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SPETTROSCOPIA UV-VISIBILEProf. Attilio CitterioDipartimento di CMIC “Giulio Natta” https://corsi.chem.polimi.it/citterio/
Corso di Chimica Generale - CHI083424 - CCS Ingegneria ChimicaA.A. 2015/2016 (I° Semestre)
Attilio Citterio
Spettroscopia
• A insieme di strumenti per misurare le proprietà molecolari.
• La spettroscopia è l’assorbimento o l’emissione di luce.
• L’analisi spettrochimica può esser definita come l’uso dello spettro della radiazione elettromagnetica in analisi qualitative e quantitative.
• Quando una molecola assorbe luce, la sua energia aumenta
• Quando una molecola emette luce, la sua energia diminuisce
Attilio Citterio
Fotoni o Quanti di Luce
• Atomi e molecole assorbono solo alcune frequenza, ma non altre.
• Ci sono due ragioni per questa osservazione. L’energia assorbita o emessa è proporzionale alla frequenza, .
Energia di un fotone = hCostante di Plank
e–
260 2400
Attilio Citterio
Effetto Fotoelettrico (emissione di elettroni da un metallo solido irraggiato)
Misura dell’energia cinetica deglielettroni emessi (fotoelettroni) =Voltaggio per cui la corrente è zero
-
+
+
-Batteria
Elettrodo di raccolta
Elettrodo metallicoilluminato
Luce incidenteda sorgente
+
-
-
+Generatorea voltaggio
variabile
Amperometro
e-
e-
Attilio Citterio
Energia dei Fotoelettroni Emessi da Metalli
o del Cesio
100
200
300
400
x 1014 (Hz)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Ecin./ kJ mol-1
Cs K Mg Zn Ni Pt
Infrarosso Visibile Ultravioletto
Pendenza = h (costante di Plank)
Ecin. = Efot.- Eemis.= h - = h Ecin. = h (- )
Attilio Citterio
Peculiarità dell’Effetto Fotoelettrico
L’emissione fotoelettrica dimostra che l’energia dell’elettrone:
Aumenta se si aumenta
Non è influenzata aumentando l’intensità
L’intensità influenza il numero di elettroni emessi per secondo
Attilio Citterio
Quantizzazione dell’Energia Molecolare
Le energie molecolari sono quantizzateSe solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono permesse
ener
gia
ener
gia
Attilio Citterio
Quantizzazione dell’Energia Molecolare
Le energie molecolari sono quantizzateSe solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono permesse
ener
gia
ener
gia
Attilio Citterio
Altre Evidenze della Quantizzazione
• Assorbimento del corpo nero (Panck)
• Capacità termica dei solidi a bassa temperatura
quindi E = h
Attilio Citterio
Spettrometri
• sorgente
• monocromatore (selettore di frequenza)
• campione
• rivelatore
Attilio Citterio
Strumenti a Dispersione
Usati negli spettrometri visibile/ultravioletto e nei vecchi tipi di strumenti infrarosso
Attilio Citterio
Strumenti a Trasformata di Fourier
Richiedono estesi calcoli per convertire il segnale in uno spettro. Usati nei moderni strumenti.
Attilio Citterio
Lo Spettro Elettromagnetico
= c / E = h
InfrarossoVisibileUltravioletto
1022 1019 1017 1015 1014 1010
Frequenza [Hz]106 103 1 10-3
106 108 10101041021
Lunghezza d’onda [m]
10-210-410-610-810-1010-1210-14
Ragg
i Cos
mici
Ragg
i Gam
ma
Ragg
i X
Ultra
violet
toVi
sibile
Infra
ross
o
Micr
oond
e
Rada
r
Telev
ision
e
NMR
Radi
o
Ultra
suon
i
Suon
i(u
dibi
li)
Infra
suon
i
Attilio Citterio
Transizioni Elettroniche nella Formaldeide
transizione *(187 nm)transizione
n *(285 nm)
Attilio Citterio
Transizioni Elettroniche e Spettri di Atomi
E
S0 S2
S0 S1
S0S1S0S2
IES2
S1
S0
Attilio Citterio
Transizioni Elettroniche e Spettri UV-visibile in Molecole
massimi di assorbimento (max.)
Ampiezza della banda a metà altezza
E
S2
S1
Su
livelli elettronicilivelli vibrazionalilivelli rotazionali
I
= transizioni elettroniche
Attilio Citterio
Spettri Derivati di una Banda di Assorbanza Gaussiana
1a Derivata:
2a Derivata:
Assorbanza:
)('
fddA
)(fA
)(''2
2
fd
Ad
3° derivata
300 400 500 600 700
-2.0E-05
-1.0E-05
0.0E+00
1.0E-05
2.0E-054° derivata
300 400 500 600 700
1.0E-06
-5.0E-07
0.0E+00
5.0E-07
1° derivata
0.00
0.01
-0.01
Assorbanza
0.0
0.5
1.0Assorbanza
0.0
0.5
1.0
2° derivata
2.0E-04
0.0E+00
-2.0E-04
-4.0E-04
-6.0E-04
Attilio Citterio
Aumento Risoluzione
• Sovrapposizione di 2 bande Gaussiane con un NBW di 40 nmseparate da 30 nm
• Separate alla 4a
derivata
400 500 600
-5.0E-06
5.0E-06
0.0E+00
4° derivata
400 500 600
Assorbanza1.5
1.0
0.5
0.0
Attilio Citterio
Trasmissione e Colore
L’occhio umano vede il colore complementare di quello che è assorbito
Attilio Citterio
Assorbanza e Colori Complementari
400
500
600
700
800
380-435
435-480
480-490
490-500
500-560
560-595
595-650
650-780
violetto
blu
verde blu
blu verde
verde
giallo verde
arancio
rossoverde blu
blu verde
rosso
rosso-porpora
porpora
aranciogiallo
giallo-verde
Lunghezza d’onda [nm]
Coloreassorbito
Colorecomplementare
Attilio Citterio
Trasmissione e ConcentrazioneLa Legge di Lambert-Bouguer
Lunghezza Percorso
Tras
mitt
anza 100%
50%
25%
100% 50% 25% 12,5% 6,75% 3,125%
Io I1 I 2 I 3 I 4 I 5
Cammino Cost.0/T I I e
Attilio Citterio
Trasmittanza e Cammino OtticoLa Legge di Beer
Concentrazione Cost.0/T I I e
25%
50%
100%
Tras
miss
ione
Concentrazione
I5
I4
I3
I2
I1
3.125%
6.75%
12.5%
25%
50%
100% 5C
4C100%
3C100%
100% 2C
100% C
I0
Attilio Citterio
La Legge di Lambert-Bouguer-Beer
cbIIIITA /log/loglog 00
Concentrazione
Asso
rban
za
0.0
0.5
1.0
1.5
Attilio Citterio
Miscela Bicomponente
Esempio di miscela bi-componente con scarsa sovrapposizione spettrale
Asso
rban
za
0.0
0.5
1.0
1.5
200 210 220 230 240Lunghezza d’onda
x y x + y
Attilio Citterio
Miscela Bi-componente
Esempio di miscela bi-componente con significativa sovrapposizione spettrale
200 210 220 230 240Lunghezza d’onda
Asso
rban
za
0.0
0.5
1.0
1.5x y x + y
Attilio Citterio
Influenza di un Errore Casuale del 10%
Influenza sulle concentrazioni calcolate• Scarsa sovrapposizione spettrale: Errore 10%• Significativa sovrapposizione spettrale: Dipende dalla similarità, può essere
molto più alto (p.es. 100%)
200 210 220 230 240Lunghezza d’onda
Asso
rban
za
0.0
0.5
1.0
1.5Vero Misurato
Attilio Citterio
Spettri di Assorbimento di Derivati dell’Emoglobina
500 550 600Lunghezza d’onda [nm]
650
Asso
rban
za [A
U]
0.0
0.1
0.2
SulfemoglobinaOssiemoglobinaCarbossiemoglobinaEmoglobina (pH 7.0-7.4)Deossiemoglobina
Attilio Citterio
Intensità dello Spettro della Lampada ad Arco di Deuterio
• Buona intensità nell’intervallo UV
• Utile intensità nell’intervallo del visibile
• Basso rumore di fondo
• Intensità calante nel tempo Lunghezza d’onda [nm]
Irrad
iazio
ne S
pettr
ale200 300 400 500 600 700
0.00
0.01
0.1
1
Attilio Citterio
Intensità dello Spettro della Lampada a Tungsteno-Alogena
• Bassa intensità nell’intervallo UV
• Buona intensità nell’intervallo visibile
• Rumore di fondo molto basso
• Basso drift1000
Lunghezza d’onda [nm]200 400 600 800
Irrag
giam
ento
Spe
ttrale
0.01
0.1
1
10
Attilio Citterio
Intensità dello Spettro della Lampada a Xeno
• Alta intensità nell’intervallo UV
• Alta intensità nell’intervallo visibile
• Rumore di fondo medio
Lunghezza d’onda [nm]200 400 600 800 1000
0.01
0.1
1
10
100
Irrag
giam
ento
Spe
ttrale
Attilio Citterio
Dispositivi di Dispersione
• Dispersione non-lineare• Sensibile alla temperatura
• Dispersione lineare• Differenti ordini
Secondo ordinePrimo ordine
Reticolo
Prisma
Attilio Citterio
Dispositivo Fotomoltiplicatore
• Alta sensibilità a bassi livelli di luce
• Il materiale catodico determina sensibilità spettrale
• Buon segnale/rumore di fondo
• Sensibile agli urtiCatodo Anodo
Attilio Citterio
Il Rivelatore a Fotodiodi
• Ampio intervallo dinamico
• Rapporto segnale/rumore molto buono ad alti livelli di luce
• Dispositivo a stato solido
Contatto metallico Fotone
SiO2
Regione intrinseca
Blocco d’orostrato n
strato p
Attilio Citterio
Diagramma Schematico di un Dispositivo a Fotodiodi
• Stesse caratteristiche dei fotodiodi
• Dispositivo a stato solido
• Veloci cicli di lettura
Ciclo di lettura
Linea video
Deviatoretransistor
Registrodeviazione
Capacitore Fotodiodo
Luce
Attilio Citterio
Spettrometro Convenzionale
Sorgente
Fessura d’ingresso
Monocromatore
Dispositivodi dispersione
Fessura d’uscita
Campione
Rivelatore
Attilio Citterio
Spettrometro a “Diode Array”
Fessura d’ingresso
Campione
Sorgente
Policromatore
Dispositivodi dispersione
Batteria di diodi
Attilio Citterio
Spettrometro a “Diode Array”
Fessura Lente
Lente
Campione
Reticolo
Lampada adeuterio
Lampada aTunsteno
Shutter
Diode array a1024-elementi
Sistema ottico di uno spettrofotometro HP 8453 a “diode array”
Attilio Citterio
Spettrometro Convenzionale
Rivelatore
Campione
Riferimento
Monocromatore
SorgenteFessura d’ingresso
Dispositivodi dispersione
Fessura d’uscita
Chopper
Sistema ottico di uno spettrofotometro a doppio raggio
Attilio Citterio
Spettrometro a “Diode Array”
Cella delcampione
Cella delriferimento
Elissesorgente
Lampada visibile
Lampada UV
Specchiosorgente
Elissespettrografica
Specchi alati di cubo
Specchi alati di cubo
Reticolo olografico
UV
Visibile
Specchio orientante il raggio inferiore
Specchio orientante il raggio inferiore
Uscita Spettrografo e batteria rivelatore
Sistema ottico dello spettrofotometro a diode array HP 8450A
Attilio Citterio
Spettrometro Convenzionale
Sistema ottico di uno spettrofotometro a raggio sdoppiato
Campione Rivelatore
Riferimento
Monocromatore
SorgenteFessura d’ingresso
RivelatoreDispositivodi dispersione
Fessura d’uscita
Deviatore del raggio
Attilio Citterio
Definizione di Risoluzione
La risoluzione spettrale è una misura della capacità di uno strumento di differenziare tra due lunghezze d’onda adiacenti
lunghezza d’ondalunghezza d’onda
intensitàSegnale in uscitadal rivelatore
Smax
0.8xSmax
Attilio Citterio
Ampiezza di Banda Spettrale
La SBW è definita come l’ampiezza, a metà dell’intensità massima, della banda di luce uscente dal monocromatore
lunghezza d’onda
intensità
SBW
I
0.5 I
Attilio Citterio
Ampiezza di Banda Spettrale Naturale
La NBW è l’ampiezza della banda di assorbimento del campione a metà del massimo di assorbimento
lunghezza d’onda
assorbanza
NBW
A
0.5 A
Attilio Citterio
Effetto della SBW sulla Forma della Banda
Il rapporto SBW/NBW deve essere 0.1 o migliore per dare una misura di assorbanza con un’accuratezza del 99.5% o migliore.
lunghezza d’onda
asso
rban
za
5 nm1 nm
10 nm20 nm50 nm
Attilio Citterio
Effetto del Campionamento Digitale
Anche l’intervallo di campionamento usato per digitalizzare lo spettro per la valutazione e lo stoccaggio da parte di un computer influenza la risoluzione
lunghezza d’onda
Asso
rban
zaAs
sorb
anza
Spettrodigitalizzato
Spettrooriginale
Processo dicampionamento
Attilio Citterio
Resettabilità della Lunghezza d’Onda
Influenza della resettabilità della lunghezza d’onda sulle misure al massimo e sulla pendenza della banda di un assorbimento
lunghezza d’onda [nm]
Asso
rban
za [A
U]
Errore = 0.1 AU (10%)
Errore = 0.0 AU
220 240 260 280 3000.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Attilio Citterio
Effetto della Luce Diffusa
Effetto di vari livelli di luce diffusa sulle assorbanze misurate confrontate con le assorbanze reali
Asso
rban
za m
isura
ta
Assorbanza vera0.0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.01.5 2.5 3.5
0.0
0.5
1.5
2.5
3.5
1.0
2.0
3.0
4.00.00 % di Luce Diffusa0.01 % di Luce Diffusa0.10 % di Luce Diffusa1.00 % di Luce Diffusa
Attilio Citterio
Errore di Assorbanza Teorico
L’errore totale a qualsiasi assorbanza è la somma degli errori dovuti alla luce diffusa e al rumore di fondo (rumore dei fotoni ed elettronico)
Erro
re %
Assorbanza410.10.010.001
-25.0
-20.0
-15.0
-10.0
-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
Curva dell’errore da luce diffusaCurva ’errore luce diffusa + noiseCurva errore luce diffusa - noise
Attilio Citterio
Effetto del Drift
Il drift è una potenziale causa di errore fotometrico e deriva dalle variazioni tra le misure di I0 e I
lunghezza d’onda [nm]
Asso
rban
za [A
U]Errore
220 240 260 280 300230 250 270 290 310 3200.00
0.05
0.15
0.10
0.20
Attilio Citterio
Caratteristiche di Trasmissione dei Materiali di Cella
Notare che tutti i materiali mostrano approssimativamente almeno il 10% di perdita nella trasmittanza a tutte le lunghezze d’onda.
lunghezza d’onda [nm]
Tras
mitta
nza
[%]
200 300250 350 400
20
0
40
60
80
100Silice fusa
Quarzofuso
Plasticaacrilica
Vetro
Vetroottico
Attilio Citterio
Tipi di Celle 1
Cella Standard rettangolare aperta in testa (a) e cella con apertura (b) per volumi limitati di campione
(a) (b)
Attilio Citterio
Tipi di Celle (II)
Micro cella (a) per volumi molto piccoli e cella a flusso (b) per applicazioni automatizzate
(a) (b)
Attilio Citterio
Effetto dell’Indice di Rifrazione
Variazioni nelle misure dell’indice di rifrazione del riferimento e del campione possono causare misure sbagliate di assorbanza
RivelatoreCampione
Luce non rivelata
(b) Raggio focalizzato
(b) Raggio collimato
Attilio Citterio
Geometria non Planare del Campione
Alcuni campioni possono agire come componenti ottici attivi nel sistema e deviare o defocalizzare il raggio luminoso
Campione planare Campione “inclinato”
RivelatoreRivelatore
Area fotosensibile
Attilio Citterio
Effetto del Tempo di Integrazione
Mediare i dati raccolti riduce il rumore di fondo della radice quadrata del numero dei punti mediati
lunghezza d’onda [nm]
Asso
rban
za [A
U]As
sorb
anza
[AU]
S/N = 18
16 sec
0.1 sec
S/N = 5.5± 0.00013 AU
± 0.00004 AU
450 500 550 6000.00000.00020.00040.00060.0008
0.00000.00020.00040.00060.0008
Attilio Citterio
Effetto della Media sulle Lunghezze d’Onda
• Mediare le lunghezze d’onda riduce anche il rumore (della radice quadrata dei punti raccolti)
• L’ampiezza del segnale viene influenzata
lunghezza d’onda
Asso
rban
za
Asso
rban
zaNBW Intervallo
ottimale
# dei punti
S/NSegnaleRumore
Attilio Citterio
Aumento dell’Intervallo Dinamico
La scelta di una lunghezza d’onda nella pendenza di una banda di assorbimento può aumentare l’intervallo dinamico ed evitare la preparazione del campione come la diluizione
lunghezza d’onda
Asso
rban
za [A
U]
Concentrazione mg/ml
Asso
rban
za
Misu
rata
[AU]
200 250 300 0.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0.5
1.0
1.5
266 nm
241 nm
0.1428 mg/mlspironolattone
0.1 0.2 0.3 0.4
Attilio Citterio
Diffusione
La dispersione causa un assorbanza apparente in quanto meno luce raggiunge il rivelatore
Rivelatore
Rivelatore
Campione che diffonde
Campione trasparente
Attilio Citterio
Spettri Diffusi
• Diffusione di Rayleigh : Particelle piccole rispetto alla lunghezza d’onda• Diffusione di Tyndall : Particelle grandi rispetto alla lunghezza d’onda
lunghezza d’onda [nm]
Asso
rban
za [A
U] Diffusione di RayleighDiffusione di Tyndal
200 300 400 500 600 700 8000.0
0.2
0.4
0.6
08
1.0
Attilio Citterio
Correzioni per Isoassorbanza
L’assorbanza alla lunghezza d’onda di riferimento deve essere equivalente all’interferenza alla lunghezza d’onda analitica
lunghezza d’onda [nm]
Asso
rban
za [A
U]
5004504003503002502000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
A2
A1 A1 A1 =A1 – A2
1
1
Spettro analitaSpettro interferenteSpettro misurato
Attilio Citterio
Modellizzazione del Fondo
Si può eseguire la modellizzazione del fondo se l’interferenza è dovuta ad un processo fisico
lunghezza d’onda [nm]
Asso
rban
za [A
U]
5004504003503002502000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
A1AC AC = A1 – A5
A5
Spettro misurato
Spettro diffuso estrapoato
Intervallo del modello
1
Attilio Citterio
Riferimenti Interni
Corregge per la costante absorbanza del fondo su un intervallo
lunghezza d’onda [nm]
Asso
rban
za [A
U]
220 240 260 280 300230 250 270 290 310 3200.00
0.05
0.15
0.10
0.20
A1a ≠ A1
b A2a ≠ A2
b
1
2
Spettro aSpettro b
Attilio Citterio
Correzione a Tre Punti
• Uses two reference wavelengths• Corrects for sloped linear background absorbance
Asso
rban
za [A
U]
lunghezza d’onda [nm]500450400350300250200
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
A1AC AC = A1 – A5
1
2
3
A3A1A2
Spettromisurato
Attilio Citterio
Discriminazione delle Bande Larghe
• Le derivate possono eliminare l’assorbimento di fondo• Le derivate discriminano rispetto alle ampie bande di absorbanza
lunghezza d’onda [nm]400 500 600
Derivata seconda
-0.010
-0.005
0.000
0.005-0.005
0.000
0.0050.0
0.5
1.0
Derivata prima
Assorbanza
Attilio Citterio
Correzione della Diffusione per Spettroscopia Derivata
La diffusione è discriminata come una banda ampia di assorbanza
lunghezza d’onda [nm]400 600 700
Derivata prima
Assorbanza [AU]
500300
-0.01
0.00
0.01
0.0
0.5
1.0 Spettro misuratoSpettro reale
Attilio Citterio
Effetto della Fluorescenza
La luce emessa da un campione fluorescente causa un errore nella misura dell’assorbanza
Lunghezza d’onda [nm]
Asso
rban
za [A
U]Lunghezza d’onda
di eccitazione
Lunghezza d’ondadi emissione
Spettro misurato con ottica inversa
Spettro misurato con ottica diretta
Spettro di assorbanza vera
200 250 500 350 400 450 500 550 6000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Attilio Citterio
Angoli di Accettazione e Grandezza dell’Errore di Fluorescenza
• Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d’onda di eccitazione sono troppo basse• Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d’onda di emissione sono troppo basse
Rivelatore
Rivelatore
FendituraOttica inversa
Ottica diretta
Attilio Citterio
Calibrazione Inadeguata
• Teoricamente si richiede solo uno standard per calibrare• In pratica, deviazioni dalla legge di Beer possono causare risultare sbagliati
Concentrazione Concentrazione
Asso
rban
za [A
U]
Asso
rban
za [A
U]
0.000.25
0.50
0.751.001.251.501.75
0 5 10 15 0 5 10 150.000.25
0.50
0.751.001.251.501.75
Possibile risultato di quantificazione
Curve di calibrazione possibilmente vere
Assorbanza del campione misurata
Concentrazione nota dello standard
Assorbanza misurata dello standard
Attilio Citterio
Insieme di Dati di Calibrazione
• Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d’onda di eccitazione sono troppo basse• Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d’onda di emissione sono troppo basse
Asso
rban
za [A
U]
Concentrazione
0.50
1.00
1.50
0.00
0.50
1.00
1.50
0.000 5 1510 0 5 1510
Asso
rban
za [A
U]
Concentrazione
Attilio Citterio
Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Linearità
• Una curva lineare di calibrazione è calcolata ad ogni lunghezza d’onda
• Il coefficiente di correlazione da una stima della linearità
Lunghezza d’onda [nm]200 300 400 500Co
effici
ente
di co
ncen
trazio
ne
0.9900.9920.9940.9960.998
Asso
rban
za [A
U]
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
Intervalloottimale
Attilio Citterio
Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Accuratezza
• I risultati di quantificazione sono are calcolati ad ogni lunghezza d’onda• Le concentrazioni calcolate danno una stima dell’accuratezza
Lunghezza d’onda [nm]200 300 400 500
Asso
rban
za [A
U]
0.0
0.4Co
ncen
trazio
ne
0.2
0.6
0.8
7.08.0
9.0
10.0
11.0Concentrazione misurataConcentrazione vera
Intervalloottimale
Attilio Citterio
Precisione di una Analisi
La precisione di un metodo è il grado di accordo tra I singoli risultati delle prove quando si applica ripetutamente la procedura a campionamenti multipli
Numero di misure
Valor
e [m
g/m
l]
Media = 1.41 mg/mlDeviazione standard = 0.022 mg/ml
2 4 6 8 10
31.36
31.38
31.40
31.42
31.44
Attilio Citterio
Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Sensibilità
• Il calcolo della deviazione standard relativa dei valori misurati ad ogni lunghezza d’onda
• La lunghezza d’onda con la RSD % inferiore possibilmente fornirà la migliore sensibilità
Lunghezza d’onda [nm]200 300 400 500
Asso
rban
za [A
U]
0.00
0.100.05
0.150.200.25
0.00.20.40.60.81.0
% R
SD Intervalloottimale
Attilio Citterio
Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Selettività
La selettività è l’abilità di un metodo a quantificare accuratamente e specificamente l’analita o analiti in presenza di altri composti
Lunghezza d’onda [nm]200 300 400 500
Asso
rban
za [A
U]
0.0
0.4
Conc
entra
zione
[mg/m
l]
0.2
0.60.8
5
10
15
20Concentrazione misurataConcentrazione vera Intervallo
ottimale
Attilio Citterio
Assorbanza Ideale e Standard di Lunghezza d’Onda
• Uno standard ideale di assorbanza dovrebbe avere una assorbanza costante a tutte le lunghezze d’onda
• Uno standard ideale di lunghezza d’onda dovrebbe avere picchi molto stretti e ben-definiti
Lunghezza d’onda [nm]200
Asso
rban
za [A
U]
250 200 350 400 450 500 550 600 700 8000.0
0.2
0.4
0.06
0.8Standard di assorbanza
Standard di lunghezza d’onda
Attilio Citterio
Filtro Ideale per Luce Diffusa
Un filtro ideale di luce diffusa dovrebbe trasmettere tutte le lunghezze d’onda eccetto quelle usate per misurare la luce diffusa
Lunghezza d’onda [nm]200
Tras
mitta
nza
[AU]
250 300 350 400 450 500 600 7000
20
40
60
80
100
Attilio Citterio
Soluzione di Perclorato di Olmio
Il più comune standard per l’accuratezza della lunghezza d’onda è il perclorato di olmio
Lunghezza d’onda [nm]200
Asso
rban
za [A
U]
400300 500 600 8000
0.2
0.4
0.6
0.8
Attilio Citterio
Soluzione di Dicromato di Potassio
Lo standard di accuratezza fotometrica richiesto da molte farmacopee è una soluzione di bicromato di potassio
Lunghezza d’onda [nm]200
Asso
rban
za [A
U]
250 300 350 500 6000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
400 450 550
350 nm
257 nm235 nm
313 nm
Attilio Citterio
Soluzioni Standard per Luce Diffusa
I più comuni standard per luce diffusa e le rispettive lunghezze d’onda usate
Lunghezza d’onda [nm]200
Tras
mitta
nza
[AU]
250 300 350 500 700400 450 6000
20
40
60
80
100 KCl200 nm
NaI220 nm
NaNO2340 nm
Attilio Citterio
Toluene in Esano (0.02% v/v)
La risoluzione è stimata prendendo il rapporto dell’assorbanza del massimo vicino a 269 nm e il minimo vicino a 266 nm.
Lunghezza d’onda [nm]258
Asso
rban
za [A
U]
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
260 262 264 266 268 270 272 274 276
Picco – 0.442 AU
Valle – 0. 275 AU
Rapporto – 1.61
Attilio Citterio
Analisi di Conferma
Nell’analisi di conferma, si usa l’assorbanza ad una o più ulteriori lunghezze d’onda per quantificare un campione
Lunghezza d’onda [nm]250
Asso
rban
za [A
U]
260 270 280 310290 300 3200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Acido salicilico
284 nm274 nm264 nm
Caffeina
Attilio Citterio
Similarità Spettrale
Grafici comparativi di spettri simili e dissimili
Lunghezza d’onda [nm]250 300 350 400
0.0
0.20.40.60.81.0
Norm
alizz
atoNo
rmali
zzato
Lunghezza d’onda [nm]0.0
0.20.40.60.81.0
Incognito
250 300
Stan
dard
[AU]
Stan
dard
[AU]
Incognito [mAU]
Incognito [mAU]0.0 0.1 0.2 0.3
0.0 0.5 1.0 1.5
Correlazione = 0.056
0.0
0.1
0.2
0.3
0.0
0.1
0.2
0.3Correlazione = 0.999
Incognito
Standard
Standard
Attilio Citterio
Precisione e Accuratezza
Precisione – Precisione + Precisione – Precisione +Accuratezza – Accuratezza – Accuratezza + Accuratezza +
Attilio Citterio
Uso dell’UVCinetica dell’Idrolisi del Sultone
Lunghezza d’onda [nm]
Ass
orba
nza
[AU
]
Attilio Citterio
Spettrometro Convenzionale
La geometria più semplice si trova negli strumenti a singolo raggio. Per effettuare la misura, si introduce prima il bianco e se ne misura la Io . Quindi si introduce il campione (utilizzando la stessa cuvetta) e se ne misura la I, e lo strumento ne calcola a scelta la trasmittanza o l’assorbanza.
Gli strumenti a raggio singolo sono poco costosi, hanno alta resa luminosa, e perciò alta sensibilità, a causa della semplicità del sistema. Lo svantaggio sta nel tempo che deve intercorrere tra le due misure e nell’aumento dei problemi di deriva.
Sorgente
Fenditurad’ingresso
Dipsositivo didispersione
Monocromatore
Fenditurad’uscita
Campione
Rivelatore
Attilio Citterio
Rivelazione Spettrofotometricaa “diode array”
Un rivelatore spettrofotometrico a “diode-array” usa una batteria di rivelatori e una configurazione ottica “inversa”, con il dispositivo di dispersione collocato dopo il campione. Si ha il vantaggio che solo la luce passante sull’asse dalla sorgente alla fenditura prima del dispositivo di dispersione raggiunge il rivelatore; la luce avente altri angoli viene scartata. Così la luce ambiente non interferisce e si può lasciare aperta la zona del campione, rendendo il sistema più facile da utilizzare e versatile.
La luce di tutte le lunghezze d’onda colpiscono il “diode-array” e sono misurate simultaneamente. Lo spettro si recupera per scansione elettronica della batteria. In principio, gli spettrofotometri a “diode-array” possono avere una geometria a raggio singolo o doppio ma, in pratica, i vantaggi dei primi si combina bene con il rivelatore a “diode-array”.Sorgente
Policromatore
Dispositivo didispersione
Campione
Fessurad’ingresso
batteria di diodi