cours phytoremediation

PHYTOREMEDIATION DES METAUX

Laurence MARQUES Université Montpellier 2

FLBI455

A- Les caractéristiques de la pollution métallique

B- Bases de la physiologie des métaux chez les plantes

C- La phytoremédiation

C1- la phytostabilisation

exemple du projet européen Difpolmine dans l’Aude

C2- la phytovolatilisation

C3- la phytodégradation

C4- la phytoextraction

les plantes hyperaccumulatrices de métaux

les limites

la recherche

D- Deux exemples approfondis de physiologie des métaux

D1- la tolérance à l’aluminium

D2- la tolérance au cadmium

LE STRESS METALLIQUE EST UN STRESS ABIOTIQUE

Heavy metals

UV

Laurence Marquès UM2

Contact cutané

Ingestion

directe

Alimentationanimale

Alimentation

végétale

Eau

Poisson

Ingestion/conta

ct cutané

Inhalaltion,

vapeur,

poussière

LA POLLUTION METALLIQUE DES SOLS EST UN

PROBLEME DE SANTE PUBLIQUE


POLLUTION INORGANIQUE :

engrais (nitrate, phosphate)

métaux (Cd, As, Hg, Pb, Ni, Zn)

et radioéléments

POLLUTION ORGANIQUE :

hydrocarbures

solvants chlorés

pesticides

composés nitrés

LES CONTAMINANTS MAJEURS DES SOLS

Nriagu, 1996, Science

1940

1910


3Cd

Autres

Solvants

Metaux

Hydrocarbures

Polluants dans les

nappes phréatiques

15,6

7,5

4Ni

5,4As

6Cu

6,6Cr

7,5Zn

9Pb

35,4

Répartition (%)

ORIGINE DE LA CONTAMINATION DIFFUSE DES SOLS ET DE

L’EAU EN FRANCE

Rapport de l'Académie des sciences n°42, Août 1998

http://www.senat.fr/rap/l00-261/l00-26182


LES METAUX ET LA BIOLOGIE

Cr, Al, As, Cd, Hg, Pb SONT NON-ESSENTIELS et TOXIQUES

Fe, Zn, Mg, Mn, Cu… sont ESSENTIELS mais peuvent devenir TOXIQUES lorsqu’ils

sont présents en excès

Relativement faible DISPONIBILITE des métaux du sol pour les plantes car les

ions (petites molécules chargées) ne peuvent pas traverser les membranes

biologiques par simple diffusion.


Exemple du fer

Excès Symptomes de « bronzing »

Carencesymptomes de chlorose

L’homéostasie des métaux doit être finement contrôlée pour éviter les effets

délétères.


NE MARCHE PAS ….

LA POLLUTION METALLIQUE EST UNE POLLUTION TERMINALE

DEUX SOLUTIONS POSSIBLES :

DILUTIONDILUTION

ou

CONCENTRATION et CONFINEMENTCONCENTRATION et CONFINEMENT


Pollution des sols par les métaux lourds

Pression forte sur

les végétauxProblèmes socio-

économiques Problème de santé

publiqueRéduction de

biodiversité

Sélection de végétaux

tolérants et/ou hyperaccumulateurs


Zn contamination Zn, Cd and Pb contamination

Ancien bassin de décantation à St Laurent-le-Minier (34)

Thlaspi caerulescens: petite brassicacée hyperaccumultrice de Zn et de Cd


LES IONS METALLIQUES DANS LES PLANTES

Redistribution/ Stockage

transporteurs transmembranaires: INFLUX

chélateurs

Translocation

transporteurs transmembranaires: EFFLUX

chélateurs

Absorption

--> transporteurs transmembranaires: INFLUX


Transporteurs de métaux identifiés chez les plantes

(Clemens S. (2001) Planta, 212:475-486)

famille CDF

famille ZIP

famille NRAMP

Antiport

cations/H+

ATPases

type-P

ATPases ABC

Influx : entrée dans le cytoplasme

Efflux : sortie du cytoplasme (vers l’apoplasme ou les compartiments intracellulaires)


Les chélateurs connus pour jouer un rôle dans la tolérance auxmétaux: détoxification et stockage

Acides organiques: citrate, malate, oxalate (Al, sève brute)

Acides aminés: histidine (Ni)

Nicotianamine (Ni)

Phytochelatines (Cd, vacuole)

Metallothionines (Zn, Cu, cytoplasme)


PHYTOREMEDIATION : « FROM GREEN TO CLEAN »

La remédiation physique et chimique des sols contaminés par les métaux lourds

est un procédé lourd et très chers ( plus de 1.5 M / ha).

Les racines explorent de grands

volumes de sols

Les plantes utilisent l’énergie

solaire pour pomper les métaux


PHYTODEGRADATIONPHYTODEGRADATION

PHYTOSTABILISATIONPHYTOSTABILISATION

PHYTOVOLATILISATIONPHYTOVOLATILISATION

PHYTOEXTRACTIONPHYTOEXTRACTION

SHOOTS

=

solar-driven pump

RHIZOSPHERE

(roots + microbes)

=

sensor + extractoruptake

. ..... .. ... .

...

. .

..... .

..

.

. .

.... ..

leaching

dust =air pollution herbivory = food chain entrance

ground water pollution

Pb

Pb

TNT

Zn

Zn

Zn

Se


PHYTOREMEDIATION :

un ensemble de technologies vertes et durables

PHYTOSTABILISATIONPHYTOSTABILISATION

SHOOTS

=

solar-driven pump

RHIZOSPHERE

(roots + microbes)

=

sensor + extractor

. ..... .. ... .

... .

..... .

..

.

.

. ..

leaching



Pb

Pb

TNT

PHYTOREMEDIATION :



OBJECTIF:OBJECTIF:

Utilisation des Utilisation des plantes plantes pour pour éviter éviter la la dispersion de la pollutiondispersion de la pollution

CARACTERISTIQUES:CARACTERISTIQUES:

Efficace Efficace pour pour prévenir prévenir le le lessivage vers lessivage vers les zones non les zones non polluéespolluées

Efficace contre lEfficace contre l’é’érosion éoliennerosion éolienne

Les Les espèces choisies doivent espèces choisies doivent posséder posséder un un système racinaire étendusystème racinaire étendu, , êtreêtre

tolérantes tolérantes aux aux métaux mais métaux mais non non accumulatricesaccumulatrices pour pour éviter léviter l’’entréeentrée

dans dans la la chaine alimentairechaine alimentaire

LIMITES:LIMITES:

La pollution La pollution est toujours présenteest toujours présente

Survie Survie des des plantesplantes

PHYTOSTABILISATION


Plantations de peupliers

IRD New Caledonia

Espèces endémiques

Réalisations


Le site de la Combe du Saut à Salsignes (Aude)

Ancienne mine d’or, ce site est fortement pollué par l’arsenic,

une pollution endémique fortement aggravée par l’exploitation

de la mine d’or

Usine metaleurope en 2002

2006Laurence Marquès UM2

Eau potable :

10 µg / l

0,01 ppm

Concentration dans les sols en surface Ruisellement à la Combe du Saut

Concentration dans les eaux de ruissellement


Le projet européen Difpolmine


Amendement = grenaille de fer Deux parcelles d’essai

avec sans

grenaille

Légumineuse et graminée utilisées pour le repeuplement


Vue aérienne dusite en 2006

Image numériquede la maquettedu projet


PHYTODEGRADATIONPHYTODEGRADATION

SHOOTS

=

solar-driven pump

RHIZOSPHERE

(roots + microbes)

=

sensor + extractor

. ..... .. ... .

...

. .

..... .

..

.

.

.... ..

leaching



TNT


PHYTOREMEDIATION :


PHYTODEGRADATION

AIM: Transform pollutants into non toxic products

CHARACTERISTICS:CHARACTERISTICS:

Phytodegradation is the technology of choice to remediate

organic pollutionorganic pollution

A cleaning up of the site is achieved

Both plant cells and rhizospheric microbes participate to the

degradation

LIMIT:LIMIT:

METALS CANNOT BE PHYTODEGRADATED


PHYTOVOLATILISATIONPHYTOVOLATILISATION

SHOOTS

=

solar-driven pump

RHIZOSPHERE

(roots + microbes)

=

sensor + extractor

. ..... .. ... .

...

. .

..... .

..

.

.

.... ..

leaching



Se

PHYTOVOLATILISATIONPHYTOVOLATILISATION Se


PHYTOREMEDIATION :


AIM: Dilute pollutant in the atmosphere


Plants can naturally volatilize Se : DMSe is volatil

Microbes can naturally volatilize Se and Hg: Hg0 is volatil

Cleaning up of the site is achieved

LIMIT:LIMIT:

Se and Hg are the only metals that can be volatilized

PHYTOVOLATILIZATION


Exemple de la raffinerie de pétrole Chevron à Richmond (Californie)::

le marais phytovolatilise 89% du Se relargué par la raffinerie.

http://epics.ecn.purdue.edu

Construction de marais artificiels


Phytovolatilisation du sélénium

(Terry N, Plant Physiol., 1999, 119, 565)

Le Se est métabolisé par les enzymes de la voied’assimilation du sulfate.Il se forme de la SeMet qui peut être méthylée enDMSe VOLATIL.

Les marais sont des biotopes dans lesquels le Se estnaturellement fortement volatilisé

MODELE DE PRELEVEMENT ETMETABOLISATION DU Se

ROLE DES BACTERIES DANS L’ACCUMULATION DU Se PAR LES PLANTES

Axenic Plus bacteria

No Se

20 µM Se


PGM et nouveaux procédés de remédiation

Hg(II) toxique

merA protéine bactérienne

Hg0 VOLATILE et moins toxique

Problème de la dissémination des PGMs…


PHYTOEXTRACTIONPHYTOEXTRACTION

SHOOTS

=

solar-driven pump

RHIZOSPHERE

(roots + microbes)

=

sensor + extractoruptake

. ..... .. ... .

...

. .

..... .

..

.

. .

. ..

leaching



Zn

Zn

Zn


PHYTOREMEDIATION :


PHYTOEXTRACTION


It does not transform the pollutant

Use in the case of terminal pollution as

metallic pollution

It needs TRANSLOCATIONTRANSLOCATION from root to

shoot what is a great limiting factor

AIM: AIM: ExtractionExtraction of the pollutant from the soil using the of the pollutant from the soil using the solar-drivensolar-driven

forceforce andand concentrationconcentration in aerial harvestable part of the plantin aerial harvestable part of the plant


Niemeyera (Sebertia) acuminata

20% de nickel en poids secs dans la sève !

LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE METAUX

« Le sève bleue »


Arabidopsis halleri : zone urbaine près de l’ancienne usine Metaleurope à

Auby (59), hyperaccumulateur de Zn et Cd



Ancien bassin de décantation à St Laurent-le-Minier (34)

Thlaspi caerulescens: petite brassicacée hyperaccumulatrice de Zn, de Ni et de Cd



LES PLANTES HYPERACCUMULATRICES DE MÉTAUX

Accumulation dans les partiesaériennes : jusqu’à plusieurs % / gMS sans effet néfaste

Augmentation de la translocation

Augmentation de l’absorptionracinaire

Hyperaccumulation:

teneur foliaire > teneur racinaire


Whiting et al., New Phytol., 2000

Homogeneous Zn pollution No pollution Zn pollution

Exploration du sol par les racines

Thlaspi caerulescens


Différences de prélèvements racinaires entre

T. arvense et T. caerulescens

Complémentation fonctionnelle

du transport de zinc dans le

mutant de levure zrt1zrt2 (zhy3)

par TcZNT1.

Expression transcriptionnelle de ZNT1

Pence et al., 2000, PNAS, 97, 4956

Clonage d’un transporteur de zinc impliqué dans le

prélèvement accru de ce métal chez T. caerulescens

Répartition racine / parties aériennes des métaux

Thlaspi arvense

plante non hyperaccumulatrice


hyperaccumulateur de Ni

Teneur en Ni de plantes cultivées sur 10 µM NiSO4

ROOT

SHOOT

ROOT

SHOOT

5% 89%


Localisation subcellulaire du zinc chez TT. caerulescens

MEB après cryofixation et EDXMA

--> La localisation subcellulaire des métaux est très délicate car les

ions métalliques sont très mobiles dans les tissus.

L’hyperaccumulation est apparue à plusieurs reprises dansdifférentes familles botaniques


Baker and Brooks (1989) Biorecovery 1 81-126

LIMITE = LA NOTION DE BIOCONCENTRATION

Bioconcentration factor (BCF) = shoot [metal] / soil [metal]

Model calculation from McGrath and Zhao,Curr Opin Biotechnol, 2003

HYPERACCUMULATION ET BIOMASSE SONT TOUTES DEUX NECESSAIRES

Nombre de récoltes

requises pour diminuer de

moitié la concentration en

métal dans 20 cm de sol

Plant biomass (t.ha-1)


Hyperaccumulateurs

Non-accumulateurs

Zinc absorbé

(kg/ha)

Nombre de

récoltes

Nombre de récoltes pour passer de 444 à 300 mg zinc/kg sol (norme NF U 44-041)(Baker et al., 1995)


Arabidopsis halleri

Alyssum lesbiacum

Brassica napus

Raphanus sativus

30,1

10,3

3,9

0,5

0,2

37

96

832

2046

13

…


LE VERROU BIOLOGIQUE:

FORTE BIOMASSE

FAIBLE TRANSLOCATION

TRES FAIBLE BIOMASSE

FORTE TRANSLOCATION

Brassica napus : colza


Nombre de récoltes requises

pour diminuer la teneur du sol

de 444 à 300 mg Zn.kg-1

(norme NF U 44-041)

832 15


COMMENT OBTENIR DES PLANTES ADAPTEES ACOMMENT OBTENIR DES PLANTES ADAPTEES A

LA PHYTOEXTRACTION ?LA PHYTOEXTRACTION ?

- EXPLOITATION DE LA BIODIVERSITE

- GENETIQUE

- BIOTECHNOLOGIE: recherche fondamentale et PGM


Ma et al, Nature, 2001

EXPLOITATION DE LA BIODIVERSITE


GENETIQUE QUANTITATIVE

LD70,2

At4-GA281,0

ZnT

ol Q

TL3

Mt2b0,0

At5g0816013,1

AthCDPK935,8H937,7

AthDET150,0

MTP1-B53,6

AGG/CT-8062,6

RESULTS:RESULTS:

tolerance and hyperaccumulation are two

distinct genetic traits (McNair, 1999 )

QTL analyses; marker assisted selection

0

2

4

6

AIMAIM:: Identification and selection of metal Identification and selection of metal

tolerance and/or tolerance and/or hyperaccumulation hyperaccumulation traitstraits

A. halleri A. lyrata

P. Saumitou-Laprade, Lille


La surexpression de la nicotianamine synthase confère une forte

tolérance au Ni

Col

35S-TcNAS

Col

O ppm 70 ppm 700 ppm 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 ppm 70 ppm 700 ppm N

i c

on

ten

t (m

g/g

DW

)

Col

35S-TcNAS Col

Pianelli et al., 2005, Transgenic Research.

BIOTECHNOLOGIE: utilisation de PGM

--> validation de cibles


SOLUTIONS FOR MULTI-METALLIC POLLUTION EXIST

Transgenic Indian mustards

overexpressing -ECS display

increased metal tolerance and

shoot accumulation for Cd, Cr,

Cu, Pb and Zn

Plants are grown on aged polluted soil containing

mixture of metals

APS = adenosine triphosphate sulfurylase

GS = glutathione synthase

-ECS = -glutamylcysteine synthase

Nature 395, 553 - 554 (1998)

Harvesting a crop of gold in plants

CHRISTOPHER W. N. ANDERSON*, ROBERT R. BROOKS*, ROBERT B. STEWART* &ROBYN SIMCOCK†

US PATENTSChaney, 1998, Method for phytomining of nickel, cobalt and other metals from soil, US Patent 5711784

La toxicité aluminiqueL’Al est le troisième élément le plus abondant sur terre. En solsacides la forme Al3+ très phytotoxique domine. Ces solsreprésentent 40% des terres arables (+ acidification suite àl’utilisation excessive d’engrais).

Au niveau cellulaire, des concentrations symplastiques del’ordre du nmol sont toxiques car Al3+ à une constanted’affinité pour l’ATP 107 fois plus importante que Mg2+.

La constante de stabilité des complexes Al3+ -acidesorganiques est encore plus forte que celle de l’ATP et permetdonc de chélater efficacement l’Al3+ .

Pour la racine en croissance la toxicité est très forte auniveau de l’apex racinaire.

•Réponse spécifique de Al.

*Le sarrasin résiste à l’aluminium

en protégeant l’apex racinaire par

sécrétion d’acide oxalique: ce

mécanisme est commun à toutes

les plantes résistantes à l’Al, seul le

type d’acide varie.

* Le sarrasin accumule de l’Al dans

ses parties aériennes. La forme

complexée avec l’acide oxalique est

une forme non toxique accumulée

dans les feuilles.

Nature (1997), 390, 569

Detoxifying aluminium with buckwheatMa et al.

Les différents acides organiques qui détoxifient l’Al

Coloration de l’Al dans les

apex racinaires

Modèle de sécrétion d’acides organiques par les racinesen réponse à l’Al

Prélèvement, transport et stockage de l’Al chez le sarrasin:différents ligands organiques interviennent

0 75 200 1000µM Al3+

(de la Fuente J. M. et al. (1997) Science 276: 1566-1568)

La résistance à l’aluminium est contrôlée parl’excrétion d’acide organique par l’apex racinaire

La surexpression de citrate synthase confère une résistance aluminique au tabac et à la papaye

con

trô

leC

Sb

Papaye transgénique et témoin cultivées sur

aluminium

Phytochelatin synthase (Grill, 1989): en présence de Cd, Ag, Bi, Pb, Zn, Cu, Hg, Au:

-Glutamylcystéine synthase

Glutamate + cystéine + ATP ---> -glutamylcystéine + ADP + Pi

Glutathion synthase

-glutamylcystéine + glycine + ATP ---> glutathion + ADP + Pi

La résistance au cadmium

Plant Physiol. (1992) 100, 100

Cadmium-sensitive Mutants of Arabidopsis thalianaHowden R and Cobbet S

- 15000 M2 (mutagénèse EMS) criblées pour la sensibilité au cadmium dans un test de croissanceracinaire.- 120 mutants isolés.- 2 mutants confirmés.- 1 seul locus cad1

•mutation récessive

•pas d’effet maternel

•ségrégation 3:1 : locus mendélien

unique

•le croisement entre les deux mutants

montre que les deux mutations sont

alléliques.

Plant Physiol. (1995) 107, 1067

A Cadmium-Sensitive, Glutathione-Deficient Mutant ofArabidopsis thalianaHowden R et al.

-20000 M2 (mutagénèse aux rayons X) criblées pour lasensibilité au Cd dans un test de brunissement racinaire

- 1 mutant identifié cad2

Glutathion -Cd +Cd

Wild type 231 154cad2-1 41 30cad1-1 225 567

Plant Physiol. (1995) 107, 1059

Cadmium-sensitive, cad1 Mutants of Arabidopsis thaliana ArePhytochelatin DeficientHowden R et al.

Total PCs

Cd (µM) Wild type cad2-1 cad1-1

0 5 1 5 30 150 16 37

Le locus CAD2 =la -Glutamylcystéine synthase

Strain Cystéine(nmol g-1 DW)

GC(nmol g-1

DW)

GSH

(µmol g-1DW)

GCS(nmol min-1 mg-1

protein)

WT 111 64 3 0,8

cad2 234 21 1,3 0,3

pBI-GSHA 122 160 5,5 1,8

pBI101 223 24 1,3 0,3

Cartographie RFLP du locus CAD2

Caractérisation biochimique des plantes

Plant J, 1998, 16, 73

Le locus CAD1 = la phytochelatin synthase

Cette enzyme avait été caractérisée biochimiquement en 1989mais pendant dix ans personne n’avait pu cloner le gènecorrespondant.

En 1999, trois équipes publient simultanément le clonage pardes approches toutes différentes

cartographie du locus CAD1 par RFLP

un gène inconnu identifié

le séquencage dans les différents mutants cad1 donne des

mutations ponctuelles

complémentation du mutant cad1-3 par le locus CAD

sauvage: ça marche!

expression dans E. coli donne une enzyme fonctionnelle

capable de synthétiser des PCs.

pas de régulation transcriptionnelle par le Cd

1- Equipe de Cobbett Plant Cell (1999) 11, 1153

2-Equipe de Schroeder EMBO J (1999), 18, 3325

transformation de S. cerevisiae par une banque de cDNA

de racines de blé et criblage pour la résistance au cadmium

accumulation de Cd2+ dans les levures transformées

purification de la protéine correspondante

la protéine correspondante à une activité catalytique

produisant des PC2 à partir de milieu contenant du Cd et du

GSH

3- Equipe de Ph. Rea PNAS (1999), 96, 7110

transformation du mutant de levure yap1 par une banque

cDNA d’A. thaliana, criblage sur des milieux toxiques en

Cd et retransformation dans le mutant ycf1 pour les

plasmides conférant tjrs une résistance au Cd

clonage d’un cDNA

purification de la protéine correspondante

démonstration de l’activité catalytique de l’enzyme:

production de PC à partir de GSH en présence de Cd

Mécanismes de détoxication du cadmium par les phytochélatines

cours phytoremediation

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