quemostrarán las plántulas generadas de esas semillas. Así resultara afectadas

características comoaltura, desarrollo de la raíz, longituddel hipocótilo, tamaño, color, comoasímismo la

velocidaddegerminación.Estascaracterísticasdefinenelvigor.Porlotantounlotedesemillasquemuestra

germinaciónrápida,uniformeyundesarrollonormalde lasplántulas, tienenaltovigormientrasqueun lote

quecarecedeesascaracterísticastienebajovigor.Cabemencionarqueestaesunadefinicióndevigorde

alcance restringido, o mejor dicho, adaptado al marco experimental de esta tesis, en la que evalúa el

comportamientogerminativoenlasclásicaspruebasdegerminaciónsobrepapelembebidoenagua,loque,

porotraparteesloquecorrespondeaestetipodetrabajo.Unadefiniciónmasampliadelconceptodevigor

- 29 -

incluyeunítemsumamenteimportantecomoeslavelocidaddeemergenciaacampoqueobviamenteaquíno

seconsidera.

Losparámetrosgerminativosqueseconsideranalolargodeestatesissongerminaciónnormal(GN),

germinaciónanormal(GA)ygerminacióntotal(GT)y tiempomediodegeminación(TMG)y,eventualmente

otrosparámetroscuandosehacereferenciaalabibliografía.

Enestecapítuloseconsideralacuestióndelatoleranciaaladesecaciónyla longevidadadiferentes

temperaturas a fin de precisar la información existente, sobre todo teniendo en cuenta que la categoría

ortodoxaasignadaaestassemillasnopareceríacorresponder,almenosestrictamente,conlalongevidadque

seesperadeunasemillapertenecienteaesacategoría.

También este capítulo trata sobre el efecto que tiene la humidificación, sobre todo porque entre los

poquísimostrabajosfisiológicosdedicadosaestassemillasseencuentraaPolyaetal.(1961)quiendetectó

ensemillasdeálamoqueeseprocesomejoraelcomportamientogerminativo.

- 30 -

RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�

Las semillas de �0� ����, inmediatamente luego de ser expulsadas de la cápsula, exhibieron un

contenidodedeagua(ca)de40%yunporcentajedegerminaciónde100%.La inmersiónde lassemillas

recientemente liberadas en nitrógeno líquido fue letal, ya que la germinabilidad fue nula. Después de tres

horas de permanencia en condiciones ambientales, el contenido de agua descendió a 12% sin que se

registrara reducción del porcentaje de germinación; las semillas deshidratadas de este modo no fueron

afectadas por el tratamiento con nitrógeno líquido (Tabla 3.I.1). Resulta evidente, entonces, que 3 h de

deshidratación natural fueron suficientes para reducir el contenido de agua (ca) por debajo de aquél que

permitelaformacióndehielo,letalparalostejidosvivos(Stanwood,1985).Estelotedesemillascon100%de

germinación toleró una posterior deshidratación artificial a 9 y 6,7% de ca sin que se redujera

significativamente la germinación inicial (Tabla3.I.1).Esta se redujo a la cuartaparte cuando el ca bajó a

4.3%.El lotedesemillascon75%degerminación inicial fuemássusceptiblea ladeshidrataciónyaque,a

diferencia del lote con 100%de germinación inicial, cuando el ca se redujo a 6.7% hubo una disminución

significativaa55%degerminación,yunamásacentuadadeshidratacióna4.3%ca laredujoa33%(Tabla

3.I.1).Seobservoqueenamboslotes,lagerminacióndesemillasconcaentre12y4.3noresultóafectada

poreltratamientoconnitrógenolíquido.

- 31 -

Germinación�inicial�normal�

100%� 75�%�Contenido�de�humedad�

(%�base�húmeda)�-�LN� +�LN� -�LN� +�LN�

12� 100ª 98ª 75ª 70a

9� 94ª 96ª 68ª 66ª

6-7� 89ª 93ª 55b 54b

4-3� 23b 28b 33c 36c

�Tabla� 3.I.1.- Influencia del contenido de agua sobre la germinación (%) de dos lotes de semillas de

Salixalbaquedifierenenlagerminacióninicial,expuestosanitrógenolíquido(+LN)ynoexpuestosnitrógenolíquido (&LN). Los valores seguidos con la mismo letra (superíndice) dentro de la columna son nosignificativamentediferentesen�=0.05poreltestdeTukey

Similaresresultadosconrespectoaladeshidrataciónyalatoleranciaalnitrógenolíquidoseobtuvieron

consemillasde�0���������� (Fig.3.I.1).Semillas reciénexpulsadaspresentaron41%decayentre98y

100%degerminación inicial; deshidratadaspor3h encondicionesambientales redujerona 11%elcasin

afectarlagerminación.Unamayorreduccióndelcaa6,5%,llevólagerminaciónal86%,mientrasqueuna

reducciónaúnmayora4.4%calabajóa16.5%.Comoenelcasode�0�����,elnitrógenolíquidoresultóletal

para lassemillas reciénexpulsadas, peronoafectó lagerminaciónde lassemillasdeshidratadasnatural y

artificialmentealosdiferentesca.Semillasde�0����������con11%ca,almacenadasdurante11mesesen

nitrógeno líquido no mostraron disminución significativa de la germinación (datos no mostrados). Esta

tolerancia al nitrógeno líquido fue observada por Pritchard y Seaton (1993) para semillas de vida

relativamente corta. Además, el tamaño tan pequeño de las semillas de sauce facilita el empleo de este

método.�

- 32 -

0%

20%

40%

60%

80%

100%

A A+NL B B + NL C C + NL D D + LN

Tratamientos

Por

cent

aje

del n

úmer

o to

tal d

e se

mill

as

Germin.normal Germin. anormal No germinadas �

�

Figura�3.I.1.Germinación(%)desemillasde�0����������despuésdeltratamientodedeshidratación,

cada unocon/ y sin inmediata inmersión en nitrógeno líquido (NL)durante 1 h.A,Semillas recientemente

liberadas (control): 40% contenido de humedad;B, 3 h después de liberadas en condiciones ambientales:

11%contenido de humedad;C, desecadasen solución saturadade LiCl: 6.5% contenidode humedad;D,

desecadas en solución saturada de H2SO4 : 4.4% contenido de humedad. Los valores de barra son

promediosdecuatroréplicasde25semillas±DE.

- 33 -

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 30 60 90 120 150 180

Tiempo (dìas)

Ger

min

ació

n no

rmal

(%

)

25ºC

5ºC

-20ºC

Figura�3.I.2.-Germinación (%)deSalixalbadespuésdeseralmacenadasencondicionesde9%de

contenidoacuosoya25º,5ºy&20ºC.Losvaloressonpromediosdecuatroréplicasde25semillascadauna

±DE.�

Elefectodelatemperaturadealmacenamientosobrelalongevidaddesemillasde�0�����con9%ca

semuestraenlafigura3.I.2;laviabilidadseperdióen2semanasa25ºC.Sinembargo,lasupervivenciade

lassemillasseextendióavariassemanasa5ºCyavariosmesesa–20ºC.Semillasde�0����������con

10.5%caalmacenadasa–70ºCmantuvieronsusnivelesdegerminacióninicialhasta30meses(Tabla3.I.2).

Comoseindicóenlaintroducciónsemillasdealgunasespeciesdesauce,entrelasquenoseencuentranlas

aquí estudiadas, conservaron porcentajes de geminación relativamente altos durante unos pocos años

(Crocker, 1938; Sato, 1955; Zasada y Densmore, 1977, 1980; Simak, 1982; Densmore y Zasada, 1983;

Bol'shakow,1988).

- 34 -

Germinación�(%)�

Meses�de�

almacenamiento�24�h*� Normal�+�Anormal� Normal�

6� 95±1.8 100 98±1.4

18� 96±4.5 100 95±3.9

24� 100 100 97±4.5

3� 89±9.6 99±3.3 97±4.5

*Desdelasiembra

Tabla�3.I.2.-Germinación(%)desemillasde�0����������almacenadasdurantediferentesperíodosa10.5%decontenidodehumedady–70ºC.Losvaloressonpromediosdecuatroréplicasde25semillas±ds

�

Los resultados aquí obtenidos muestran que la germinación de las semillas de ������ ���� y �0�

���������, recién resultan afectada amuy bajos ca y que la longevidad esmayor cuantomas baja e la

temperaturas.DeacuerdoconelcriterioqueHongyEllis(1996)aplicanalacaracterizacióndelassemillas

ortodoxas(�0!.amenorcaymenor temperaturacorrespondemayor longevidad)esposibleconcluirque las

semillasdelasdosespeciesinvestigadasmuestranuncomportamientoortodoxoduranteelalmacenamiento.

Estaconclusiónconcuerdaconelcomportamientoortodoxoasignadoalassemillasdelasotras28especies

de sauce (Hong y col. 1996). Sin embargo, entre las semillas ortodoxas, aun las menos longevas, se

mantienenviablesdurantealmenosunospocosañosatemperaturaambiente,enlugardedecaertanrápido

comolohacenlasdesauce.Enestesentidomuestranunaatipicidadcuyascausasnohansidoinvestigadas

y este es unos de los ítems que se trata de aclarar en los siguientes capítulos (Capítulos 3.III y V). Un

comportamiento también atípico que detectamos en estas semillas consiste en su respuesta a la

humidificación. Este procedimiento se aplica a aquellas semillas cuya germinación se puede ver afectada

cuando son puestas a germinar directamente sobre papelmojado. Se considera que la rápida entrada de

aguaqueseproducenodatiemposuficienteparaquelamembranaplasmáticapasede lafasegel,propia

delestadodeshidratado,alafasecristal,propiadelestadohidratado,quenoesafectadaporlavelocidadde

- 35 -

hidratación. La lenta hidratación que se produce con la humidificación, en cambio, permite que ocurra la

transicióndefasey,puestaagerminar,lasemillalohacesinqueseveaafectadasugerminación.

Al respecto, ensemillasdeunaespeciedesalicácea,comoel álamo,Polya (1961)detectóquecon

humidificaciónpreviaaumentabaelporcentajedesemillasquemostrabanGN,hechoqueloatribuyóaquese

evitabadañoporimbibición.Esteesunodelospocosantecedentessobreestudiosfisiológicosensemillasde

salicáceasyquisimosconocercualeslarespuestadelassemillasdesaucealahumidificación,dadoqueel

comportamientogerminativoesuntemadeestatesis.

Enlosexperimentosseusaronlotescondiferentesporcentajesdegerminacióninicial,reflejodelgrado

deenvejecimientodelassemillas.Eltratamientodehumidificaciónenloslotesdesemillasdeterioradasde�0�

����(Fig.3.I.3)y�0����������(Fig.3.I.4)dieronporresultadoprimeramenteunareduccióndelporcentajede

GNquefueseguidoporunincremento.Porejemplo,enelloteAde�0����(Fig.3.I.3),lagerminacióninicial

de 42%se redujo a 33% a las tres primeras horas de tratamiento,mientras que a las 6 h la germinación

recuperó, recobrando el porcentaje de germinación inicial (41 %) el que continuó incrementándose hasta

superarel60%.Uncomportamientosimilarseinsinuóenlos lotesByC,aunquelaeventualrecuperación

quedóinconclusadebidoalafaltadesemillas.

- 36 -

0

10

20

30

40

50

60

70

0 3 6 9 12 15

Tiempo (horas)

Ger

min

ació

n no

rmal

(%

)

A

B

C

Figura�3.I.3.-Efectodehumidificacióna100%HRy25ºCsobrelagerminación(%)delotesdesemillas

������ ���� (A&C) con diferente germinación inicial. El contenido inicial de agua fue 9 %. Los valores sonpromediosdecuatroréplicasde25semillas±DE.

10,5

17,5

25,1

33,5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12

Tiempo (horas)

Ger

min

ació

n y

cont

enid

o de

hum

edad

(%

)

GT lot A GN lot A caGT lot B GN lot B �

�Figura� 3.I.4.- Efecto de la humidificación a 100% HR y 17ºC sobre la germinación (%) de lotes de

semillasde���������������(AyB)condiferentegerminacióninicial.Elcontenidodeaguainicialfue10.5%.Germinaciónnormal+anormal(G);GerminaciónNormal(GN).Losvaloressonpromediosdecuatroréplicasde25semillas±DE.

- 37 -

Respectodelassemillashumidificadasde�0����������,loslotesAyB(Fig.3.I.4)siguieronunpatrón

similar.Despuésde3hdehumidificaciónelporcentajedeGNseredujoalaterceraparte:de90%y46%a

30%y15%paraloslotesAyBrespectivamente.Acontinuaciónseprodujounpaulatinoincrementoquellevó

a laGNaaprox.80%paraambos lotesa las 9horasdehumidificación,valor quesuperaampliamenteel

inicialdelaGNdelloteB.Polya(1971),encambio,solodetectaunefectofavorabledelahumidificaciónque

hace aumentar el porcentaje deGN, lo que también sucede en trabajos de otros autores que emplean el

tratamientodehumidificación(BewleyyBlack,1994;Ellisycol.,1990;Pollock,1969).

Enlosexperimentosllevadosacaboenesteestudio,tambiénhubounincrementodelaGN,perofue

posterioraladisminucióninicialquealcanzóelvalormásbajoalas3hdehumidificación.Enesemomento,

elcapromedió25,1%(Fig.3.I.4),unnivelque,deacuerdoaHongyEllis(1996)excluyelaposibilidaddeque

ocurradañoporimbibición.Además,variaspruebasdegerminaciónhechasconlotesdesemillasdeambas

especies con ca entre 9 y 12% mostraron 98&100% germinación normal cuando se hicieron sin previa

humidificación,locualsugierequenosehabíanproducidodañosporimbibición(Tabla3.I.2,Fig.3.I.1).

Porotraparte,llamalaatenciónquelaGTsehayamantenidoprácticamenteen100%alas3horasde

humidificación,momentoenquelaGNdescendióasuvalormasbajo,dadoqueengenerallosvaloresbajos

deGNsecorrespondenconsensiblesdisminucionesdelaGT,noproduciéndosetanaltaproporcióndeGA

comolomuestranlasFiguras3.I.4y3.I.5.EnconsecuenciatantoelinicialdescensodelaGN,comolafalta

decorrespondenciaentreGNyGTdurante lahumidificaciónsonotrosrasgosatípicosquesetratanen los

capítulos3&IIIy3&IV.

- 38 -

Figura�3.I.5�–Plántulasdesemillasde����������������correspondientesal loteB:A,control;B, tres

horasdehumidificación;C,9hdehumidificación.NóteseenBquelasplántulasmuestranmarcadodesarrollo

anormal(reduccióndecotiledones,hipocótiloyraíz,tamañomenorysignificativapérdidadeclorofila).EnC,

lasplántulasmuestranundesarrollonormal,quesuperaencalidadfisiológicaaldelasplántulascontrol.

Los resultados sugieren que algún proceso deteriorativo, diferente a los daños por imbibición,

explicarían ladisminuciónobservadaen lagerminaciónen loscomienzosde lahumidificación,yqueen la

posteriorrecuperaciónestaríainvolucradoalgúnprocesometabólicodereparación.(BurgassyPowell,1984;

Bray y col., 1989; Gray y Drew, 1991; Fujikura y col., 1992). Este comportamiento de las semillas

humidificadas de �0� ���� y �0� ��������� no ha sido previamente reportado para ninguna especie de

Salicaceae.Paraaclararestosaspectos,losestudioscontinuaronenunaterceraespeciedesauce,�0������

L.ylosresultadossemuestranenlossiguientescapítulosdeestatesis.

- 39 -

CAPÍTULO�3.II�

ESTUDIOS�HISTOQUÍMICOS�Y�SUBCELULARES�EN�SEMILLAS�DE����4���1����4�5�����1�

���4�����Y� � ����������

�

INTRODUCCIÓN�

Las semillas maduras de las especies de Salicáceas tienen un embrión de color verde porque sus

tejidos contienen clorofila. La presencia de clorofila en los embriones en desarrollo constituye un carácter

bastantecomúntantoenMonocotiledóneascomoenDicotiledóneas(YakovlevyZhukova,1980);esdecir,en

la mayoría de las especies, la clorofila aparece en los embriones en los estados globular a torpedo y

desaparece cuando las semillas alcanzan la madurez (Klein y Pollock, 1968; Yakovlev y Zhukova, 1980;

BewleyyBlack,1994;Dahlgren,1980;PeriasamyyVivekanadan,1981;Janzen,1982;PretováyVojteková,

1985;VertucciyFarrant,1995).Sinembargo,seha reportadoque lassemillasmadurasdealgunaspocas

especiesmantienenlaclorofilaenlamadurez.Entreestasespeciessepuedenmencionar:�)�#!�����������

(Farrant y col., 1992);�#!����!�� �������� (Pinfield y col., 1973);8 #"��� #"������ (Marin yDengler, 1972),

8 #"��� ����#� (El&Shishiny y Thoday, 1953),���� ��� ) �:!���� y�!��!���� �������� (Negbi y Tamari, 1963).

Existensinembargoalgunasdiferenciasentre ellasen loquese refierealmomentoen quedesarrollanel

sistema de tilacoides: en �)�#!���� ������ la estructura granal desarrolla apenas poco antes de que las

semillasesténmadurasparasudispersión,aunqueloscloroplastossemuestrantotalmenteorganizados24

hdespuésdelaabscisióndelfruto.Losembrionesmadurosde !���� ���#�+!��(ZhukovayYakolev,1966)

también presentan cloroplastos pero en las semillas maduras el sistema de endomembranas no está

organizadoengranos.

Hastael presente,noexistenestudiosmorfológicos,histoquímicosnisubcelularesensemillasde las

especiesdeSalicáceas.Enestecapítuloseinvestiganlascaracterísticasestructuralesyultraestructuralesde

lassemillasmadurasdetresespeciesdesauceyunadeálamo(����������L.y�0����������Koidz.,������

�����Marsh.y� �����������L.)usandomicroscopíadecampoclaroyelectrónicadetransmisión.Asimismo

- 40 -

se determina la naturaleza de las principales sustancias de reserva de estos tejidos usando métodos

químicos, histoquímicas, físicos. Finalmente se analiza comparativamente el contenido de clorofila de las

semillas de ������ ����� y de � ������ �����. Estos estudios tienen el objetivo de identificar aquellas

características que podrían estar relacionadas con el comportamiento atípico de estas semillas durante el

almacenamiento(Cap.3&I).

�

- 41 -

RESULTADOS�

Las semillas contienen lípidos y proteínas como sustancias de reserva. El contenido de lípidos y

proteínastotalesalcanzavaloresaproximadosde20y34.6%,respectivamente.

Las semillas de las especies de sauce aquí estudiadas carecen de endosperma en el estado de

madurez. Por ello, las semillas consisten de un embrión y una cubierta seminal (Fig. 3.II.1 A). No se

encontrarondiferenciasentrelasespeciesestudiadas.Lacubiertaseminalconsistede3&4capasdecélulas

muertas(Fig.3.II.1B).Lacapaexternapresentaengrosamientosdeligninasobrelasparedesradiales(Fig.

3.II.1B). La lignina fue identificadacon floroglucinol. Lascélulasde lascapas subyacentes tienen paredes

delgadasycarecendecitoplasma.

El embrión es recto, y consiste de dos cotiledones y un corto eje (Fig. 3.II.1 A). El eje tiene en sus

extremos los meristemas apicales del brote y de la raíz. El meristema apical del brote es una estructura

cónicaenlacualsediferencia laorganizacióntúnica&cuerpo,típicadelosmeristemasapicalesdelbrotede

lasAngiospermas(3.II.1C).Enestecasolatúnicaestáconstituidaporunaúnicacapadecélulas.Noexisten

primordios foliares diferenciados. En el ápice meristemático de la raíz se pueden identificar las células

inicialesdelacaliptrayprotodermis,delacortezaydelcilindrocentral(3.II.1D).

Enloscotiledonescomoeneleje,sepudieronidentificarlostejidosprecursoresdelaepidermis,delos

tejidos vasculares y del parénquima, es decir, la protodermis, el procambium y elmeristema fundamental.

Esta identificación fue posible hacerla, teniendo en cuenta la forma, tamaño y posición de las células del

embrión(Fig.3.II.2A&E).Laprotodermisformaunacapacontinuaalrededordetodoelcuerpodelaplanta,

salvoenlosmeristemasdondenoestádiferenciada.Unacutículadelgadaseobservasiempresobrelapared

externa. En los cotiledones, el meristema fundamental se diferencia en los tejidos en empalizada y

esponjoso,elprimero,concélulasalargadasenelejeperpendicularalasuperficie;elsegundocomocélulas

isodiamétricas.Eneleje,elmeristemafundamentalconstituyelacorteza,ysuscélulassonisodiamétricas.El

procambiumestáconstituidoporcélulasangostasyalargadas.Enloscotiledones,eltejidoprocambialforma

unhacecillomediodelqueseseparanhaceslaterales.Eneleje,elprocambiumformauncilindrocentral.

- 42 -

Todas las células del embrión tienen paredes primarias. En el citoplasma, pueden identificarse los

cuerposproteicos, loscuerpos lipídicos,mitocondrias,cloroplastos,retículoendoplásmicoyelnúcleo(3.II.2

A&F,3.II.4).Enlascélulasdelmeristemafundamentaldeloscotiledonesydeleje,loscloroplastosestánbien

desarrolladosy,ocasionalmente,contienenalmidón.Enlascélulasdelprocambium,delaprotodermis,yen

lascélulasqueconstituyenlosmeristemasapicales, losplástidosnoestándiferenciadoscomocloroplastos,

esdecir,carecendeendomembranas,yenellosesfrecuenteencontrardepósitosdefitoferritina(Fig.3.II.3D&

F).

- 43 -

Fig.� 3.II.1.- Secciones de semillas maduras de ������ ����. A, Microscopía de campo claro de unasección longitudinal de la semilla. La sección fue teñida con azul de toluidina. Escala = 100 fm. B&CMicroscopíaelectrónicadetransmisión.B,Tegumentodelasemilla.Escala�=10fm.C,Secciónlongitudinalmedia del ápice meristemático del brote. Escala = 10 fm.D, Microscopía de campo claro mostrando laorganización delmeristema apical de la raíz.Escala = 10 fm. Abreviaturas: ar, ápice de la radícula; co,cotiledón; cp, cuerpo del ápice meristemático del brote; cha, chalaza; ej, eje radícula&hipocótilo; en,engrosamientodelaparedcelulardelaexotesta;ic,célulasinicialesdelmeristemafundamental;icc,célulasinicialesdelcilindrocentral;ipr,inicialesdelaprotodermisydelacaliptra;pd,protodermis;r,rafe;spd,unacélulasubprotodérmicadelacorteza,vacuolizada;tu,túnica�va,vacuola.

- 44 -

Fig.� 3.II.2.- Microscopía de campo claro de los tejidos de los cotiledones de �����. Los cuerpos

proteicos(flechas)estánpresentesentodoslostejidos;contienenunoomáscristalesgloboides.Algunosdelosgloboidessehanperdidodurantelafijacióneimbibición,dejandounhuecodentrodelamatrizproteicadeloscuerposproteicos.Loscloroplastos(cabezadeflecha)estánenlostejidosdeempalizadayesponjosoyenalgunascélulasde laprotodermis.Lascélulasvacuolizadasseencuentranen lacapasubprotodérmica.Las secciones fueron teñidas con azul de toluidina.A, Sección longitudinal de uno de los cotiledones delembrión maduro de �0� ���������.Escala: 20 fm.B,C, Secciones longitudinales de los cotiledones deembrionesjóvenesde�0�����.,coleccionado15díaspreviosalmomentodeladispersión(B)ycoleccionado7 días precios al momento de la dispersión (C). Escala: 10 fm. D, Sección longitudinal de uno de loscotiledonesdeunasemillamadurade�0�����;seobservalaprotodermisyeltejidodeempalizada.Escala:10fm.E,Secciónlongitudinaldeunodeloscotiledonesdeunasemillamadurade�0�����.Semuestranlaprotodermisyeltejidoesponjoso.Escala:10fm.(hv,hacecillovascular;�va,vacuola).

- 45 -

Los cuerpos proteicos contienen 2 o más globoides, salvo en las células de la protodermis, en las

cualeslosgloboidesfrecuentementeestánausentes.Enlosgloboides,elusodeenergíadispersivaderayos

XpermitiódetectarP,K,MgyCacomosusprincipalesconstituyentes(Fig.3.II.5A&B).Loscuerposlipídicos

estándispuestosenproximidadesdelamembranaplasmáticaytambiénestándistribuidosalrededordelos

cuerposproteicos (Fig.3.II.3A&D).Lapresenciadeproteínas fuedeterminadapor tinciónconazulbrillante

coomassie, ácido fucsínico y fast green FCF. La presencia de los lípidos fue determinada por tinción con

SudanblackB.

Unacaracterísticapeculiarencontrada enel embriónde sauce fue lapresenciadecélulasconunaamplia

vacuola central, que desplaza el citoplasma y organelas contra la pared; estas células vacuolizadas que,

llamativamentesóloseencuentranenlacapasub&protodérmica,alternandemanerairregularconlascélulas

reservantes (Fig. 3.II.2 A&E). En algunos casos se identificaron taninos y sales de oxalato deCa en esas

vacuolas.

- 46 -

Fig.� 3.II.3.- Micrografías obtenidas con microscopía electrónica de transmisión, de los tejidos

embrionarios de una semilla madura. A, células del tejido de empalizada de �0� ����. Escala:: 2 fm.B,Célulasvacuolizadasdeltejidoesponjosode�0�����.Escala:1fm.C,detalledeunodeloscloroplastosdela figuraA. Uno de los cloroplastos contiene un pequeño grano de almidón (flecha).Escala: 0.5mm.D,Plástidosdeltejidomeristemáticodelápicedelbrotedeunembriónde�0����������.Puedeserobservadoun depósito de fitoferritina en su característico arreglo cristalino. Escala: 0.2 fm.E, Detalle de plástidosmostrando depósitos de fitoferritina. Escala: 0.1 fm. F, Cuerpo proteico de una célula del tejido deempalizadadeunasemillade�0�����.Laimagenmuestrauncuerpoproteicoelcualconsistedelamatrizyde3cristalesgloboides(cabezadeflecha).Escala:1fm.Lasseccionesfueroncoloreadasconacetatodeuranilo seguidas por citrato de plomo (ch, cloroplasto; cl, cuerpo lipídico; ei, espacio intercelular; m,mitocondria;pc,paredcelular;va,vacuola).

- 47 -

Elanálisisdelaclorofiladelembriónde�����������y�� ������������revelólapresenciadeChl�yChl�.

Elestudioquedeterminalaabsorbancialeídaconunespectrofotómetro,permitiódeterminarquelaclorofila

totalfuemayorenlosembrionesdesaucequeenlosdeálamoyencambiolarelaciónChl�;Chl�fuecasiel

dobleenlosembrionesdeálamo,comparadosconlosdesauce(Tabla3.II.1)�

GN� Chl��� Chl��� Chl���6Chl��� Chl�total�

%� Lg/mg�de�peso�seco

����&�'�*��� 94 2.08 1.4 1.48 3.14

#)�����'�*��� 95 0.21 0.08 2.62 0.29

Tabla�3.II.1.-�Concentracionesdeclorofila(`g/mgdepesosecodetejidosseminales)ylarelaciónChl�;��ensemillasde������������y� �����������0�GN:germinaciónnormal

Fig.� 3.II.4.-Micrografía obtenida conmicroscopía electrónica de transmisión de una célula del ápice

meristemático de la raíz del embrión de ������ �����0 En esta parte del citoplasma pueden observarse elretículo endoplásmico rugoso en cisternas apiladas, unamitocondria, y varios cuerpos lipídicos. La flechaindicaundepósitodefitoferritinaenunproplástido.Escala:1fm.

- 48 -

Fig.�3.II.5.-EspectrosdelosanálisisEDXdelosgloboidesencontradosencuerposproteicosdecélulasdeempalizadadecotiledonesde����������(A)y���������������(B)

�

- 49 -

DISCUSIÓN�

Nadaseconocíasobrelascaracterísticassubcelularesdelostejidosembrionariosdelasespeciesde

Salicáceas y en la bibliografía solo aparece reportado que las semillas son verdes, es decir los tejidos

embrionarios contienen clorofila en su madurez. Es cierto que los embriones en desarrollo de muchas

especiesdeplantassonverdesdebidoalapresenciadecloroplastossimilaresaloscloroplastosdelashojas;

sinembargo,estosembrionesclorofílicossevuelvenaclorofílicosenlamadurez.Esdecir,elestadoclorofílico

existe, en la mayoría de los casos, sólo durante el desarrollo del embrión (Dahlgren 1980; Yakovlev y

Zhukova1980;Janzen1982;VertucciyFarrant1995).Cloroplastosyclorofilahansidoencontradosen los

embrionesmaduros demuy pocas especies: !���� � ��#�+!�� (Zhukova y Yakolev 1966),8 #"��� #"������

(MarinandDengler1972),�#!����!�� ��������(Pinfieldycol.1973),�)�#!�����������(Farrantycol.1992,

1997)y1:!�!����� #��!���� (Pammenterycol.1998).Lassemillasde !���� ���#�+!�� tienen larga vida

(Priestley1986)aunquecabe ladudadequeelestudiodeZhukovayYakolev (1966)sebaseensemillas

totalmente maduras. En �#!�� ��!�� ���������� �)�#!����� ������� %� 1:!�!����� #��!����� las semillas son

categorizadas como recalcitrantes (Pinfield y col. 1973; Farrant et al 1992; Pammenter et al 1998). El

comportamientoduranteelalmacenamientode8 #"���#"������esdesconocido.Lassemillasdelasespecies

de���.� que aquí se estudian son ortodoxas con un períodomuy corto de viabilidad (Capitulo 3&I.de esta

tesis)ellaspresentancloroplastoscongranabiendesarrolladayfrecuentementealmidónenelestroma,es

decir cloroplastos similares a los encontrados en las semillas maduras de !���� � ��#�+!��, �#!��

��!�� ��������,�)�#!�������������1:!�!����� #��!����� y8 #"��� #"������. Teniendo en cuenta las especies

mencionadasincluidaslasdeSalicáceas,esposibleinferirquelapresenciadecloroplastosenlosembriones

madurosnopareceríaestarasociadaconelcomportamientodelassemillasduranteelalmacenamiento.

Lapresenciadeclorofilaydecloroplastoscongranasugiereque loscotiledonesdesauce (yde las

otras especies mencionadas con similares características) son capaces de cumplir su rol de órganos

fotosintetizantesmastempranodurantelagerminaciónqueentodasaquellasespecies(quesonlamayoría)

- 50 -

en las cuales debe producirse el desarrollo de la grana y la síntesis de clorofila antes que la fotosíntesis

puedaseractivada,loqueocurredespuésdelaimbibición.

La relación Chl �;Chl �� de aproximadamente 3&4 es reportado para hojas normales de diferentes

especies adaptadas a crecer en altas intensidades de luz. De acuerdo a Palanisamy (1989) y Pretová y

Vojtekova (1985), la relación Chl �;Chl � es más baja en embriones verdes que en hojas normales. Sin

embargo,enembrionesde�0������yde� �����������,convaloresde1.48yde2.62,respectivamente,los

valores resultaronsimilaresa losencontradosenhojasnormalesdeespeciesadaptadasacrecerenbajas

intensidadesdeluz,condiciónenlacuallaactividadfotosintéticaesmásalta(Thornber1975).Estosugiere

quelaclorofilaencontradaenlassemillasdesauceyálamoayudaríaenlaemergenciaycrecimientodelas

diminutasplántulas,probablementeensombrecidasporlavegetaciónquelarodea.

La fitoferritina,proteínaquealmacenaelhierro, juegasu rolenelmetabolismodelhierro (Harrisony

Arosio 1996). La fitoferritina se encuentra especialmente en los plástidos de los tejidos agranales de los

meristemasapicalesdelbroteylaraízy,menosfrecuentemente,enloscloroplastosgranalesdelrestodelos

tejidosembrionarios.Lafitoferritinaentejidosseminaleshasidoreportadaenproplástidosdecotiledonesde

algunosmiembrosdeFabaceae, i.e.����������)��L. (LobreauxyBriat1991),<�#��� +��� L. (Johanssony

Walles1994)y4!�#�������*�������L. (Baldanycol.1995)ydeChenopodiaceae, i.e.4"!� � �����*��� �

Willd. (Pregoycol.1998).También la fitoferritina fueencontradaenelendospermade%����!� ��!�!)��!��

(Oteguiycol.1999).Lapresenciadefitoferritinaenlosproplástidosysucarenciaenloscloroplastos,sugiere

queenelprocesodetransformacióndeunaorganelaenlaotra,elFedelafitoferritinaesusadoenlasíntesis

deproteínasyenzimasdelsistemafotosintéticoquelocontiene.

Ademásdelapresenciadecloroplastosdesarrollados,lascélulasdelostejidosembrionariosdesauce

retienenensumadurezuncomplejosistemademembranas,estoes,elreticuloendoplásmicorugosoylas

mitocondrias con crestas parcialmente desarrolladas. Estas características hasta el momento habían sido

reportadassóloensemillasrecalcitrantes(Farrant,ycol.1989;1992).Enlassemillasortodoxas,encambio,

seproduceunadesdiferenciacióndecloroplastosymitocondriasyunareduccióngeneraldemembranasen

- 51 -

losúltimosestadosdeldesarrollode lassemillas.Esentoncesquelassemillasdesauceseapartandelas

categorías tradicionalmentereconocidasensemillasyconfirman lahipótesisdeque lasmismasconforman

unmodelodiferente.

Encuantoa las reservas,se identificaron lípidos,proteínasyminerales.Loscuerpos lipídicos fueron

detectadosentreloscuerposproteicosyencontactoconlamembranaplasmática.DeacuerdoaVertucciy

Farrant (1995), estos cuerpos lipídicos están presentes en las células de los embriones de semillas

recalcitrantesyortodoxascumpliendo las funcionesde reservaysu funciónseasociacon lanecesidadde

repararyconstruirmembranasaliniciodelaimbibición.

En las semillas típicamente ortodoxas, la vacuola central está ausente en las células de todos los

tejidos embrionarios (Vertucci y Farrant 1995). Vacuolas grandes que ocupan una posición central en las

células, es decir, célulasdiferenciadas, fueronobservadasen todos los tejidosde los cotiledones y eje de

�)�#!����� �������� ���� ��"��� :��:��� y �#�� ���� �!������#!��� (Farrant y col. 1989; Berjak y col. 1992;

Farrant y col. 1992), todas ellas con semillas recalcitrantes. Las semillas de las especies de ����� aquí

estudiadas, tienenvacuolasenalgunasde lascélulasdelacapasub&protodérmicadeejeycotiledones;en

esteaspectoentonces,estassemillassediferenciannosólode lassemillasortodoxassinotambiénde las

semillasrecalcitrantes.Enestepuntopareceríainteresanteabordarenelfuturo,investigacionesorientadasa

investigar lasrazonesporlascualessóloalgunasdelascélulasdelacapasubprotodérmicamantienensus

vacuolas;estehechoestotalmentenovedosoenlabibliografíadesemillas.

- 52 -

CAPITULO�3-III�

REACCIONES�QUÍMICAS�DE�DETERIORO�EN�LAS�SEMILLAS�SECAS�

�

INTRODUCCIÓN

Las semillas típicamente ortodoxas muestran longevidad de varios años (Roberts, 1973). Como se

señaló en el capítulo 1 (Maroder y col., 2000), se considera que las principales reacciones químicas de

deterioro que ocurren durante el almacenamiento de las semillas ortodoxas son lentas reacciones de

oxidaciónydeMaillardqueprocedenabajoscontenidosdeagua(Priestley,1986;WilsonyMcDonald,1986;

McDonald,1999).Debidoaque lassemillasdesaucedecaenenpocassemanasa temperaturaambiente,

esasconsideracionesresultaninsuficientesparaexplicarelrápidodeterioro.Alrespecto,cabemencionarque

sibienel bajo contenidodeagua impide laactividadde laenormemayoríade lasaccionesenzimáticasy

hacennecesariamentelentaslasquenolosson,comoautooxidaciones,Maillard(WilsonyMcDonald,1986;

VertucciyLeopold,1987;Ponquettycol.,1992),estudiosrelativamenterecienteeneláreadelassemillas,

quederivandeinvestigacionessobreconservacióndealimentosmuestranque,enlassemillaslongevas, la

matriz citoplásmica se encuentra en un estado de alta viscosidad o baja porosidad lo que determina una

movilidadmolecularreducidayporendequelasreaccionesdedeterioroseanlentasylassemillas,longevas.

Cabepreguntarseentoncessi,almenosenparte, labrevísima longevidadde lassemillasdesaucenose

debería a que el estado de lamatriz citoplásmica es poco viscoso omuy poroso permitiendo así que las

reaccionesmencionadasno resulten lentasycontribuyanal rápidodeterioro.Porotraparte,elcapitulo3.II

muestraqueotrorasgoatípicodeestassemillasesqueenestadosecoconservancloroplastosconclorofila

loqueinduceapensarquelaluzpodríajugarunrolcomoagentedeteriorante(Capítulo3&II;Maroderycol.,

2003).Entejidosverdesfrescos,sibienelrolfundamentaldelaclorofilaexcitadaporlaluzsecumpleenel

proceso fotosintético, ésta también puede activar el oxígeno molecular ya sea directamente por

transferenciadelaenergíadeexcitaciónformandooxígenosingulete,o indirectamentepor transferenciade

electronesformandoradicalsuperóxido.Ambasespeciesdeoxígenodanlugara lageneraciónderadicales

- 53 -

libres (RL)yespeciesreactivasdeoxígeno(EROs) (Asada,1994;Dalton,1995;Foyer,1996).Laformación

mediada por la luz de estas especies, que son importantes agentes de daños metabólicos en sistemas

biológicos,seconocecomofotooxidación.Entejidosvedessecos,encambio,comoeselcasodelostejidos

de los embriones de las semillas de Salicáceas, aún cuando la activación del oxígeno ha sidomuy poco

estudiada,sedescartaqueseformeradicalsuperóxidodebidoaqueestaespecieradicalariaseoriginaenla

cadenadetransportedeelectronesdelprocesofotosintéticoquenoesoperativaenestadoseco.Endicho

estado, la energía de la clorofila activada puede originar oxígeno singulete, disiparse como luz demayor

longituddeondaocomocalor(TaizyZeiger,1998).�

De lo hasta aquí considerado surge que dos procesos no excluyentes entre sí podrían explicar, al

menos en parte, el rápido deterioro de estas semillas. Uno de ellos sería la existencia de unamovilidad

molecularrelativamentealtayelotrounprocesofotooxidativogeneradordeimportantesdañosoxidativos.En

este capítulo se estudiará el rol que tiene el proceso fotooxidativo y en el capítulo 3.IV el rol que tiene la

movilidadmoleculary/olaporosidadenelatípicocomportamientodeestassemillas.�

Enesteestudioseutilizaronsemillasdeotraespeciedesauce,�����������,enlasqueestudiosprevios

demostraronteneruncomportamientoycaracterísticassimilaresal lasde�0������y�0����������utilizadas

en los capítulos anteriores. Se emplearonmétodos complementarios para estudiar el papel que tendría la

clorofilaenlacortaviabilidadquecaracterizaalassemillasdesauce.SeproponequeRLyEROsgenerados

comoconsecuenciade laacciónde la luzproduciríaprimeramenteuna intensaperoxidación lipídicaen las

membranas tilacoides dado que son particularmente ricas en ácidos grasos poliinsaturados y en ellas se

encuentranloscomplejosfotosintéticosquecontienenclorofila;desdeallíeldañooxidativosepropagaríaa

otroscomponentes,membranasyestructurascelulares(Cuadro3).Debidoalestadodeshidratadoenquese

encuentran las semillas, las defensas moleculares contra esos agentes oxidantes serían insuficientes y/o

pocoeficaces,y lasdefensasenzimáticasestarían inactivaspor lamismarazón(Nandiycol.,1997;Bailly,

2004).

- 54 -

Dado que no existen estudios en semillas que decaigan tan rápidamente, algunos aspectos se

cotejaronconlainformaciónderivadasdeestudiosenespeciesdelíquenes(Seelycol.,1991)porcontener

éstos clorofilayser particularmente tolerantesa ladeshidratación loque, desdeestepuntodevista,haría

semejantesustejidosalosdelasemilladesauce

Para demostrar la propuesta anteriormente delineada, en lotes de semillas envejecidas a diferentes

intensidades de luz y composición de atmósfera, se investigó la producción de RL por espectroscopia de

resonancia de espín electrónico (Electronic Spin Resonance Spectroscopy&ESR) y cuatro indicadores de

daños moleculares fueron monitoreados: peroxidación lipídica, destrucción de pigmentos, oxidación de

proteínasyformacióndeproductosdeMaillardademás,seevaluólaintegridaddelasmembranastilacoides

yplasmáticas.Estas determinaciones fueron acompañadaspor ladeterminación de lagerminaciónnormal

(GN),germinacióntotal(GT)yeltiempomediodegerminación(TMG).

- 55 -

RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�

�

Lasfiguras3.III.1y3.III.2muestranquehubounaaltacorrelaciónentreGNyTMG(R2=0.97,α≤0.01)

así como también entre cada una de ellas y la producción de radicales libres (RL) (GN/RL R2 = 0.94 y

TMG/RLR2=0.98,α≤0.01).

Los resultados mostrados en la Figura 3.III.1 muestran que la luz y el oxígeno promueven el

decrecimientodelaGNyelincrementodeTMG,manteniéndoselaGTinalterada.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A B C D E F

Tratamientos

Ger

min

ació

n (%

)

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

1,50

1,60

1,70

1,80

1,90

TM

G (

días

)

Figura�3.III.1.-�Semillasde�����������sometidasa25ºCy45%HRdurantetresdías:A,control.�B-F,diferentestratamientos:B,oscuridadyatmósferaN2;C,oscuridadyaire;D,luz(140lux)yatmósferadeN2;E,luz(140lux)yaire;F,luz(1300lux)yaire.GerminaciónNormal(GN)(■),TiempoMediodeGerminación(TMG) (▲) y Germinación Total (TG) (♦). Tratamientos con la misma letra minúscula son nosignificativamentediferentesaP=0.05poreltestdeTukey.

a h a

g

b

f

ab

e

e

f

d

c

- 56 -

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

A B C D E F

Tratamientos

Am

plitu

d de

señ

al E

SR

(1

03 )

Figura�3-III-2.-� I,�EspectrosdeESRcorrespondientesa los tratamientosA&F. II,Laamplitudde lasseñalesESRdesemillasde�����������enlasdiferentescondicionesdealmacenamientodescriptasenfigura1.LostratamientosconlamismaletraminúsculaencimadelascolumnasnosonsignificativamentediferentesenP=0.05poreltestdeTukey.

Enestassemillasfueevidente lainduccióndeRLpor laluz(Fig.3.III.2 tratamientoEyF),ytambién

fuerondetectadosenlassemillascorrespondientesalosdemástratamientosyenlassemillascontrol.Enlos

líquenes ������������+ ����y��#���!������������� la luztambiéninduceunimportantecantidadderadicales

libres quesuperan ladel control (Seel y col., 1991). Las semillas control de sauceconcasi 100%deGN,

mostraron contener una importante cantidad de RL, aproximadamente la mitad de la encontrada en las

semillas cuya GN había descendido casi a 0% (Fig 3.III.2 A y F). Estos resultados admiten dos

interpretaciones:(i)talcantidaddeRLnoafectalaGN;(ii)elniveldeRLpodríaserreducidoyreparadoel

dañoporelloscausado,comoconsecuenciadelaactividadtantodelasdefensasantioxidantescomodelos

mecanismosdereparación,procesosqueseactivanconlahidratación.EstosRLpudieronhaberseformado

por dos vías: (i) a partir del radical superoxido que se puede formar al pasar los electrones de la cadena

respiratoria directamente al oxígeno, como consecuencia de la desregulación del proceso respiratorio que

ocurre durante la deshidratación de la semilla (Vertucci y Farrant, 1995; Bailly 2004); (ii) debido a la alta

a b

ab

d

c

ab

I II

Tratamiento A

Tratamiento F

- 57 -

sensibilidadalaluzquemuestranestassemillas(vermásadelanteenestemismocapítulo),esprobableque

losRLtambiénhayanpodidoformarseduranteellapsotranscurridodesdequelassemillascomenzaronaser

expulsadas del fruto hasta que se recolectaron, a pesar de que se mantuvo baja la intensidad de la luz

durantedicholapso.

Encuantoalosdiferentestratamientos,elB(Luz&Nitrógeno)nomuestradiferenciassignificativasconel

control(Fig.3.III.1).EldecrecimientodelaGNeneltratamientoCreflejaríaeldañoquesegeneraapartirde

la reaccióndeloxígenocon los radicalespre&existentes (OhlroggeyKernan,1982;JustinyBass,1978)y/o

conlosácidosgrasospoliinsaturados(autooxidación)sobretodoteniendoencuentaquelassemillasfueron

tratadasdurantetresdíasa25ºC,temperaturaquepromueveelenvejecimiento(Capítulo3&I;Maroderycol.,

2000).LadisminucióndelaGNqueseprodujoeneltratamientoD(Luz&Nitrógeno)podríadeberse,segúna

Benson (1990), a la clorofila excitadapor la luz que reaccionaríadirectamente con el sustrato para formar

radicales libressinsereloxígenopartede la reacción.Sinembargo, la formacióndealgunosoxi&radicales

(EROs) no se puede descartar debido a que la remoción del oxígeno por el nitrógeno pudo haber sido

incompleta.EldecrecimientodelaGNporefectodelosRLquedaclaramentemostradaenlostratamientos

conluz&aire(EyF):a140 lux(E)seprodujounincrementodel53%delosRL(de1900a2900UA)yuna

disminución del 81% de laGN (de 97 a 18%) con respecto al control. Esto sugiere que, aún a tan baja

intensidadde luz,ocurrióun fuerteproceso fotooxidativo.Llama laatenciónqueuna intensidadde140 lux

indujeraunadisminucióndel81%delaGNmientrasqueunaintensidadaproximadamentediezvecesmayor

(tratamientoAyFFig.3.III.1y2)noresultarasuficienteparaanularlanitampocollegaraaafectarlaGT.Al

respecto,doshechosmerecenseñalarse:(i)Labajaintensidaddeluzresultóproporcionalmentemáseficaz

quelaaltaendisminuirlaGN,y(ii)SibienelcursodeldecaimientodelaGNsiempreantecedealdelaGT,

durante lamayorpartede esecursoambasgerminacionesdecaensimultáneamente (SivritepeyDourado,

1995;EllisyRoberts,1981;SunyLeopold,1995) (vercuadro3.III.2);encambio,en lassemillasdesauce

que envejecen por la acción de la luz y del oxígeno, la GN y GT no decaen necesariamente en forma

- 58 -

simultáneasinoque laúltimapuedecomenzaradecaerunavezque laprimerayase anuló (Fig.3.III.1 y

3.III.10).

Amboshechos(i)y(ii)podríanexplicarsealanalizarelprocesodefotooxidacióntalcomopareceocurrir

enestassemillas.Elataquedelosradicaleslibresinducidosporlaluzenpresenciadeloxígenocomenzaría

en los tejidossuperficialesdelembrión.Debidoa queestasemillaconsistedeunembrióncubiertoporun

tegumento tenuey transparente (Maroderycol.,2003), los tejidosmássuperficiales,es decir, los del lado

abaxial de los cotiledones, los tejidosmás externos del eje y el ápicede la radícula, son los que resultan

dañadosenestascondiciones.Estedañoqueseproduceenlassemillassecas,durantelagerminaciónse

manifiestaenundesarrolloanormaldelaraízyeneldesarrollodecotiledonesconirregularidadesentamaño

y color, aspectos que son tenidos en cuenta para evaluar la GN. Desde los tejidos superficiales el daño

oxidativosepropagaríahacialosmásinternosdemaneraquehastatantonoalcanceelmeristemaapicaldel

brote,éstequedaríaprotegido,posponiéndoseenconsecuencia,eldescensodelaGT(iniciodelamortalidad

delassemillas).Cuandoeldañoloalcanza,yalaGNsehuboanulado.EstaseríalarazónporlacualGTy

GNnodecaensimultáneamente.Estecomportamientodifieredelquemuestranlassemillasortodoxastípicas,

debido a que en éstas el deterioro no comienza por los tejidos superficiales del embrión sino que ocurre

simultáneamente en todos los tejidos del mismo aunque con diferencias de intensidad entre ellos (Ellis y

Roberts, 1981), lo que determina que las curvas de decaimiento de ambas germinaciones (GN yGT) se

superponganensumayorparte.�

- 59 -

Figura�3.III.3.-�ImágenesdeMETmostrandolosdañosgeneradosporlaluzenloscloroplastosde�����������.A,Enunasemillacontrol,uncloroplastodeunacélulasubprotodermal(ladoabaxial)delcotiledón.B:detalle deA;C yE, Semilla expuesta durante tresdías a 25 ºC y1300 lux.C, cloroplasto de unacélulasubprotodermal (lado abaxial). D, detalle de C. E, Cloroplasto de una célula del mesófilo central de uncotiledón.F,detalledeE.NotelasdiferenciasenelestadodelasmembranastilacoidesentrelasfigurasCyE.Abreviaturas:pc,paredcelular;ei,espaciointercelular;cl,cuerpolipídico;df,depósitodefitoferritina;v,vacuola.Escala=1fm

Esta interpretación de los hechos basada en un proceso oxidativo que se inicia en los tejidos

superficiales y se propaga hacia los más internos permitiría también explicar la razón por la cual una

intensidad de 140 luxdisminuye laGN al 20%,mientras queuna intensidad aproximadamente diez veces

mayornosólonolaanulasinoquetampocollegaaafectar laGT.Enestesentido,1300luxproduciríanun

- 60 -

dañoenlostejidossuperficialeslosuficientementeintensocomoparadestruirclorofilayotrasmoléculas(Ver

Capítulo 3&II de esta tesis) y reducir la penetración de la luz y la capacidad fotoactivable del tejido. En

consecuencia,elefectodelaluzsobrelaGNylapresenciadeRLnoguardaríanrelaciónconsuintensidad.

Esta interpretación de la fotooxidación que ocurre en estas semillas recibe sustento de los estudios de

microscopíaelectrónicadetransmisión(TEM)(Fig3.III.3).Enlassemillasexpuestasa1300luxdurantetres

días,losefectosdetrimentalesdelaluzafectaronespecialmentelostejidossuperficialesdelembrióncomola

epidermisylascapassubyacentesdelparénquimaclorofílico(Fig.3.III.3).Eldañofueclaramentevisibleen

loscloroplastosde lascélulasdeestos tejidos, especialmenteen lasmembranas tilacoides.Enefecto, los

tilacoides granales aparecieron dilatados, formando vesículas intergranales, y las membranas tilacoides

mostraronpérdidadedefinición(Fig.3.III.3A&F).Porelcontrario,fueronobservadassóloligerasalteraciones

enloscloroplastosdelmesófilocentralyladoadaxialdeloscotiledones(Fig.3.III.3CyD)yningúndañoen

loscloroplastosdelostejidoscentralesdelejeydelmeristemaapicaldelbrote.Estoexplicaríalarazónporla

cualalostresdíaslaGTaúnnoresultóafectada(Fig.3.III.1E&F),sibienlasplántulasquegeneraronestas

semillasmostrabansíntomasquehacíandisminuirelporcentajedeGNcomo:(i)Plántulasmáspequeñas,(ii)

Radículaspocodesarrolladas;(iii)Cotiledonesconáreasdecolormarrón&rojizas(enlugardeverdes)ensu

superficiesabaxialesyenlosbordes(Fig.3.III.4).Comoyasemencionara,porserestasdosáreasjuntocon

elmeristemaapicalde la raíz, incluyendo lacaliptra, laspartesmásexternasdelembrión,sontambién las

más expuestas a la acción detrimental de la luz incidente (consecuentemente, lasmás afectadas). Por lo

tanto, lostejidosmásinternos,estoes, losdel ladoadaxialdeloscotiledones(epidermisadaxialymesófilo

subyacente),loscentralesdeleje,yelmeristemaapicaldelbrote,resultaronpocoonadaafectados.Porotro

lado,lassemillasenvejecidasenoscuridadgeneraronplántulasque,encomparaciónconlassemillascontrol,

fuerondetamañoalgomenorysuscotiledonesmostraronuncolorverdepálido(Fig.3.III.4C).Losefectosde

laluzfueronmásdébilesensemillasexpuestasa140lux(datosnomostrados).�

�

- 61 -

Fig.� 3.III.4.-�Plántulas de������ ����� de siete días:A,Plántulas de semillas control.B, Plántulas desemillasexpuestasdurantetresdíasa25ºC,1300lux.C,Plántulasexpuestasdurantetresdíasa25ºCyoscuridad.Abreviaturas:ab,vistaabaxialdeloscotiledones;ad,vistaadaxialdeloscotiledones.;r,radícula;mab,meristemaapicaldelbrote.Escala=2mm

Respectodeldañocausadoporlafotooxidaciónalostejidosunindicadordelmismoeslavariaciónen

lacomposicióndeácidosgrasos.(VanHasselt,1974;DeKokyKuiper,1977).Dadoque losácidosgrasos

poliinsaturadossonfácilmenteoxidados,unamayordisminucióndeestosrespectodelosmono&ydelosno&

saturadosdelafracciónlipídicaproveeunaevidenciadelaperoxidacióndelosmismos(WilsonyMcDonald,

1986).Alrespecto,loscambiosmásimportantesdetectadosenlassemillasde�0������expuestastantoa140

como a 1300 lux, correspondieron a los ácidos grasos poli&insaturados (Tabla 4). Esto concuerda con el

hechodequela fotooxidaciónproduceunaimportanteperoxidaciónlipídicaen lostejidos(Foote,1996).La

pronunciada disminución de los ácidos grasos poli&insaturados (constituyentes de lasmembranas) que se

detectacomoconsecuenciadelaexposiciónadiferentes intensidadesde luzsuponeimportantesdañosen

las membranas, que serían reflejados en el decrecimiento de la GN. Un método sensible de detectar la

peroxidación lipídica consiste en determinar la relación ácidos grasos poli&insaturados/(monoinsaturados +

ácidos grasos saturados) (Priestley y Leopold, 1983). Cambios en la composición de ácidos grasos que

acompañan la disminución de la GT se encuentran en Stewart y Bewley (1980), Pearce y Abdel Samad

(1980),PowellyMatthews(1981).ElgráficodebarrasdelaFig.3.III.5queseelaboróutilizandoesarelación,

muestraquelaintensidadde140luxfuesuficienteparaproducirunmuyaltodecrecimientodeesarelación

- 62 -

demaneraqueunaintensidadmayorsólopermitióunapequeñadisminuciónadicionaldelaGN.Deacuerdo

a Leech y Murphy (1976) la marcada disminución en el contenido de los ácidos grasos poli&insaturados

(Figura13)podríaserexplicadopor lapresenciadecloroplastos,cuyasmembranastilacoidesson ricasen

esosácidos.Estasmembranasconstituyenunblancopotencialparalaperoxidacióndebidoalacontigüidad

entre los ácidos poliinsaturados y la clorofila contenida en los complejos receptores de la luz (Halliwell y

Gutteridge,1999).Enesteaspecto,lasmembranastilacoidesseríanelprimerblancoatacadoporeloxígeno

activadoproduciéndoseunaperoxidación que destruiríaácidosgrasos y tilacoides, generandoRLyEROs

que propagarían el daño oxidativo a otros componentes, membranas y estructuras celulares, como se

compruebaacontinuación.EstasuposiciónrecibiósoportedelasimágenesobtenidasporTEM(Fig.3.III.3),

yadescriptas.

� Porcentaje�de�área�de�ácidos�grasos�

Palmítico� Esteárico� Oleico� Linoleico� Linolénico� Otros�

78%99� 7:%99� 7:%7�";� 7:%<�"8� 7:%=�"=� 4%4�

Control� 25.0±3.5 4.6±0.8 8.5±0.7 41.7±3.5 6.2±1.4 12.9

140�lux� 33.3±5.6 5.0±0.8 8,4±1.6 15.7±5.2 2.7±2.4 24.8

1300�lux� 30.4±1.3 8.2±1.7 11.2±5.2 8.1±1.3 2.4±2.0 39.5

��

Tabla� 3.III.1.-� Porcentaje de área de ácidos grasos saturados e insaturados en semillas control yenvejecidasendosdiferentes intensidadesde luz, a25 ºCdurante tresdías. Losvalorescorrespondenamedias±SD

��

- 63 -

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Control 140 lux 1300 lux

Rel

ació

n ac

idos

gra

sos:

po

liins

atur

ados

/(m

onoi

nsat

urad

os +

sat

urad

os)

�Figure� 3-III.5.-� Relación entre ácidos grasos poli&insaturados/ (ácidos grasos monoinsaturados +

saturados)ensemillascontrolysemillasenvejecidasdurantetresdíasa25ºCy140,y1300lux.

De acuerdo a Smith y Berjak (1995) la MET permite detectar los cambios que se producen en las

membranas de los meristemas radiculares (como la separación de la membrana plasmática de la pared

celular) al embeberse las semillas envejecidas. En este estudio se observó también la ocurrencia de una

incipienteseparacióndelamembranaplasmáticadelasparedescelulares,loqueenestadosecoydebidoal

intenso proceso fotooxidativo podría significar daños en la misma (Fig. 3.III.3). Con el fin de evaluar la

integridaddedichamembranasedeterminólapermeabilidadpormediodeESRypérdidadeelectrolitos.La

Fig. 3.III.6A representa los espectros de resonancia paramagnética de TEMPONE. Las señales del lado

derechodelespectromuestranloscomponentesLyWquecorrespondenalasseñalesdelassondasquese

encuentranen la fasehidrofílicaehidrofóbicadelcitoplasma, respectivamente.La relaciónW/L,queesun

índicedeldañodelamembranaplasmática,decrecea74%con140luxynollegaa100%conunaintensidad

muchomayor(1300lux).Estadiferenciaenlaeficaciadetrimentaldelaluzguardacorrespondenciaconlos

efectossobreRLyGNantesmencionados,esdecir,elaumentodelapermeabilidadnoguardarelacióncon

la intensidad de luz. Los espectros de la figura 3.III&6 A muestran que el agente dispersante penetró la

membranaplasmáticadañadadisipandolaseñalhidrofílica.

- 64 -

EldecrecimientodelarelaciónW/Lcorrelacionócercanamentedeformalineal(R2=0.99,α≤0.01)con

la pérdida de electrolitos resultando ambos métodos igualmente eficaces para medir la integridad de las

membranas(Fig.3.III.6B).Ensemillassometidasaprocesosdesecado,encambio,Leprinceycol.(1999)

encontraronquelaESResunindicadormássensiblequelaconductividadeléctricaparaevaluarlaintegridad

de las membranas. Estos resultados refuerzan la suposición ya mencionada de que el daño por RL

originadosenlasmembranastilacoidessepropagaaotrasestructurasincluyendolamembranaplasmática.

�

��

Figura� 3.III.6.-� ESR y conductividad como medidas de la permeabilidad de membrana en semillasenvejecidasa25ºCportresdías.A,EspectrosESRdelasondaspinTEMPONE;B,&cartadecomparaciónentreESR(&&●&&)yconductividad(__■__).Valorescorrespondenamedia±DS.

Proteínas�Oxidadas�

Una gran variedad de proteínas esenciales para la fotosíntesis se encuentran insertas en las

membranas tilacoides. Estas proteínas se hallan formando junto a la clorofila y otros pigmentos como los

180

220

260

300

340

380

420

Control 140 lux 1300 lux

Con

duct

ivid

ad (�

S/m

g)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

ES

R (W

/L)

Cond.

ESR

B

L

W

Control

A

L

L

W

W

Envejecida 1300 lux

Envejecida140 lux 1X

5X

6X

- 65 -

carotenosloscomplejosreceptoresdelaenergíaluminosa.Sucontigüidadconlaclorofilaactivadayconlos

ácidosgrasospoli&insaturadosdelasmembranastilacoidesindudablementehacendeestasproteínasblanco

de RL y ERO, tanto al inicio del proceso fotooxidativo (formación del oxígeno singulete) como durante la

peroxidacióndeesosácidosgrasos.Otrasproteínascomponentesdedichamembrana,comolasenzimasdel

transporte de electrones de la fotosíntesis y las que protegen dicho sistema del ataque oxidativo, serían

también blancos de los agentes oxidantes como asimismo proteínas que atraviesan las membranas

tilacoides,noligadasalafotosíntesis.

El envejecimiento de las semillas ha sido asociado con la acumulación de proteínas oxidadas. Las

semillas de�0� ����� envejecidas por la luzmostraron un apreciable aumento en la cantidad de proteínas

oxidadas(Fig.3.III.7).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

C0 E0

Car

boni

los

(nm

oles

/mg

prot

)

Fig.�3.III.7.-�Efectosdelafotooxidaciónsobreelcontenidodecarbonilosensemillasenvejecidasa25ºCportresdías

Pigmentos

Si bien en las semillas secas mantenidas en oscuridad se forma oxígeno singulete durante la

peroxidación que acompaña al proceso de auto&oxidación, en condiciones de iluminación, el nivel de ese

5

1

3

2

4

- 66 -

agente se ve aumentado tanto por la transferencia al oxígeno de la energía de excitación de la clorofila

activadaporlaluz,comoelqueseformadurantelaintensaperoxidaciónlipídicaqueocurreenesacondición.

Laclorofilatieneunroldualyaqueesgeneradorayblancodeloxígenosingulete(KnoxyDodge,1985).Un

papel importante de los carotenos que se encuentran en los llamados complejos fotosintéticos junto a la

clorofila, es proteger este pigmento contra el ataque del oxígeno singulete (Halliwell, 1987; Brown y col.,

1991).Losresultadosdelafigura3.III.8muestranqueen lasemillaseca,unaintensidadluminosabajaes

suficiente para producir una marcada disminución de los carotenos, hecho indicador de su rol protector

aunquetambiénseproduceunadisminucióndeclorofilaa.Elaltocontenidodeclorofiladeestassemillas,al

ser excitadas por la luz, seguramente promueve un nivel de oxígeno singulete que parece superar las

defensasrepresentadasporloscarotenosyasíafectarlaclorofila.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

CO E0

clor

ofila

a y

b (µ

g/m

g)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

caro

teno

s (µ

g/m

g)

Clf a

Clf b

carotenos

Fig.�3.III.8.-��Efectodelafotooxidaciónsobreelcontenidodepigmentos�

- 67 -

Comoseviohastaahoralosnivelesderadicaleslibresestablesdetectadosenestassemillasguardan

relaciónconlosdañosproducidosadiferentescomponentescelulares.Estocontrastaconloqueaconteceen

el líquen ������������+ ����� (Seelycol.1991), líquentolerantea ladesecación,yporellocomparablea la

semillade�����.Enel líquen,sibienseformanRLporfotoactivacióndelaclorofila,noseproducendaños

metabólicos.SeespeculaquepodríanocurrirreaccionesradicalariasnodañinasqueacumulanRLestables

y/oexistirenlostejidosdeshidratadosunelevadoniveldedefensasmolecularescomocarotenos,α&tocoferol,

glutationentreotros,quelosanulan.

Respectodesiuna intensaperoxidación lipídicacomolaqueocurreenestassemillasescompatible

conlaexistenciadeunestadodealtaviscosidadquerestringeelmovimientomolecular,cabemencionarque

eseestadoconstituidoporunamatrizdemovimientorestringido,contieneespacioslibresabiertosporlosque

pueden difundir pequeñas moléculas como el oxígeno. Éste, activado por la clorofila excitada por la luz

iniciaríaelprocesodeperoxidación,elqueeventualmentesepropagaríaentrelosácidosgrasosdebidaala

adyacenciaqueexiste entreestos últimosen lamembrana.Desdeestepuntodevistaparecería nohaber

incompatibilidad entre intensa peroxidación lipídica y un estado de alta viscosidad. En cambio, la rápida

propagacióndeldañoaotrossistemasdemembranascomomembranaplasmáticaydeotrasorganelas,no

sería explicable por adyacencia entre ácidos grasos y parecería difícil de conciliar con un estado de alta

viscosidad. De todas maneras, si previo al inicio de estos procesos degradativos existió tal estado, es

probablequeunadisminucióndelaviscosidadhayaacompañadoaquellosprocesos.

Ensíntesis,losresultadosdelostratamientosdeluzmostraronqueelincrementodelaintensidaddela

luzfueacompañadoporlaformacióndeRL,conduciendoaundecrecimientodelosácidospoli&insaturados.

Esto último fue asociado con importantes daños en las membranas tilacoides y con alteraciones en la

estructura y permeabilidad de lamembrana plasmática, todo lo cual conformauna secuencia de procesos

fuertementeligadosquefinalmentesereflejaroneneldecrecimientodelaGN.

�

- 68 -

Reacción�de�Maillard�

La reacción de Maillard consiste en una serie de reacciones que derivan de condensaciones no&

enzimáticasentreunaaldosaocetosaconungrupoaminolibrepertenecienteaproteínasoácidosnucleicos

enlasqueseformaglucosamina.Ésta,porreordenamientomolecularformaproductosdeAmadorilosquea

su vezdan lugara intermediarios congrupos carboniloque por reacciones conotrosgruposamino ypor

subsiguiente reordenamiento originan los llamados productos deMaillard. Los productos intermediarios de

esta reacción compleja se caracterizan por su fluorescencia y con el tiempo llevan a la formación de

pigmentos pardos y/o formación de entrecruzamiento entre proteínas, causando rigidez y pérdida de

funcionalidaddelasmismas(Graham,1996).Eneláreadelacienciadelosalimentoslosproductosdeesta

reacción son considerados como un índice de pérdida de calidad. El aumento de la fluorescencia de las

proteínas a 395/450 nm (excitación/emisión) es usado como una medida de la reacción de Maillard en

numerosos estudios de viabilidad de semilla durante del almacenamiento, aunque los resultados son

contradictorios(SunyLeopold,1995;MurthyySun,2000;Murthyycol.,2002;Matiasevichycol.,2005).Al

respecto, Wettlaufer y Leopold (1991) observan que en condiciones de envejecimiento acelerado, la

germinacióndelassemillasdesojadecreceen lamedidaqueseacumulanproductosdeMaillardeneleje

embrionario;estacorrelaciónnoseproduceencondicionesdeenvejecimientonoacelerado.Encambio,Sun

yLeopold(1995)síencuentranqueenlosembrionesdesoja,losproductosdeMaillardsecorrelacionancon

lapérdidadegerminabilidadencondicionesdeenvejecimientonoacelerado.Porsuparte,Castellionycol.

(en preparación) encuentran en semillas de quinoa que la formación de productos de Maillard esta

estrechamentecorrelacionadaconlapérdidadegerminabilidad.

Las semillas usadas en estas determinaciones que fueronmantenidas 3 años a &70°Cmuestran la

presenciadeproductosdeMaillard (Fig. 3.III.9a).FormacióndeproductosdeMaillarda temperaturasbajo

cerofueronreportadosporSchoebelycol.(1969)yLimyReid(1991).

Por otra parte, cuando las semillas control se mantuvieron a 25° C en oscuridad durante solo tres

meses, el contenido de los productos de Maillard se incrementó aunque es importante señalar que las

- 69 -

semillasyahabíanperdidolaviabilidaddosmesesantes.Independientementededichapérdida,eseaumento

producido en tres meses parece sugerir que el estado de la matriz citoplásmica permite una movilidad

molecularrelativamentealta.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

400 450 500 550 600longitud�de�onda�de�emisión�(nm)

intens

idad

�de�flu

ores

cenc

ia�(U

A

control

envej.3meses(osc)

�

Fig.�3.III.9.a-�Fluorescenciadelostratamientosindicadosenelcuadro.

Lassemillasmantenidasdurantetresdíasa25ºCenoscuridadya1300 lux,nodifirierondelcontrol

respectodelcontenidodeproductosdeMaillard.Sibientresdíasresultaunlapsoexcesivamentebrevecomo

paraquesemanifiestedichareacciónameritaseñalarsequeeneselapsoseprodujounsignificativoaumento

decarbonilos,unodelosprecursoresdelosproductosdeMaillard(Fig.III.9.B).

- 70 -

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

400 450 500 550 600

longitud�de�onda�de�emisión�(nm)

intens

idad

�de�flu

ores

cenc

ia�(U

A

control

envej.3dias(1300lux)

envej.3dias(osc)

Fig.�3.III.9.b-�Fluorescenciadelostratamientosindicadosenelcuadro

LapresenciadeproductosdeMaillardenelcontrol,lomismoqueladelosotrosindicadoresdedaño

evaluadosenestecapítulonoafectósensiblementelaGNyaqueestafuecercanaal100%(Fig.3&III&1.).Al

respectonosedescartaqueuncontrol conmenoscontenidosdeesos indicadorespudierapresentar igual

porcentajedeGNperounmayorvigorqueestaríarepresentadoporunTMGmenora1día(Fig.3&III&1.)

Autooxidación�

En muchas semillas secas se han detectado muy bajos niveles de quimioluminiscencia que se

producen durante el lento proceso de peroxidación lipídica (Boveris y col., 1980). Esto refleja el nivel de

radicales libres reactivos yoxígeno singulete que se producen enese proceso y que pueden generar una

serie de reacciones radicalarias que concluyen en la formación de los radicales libres estables. (Hendry,

1993;Szöcs,2002,Smirnoff,1993).Ladeteccióndeestosagentesdedañometabólicosesunapruebadela

ocurrenciadelprocesodeautooxidaciónuoxidaciónespontánea.

Respectodelprocesodeautooxidaciónquepuedeocurrirenestassemillas, laevaluacióndelmismo

requiereque las semillassemantenganenoscuridada findeevitar la interferenciade la fotooxidación.El

- 71 -

experimentograficadoenlafigura3.III.1muestraqueeltratamientoC,quesehizoenoscuridad,produjoen

sólotresdíasa25°CunasignificativadisminucióndelaGNqueseatribuyóaautooxidaciónyareacciones

deloxígenoconradicales librespre&existentesen lassemillascontrol.Eseprocesonofueacompañadopor

unaumentode radicales libresestables respectodelquemostróelcontrol;al respectonosedescartaque

durantelostresdíasdeduracióndelexperimentonosehubieraproducidoaúnunsignificativoincrementode

losradicaleslibresestable,yaque,comoseindicóprecedentementederivandereaccionesradicalariasque

en estado seco son lentas. Estos resultados son consistentes con los correspondientes a los realizados

tambiénenoscuridadqueilustralafigura3.III.10A.Enlamismaseapreciaelcursoquesigueeldescensode

laGNylaGTduranteunlapsosuficientementeprolongadocomoparaquedecaiganambasgerminaciones

(GNyGT)ynosólodetresdíascomoenelexperimentoilustradoenlafigura9.Lafigura3.III.10Bmuestra

lapresenciademalondialdehído(MDA)tantoenelcontrolcomoasimismoelquesefuegenerandoalolargo

deldescensodeambasgerminaciones.MDAesunodelosproductosquederivandelareacciónespontánea

entreeloxígenoylosácidosgrasosinsaturados(autooxidación)enlaqueseproducenunaseriederadicales

libresreactivosyotroscompuestosentrelosqueseencuentraaquellamolécula.Supresencia,determinada

medianteelácidotiobarbitúrico,seusacomoindicadordelaocurrenciadeprocesosdeautooxidaciónydela

presencia de radicales libres.MDA se forma por la peroxidación de ácidos grasos con tres omás dobles

enlacesy,delosácidosinsaturadosdetectadosenestassemillas,sóloellinoleico,queseencuentraenmuy

baja proporción, cumple esta exigencia quedando la peroxidación de los otros sin ser detectada. En

consecuencia,elMDAresultaunindicadorquesubestimalacuantíadeeseproceso.

Otra conclusión que deriva de la figura 3.III.10 es que el descenso de la GT en oscuridad

(autooxidación) es prácticamente el mismo que ocurre a 140 lux, lo que indica que el intenso proceso

fotooxidativoconel dañometabólicoasociadoqueseproduceen los tejidossuperficialesde lasemilla,no

alcanzaaafectaralmeristemaapicaldelbroteaesaintensidaddeluz,locualreducelarelevanciaqueenun

principio se le adjudicó al proceso fotooxidativo y a la presencia de clorofila como causantes del rápido

deterioro. En cambio estaría fuertemente asociado con la autooxidación y no con la fotooxidación. Sin

- 72 -

embargo, no se descarta que la fotooxidación inducida por la luz tenga algún grado de incidencia,

indudablementemenorenlapérdidadeviabilidad,segúnseconcluyecuandosecomparaneldescensodela

GTala luzyenoscuridad.EnesascircunstanciasseobservaquelaanulacióndelaGTalaluzantecede

aunqueenunospocosdíasalqueocurreenlaoscuridad.

Por otra parte, otra de las reacciones además de la autooxidación que se considera causa de

envejecimientoen lassemillassecases la formaciónde losproductosdeMaillard.Comoseviocuandose

tratóestareacción,elcontenidodeestosproductosenlassemillascontrolnoafectólaGNdadoqueéstafue

de casi 100%. Por otra parte, la figura 3.III.10muestra que las semillasmueren en alrededor de unmes

cuando el contenido deMaillard aumentó sólo una tercera parte del nivel alcanzado a los tresmeses, no

llegandoésteaduplicareldelasemillacontrol.Estosresultadosparecenentoncesseñalaralaautooxidación

comocausaprincipaldeldeterioro,aunquecabepreguntarseentoncesporqueesteprocesoesmuchomás

intensoenestassemillasqueenotrasquetambiéntoleranladeshidratación.

Los resultadoshastaaquíobtenidos rechazan, enconsecuencia lahipótesisoriginalmente formulada

acerca de que la clorofila tendría un rol significativo en la rápida perdía de la viabilidad.

- 73 -

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

- 74 -

�

Cuadro�3.III.1.-�Radicales�libres�y�Especies�reactivas�del�Oxígeno�

Los radicales� libres son especies moleculares que contienen un electrón desapareado (representado

generalmentecomoR�), loque losvuelveunade lasde lasmoléculasquímicamentemasreactivas.Unradical libre

tiene la capacidad de sustraer un segundo electrón de unamolécula vecina debido a la necesidad de aparear su

electrónlibre.Estocausalaformacióndeotroradicallibregenerandounaautopropagaciónencadenadereacciones

sucesivas.

SedenominacolectivamenteEspecies�Reactivas�del�Oxígeno(ERO)tantoalosradicaleslibresquecontienen

oxígeno&comoelaniónsuperóxido(O2�),elradicalperóxido(LOO�),elradicalhidroxilo(HO�)&comoaloscompuestos

noradicalariosymuyreactivosquelocontienen,porej.peróxidodeHidrógeno(H2O2).

Existen sustancias antioxidantes (enzimáticas y no enzimáticas) encargadas de “neutralizar” a los radicales

libresporlasustraccióndelelectróndesapareado.

Los antioxidantes son un conjunto heterogéneo de sustancias formado por vitaminas,minerales, pigmentos

naturales,enzimasyotroscompuestos,quebloqueanelefectonocivodelosradicaleslibres.

Cuandoel aumento del contenido intracelular deEROs sobrepasa las defensas antioxidantes de la célula se

produceelestrés�oxidativo,atravésdelcualseinducedañoamoléculasbiológicascomolípidos,proteínas,ácidos

nucleicos, etc. Los radicales libres son especiesmoleculares que contienenun electrón desapareado (representado

generalmentecomoR�), loque losvuelveunade lasde lasmoléculasquímicamentemasreactivas.Unradical libre

tiene la capacidad de sustraer un segundo electrón de unamolécula vecina debido a la necesidad de aparear su

electrónlibre.Estocausalaformacióndeotroradicallibregenerandounaautopropagaciónencadenadereacciones

sucesivas.�

SedenominacolectivamenteEspecies�Reactivas�del�Oxígeno(ERO)tantoalosradicaleslibresquecontienen

oxígeno&comoelaniónsuperóxido(O2�),elradicalperóxido(LOO�),elradicalhidroxilo(HO�)&comoaloscompuestos

noradicalariosymuyreactivosquelocontienen,porej.peróxidodeHidrógeno(H2O2).

Existen sustancias antioxidantes (enzimáticas y no enzimáticas) encargadas de “neutralizar” a los radicales

libresporlasustraccióndelelectróndesapareado.

Los antioxidantes son un conjunto heterogéneo de sustancias formado por vitaminas,minerales, pigmentos

naturales,enzimasyotroscompuestos,quebloqueanelefectonocivodelosradicaleslibres.

Cuandoel aumento del contenido intracelular deEROs sobrepasa las defensas antioxidantes de la célula se

produceelestrés�oxidativo,atravésdelcualseinducedañoamoléculasbiológicascomolípidos,proteínas,ácidos

nucleicos,etc.

�

�

- 75 -

Cuadro� 3.III.2.-� Tres� ejemplos� tomados� de� la� bibliografía� que� muestran� que� GN� y� GT� ocurren� casi�simultáneamente.��

�

Semillas�ortodoxas��(Ellis�y�Roberts,�1981)�

�

Semillas�de�soja��(Sun�and�Leopold,�1995)�

�

�

�

�

�

�

�

Semillas�de�arveja�(Sivritepe�y�Dourado,�1995)�

�

- 76 -

CAPITULO�3-IV�

�

REVERSION�DEL�DETERIORO�DURANTE�LA�IMBIBICIÓN�DE�LAS�SEMILLAS�ENVEJECIDAS�

INTRODUCCIÓN�

En el capítulo 3&1 se vio que cuando las semillas de �0� ���� y �0� ��������� se sometían a

humidificación y se testeaba la germinación, a medida que aumentaba el contenido de agua, ocurría

inicialmente un descenso de la germinación normal (GN) que era seguido por un ascenso de la misma,

comportamientoqueesdifícildeexplicar,suponiendoqueelefectode lahumidificaciónseaevitarundaño

porimbibición.

Porotraparte, en las semillas secas se determinó queel rápidodescenso de laGNque ocurre por

exposición a la luz, estaba asociado a un intenso proceso de peroxidación lipídica, formación de RL e

importantesdañosacomponentescelulares.Elmáslentodescensoqueocurreenoscuridad,tambiénestaba

asociadoaunprocesoperoxidativoaunqueproducidoespontáneamente.

Cabeseñalarquecuandolassemillasdesaucesesometieronahumidificaciónalcanzaronun33%de

contenidodeaguaenrelativamentepocotiempo(capitulo3&I),porcentajequeseincrementósóloligeramente

durante las 18 horas posteriores al comienzo de la humidificación, sin que se produjera el inicio de la

germinación propiamente dicha (extensión del hipocótilo). En cambio, colocadas sobre papel mojado la

germinaciónseiniciabaenmenortiempo.Estademoraenel iniciodelagerminacióncuandosehumedece,

hace comparable la humidificación a la hidratación parcial a la que se someten las semillas (priming)

(Chojnowskiycol.,1997;Taylorycol.,1998),especialmentelasenvejecidas,afindeaumentarlavelocidad

degerminaciónydereducirlaamplituddelperiododegerminaciónlocualpermiteobtenerlotesdeplántulas

uniformes enmenor tiempo. El fundamento de estemétodo se basa en que durante la imbibición de una

semilla ortodoxa, y hasta tanto no se alcance el valor de contenido de agua que permite la división y la

- 77 -

elongacióncelular(iniciodelaplántula),operanprocesospregerminativosderediferenciacióndelaestructura

celularydereparacióndelosdañosacomponentescelularesquepudieronocurrirporunaparte,durantela

deshidrataciónqueacompañalaúltimaetapadeldesarrollodelasemillayporotra,delosdañospropiosdel

envejecimiento.Evitarquesealcanceesevalordecontenidodeaguaquepermiteeliniciodelagerminación

equivale,entonces,aprolongarellapsoenqueactúanesosmecanismosyasímejorarlacalidadfisiológica

de la semilla (Taylor y col., 1998; Chojnowski y col., 1997). Unmétodo usado para controlar el nivel de

hidrataciónesmantener lassemillasembebidasenunasolucióndeunagenteosmótico (osmopriming).La

figuraFig.3.IV.1muestracomolaGNdesemillasdesauceremovidasatiemposcrecientesdeunasolución

de PEG 6000 al 33%, muestra una fluctuación de la GN similar a la que ocurre por humidificación,

confirmandoasílasimilitudentrehumidificacióny�������(Cap3&I).

Por lo hasta aquí considerado es presumible que la mencionada recuperación de la GN esté

acompañada por una progresiva disminución del daño celular (producidos por RL y por el proceso de

peroxidaciónlipídica,comoantesmencionado)mientrasqueelinicialdescensodeeseparámetrogerminativo

losea,encambio,porunaacentuacióndeldañooxidativo,aspectosqueseinvestiganenestecapítulo.

- 78 -

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

0 3 6 9 12 15hs

Ger

min

ació

n (%

)

GN

GT

Fig.�3.IV.1.-GyGNenfuncióndeltiempodehidrataciónensolucióndePEG6000al33%.

a 1

d 7

c 8c

9

b 1

d 6

- 79 -

RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�

���� �!������� # ��� �� ������� !�� !��!� #��.��� � +�!� �� !�)!-!#����� !�� ����������� # ���#� �!�� *�!� ����

�������!��!��4&�0�=>����'?@A�����������!�=��.���%��BCD�4$�

�

Autooxidación�

Las semillas sometidas a humidificación muestran al inicio de este proceso un aumento de la

luminiscencia.Eseaumentoinicialytransitorioes,segúnBoverisetal. (1984),unodelosprimeroseventos

bioquímicosdelagerminación.Dichoautorconsideraqueelloesdebidoaqueaumentalaactividadoxidativa

comoconsecuenciadeque:(i)losradicalesperoxilos(ROO�)producidosenellentoprocesodeautooxidación

colisionancon lasmoléculasblancopor lamayormovilidaddebidoa lahidratación; (ii) loshidroperóxidos

experimentan rupturas homolíticas (ROOH→RO�� HO�); y (iii) se forma oxígeno singulete. Todos estos

procesoselevanelniveldeluminiscencia(golpeoxidativo).Enelcasodelasemilladesauce,alastreshoras

de humidificación, momento en el que es máximo el descenso de la GN, se detectó un aumento de la

luminiscencia.Enlosnumerosostrabajosenlosqueseaplicael�������afindemejorarsucomportamiento

germinativo,nosemencionaquealiniciodelaimbibiciónsehayadetectadoundescensodelaGNodeotro

indicadordelcomportamientogerminativo(Bradford,1986;Liuycol.,1996;Usberti&Valio,1997).Tampoco

sehaceesamenciónenlostrabajossobrehidrataciónenatmósferasaturada(humidificación)(Pollock,1969;

Ellisycol.,1990;BewleyyBlack,1994).

. En este sentido los resultados aquí obtenidos son los primeros en reflejar en un parámetro visible

comoeslaGN,laocurrenciadeestegolpeoxidativoqueseproduceal iniciodelahidratación.Estehecho

parece consistente con el nivel relativamente alto de actividad oxidativa que tienen estas semillas y que

determinasucortalongevidad.Poresarazón,elgolpeoxidativoqueseproducealcomienzodelahidratación

sería importante y además, estaría potenciado porque el contenido de agua en ese momento resultaría

insuficiente para que actuaran los mecanismos enzimáticos de defensa antioxidante y de reparación.

Además, la rápida germinación que tienen estas semillas, probablemente debido al estar ya parcialmente

- 80 -

desdiferenciadas, no permite completar la reparación metabólica. La convergencia de estos dos hechos,

fuerte golpe oxidativo y desdiferenciación parcial, determinaría que cuando las semillas al comienzo de la

humidificaciónsonpuestasagerminarmuestrenundescensode laGNsimultáneoconel incrementode la

luminiscencia. A media que aumenta el tiempo de humidificación se produce una disminución de la

luminiscenciaqueresultaríaconcordanteconelincrementoenelaccionardeesosmecanismos(Fig.3.IV.2)

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

0 3 6 9 12 Tiempo de hidratación (horas)

Bio

lum

inis

cenc

ia (c

pm)

Fig.� 3.IV.2.- Quimioluminiscencia de semillas sometidas a diferentes tiempos de hidratación. Lostratamientoscon lamismaletraminúsculaencimadelascolumnasnosonsignificativamentediferentesconunP=0,005poreltestdeTukey.

Radicales�libres�(RL)�estables�

Lassemillassometidasahumidificaciónmostraron,conelaumentodel tiempodehumidificaciónuna

progresivadisminucióndelosRLestables,sinqueseprodujeraalprincipiounincrementodeesosagentes

que pudiera asociarse con el descenso de la GN tal como ocurre con la quimioluminiscencia y otros

parámetrosdedañoquesedescribenenestecapítulo.

Al respecto, no se descartaqueelmomento en que seefectuó la primeramedición (3h) haya sido

inadecuado para detectar un incremento en la cantidad de radicales libres estables. Por otra parte, el

a 1

d 1

c 1

c 1

b 1

- 81 -

momento que se detecta la mayor formación de RL libres activos (asociados a la generación de

luminiscencia;3hdehumidificación)seríaprácticamenteelmismoenquesedetectanlosestablessóloenel

casoenquelavelocidaddelasreaccionesquelosoriginanapartirderadicalesreactivosfuesemuyalta.Por

otra parte, si se hubiese producido un aumento después de las 3 h no se descarta que tampoco se los

detectaraporqueconelaumentodetiempodehumidificaciónse incrementaría laactividadde lossistemas

enzimáticosqueloseliminan,loqueexplicaríaelpaulatinodescensodeesosradicales(Fig.3.IV.3)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 3 6 9 12hs

Am

plitu

d de

la s

eñal

de

ES

R U

A (

103 )

Fig.�3.IV.3.-RadicaleslibresestablesmedidosporEPRensemillassometidasadiferentestiemposdehidratación.LostratamientosconlamismaletraminúsculaencimadelascolumnasnosonsignificativamentediferentesconunP=0,005poreltestdeTukey.

Perfil�del�ácidos�grasos�

Unsensibleindicadordeladisminucióndelprocesodeperoxidaciónlipídicaporefectodelahidratación

estádadoporloscambiosenelperfildelosácidosgrasos.Lafigura3.IV.4muestraloscontenidosdeácidos

grasos extraídos de semillas después de 9 horas de humidificación (E9). Se observa una marcada

recuperación de los ácidos poliinsaturados (linolénico y linoleico) que superan ampliamente a los niveles

correspondientesalosdelosdelassemillascontrol,indicandounareversióndelprocesodeperoxidación.

a 2

d 1

c 1

b 1

b 2

- 82 -

.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

palm

itico

este

áric

o

oleico

linole

ico

lino len

ico

araq

uidico

gondo

ico

eico

sadie

noico

Aci

dos

Gra

sos

(%)

E0 E9

Fig.�3.IV.4.-Perfildeácidosgrasosdesemillascontrol(E0)yalas9horasdehidratación(E9).

Proteínas�Oxidadas�

Las semillas sometidas a humidificación mostraron, coincidentemente a lo sucedido con los otros

parámetrosdedañoevaluados,unaumentodeproteínasoxidadasaliniciodelaimbibición(Fig.3.IV.5).Sin

embargo, a diferencia de esos mismos parámetros, con el aumento del tiempo de humidificación sólo se

registró una ligera disminución de proteínas oxidadas. Este bajo descenso podría deberse a que esas

proteínas resultaronoxidadasporproductosde laperoxidación lipídica,porqueenesecasonosóloserían

resistentesa laproteólisissinoque tambiénpueden inhibir lacapacidadde lasproteasasparadegradarlas

(Rivet, 1986;Friguetycol., 1994).Esasería la razónpor laque lasproteínasoxidadas disminuyeransólo

ligeramente.

- 83 -

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 3 6 9 12hs

nmol

es/m

g pr

ot

Fig.�3.IV.5.-Contenidodecarbonilosdeproteínassolubleensemillassometidasadiferentestiemposde hidratación (hs). Los tratamientos con la misma letra minúscula encima de las columnas no sonsignificativamentediferentesconunP=0,005poreltestdeTukey

Pigmentos

Lassemillassometidasahumidificaciónmostraronalprincipiodelamismaunasensiblereducciónen

elcontenidodeclorofilaaycarotenossinqueseprodujerancambiosapreciablesenelcontenidodeclorofila

b (Fig. 3.IV.6). En el líquen��#���!���� ��������� durante la desecación también se produce una selectiva y

severadestruccióndeclorofilaaresultandolaclorofilabmenosafectada.(Seelycol.,1991)

Asimismo el contenido de carotenos mostró una fuerte reducción. Con el aumento del tiempo de

humidificación tanto el contenido del clorofila a como el contenido de los carotenos aumentaron

sensiblemente.(Fig.3.IV.6).

a 2 c

2

bc 2

b 2

b 2

- 84 -

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 3 6 9 12Tiempo de hidratación (horas)

clor

ofila

a y

b (µ

g/m

g)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

caro

teno

s (µ

g/m

g)

Clf a

Clf b

carotenos

Fig.�3.IV.6.-Contenidodepigmentos(vercuadroinserto)ensemillassometidasadiferentestiemposdehidratación (hs). Los tratamientos con la misma letra minúscula encima de las columnas no sonsignificativamentediferentesconunP=0,005porel testdeTukey.Losvaloresdeclorofilabnopresentandiferenciassignificativasentrelostratamientos

Integridad�de�la�membrana�plasmática�

En el capítulo 3.III se evaluó por medio de ESR y por pérdida de electrolitos, el estado de las

membranas plasmática en las semillas envejecidas por la luz y se comprobó que valores bajos de la

intensidadlumínicaeransuficienteparaproducirunimportantedañoalamembrana.Ellosereflejabaenun

aumentodesupermeabilidad (valoresbajosdeW/Lyaltosde pérdidadeviabilidad).Cuando las semillas

envejecidassesometieronahidrataciónseobservóunagradualrecuperacióndelapermeabilidadevaluada

porelcocienteW/L, loque implicaunaclaramuestradel importante rolqueenestassemillascumplen los

mecanismos de reparación. No se evaluó, como en el caso de la semilla seca, la pérdida de electrolitos

e 3

a 3

d 3

d 3

c 3

b 3

h 3

i 2

h 3

g 3

f 2

i 4i

4

i 2

i 3

- 85 -

debidoaquedurantelahidrataciónyaseproduceesteproceso.Resultadosdelmismocapítulosugierenque

elmayordañooxidativoenlassemillasquerecibenluzseproduciríaenlastilacoidespropagándoseaotros

componentes celulares como las membranas plasmáticas. En consecuencia, es esperable que en los

cloroplastos,elnivelderadicaleslibresactivosseamayorqueenelrestodelcitoplasmayenconsecuencia,

tambiénloseaelgolpeoxidativo.Enel restodelcitoplasma,elmenornivelderadicaleslibresdeterminaría

queel incrementoqueseproducealcomienzode lahidratación (3h)noalcanceapromoverundañoque

aumentelapermeabilidadrespectodelaquemuestraelcontrolcomoseapreciaenlafigura3.IV.7.

0

1

2

3

4

0 3 6 9hs

ES

R (

W/L

)

Fig.�3.IV.7.-ESRcomomedidadepermeabilidaddemembranaensemillasenvejecidassometidasadiferentes tiempos de humidificación (hs). Los tratamientos con la misma letra minúscula encima de lascolumnasnosonsignificativamentediferentesconunP≤0,05poreltestdeTukey

Reacción�de�Maillard�

LassemillassometidasahumidificaciónmostraronunmarcadodescensoenelcontenidodeMaillard

(Fig.3.IV.8).Sibienenlabibliografíanoexistenreferenciasdeunhechosimilarcabesuponerqueentrelos

mecanismos de reparación que comienzan a actuar al hidratarse la semilla, se encontrarían los que dan

cuenta de ese descenso, sin que se pueda descartar �� ��� �� la existencia de alguno específico para la

eliminacióndeesosproductos.

a 4

c 4

b 4

a 4

- 86 -

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

400 450 500 550 600longitud de onda de emisión (nm)

inte

nsid

ad d

e flu

ores

cenc

ia (

UA

)control priming

Fig.�3.IV.8.-Fluorescenciadesemillasantesydespuésdelahumidificación.

LosresultadosobtenidosenestecapítuloconcuerdanconlasuposiciónexpresadaenIntroducción(de

estemismocapítulo)acercadequelafluctuacióndelaGNdurantelahumidificaciónesdebidaaunasimilar

fluctuaciónenelniveldedañooxidativo.

�

- 87 -

CAPÍTULO�3.V�

CARACTERÍSTICAS�FÍSICAS�DEL�CONTENIDO�CELULAR�

Enestecapítulosetratanseparadamentetresaspectosquetienenqueverconlascaracterísticasfísicasdel

contenidocelulardelostejidosembrionarios.Ellosson.

(a).�TRANSICIONES�VÍTREAS�(página88)

(b).�MOVILIDAD�MOLECULAR(página95)�

(c).�ISOTERMAS�DE�SORCIÓN�DE�AGUA�Y�NITROGENO�(página100)�

- 88 -

(a).�TRANSICIONES��VÍTREAS�

INTRODUCCIÓN�

La capacidad de algunas semillas para mantenerse viables por largos períodos con muy bajos

contenidosdeaguayenalgunos casos soportar contenidos tan bajos comocercanosal 1%, sugirió a los

investigadoresqueelmecanismodetoleranciadebeproducirprotecciónatodosloscomponentescelulares.

Un tipo de protección del citoplasma es el obtenido por la vitrificación delmismo. En sistemas biológicos

deshidratados,granpartede loscomponentesseencuentranenestadoamorfo formandovidrios(Levine&

Slade 1990; Ross & Karel 1991). Los componentes celulares no pueden alcanzar configuraciones de

equilibrio y por lo tanto no pueden organizarse para formar un cristal, sino que permanecen en forma

desordenadaoamorfa.

En el estado vítreo, por lo tanto, un fluido llega a ser altamente viscoso hasta tener propiedades

mecánicassimilaresaladeunsólido.Lossólidosamorfossonmaterialesmeta&establesconaltaviscosidady

bajamovilidadmolecular,existenenunestadodeno&equilibrioyexhibencambiosdependientesdeltiempoa

medida quese acercan al equilibrio. El aspecto de unmaterial vítreo es el de un sólido rígido quebradizo

caracterizadoporunaaltísimaviscosidad(alrededorde1012a1014Pas)(Sperling,1986).

Lamovilidadmolecularenlosvidriosestárestringidaavibracionesymovimientosrotacionalesderango

corto. Los cambios que ocurren en el estado vítreo, generalmente llamados “envejecimiento físico”, son

extremadamente lentos, y por lo tanto, los sistemas se pueden considerar estables a cambios físicos y

químicos. Un material amorfo vítreo puede pasar al estado líquido sobreenfriado dependiendo de la

temperaturaydelapresenciadeagua.Elcambioentrelosestadosvítreosysobreenfriadosseconocecomo

transiciónvítreaycorrespondeaunatemperaturaalacuallosvidriosempiezanaablandarseyfluir(Sperling,

1986). Por debajo de la temperatura de transición vítrea (Tg), que es característica de cada sistema, el

material es un sólido amorfo (vidrio). Las propiedades típicas de la mayor parte de los materiales vítreos

(llamados frágiles) son la fragilidad y la transparencia. La transformación demateriales vítreos en líquidos

- 89 -

superenfriadosviscososocurreenel rangode la temperaturadetransiciónvítrea.Es importantenotar,que

sobreelrangodelaTg,uncambiodepocosgradosdetemperaturapuedeprovocarenlosmaterialesfrágiles,

una disminución significativa en la rigidez. Debido a que las moléculas en los materiales en estado

sobreenfriadotienenmayormovilidadqueenelvidrio,sonmássusceptiblesaqueenellosocurrancambios

físicos o químicos. En este sentido la Tg es considerada como un “punto crítico” o una “barrera” para los

cambiosenloquerespectaaciertosaspectosdelaestabilidaddesistemasamorfos.

Burke(1986)consideraqueelestadovítreoeselmayorcomponentedelaestabilizacióndesemillas

secasenalmacenaje.LostrabajosrealizadosporWilliams(1994),Leopoldycol.(1994)confirmanlas

sugerenciasdeBurkeydesarrollanevidenciasdelacontribucióndelestadovítreoenlafisiologíadelas

semillas.Elestadovítreoesunodelosprincipalesfactoresdelaestabilidadycalidaddesemillassecasal

suprimirreaccionesquímicas,previniendoasídañosamacromoléculasymetabolitos.

RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�

LostermogramasobtenidosporDSCparasemillasde�����������equilibradasaactividadesdeaguade

0.11 y 0.75 se muestran en la figura 3.V.1 (A&B). Se observan transiciones térmicas que fueron

independientesdelcontenidoacuoso,conunpicoenelrangode0°C,atribuidosaloslípidosdelasemilla.

Enestudiospreviosrealizadosensemillasdequinoa(Matiacevichycol.2007),embrionesdemaíz(Williams

&Leopold1989),semillasde4��"!�(Craneycol.2003)seobservarontransicionesimportantesamenores

temperaturas, en el rango de–80 a &10º C que se atribuyeron principalmente a la fusión de las distintas

fraccionesdelípidos.Enelcasodesauce,lafusiónsepresentaatemperaturascercanasa0°Cyeláreade

lospicosesmásgrande(5.5J/g),comparadoconeldeotrassemillasindicandounaltocontenidolipídicode

un punto de fusión relativamente elevado. Las temperaturas de transición vítrea se muestran también

indicadaenlasfiguras3.V.2(A&D).

- 90 -

Fig.� 3.V.1.- Termogramas obtenidos por DSC para semillas de sauce equilibradas a actividades deaguade:0.11(A);0.75(B).

Lípidos

Proteína

Tg

Lípidos

Proteína

Tg

aw 0,75 6,98 mg; 10°C/min

A�

B�

- 91 -

Paraalgunasmuestras,lastemperaturasdetransiciónvítreasfuerondifícilesdedeterminar,debidoala

superposiciónde lasmismascon las transicionesde los lípidos,queseextendieronenunrangoampliode

temperaturas.EnlaFigura3.V.2seindicapormediodedeflechaselvalorprobabledelastemperaturasde

transiciónvítreaparamuestrasdedistintasactividadesdeagua.

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

2 m

W

exo

>

A� aw= 0,22

2 m

W

exo

>

&50050100°C

�B aw= 0,44

d. aw= 0,58

&50050100°C

exo

>

exo

>

exo

>

exo

>

2 m

W

2 m

W

2 m

W

2 m

W

Fig.�3.V.2.-�TermogramasobtenidosporDSCparasemillasdesauceequilibradasaactividadesdeaguade:

0.22(A);0.44(B);0.58(C);0.84(D).

&50050100°C

�D aw= 0,84

&50050100°C

��C�

- 92 -

Cuandoseextrajeron loslípidosde lassemillasloseventostérmicosatribuidosalafusiónde lípidos,

disminuyeronsignificativamente.Porotraparte,segúnseobservaenlafigura3.V.3lastransicionestérmicas

delextractolipídicomuestraneventosendotérmicosquecoincidenconlosobservadosenlasemillacompleta.

Apareceenlasemilla,además,unatransiciónendotérmicaentre60y90°Cquehasidoobservadaenotras

semillas, que desaparece luego de barridos subsecuentes. Leprince yWalter&Vertucci (1995), Sun y col.

(1998)ySánchezdelÄngelycol. (2003)mostraron transicionessimilaresenporotoyproductosabasede

maíz, respectivamente. Estos picos son típicos y se consideran debidos a desnaturalización de proteínas.

Hastaunahumedadrelativade84%noseobservóaguacongelable(yaquenoseobservanningunadelas

transicionesdelagua,comocristalización/fusióncercade0°C).

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

Fig.�3.V.3.-�TermogramaobtenidoporDSC(5°C/min)delextractolipídicodelassemillasdesauce.

Elaumentodelahumedadrelativadeequilibrio,produjounadisminucióndelvalordelaprobableTg.

Segúnsemuestraenlafigura3.V.4.LamovilidadmolecularporencimadeTgesunfactorimportanteque

Extracto lipídico

-50 -25 0 25 50-1.00

-0.75

-0.50

-0.25

0.00

T (°C)

mW

- 93 -

puedeinfluirenlaestabilidaddelmaterialbiológicodadoquepuedeinfluirenlavelocidaddereaccionesde

deterioro,disminuyendolalongevidad.Comoseobservaenlamismafigura,a25°C,elcontenidodeagua

límiteparaquelasemillaseencuentreenestadovítreodebesermenorque10%.

Pequeñosaumentosdelatemperaturaodelahumedadrelativaprovocanelpasajedelestadovítreoalestado

menosestabledelíquidosobreenfriado.Deestaforma,paramejorarlaestabilidaddelassemillas,latemperaturaesla

variablequepodríaajustarse.Deacuerdoconlamismafigura,paramantenerelestadovítreo,lasmuestrascon

humedadessuperioresa10%deberíanconservarsebajorefrigeraciónocongeladas.Sinembargo,lospuntos

marcadosenlacurva,correspondenatemperaturasalasquelagerminaciónmuestraundecaimientorelativamente

rápidoquenopareceríacompatibleconunestadodealtaviscosidadcomoeselvítreo.Alrespecto,nosedescartaque

esasituaciónpuedadeberseacausasnoexcluyentesentresí,comounestadodelcontenidocelularconaltaporosidad

loquefacilitaríaladifusióndeloxígenoy,porende,lasreaccionesdeautooxidacióny/oalaestructuracelularmás

compleja(menoshomogénea)quetienenestassemillasrespectodelasortodoxaslongevas,debidoaqueenellasel

procesodedesdiferenciacióncelular(capítulo3.II)esmenosacentuado.

- 94 -

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

Fig.�3.V.4.-�Temperaturadetransiciónvítrea(Tg)obtenidaparasemillasdesaucededistintoscontenidosacuosos(ca)eng/100gdesólidoseco.Loscículossobrelaflecharepreswentanlascondicionesexperimentalesanalizados

�

�

�

�

�

�

SAUCE

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.00

20

40

60

80

100

C.A.

T g,

°C

- 95 -

(b).�MOVILIDAD�MOLECULAR��

INTRODUCCIÓN�

La resonancia magnética nuclear protónica de baja resolución (TD&NMR) ha sido empleada para

estudiar el estado del agua y los cambios metabólicos en muchos sistemas biológicos. La relajación

transversal de los protonesdel agua ha sidoutilizadapara describir la compartimentación del agua en los

tejidos (Ratcliffe 1994). Lasmoléculas de agua que sonmás omenosmóviles tienen diferentes tasas de

relajación, pudiendo calcularse sus cantidades relativas (Krishnan y col. 2004). En comparación con los

métodosgravimétricos,lastécnicasdeRMNpuedenproveerinformaciónmásdetalladasobreelcontenidoy

elestadodelaguaen lassemillascondiferentescontenidosdeaguaduranteelalmacenamiento(Krishnan

2004).

RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�

Sedeterminaronlostiemposderelajaciónespínespíndesemillasdesauce,equilibradasaactividad

de agua de 0,52, que presentaban contenidos acuosos cercanos al 10%, los que se compararon con los

resultados obtenidosdeotras semillasde tamañosimilar, equilibradasa lamismaactividaddeagua. Los

resultadossemuestranenlaTabla3.V.1.

ElanálisisdelaseñalderelajacióntransversaldeterminadosporFIDparalassemillassecasmostraron

queeldecaimientodelaseñalpodíaserrepresentadoporunacurvaexponencialdeprimerorden,yqueel

tiempo de relajación de las semillas de sauce supera al de las otras. Esto indica una mayor movilidad

molecularqueseríaconsistenteconelmásrápidodeterioroquemuestranestassemillas,sibienladiferencia

enlasmovilidadesnoguardarelaciónconlaqueexisteentrelaslongevidades.Detodasmaneras,respecto

de laaplicacióndeestametodologíaode laquedetectaelmovimientodesondas (ESRespínprobepara

evaluar la movilidad molecular, es necesario tener en cuenta que, como consecuencia de la menor o

incompleta desdiferenciación celular las semillas de sauce presentan un sistema más heterogéneo

estructuralmente que el de las semillas ortodoxas típicas por lo que una estricta comparación de las

- 96 -

movilidadesentresauceylasotrassemillasresultaríacuestionable.Enconcordanciaconestoúltimosurgela

cuestión del grado de homogeneidad del sistema a evaluar que sea compatible con una confiable

interpretacióndelosresultados.Sinembargo,unanálisisdelosecosdeespínatravésdelasecuenciaHahn

exhibiódiferenciasdecomportamientoparalassemillasdesauce(Tabla3.V.2).

�

��Tabla� 3.V.1.- Tiempos de relajación T2 obtenidos por FID, para un modelo de decaimiento

monoexponencial, con para semillasdedistinto tipo.Wcontenidodeaguaenbaseseca;aw: actividaddeagua;I.C.:intervalodeconfianza;Amp:amplitudrelativadelaseñal.�

Tabla� 3.V.2. Tiempos de relajación T2obtenidos por la secuencia de ecos de espín deHahn parasemillasdedistintotipo.IC:intervalodeconfianza;Amp.:amplitudrelativadelaseñal,enporcentaje;

&&:nocorresponde,yaqueelmodelodeprimerordenfueelúnicoadecuado.

W� aw�

T2�FID�

(µµµµs)�

IC�

(µµµµs)�

Amp.�

(%)�

Cilantro 9,2 0,552 9,7 0,1 100

Valenciana 8,9 0,551 9,9 0,1 100

Trebi 8,7 0,553 8,9 0,1 100

Sauce 10,1 0,510 11,4 0,1 100

Trigo 11,0 0,547 9,0 0,1 100

T2�Hahn��

(µµµµs)�

IC�

(µµµµs)�

Amp.�

(%)�

T2�Hahn�

(µµµµs)�

IC�

(µµµµs)�

Amp.�

(%)�

Cilantro 37 4 100 && && &&

Valenciana 40 4 100 && && &&

Trebi 33 3 100 && && &&

Sauce 30 3 80 530 0,461 20

Trigo 33 3 100 && && &&

- 97 -

�

Enlassemillasdesauceaquíestudiadasaparecierondospoblacionesdeprotones,una,quedacuenta

dealrededordel80%delaseñal,contiemposderelajaciónde30microsegundosyunasegundapoblación,

correspondienteal20%delaseñal,conuntiempoderelajaciónde530microsegundos.Lasecuenciade

Hahndetectamovilidadesintermediascuandoyahanrelajadolosprotonesmenosmóviles.Paraelrestode

lassemillasmásdel99%delosprotonesdecayóenuntiempoderelajacióncercanoa30microsegundos.La

presenciadelasegundapoblacióndeprotones,muchomásmóviles,segúnloqueindicasumayortiempode

relajación,probablementeestéasociadaalapresenciadevacuolas,talcomoseobservópormicroscopía

electrónica(Capítulo3.IIdeestatesis).

Cuandolassemillasdesaucesehumedecierondurantetodalanoche,laactividaddeaguadelas

mismasaumentóa0.97yserepitieronlasdeterminacionesparadetectarsieneseestadohídricola

presenciadeagualibrepodríadistinguiralgúncomportamientodiferencialdelassemillasdesaucecon

respectoalasortodoxastípicas.Enestecaso,laaplicacióndelasecuenciadeHahnpermitiódetectarqueel

decaimientodelaseñalsepodíarepresentarporunafuncióndedecaimientobi&exponencialparaelcasode

sauceymono&exponencialparaelrestodelassemillas.Paralassemillasdesaucehúmedassedeterminó

unaprimerapoblacióndealrededorde30µsyunasegundacercanaalmilisegundo(844µs).Paraelresto

delassemillaseldecaimientofueentiemposdelordende60a120µs(Tabla3.V.3).

- 98 -

T2�Hahn��

(µµµµs)

IC�

(µµµµs)

Amp.�

(%)

T2�Hahn��

(µµµµs)

IC�

(µµµµs)

Amp.�

(%)

Cilantro 97 2 100 && && &&

Valenciana 121 20 100 && && &&

Trebi 64 3 100 && && &&

Sauce 30 4 23 844 123 77

Trigo 57 10 100 && && &&

Tabla�3.V.3.-TiemposderelajaciónT2luegodelasecuenciadeecodeespíndeHahnparasemillas

humedecidas.IC:intervalodeconfianza;Amp.%:porcentajedeintensidaddelaseñal.

&&:nocorresponde,yaqueelmodelodeprimerordenfueelúnicoadecuado

Demodosimilaraloquesucedeenlassemillassecas,enlassemillashúmedasdesaucetambiénse

detectarondospoblacionesdeprotonesaunqueconmayormovilidad(Tabla3.V.3).Enelrestodelas

semillas,porestemétodo,sólosedetectasólouna.

Medianteelanálisisdelostiemposderelajaciónporecodeespín,luegodelaaplicacióndela

secuenciaCPMGsepuedeestudiarelcomportamientodelasfraccionesdeprotonesmásmóviles.Yaque

laaplicacióndeestasecuenciainvolucralaaplicacióndetiemposdevariospulsosytiemposdeinterpulsos,

lamediciónserealizacuandolaspoblacionesdeprotonesmenosmóvilessehanrelajado,yporesose

detectaúnicamenteelcomportamientodelosprotonesmásmóviles.Enestecaso,sepudodeterminarque

eldecaimientoeratri&exponencial(locualindicalapresenciadeporlomenostrespoblacionesdeprotones

dealtamovilidad).ComomuestralaTabla3&V&4,laprimerapoblacióncorrespondeaprotonesquerelajanen

elordende5a10ms,lasegundaentre15y50ylatercera(másmóvil)de77a170ms.Enestecasolas

semillasdesaucemuestrantiemposderelajacióndentrodelrangodelrestodelassemillas,yquizáuna

pequeñadiferenciaenladistribucióndemovilidades,yaquepresentanunaproporciónlevementemenorque

elrestodelassemillasdelatercerapoblación(másmóvil).

- 99 -

Tabla�3.V.4.-TiemposderelajaciónT2luegodelasecuenciadeecodeespínCPMGparasemillas

humedecidas.IC:intervalodeconfianza;Amp.%:porcentajedeintensidaddelaseñal

ElanálisisdelosdiferentestiemposderelajaciónT2obtenidossegúnFID,HahnyCPMGindicaquela

diferenciadecomportamientomásnotableencuantoalamovilidaddelosprotonescorrespondealas

semillasconcontenidoacuosocercanoal10%,queeselquealcanzanlassemillascuandosedeshidratan

naturalmente.

Enuntrabajodeinvestigaciónrecientesobresemillasdequinoa(Castellion2008)sereportaquela

tercerapoblacióndeprotonescuyotiempoderelajaciónesdelordende100ms,correspondíaalosprotones

deloslípidosmásmóvilesyaquesuamplitudytiempoderelajaciónnovariabaconelcontenidodeagua

(Castellión2008).Deestamanerasepodríaatribuiraloslípidosunaimportantecontribucióndelosprotones

dedichapoblación.

T2�CMPMG��

(ms)

IC�

(ms)

Amp.�

(%)

T2�CPMG��

(ms)

IC�

(ms)

Amp.�

(%)

T2�CPMG��

(ms)

IC�

(ms)

Amp.�

(%)

Cilantro 13 1 39 46 10 34 164 10 26

Valenciana 8,7 0,4 43 32 2,2 38 136 10 19

Trebi 3,8 0,1 47 19 0,7 35 71 2 19

Sauce 4,3 0,1 44 15 0,3 32 96 1 12

Trigo 4,8 0,2 49 17 0,7 36 77 3 15

- 100 -

(c).�PROPIEDADES�DE�SORCIÓN-�ISOTERMAS�DE�SORCIÓN�

INTRODUCCIÓN�

Elcontenidodeaguaenlassemillasesciertamenteelfactormásimportanteparadeterminarsus

característicasdealmacenaje.Engeneral,lashumedadesadecuadasparaelalmacenamientodesemillas

ortodoxasseencuentranentre7y10%(baseenmasaseca)(Leopolds1990).

Laactividaddeagua(aw),esunamedidaindirectadelaguaqueestádisponibleenundadomaterial

paraparticiparendiferentesreaccionesdeteriorativasyenelcrecimientomicrobiano.

Enelequilibrio,atemperaturaconstante,lasactividadesdeaguadeloscomponentesdeunamezcla

soniguales,mientrasqueloscontenidosdeaguapuedennoserlo.Laactividaddeaguaestárelacionadacon

lahumedadatravésdelaisotermadesorcióndeagua.Suvalorvaríaentre0y1.

ap

pT cteW

V H O

V H Opura

o= ≈ =( )

( )

.2

2

��� ���1.1�

Donde:

aweslaactividaddeagua

peslapresióndevapordeaguaenelsustratoalatemperaturaT

p0eslapresióndevapordelaguapuraalatemperaturaT

Estaigualdadsebasaenasumirlaexistenciadeequilibriotermodinámico.Generalmenteensistemas

complejos,comolassemillas,estacondiciónpuedenocumplirseyporelloseríamáscorrectousareltérmino

presióndevaporrelativa(PVR)enlugardeltérminoaw(Fennema,1996).

Enelequilibrio,larelaciónentrelaawylahumedadrelativa(HR)estádadaporlaecuaciónsiguiente:

aHR

w =100

1.2

- 101 -

Elcontenidodeaguaessimplementeunamedidadelaconcentracióndeaguaenlasemilla.Enelequilibrio,

el contenido de agua se relaciona con la humedad relativa o awmediante las isotermas de sorción. Las

isotermas de sorción de diferentes materiales biológicos muestran un curva de forma sigmoidal reversa

(LeopoldyVertucci,1986;VertucciyLeopold,1987,Ishidaycol,1988;RobertsyEllis,1989).

Ψ Ψ Ψ Ψ (Mpa) a 25°C

1009080

70

60

50

40

30

20

10

0

Con

teni

do d

e hu

med

ad (

% b

ase

seca

)

Con

teni

do d

e hu

med

ad (

% b

ase

húm

eda)50

40

30

20

10

0

Ψ Ψ Ψ Ψ (Mpa) a 20°C

0 50 100

-500 -100 -50 -10 0

-500 -100 -50 -10 0

Humedad relativa (%)

�

Figura�3.V.5.-Isotermadesorcióndesemillasdelechuga(azul)ydecebada(roja)atemperaturaconstante(EllisyRoberts,1980).Elcontenidodeaguasemuestracomo%enbasehúmeday%enbaseseca.

Deacuerdocondichascurvasyestudioscalorimétricos,sehanclasificadoalmenos5rangosdeagua

onivelesdehidrataciónenlostejidosdesemillasortodoxasyrecalcitrantes(Vertucci,1989,1990;Berjaky

col., 1990, 1992; Pammenter y col, 1991). En la región 1 (de 0 a 8&10 g H2O/ 100g demasa seca), las

moléculas de agua están asociadas fuertemente a superficiesmacromoleculares por enlaces iónicos y se

comportancomoun ligandoantesquecomounsolvente.Laenergíadeatracciónesestimadacomo–50kJ

mol&1.

- 102 -

Enlaregión2(8&22%),elaguaformapartedevidriosgeneradosporlossólidos(Williams&Leopold,

1989) y la energía de atracción disminuye a cerca de –2kJ mol&1 sugiriendo una interacción débil con la

superficiemacromolecular(Vertucci,1989).Cuandosuconcentraciónestácercadel22%,elaguarecupera

sus propiedades de solvente y aparecen algunas actividades metabólicas. Las moléculas de agua

correspondientesalasregionesdehidratación1y2seconocentradicionalmentecomo“agualigada”,queda

cuentadelagraninteraccióndeestasmoléculasconlossólidos.

Las propiedades térmicas del tercer nivel de hidratación (22&33%) aparentan ser de una solución

concentrada. A este nivel de hidratación se puedemedir la respiración (Leopold & Vertucci, 1989). En la

región 4 (33&55%) y 5 (encima del 55%), el agua exhibe propiedades térmicas similares a una solución

diluida. Encima del 55 % de contenido de humedad, los tejidos de las semillas están completamente

hidratados,permitiendoqueselleveacaboelprocesodegerminación.

Estudiosdelainfluenciadelaactividaddeagua(aw)enlavelocidaddelasreaccionesquímicasindican

queabajasactividades,elaguanoestádisponibleparaactuarenreaccionesquímicasdebidoaqueestase

encuentrafuertementeligadaalasuperficiedesitiospolares.Amásaltasactividades,elaguaexisteen

multicapasodentrodecapilarescomofasecondensadaylamovilidaddelsistemaseincrementa.Esta

situaciónesatribuiblealasdiferenciasdeintensidadconlaqueelaguaseasociaconlosconstituyentesno

acuosos.Elaguaunidafuertementeestámenosdisponibleparalasreaccionesdegradativas,talescomoel

crecimientodemicroorganismosylasreaccionesquímicashidrolíticas,queelaguaquetieneasociaciones

débiles.

Aunadadahumedadrelativa,ladiferenciadelcontenidodeaguaenelequilibrioentresemillasde

diferentesespeciespuedevariar,yaquedependedelacomposicióndelcitoplasma(Vertucci&

Leopold1987).Másaún,laintensidadynaturalezadelainteraccióndelaguaconlossólidosdelassemillas

incidesobrelavelocidaddelasreaccionesdedeterioro(Vertucci&Ross1993;Leopold&Vertucci1989).Por

lotanto,lascaracterísticasdesorcióndelassemillaspuedentenerinfluenciasobrelavariacióndela

- 103 -

longevidaddelassemillasentrediferentesespecies(Eiraycol.1999)o,aún,entredistintoscultivaresaunque

larelaciónentrelacapacidaddeunióndelaguayelcomportamientoenelalmacenamientonohasido

confirmada.

�

Modelado�de�las�isotermas�de�sorción�de�agua�

Elmodeladodelasisotermasdesorcióndeaguaesparticularmenteimportanteparapredecirlavida

mediadealimentosdehumedadbajaeintermedia(Labuza,ycol.,1970;Labuza,1980;Simatos&Karel,

1988).LasecuacionesdeBrunauer&Emmett&Teller(BET)(Brunauer,ycol.,1938)yGuggenheim&Anderson&de

Boer(GAB)(vandenBerg,1981)sonmodelosconocidosdeisotermasdesorciónqueproveenelvalorde

humedaddemonocapa.Elvalordehumedaddemonocapasueleserconsideradocomoelcontenidodeagua

óptimoparalaestabilidaddealimentosdebajahumedad.ElmodeloBETsederivadeunmodelodesorción

quefueoriginalmentepropuestoparalasorciónfísicadeungasinerteenunasuperficiedeunsólido,ysus

dossupuestossonquelasuperficietieneunáreafijaygeométrica,yquehayunadiferenciagrandeentrela

cantidaddeenergíaliberadacuandounamoléculallegaalasuperficiedelmismosólidooaunsitiodondeya

estácubiertoporotrasmoléculasdegas.Deestaforma,elvalordemonocapasevisualizacomolacantidad

degasquecubrelasuperficieexpuestadelsólidocompletamenteconunacapadeunamoléculadegrosor

(vandenBerg,1981).LaaplicabilidaddelmodeloBETselimitaaawenelrangode0,1a0,5(Labuza,1968),

peroelmodeloGABsepuedeaplicarsobreunrangomásampliodeaw(vandenBerg,1981).

ElmodeloBETesempleadoparaestimarlassuperficiesdesorcióndegasesenmaterialesporososa

findeconocersugradodeporosidad,tipo,distribucióndetamañodeporoyvolumenmediodeporos.

�

�

�

�

- 104 -

�

RESULTADOS�Y�DISCUSIÓN�

Isotermas�de�sorción�de�sauce�comparadas�con�otras�semillas�

Lafigura3.V.6muestralaisotermadesorcióndeaguaobtenidaparasemillasdesauceapartirdelos

datosdecontenidoacuosoacadahumedaddeequilibrioempleada.

SeempleólaecuaciónGABparadescribirlasisotermasdesorcióndesauce,empleandoelmétodode

cuadrados mínimos para minimizar la diferencia absoluta entre los valores experimentales y calculados a

travésdelmodelo.EstaecuaciónGABsehaempleadoparavariosmaterialesbiológicosyesaplicableenun

amplio rango de contenido acuoso. Las constantes GAB m0, C y k, se obtuvieron empleando la forma

cuadrática:

2

00)

)11(()21()1( ww

w amkCaCCkmm

a −+−+=

donde:meselcontenidodeagua;m0eselvalordehumedaddemonocapaGAB,Ceslaconstantede

Guggenheim,relacionadaconelcalordesorcióndelaprimeracapademoléculas,sobrelossitiosprimariosy

kesun factorquecorrige laspropiedadesde lamulticapadeaguarespectode lasdelagua .Cykestán

relacionadosconlaenergíadeinteracciónentrelamonoymulticapayreflejanelefectodelatemperatureen

laspropiedadesdesorción.kesprácticamentesinexcepcióncercanoa1,peromenor.

La bondad del ajuste se evaluó a través de la desviación porcentual (%E) entre los valores

experimentalesyloscalculados,paralocualseempleólasiguienteecuación:

∑−

=m

mim

nE

*100%

Donde:neselnumerodemediciones,meselcontenidoacuosoexperimental ymi*eselcontenido

acuosocalculadomedianteelmodelo.

LosparámetrosobtenidosparaGAB,mo,kyCsemuestranenlaTabla1juntoconeldelassemillas

de especies originarias del desierto de Atacama, pertenecientes a los géneros�� ����&���� � y ����,

- 105 -

algunasextremadamentetolerantesaladesecación.Lasconstanteskfueronmenoresque1paratodoslos

materiales analizados [27]. Es interesante notar que tanto la llamada humedad de monocapa como las

constanteskycnomuestrandiferenciasparalassemillasquetienendistintatoleranciaaladesecación.Enel

trabajo de Vertucci & Leopolds (1987) se sugiere que las semillas intolerantes a la desecación presentan

curvasdesorciónhiperbólicas,caracterizadaspor laausenciadesitiosdesorciónenlaregión1.Segúnlos

resultados obtenidos en el presente trabajo, no es posible distinguir las semillas de sauce, de otras de

estabilidadmuchomayor,porelanálisisdelaspropiedadesdesorción.

- 106 -

SAUCEISOTERMA GAB

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

10

20

30

aw

Hum

edad

, %

(b.s

.) 26°C

BÁLSAMOISOTERMA GAB

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

10

20

30

40

5026°C

aw

Hum

edad

, %

(b.s

.)

�

NOLANA V.ISOTERMA GAB

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000

10

20

30

aw

Hum

edad

, %(b

.s.)

Figura�3.V.6.-�Isotermadesorcióndeaguadesemillasdesauce(medicionesporduplicado).�

- 107 -

LosdatosobtenidosatravésdelaaplicacióndelmodeloGABsepuedenobservarenlaTabla3.V.5.

Muestra� moa(%d.b.)� kb� Cb� %Ec� Referencias�

Sauce 5.7 0.697 17.7 4 Presenteestudio

Quinoa,cv.BaerII 5.0 0.873 23 3 Matiacevichycol.2006

Quinoacv.Ollagüe 4.5 0.87 52 3.2 Matiacevichycol.2006

Quinoacv.Chadmo 4.7 0.88 56 3.4 Matiacevichycol.2006

Lechuga 4.6 0.913 7.5 4 EllisyRoberts1995

�����)��� ��� 5 0.679 19.1 5 Scheborycol.2002

Bálsamo 5.1 0.872 39.8 3 Scheborycol.2002

Cebada 7.3 0.807 51.12 7 EllisyRoberts1980

Amaranto 10.2 0.81 16.8 5 Pollioycol.1998

Bálsamo 10.2 0.62 18.6 6 Timmermannycol.2001

Table�3.V.5.-ConstantesdelaecuaciónGABybondaddelajusteaplicadoalasisotermasdesorcióndesemillasdesauceycomparaciónconlosvaloresdeotrassemillas.

aContenidodeaguanecesarioparacubrirlasuperficiedelossitiosmáspolaresconunamoléculadeagua.(mo).

bFactordecorreccióndelaspropiedadesdelaguaenmulticapasconrespectoalagualíquida.cGuggenheimconstantdDesvíorelativoporcentual.

Isotermas�de�adsorción�de�Nitrógeno�

Debidoaqueelairepresenteenlassemillaspuedeserunfactormuyimportanteparadeterminarla

velocidaddedeteriorodelassemillas,seevaluólasuperficiedelassemillasdesauceexpuestaaaire,a

- 108 -

travésdelasisotermasdeadsorcióndenitrógeno,quesegraficanenlafigura3.V.6.Paracomparaciónse

realizóelanálisistambiénensemillasdetrigo.Laformadelascurvasdeambosmaterialescorrespondeala

clasificacióndeisotermastipoIIsegúnlasisotermasestándardeIUPAC(setratadesólidosdebaja

porosidad),yenellaspuedeobservarsequelaadsorcióndeNesmayorenlassemillasdesaucequeenlas

detrigoentodoelrangodepresionesparciales.

0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.000

0.025

0.050

0.075

0.100

0.125

sauce

trigo

Presión relativa

Vol

umen

ads

orbi

do(c

m3 /g

)

Figura�3.V.6.-Isotermasdeadsorcióndenitrógenoparasemillasdesauceyparagranosdetrigo.

Losresultadosobtenidosapartirdelanálisisdelasisotermasdeadsorcióndenitrógenoseencuentran

tabuladosenlaTabla3.V.6enlacualseincorporóademáseláreasuperficialparalaadsorcióndeagua

(SWGAB)calculadaapartirdelosdatosobtenidosmediantelaecuacióndeGAB,delasecciónanterior:

M

moNaSWGAB =

- 109 -

DondeSWGABeslasuperficieparaadsorcióndeagua(m2/g),moeselcontenidodeaguademonocapa

obtenidoporGAB(gH2O/g/NeselnúmerodeAvogadro(6.02x1023moléculas/mol);Meslamasamolarde

agua(18g/mol)y�eseláreadeunamoléculadeagua(10.6x10&20m2/molécula).

Especie SNBET

(m2/g)

Vm

(cm3/g)

SWGAB

(m2/g)

Trigo 0.0212 0.00487 354.50

Sauce 0.0800 0.01839 202.07

Tabla�3.V.6.-�SuperficiesespecíficasparalaadsorcióndenitrógenocalculadaporBET(SNBET)yparalaadsorcióndeaguacalculadaporGAB(SWGAB)parasemillasdetrigoysauce.

Comoloindicanlosdatosobtenidos,eláreaparalaadsorcióndegasesesmuybajaenambas

semillasconrespectoalosmaterialesquenormalmenteseanalizanporestametodología(catalizadores,

polvos,etc.).Además,parasemillasdesauceescasicuatrovecessuperiorqueparagranosdetrigo.Al

respecto,cabemencionarquenoexistenreferenciassobrelamedicióndelaporosidadensemillas,

metodologíaqueporlosresultadosobtenidospodríaaportarunainformaciónmuyútilparadiferenciar

comportamientosysusceptibilidadalaoxidación.Asuvez,elvolumenmediodeporoestambiéncuatro

vecesmayorenlassemillasdesaucequeenlasdetrigo.Lamayoráreasuperficialyelmayorporoindican

unaporosidaddelassemillassuperioraladelosgranosdetrigoanalizados.Asuvez,paraambassemillas,

lasáreasespecíficasparalaadsorcióndeaguaestresórdenesdemagnitudmayorquelascorrespondientes

alaadsorcióndenitrógeno,loqueesconsecuenciadelaaltahidrofilicidaddeambosmateriales,siendoesta

superiorparalosgranosdetrigo.Estosresultadossonconcordantesconlaconclusiónquesederivódelos

capítulosanterioresacercadequelacausadelrápidodeterioropareceríadeberseaciertaspropiedadesdel

- 110 -

contenidocelular,especialmente,aunaporosidadmaselevadaqueladeotrassemillasortodoxas,mucho

máslongevas.

�

- 111 -

CAPÍTULO�5�

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