crispr- cas technologie : mogelijkheden en grenzen...crispr-cas 9 en andere … • targets rna •...
TRANSCRIPT
![Page 1: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/1.jpg)
CRISPR- Cas technologie :
mogelijkheden en grenzen
Katia Pauwels, Ph.D.
Sciensano – Dienst Bioveiligheid en Biotechnologie (SBB)
![Page 2: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/2.jpg)
Dienst Bioveiligheid en Biotechnologie (SBB)
Beoordeling van risico’s voor de menselijke gezondheid en het leefmilieu bij activiteiten met
genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) en/of pathogenen
in de handel brengen
INFORMATIE
INP
ER
KIN
G
R&D, preklinische studies
Klinische proeven,
veldproeven
www.biosafety.be
![Page 3: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/3.jpg)
Naar een ‘doelgerichte’ modificatie
Conventionele Mutagenese
(virale) vectoren voor integratie van (soortvreemde) genetisch materiaal
3200 plantevariëteitenwaaronder 214 plantensoorten
Ad random locatie Doelgerichte locatie
Site-gerichte nucleases
vb CRISPR-Cas
+ selectie, en terugkruising bij planten
![Page 4: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/4.jpg)
Naar een ‘doelgerichte’ modificatie (2)
…The ability to introduce targeted, tailored
changes into the genomes of several species
will make it feasible to ask more precise
biological questions…..
Gene-editing nucleases will achieve their full
potential when they can be easily and quickly
designed…..
Nature Methods, Vol 9 (1) January 2012
• Meganucleases (MN)
• ZincFinger nuceases (ZFNs)
• Transcriptor Activator Like Effector Nucleases(TALENs)
Method of the year - 2011
![Page 5: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/5.jpg)
Inhoud
• Wat is CRISPR-Cas ?
• Hoe werken gene-editing nucleases ?
• Waarom is CRISPR-Cas baanbrekend ?
• Mogelijke risico’s ?
• Welke toepassingen ?
• Mogelijkheden voor de geneeskunde ?
• Welke regelgeving is voorhanden? Hiaten ? Beperkingen ?
• Welke debatten (dienen te) worden gevoerd?
![Page 6: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/6.jpg)
Wat is CRISPR- Cas ?
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)
and CRISPR-associated System (CAS)
Adapted from Soppe & Lebbink, Trends in Microbiology, 2017
![Page 7: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/7.jpg)
Wat is CRISPR- Cas ? (2)
RNA chimera
PAMTarget DNA
5’ 3’3’ 5’
3’
5’
Cas9crRNA tracrRNA
Adapted from Carroll, Mol Ther 2012; 20(9)
The CRISPR minimal-cleavage elements
Cas9 is een ‘RNA-guided’ nuclease, een gene-editing nuclease
met een werkingsmechanisme dat vergelijkbaar is met deze van
Zinc-Finger nucleases, TALENs and meganucleases
![Page 8: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/8.jpg)
Hoe werken gene-editing nucleases zoals CRISPR-Cas?
ZFNsTALENs MNs
CRISPR
NHEJ
indel
+ donor DNA
HR
+ donor DNA (with correction)
insertion or replacement correction
deletion
![Page 9: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/9.jpg)
Hoe werken gene-editing nucleases zoals CRISPR-Cas ?
ZFNsTALENs MNs
CRISPR ZFNsTALENs MNs
CRISPR
NHEJ
Intra-chromosomal deletion ZFNs
TALENs MNsCRISPR ZFNs
TALENs MNsCRISPR
Chromosomal translocation between two different chromosomes
![Page 10: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/10.jpg)
Waarom is CRISPR-Cas baanbrekend ?
Meganuclease
5’
3’ 5
’
3
’
FokI
FokI
5’
3’ 5’
3’
FokI
FokI
Zink Finger nucleases
TALEN
Eiwit-DNA interacties
RNA chimera
PAMTarget DNA
5’ 3’3’ 5’
3’
5’
Cas9crRNA
tracrRNA
CRISPR- Cas
Hoe gebeurt de herkenning van DNA-sequentie in het genoom ?
RNA-DNA interacties
Gemakkelijker !
Sneller !
Goedkoper !
![Page 11: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/11.jpg)
Waarom is CRISPR-Cas baanbrekend ?
Eigenschappen van genome-editing tools
![Page 12: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/12.jpg)
CRISPR-Cas 9 systeem is baanbrekend …
Science, 26 Sept 2014
“The CRISPR-Cas9 system is revolutionizing genomic
engineering … this technique has grown into one of the
most powerful genomic engineering tools to date”
Nature, 9 March 2016
“Such genetic microsurgery was a dream a decade ago…”
![Page 13: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/13.jpg)
Mogelijke risico’s ?
Off-target effecten
Doelgerichtheid van site-gerichte nucleases werkt niet altijd voor 100% ….
Off-target effecten kunnen worden verminderd door
• Nuclease activiteit in tijd te verminderen
• In silico identificatie van locaties die minder off-target homologen hebben
• Onderzoek naar nucleases met betere in vivo specificiteit
![Page 14: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/14.jpg)
Mogelijke risico’s ?
Zijn off-target effecten (on)aanvaardbaar ?
• Micro-organismen : Volledige sequenering en selectie mogelijk
• Planten : doelgerichter dan conventionele mutagenese ; selectie en terugkruising nog steeds van toepassing
• Dieren : Selectieproces is veel moeizamer + welzijn van dieren
• Menselijke somatische cellen :
• in vivo - nog veel vraagtekens rond efficiëntie, specificiteit + immunogeniciteit van CRISPR componenten
• Ex vivo – klinische proeven lopende
![Page 15: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/15.jpg)
CRISPR-Cas 9 en andere …
• Targets RNA
• Combating RNA-viruses ?
• smaller than Cas9
• different sequence requirements
• good specificity
• No need of guide RNA or specific neighbouring sequence
• Critisism…
Cpf1
C2c2
NgAgo
• Kim, D. et al. Nature Biotechnol (2016)
• Kleinstiver, B. P. et al. Nature Biotechnol. (2016)
• Abudayyeh, O. O. et al. Science 353, aaf5573 (2016).
• Gao, F. et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773 (2016).
CasX • RNA-guided genome editors distinct of Cas9 family
• Liu, JJ. et al. Nature 568 (7752) (2019).
![Page 16: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/16.jpg)
Genregulatie/epigenome engineering of base-editing
Ledford, 2016, Nature, vol 531
Fusie DNA-bindende delen van Cas 9 met
Histone methylase
Acetylase
Cytidine deaminase
![Page 17: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/17.jpg)
Toepassingen – Witte biotechnologie
Witte Biotechnologie
• Industriële stammen met verbeterde eigenschappen
(dmv. multiplex insertie van exogeen DNA)
• Onderzoek en ontwikkeling van nieuwe stammen voor productie (fungi)
• Bescherming van industriële bacteriestammen tegen bacteriofaag infectie
• Programmeerbare en CRISPR-cas gemedieerde verwijdering van een populatie uit eencultuur
![Page 18: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/18.jpg)
Toepassingen – Groene Biotechnologie
2013Rijst, tarwe, maïs
2014Tomaat, soja, citrus..
2015Katoen, aardappel …
2016Watermeloen, druif, alfalfa…
2017Cassava, groeten
2018Wortel, cacao, sla, ….
Jaganathan et al., Frontiers in Plant science (9) 985, 2018,
![Page 19: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/19.jpg)
Toepassingen bij dieren
• Verbeterde productie of nieuwe eigenschappen (bv vee zonder hoorns)
• Introductie van resistentie tegen ziektes bij vee (bv resistentie tegen tuberculose)
• Bijdrage tot voedselveiligheid (bv allergen-vrije eieren)
• Terugbrengen van verdwenen diersoorten
• Genetische modificatie van proefdieren als model voor aandoeningen bij de mens
• Verhoogde en meer veilige productie van vaccins in SPF eieren
•
![Page 20: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/20.jpg)
Toepassingen bij dieren
Gene drives
• Controle van vector-gedragen ziektes
• Controle van invasieve species
• Reversie van insecticide resistentie
Mendeliaans (normaal) Gene drive
![Page 21: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/21.jpg)
Toepassingen – Rode biotechnologie (1)
• Behandeling van monogenetische erfelijke aandoeningen
• Immuno-oncologie: gene-editing van T-lymphocyten
Ex vivo - Genetische modificatie van somatische cellen
• Regeneratieve geneeskunde : ex vivo gene-edited stem cells (iPSCs)
Autologe en allogene celtherapie
bv bloedziektes zoals Sickle cell disease, β-thalassemia
Autologe en allogene CAR-T therapie
Reardon, Nature news, June 2016
![Page 22: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/22.jpg)
Allogene CAR-T behandeling
Sommer et al., 2019 Mol Therapy 27 (6)
Allogene CAR- T behandeling Onmiddellijke behandeling
Patiënt
Gezonde donor
Sommer et al., 2019 Mol Therapy 27 (6)
Voor Diagnose Na diagnose
Week 1 Week 2 Week 3
Jour
1 :
dia
gno
se
Apheresis Productie Behandeling
Behandeling
Apheresis Productie Meerdere
dosis
Behandeling
![Page 23: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/23.jpg)
Gene-editing en EU- Regelgeving
GGO- regelgeving in Europa
GGO : een organisme, met uitzondering van menselijke wezens, waarvan het genetische
materiaal veranderd is op een wijze welke van nature door voortplanting en/of door
natuurlijke recombinatie niet mogelijk is
!! Conventionele mutagenese , techniek van genetische modificatie maar
resulterende organismen vallen buiten toepassingsgebied
Voorafgaande gevalsspecifieke beoordeling van risico’s voor menselijke gezondheid en leefmilieu
Vereisten rond detectie en traceerbaarheid
Kunnen gene-edited organismen
(puntmutatie of indels)
vrijgesteld worden
van GGO- EU- richtlijnen ?
GGO-Toelatingsaanvraag = Tijdrovend en duur
Juli, 2018
Europese Hof van Justitie
oordeelt over GGO-status
![Page 24: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/24.jpg)
Pharma versus GGO- Regelgeving
![Page 25: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/25.jpg)
Te veel / weinig regelgeving ?
• ‘Hoe kan technologie evolueren / nuttig zijn voor mens en maatschappij indien toelating voor
product gemiddeld tot 20 jaar duurt ? ‘
• ‘ Kijk naar mogelijke voordelen, laat onderzoek niet afremmen door angst voor alle mogelijke
risico’s’
• ‘ Tal van producten op de markt zijn niet risico-vrij ….’
October 2017, Josiah Zayner, San Francisco: Do-It-Yourself gene therapy
![Page 26: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/26.jpg)
Te veel / weinig regelgeving ?
November 2018, He Jiankui, China : Geboorte van gene-edited tweeling
CRISPR-gemedieerde aanpassing van het CCR5- gen met als doel HIV te voorkomen
• Genetische modificatie van kiembaancellen, erfelijke aanpassingen van het menselijk genoom
Naast ethische ook wetenschappelijke bezwaren
o HIV-kan niet volledig worden voorkomen door CCR5-gen knockout
o Neveneffecten van CCR5-gen knock-out
o Balans Risico / voordeel
Moratorium op menselijke kiembaancel gene-editing
14 maart, 2019
![Page 27: CRISPR- Cas technologie : mogelijkheden en grenzen...CRISPR-Cas 9 en andere … • Targets RNA • Combating RNA-viruses ? • smaller than Cas9 • different sequence requirements](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050514/5f9ed4ca49760c489b4452cb/html5/thumbnails/27.jpg)
Bedankt !!