L t b fili i i iLa trombofilia e i suoi percorsi diagnosticidiagnostici

Cristina Legnani, Nicola Ciavarella

Milano 9 Giugno 2011Milano, 9 Giugno 2011

• Quali alterazioni trombofiliche ricercare• Quali test eseguire• Q d i i t t• Quando eseguire i test• Quali soggetti esaminareQuali soggetti esaminare• Caratteristiche dei Centri

Quali alterazioni trombofilicheQuali alterazioni trombofiliche ricercarericercare

Quali alterazioni trombofiliche ricercareQ

• Difetto di Antitrombina• Difetto di Antitrombina• Difetto di Proteina C • Difetto di Proteina S• Mutazione Fattore V Leiden• Mutazione G20210A della protrombinaMutazione G20210A della protrombina • Lupus Anticoagulant e anticorpi

antifosfolipidi

Altre alterazioni trombofiliche/fattori di rischio

• Disfibrinogenemia• A t F tt VIII• Aumento Fattore VIII • IperomocisteinaIperomocisteina

(opzionale per tromboembolia venosa e complicanze gravidanza da eseguire percomplicanze gravidanza, da eseguire per patologia arteriosa)

Test da non eseguireTest da non eseguire• Polimorfismi della MTHFR • PAI-1 (dosaggio e polimorfismi)• Fattore XIII (dosaggio e polimorfismi)Fattore XIII (dosaggio e polimorfismi)• Plasminogeno e t-PA• TAFI• TAFI• TFPI• Cofattore eparinico II• Fattore VII, IX, XI, XII e altri, , ,• Polimorfismi della Trombomodulina• Aplotipo HR2Aplotipo HR2

R d t l’ di filRaccomandato l’uso di un profilo

• C d TUTTI i t t• Comprende TUTTI i test per l’identificazione delle alterazioni trombofiliche accertate- migliore interpretazione dei risultati di lab- migliore valutazione del rischio

• Può essere aggiornato in base ai dati della uò esse e agg o ato base a dat de aletteratura

• Evita la richiesta di test non appropriati oEvita la richiesta di test non appropriati o test non necessari

Livelli di Proteina S in soggetti portatori della mutazioneLivelli di Proteina S in soggetti portatori della mutazione Fattore V Leiden

90

708090

506070

3040

50

%

1020

0A B C D E F

M t diMetodi

Alterazioni combinate: incidenza di TEV

80

PC F.V PC + F.V

4050607080

TEV

(%)

10203040

Inci

denz

a

0

(Koeleman et al., Blood 1994)100

AT F. V AT + F.V

60

80

100

TEV

(%)

20

40

Inci

denz

a

0

(Van Boven et al, Thromb Haemost 1996)

Richiesta test non appropriati/non necessari

Dosaggi funzionali Proteina C e Proteina S

Dosaggi immunologici Proteina C e Proteina S totale

Ricerca mutazione Fattore V Leiden e G20210A Protrombina

Dosaggi coagulativi Fattore V e II

Ricerca LAC ma non degli anticorpi ACA e anti GPI

Dosaggio omocisteina

Ricerca mutazione C677T della MTHFR

Omocisteina plasmatica: variante termolabile della MTHFRdella MTHFR

12.5

7.5

10.0ol

/L

2.5

5.0µmo

Ala/Ala Val/Ala Val/Val Ala/Ala Val/Ala Val/Val0.0

Folati < 15.4 nmol/L Folati ≥ 15.4 nmol/L

La mutazione in forma omozigote:La mutazione in forma omozigote:• Può essere causa di iperomocisteinemia moderata (se folati bassi)•Non è stata inequivocabilmente identificata come fattore di rischio

indipendente per trombosi

Conferma di una alterazione

• Ripetere dosaggio AT, PC e PS in caso di valori alterati su un campione indipendente p pDiagnosi di eredofamiliarità solo se difetto presente in almeno un altro consanguineopresente in almeno un altro consanguineo

• Ripetere i test per LAC, ACA e anti ß2 GPI 12dopo almeno 12 settimane

• Riconfermare la positività per la mutazioneRiconfermare la positività per la mutazione su un secondo campione

Test genetici

Errore diagnostico

Mutazione R506Q Fattore V LeidenM t i G20210A d ll P t bi

3-6% (15 17%Mutazione G20210A della Protrombina (15-17% per omozigosi)

Risultati migliorati negli ultimi anni ma errore diagnostico

Preston et al, 1999; Hertzberg et al, 2005; Tripodi et al, 2002 e 2005

Risultati migliorati negli ultimi anni ma errore diagnostico rimane elevato (≈ 1-4%)

Quali test eseguire

Quali test eseguire (1)Q g ( )• Antitrombina (dosaggio funzionale cromogenico)• Proteina C (dosaggio funzionale cromogenico)• Proteina S (immunologico della frazione libera)( g )• Resistenza PC attivata o mutaz. Fattore V Leiden• Mutaz G20210A della protrombinaMutaz. G20210A della protrombina • Ricerca LAC (Pengo et al, JTH 2009)• D i ti i ti di li i ti ß2• Dosaggio anticorpi anticardiolipina e anti ß2

Glicoproteina I (IgG ed IgM)

Raccomandati anche PT, aPTT ed emocromo ,completo

Quali test eseguire (2)Quali test eseguire (2)

• Proteina C (dosaggio funzionale ( ggcoagulativo)

• Proteina S (dosaggio funzionale• Proteina S (dosaggio funzionale coagulativo, se usato come test di 1° livello

i f t tnecessaria una conferma con test immunologico della frazione libera)

• Dosaggio immunologico di Antitrombina, Proteina C e Proteina S totale (perProteina C e Proteina S totale (per tipizzazione difetti)

Quando eseguire i test

Alterazioni acquisite che possono q pdeterminare false positività

Erronea diagnosi di presenza di una alterazione trombofilicaEpatopatia, malnutrizione, estese ustioni, malattie infiammatorie intestinali, terapia anticoagulante, ridotto assorbimento/ass n ione itamina K gra idan a eassorbimento/assunzione vitamina K, gravidanza e trattamento ormonale, fase acuta di un processo trombotico CID reazione emolitica da trasfusionetrombotico, CID, reazione emolitica da trasfusione, tumori, terapia con L-asparaginasi, sindrome nefrosica e insufficienza renale, terapia eparinica, periodo post-e insufficienza renale, terapia eparinica, periodo postoperatorio, ARDS, plasma exchange, emorragia massiva, aumento FVIII, FX, Fattore II e XII

Modificazioni aspecifiche dovute a:

• Evento acuto Riduzione AT, PC, PS, Omocys;Aumento FVIIIAumento FVIII

• Terapia eparinica Riduzione AT;Interferenza su dosaggio PC PSInterferenza su dosaggio PC, PS, test APCR e ricerca LAC

• Anticoagulanti orali Riduzione PC e PS;• Anticoagulanti orali Riduzione PC e PS; Interferenza su test APCR

• Gravidanza Riduzione PS Omocys;Gravidanza Riduzione PS, Omocys;Aumento PC e FVIII;Alterazione test APCR

• Estroprogestinici Riduzione PS, Omocys; Aumento FVIII; Alterazione test APCR

Proteina S e gravidanza

• Proteina S ridotta in 80/139 (57.6%) donneesaminate durante la gravidanza

• Proteina S ridotta in 80/139 (57.6%) donneesaminate durante la gravidanza

• 62 donne riesaminate dopo il puerperio => tutte con Proteina S normale

• 62 donne riesaminate dopo il puerperio => tutte con Proteina S normaletutte con Proteina S normaletutte con Proteina S normale

1° trim. 2° trim. 3° trim.

Ridotta Proteina S 57 9% 59 4% 58 1%Ridotta Proteina S 57.9% 59.4% 58.1%

Proteina S e estroprogestinici

• Proteina S ridotta 113/753 donneesaminate durante un trattamentoesaminate durante un trattamento estroprogestinico (15.0%)

• 76 donne riesaminate dopo la psospensione => tutte con Proteina S normalenormale

Tchaikovsky, Women’sTchaikovsky, Women s Health 2006

Alterazioni acquisite che possonoAlterazioni acquisite che possono determinare false negatività

Mancata diagnosi di carenza di Proteina CMancata diagnosi di carenza di Proteina CGravidanza e trattamento ormonale, sindrome

nefrosica diabete e cardiopatia ischemicanefrosica, diabete e cardiopatia ischemica

Proteina C e gravidanza (1)

• Donna di 36 anni esaminata alla 25° settimana di gravidanza

• Il padre in trattamento anticoagulante per 2 pregressi episodi di TEV (1 TVP prossimale apregressi episodi di TEV (1 TVP prossimale a 30 anni dopo gesso e recidiva idiopatica di TVP a 62 anni)a 62 anni)

• Livello della Proteina C durante la gravidanza• Livello della Proteina C durante la gravidanza= 66% (n.v. > 68%)

Proteina C e gravidanza (2)

• 2 anni dopo il parto:Proteina C attività = 47%Proteina C attività = 47%Proteina C antigene = 51%

• Conferma del difetto di Proteina C nelloConferma del difetto di Proteina C nello zio paterno

Quando NON eseguire i testQuando NON eseguire i test• Trombosi acuta (eseguire la diagnostica per la ( g g p

HIT, se presente sospetto)• Durante le terapie anticoagulantiDurante le terapie anticoagulanti• Gravidanza o terapia ormonale• In tutte le condizioni associate ad aumento• In tutte le condizioni associate ad aumento

delle proteine della fase acuta (post-chirurgia, mal infiammatorie)mal. infiammatorie)

S i di bil i iSe indispensabile, test genetici sempre eseguibili, ma in genere non sono consigliabili

i i liscreening parziali

Quando eseguire i testQuando eseguire i test

• Dopo 3 mesi dall’evento tromboticoDopo 3 mesi dall evento trombotico venoso/arterioso

• D l 48 d ll i di• Dopo almeno 48 ore dalla sospensione di eparina e derivati

• Dopo 30 giorni dalla sospensione della terapia anticoagulante oraleterapia anticoagulante orale

• Dopo almeno 2 mesi dal parto• Dopo almeno 1 mese dalla sospensione

della terapia ormonaledella terapia ormonale

Quali soggetti esaminare

Quali soggetti esaminare (1)Q gg ( )

Soggetti sintomatici per:• Uno o più precedenti episodi di TEV

- idiopaticap- dopo stimoli di modesta entità- con storia familiare positiva per TEVp p

• Trombosi venose superficiali recidivanti su vena sanasana

• Trombosi venose in sedi non usuali (escluse le occlusioni venose retiniche)occlusioni venose retiniche)

• Necrosi cutanea indotta da anticoagulanti orali• Porpora fulminante neonatale

Quali soggetti esaminare (2)Q gg ( )Soggetti sintomatici per:• Patologia arteriosa in età giovanile (< 55 anni)

Limitatamente a:LAC- LAC

- Anticorpi anticardiolipina, anti ß2 Glicoproteina I(IgG ed IgM)(IgG ed IgM)

- Omocisteina

Le alterazioni trombofiliche eredofamiliari possono essere ricercate solo in casi selezionati (es pazientiessere ricercate solo in casi selezionati (es. pazienti con pregresso ictus o TIA secondario a FOP)

Quali soggetti esaminare (3)Q gg ( )

Soggetti sintomatici per:Sogge s o a c pe• Pregressa patologia della gravidanza

aborti ricorrenti (≥3 2 l i ti f t l l )- aborti ricorrenti (≥3, o 2 con almeno un cariotipo fetale normale)

- morte endouterina fetalel i- pre-eclampsia

- HELP syndromeit d di i t i t t i- ritardo di accrescimento intrauterino

- abruptio placentae

Linee guida SISET, 2009 (raccomandazioni con diversi livelli di evidenza)

Quali soggetti esaminare (4)gg ( )

Soggetti asintomaticiNon indicato in soggetti non selezionati per prevenire

episodi tromboembolici e/o complicanze della idgravidanza

Indicato prima dell’esposizione a situazioni a rischio t b ti ti l (t i l idtrombotico particolare (terapia ormonale, gravidanza, ecc) in soggetti:

• t i f ili hi t iti• con storia familiare chiaramente positiva per tromboembolia venosa (ma non per complicanze della gravidanza)della gravidanza)

• familiari di 1° grado di portatori di trombofilia eredofamiliareeredofamiliare

Familiari di portatori di trombofiliaFamiliari di portatori di trombofilia eredofamiliare

• Screening trombofilico completo

• Eseguire la ricerca della alterazione• Eseguire la ricerca della alterazione dimostrata nel proposito e almeno anche l i d ll d t i i (F tt Vla ricerca delle due mutazioni (Fattore V Leiden e G2021A della protrombina)

Caratteristiche dei Centri

Complessità del problema

• Problemi di standardizzazione fase preanalitica (raccolta, manipolazione epreanalitica (raccolta, manipolazione e conservazione del prelievo)

• Problemi di scelta dei metodi relativa scarsaProblemi di scelta dei metodi, relativa scarsa riproducibilità e probabilità di elevati errori diagnosticidiagnostici

• Possibili rilevanti interferenze di parecchi f tt i i i lt ti d i t t ( t l ifattori sui risultati dei test (patologie concomitanti, farmaci, ecc)

Test funzionali e immunologici: gcoefficienti di variazione inter-labs

CV %CV %Antitrombina 5-10%Proteina C < 10%Proteina S 20-25% (test coagulativi)

< 15% (frazione libera)

APCR < 20% (test 1° generazione)

< 15% (test 2° generazione)

LAC 40-50%ACA/anti ß2 GPI 40-50%Omocisteina < 20%

In generale la riproducibilità è peggiore per valori alterati o borderline

Test funzionali e immunologici: gerrore diagnostico

Errore diagnostico(% falsi positivi)(% falsi positivi)

Antitrombina < 5%Proteina C < 10%Proteina C < 10%Proteina S < 20%APCR < 5%APCR < 5%LAC < 20%ACA/anti ß2 GPI ?Omocisteina < 15%

Cosa i centri devono garantire (1)g ( )

• La presenza di personale ben addestrato formato e• La presenza di personale ben addestrato, formato e con esperienza nel campo dell’emostasi

• L d t i i l l i di if i t d l• La determinazione locale i range di riferimento ed la calibrazione del plasma usato per le curve contro

t d d i t i l ( di ibil )uno standard internazionale (se disponibile)• L’esecuzione di un controllo di qualità interno per

almeno due livelli (normale e patologico)• La costante partecipazione a specifici programmi di p p p p g

valutazione esterna di qualità

Cosa i centri devono garantire (2)

• L’esecuzione dei test solo previa raccoltaL esecuzione dei test solo previa raccolta dell’anamnesi del paziente (farmaci, patologie associate storia personale/familiare di trombosi)associate, storia personale/familiare di trombosi)

• Il fornire a conclusione dell’iter diagnostico una relazione/commento con esplicita interpretazionerelazione/commento con esplicita interpretazione dei risultati e/o eventuali approfondimenti da eseguire per raggiungere una diagnosi conclusivaeseguire per raggiungere una diagnosi conclusiva

• Il fornire un adeguato counseling per informazione ilib t it ll i i i fil tti hequilibrata, evitare allarmismi, misure profilattiche

da adottare in situazioni a rischio, ecc

Coordinamento dei Centri per la Trombofilia della regione Emilia RomagnaEmilia-Romagna

Bologna Palareti Gualtiero (coordinatore)Legnani Cristina

Ferrara Legnani CristinaMari RosellaMoratelli StefanoS i M i L i

Modena Serino Maria LuisaMarietta MarcoSimoni Luisa

Reggio Emilia

Parma

Pilia AnnalisaSilingardi MauroQuintavalla Roberto

PiacenzaIppolito LuigiGiorgi Pierfranceschi MatteoCroci Ezio

Area Vasta RomagnaCroci EzioArgento AntonioBiasoli ChiaraPoletti GiovanniPoletti GiovanniTiraferri Eros

La coagulazione come La coagulazione come

l “di fid di B l tt ”l “di fid di B l tt ”

F XI Fattore XII Fattore VII

la “disfida di Barletta”la “disfida di Barletta”

protrombina

Fattore XI Fattore XII Fattore VII

p

Fattore IX

Fattore VFattore von Willebrand

Fattore VIII fibrinogeno

Ca++Fattore X Fattore XIII

fosfolipidi

Ciavarella – Petronelli 2011

I°Unità Didattica

“Test di screening eTest di screening eloro interpretazione”

C i t i tt i t t diCome orientarsi attraverso i test di screening dell’emostasi …

Caso Caso n.2n.2

PT 1.8 Ratio

aPTT 2.5 Ratio

PLT 340.000/uL

Deficit X,V,II e FBG (via comune)

Paziente in TAO (VII X IX II)Paziente in TAO (VII,X,IX,II)

Deficit congeniti combinati (V + VIII) oppure (VII,X,IX,II)

ipotesi diagnostica

Ciavarella – Petronelli 2011

AlgoritmoAlgoritmostoria storia emorragica /emorragia in attoemorragica /emorragia in atto

Test di screening(PT,aPTT,PLT)

normali alterati

Test specificiTE/CT

Normale allungato

Malattia di von Willebrand (vW:Ricof ,vW:Ag, FVIII:C)

Piastrinopatia (aggr. piastrinica ,nucleotidi ,serotonina)

( )

Ciavarella – Petronelli 2011

II°Unità Didattica

“Malattia di von Willebrand eMalattia di von Willebrand eTrombocitopatie”

VON WILLEBRAND FACTOR (VWF): Proteolisi da parte dell’ ADAMTS-13

Sito di azione dell’

S-SMultimeri

S SPeptide Segnale

PropeptideADAMTS-13 (Y1605-

M1606)

S-SDimero

Peptide Segnale

D2 D3D1D’

A1D2 D3

22763 FVIII

COOHH2N

D3 A3

D1 A1 A2 D4 B1 C1 C2 CK B3 B2 A3

Collagene I & III2813

763GP IIb/IIIa

GP IbαCollagene VI

Eparina

FVIII

La carenza congenita o anticorpi contro l’ADAMTS-13 causano la Porpora Trombotica Trombocitopenicacausano la Porpora Trombotica Trombocitopenica

Lo Score emorragico

Tosetto et alTosetto et alJTH 2006

Validato in 300 controlli normali e753 pazienti e753 pazienti e familiari con tipo 1 (MCMDM-1VWD):):

BS nei normali = -BS nei normali 1/ 0

VWF:RCo (ELISA)Anti-VWF-HRP

VWF:RCo (ELISA)

Add substrateRead OD492 nm

ConjugatedPolyclonal Antibody

492 nm

antiVWF

DilutedPlasma

+Ristocetin

rGPIbαanti-GPIbα

MoAb

VWF

antiVWF

VWF

AIVWF

AIAI

C D EBA C D EBA

III°Unità Didattica

“Rischio tromboembolico e terapie anticoagulanti

Il significato del D-DimeroLivelli dei D-Dimeri nei pazienti con sospetta TVP ed EP

1000

750

500r (ng

/ml)

250

500

D-d

imer

Cut-offpazienti senza trombosi hanno livelli D-Dimeri normali o

Al contrario tutti i pazienti con trombosi hanno elevati livelli D-

L’assenza di elevati livelli di D-Dimeriindica che non vi è trombosi

250D D m melevati

trombosi hanno elevati livelli D-Dimeri

0 0,5 0,7 0,9 1 ,1 1 ,3 1 ,5 1 ,7 1,9 2,1 2,3 2 ,5

Assenza trombosi Con trombosi M.Colucci1999

DVT – D-DimerDVT – D-Dimer• In 283 patients with• In 283 patients with

suspected DVT, low-moderate pre test DVTmoderate pre-test DVT score and negative d-dimer only 1 (NPVdimer only 1 (NPV 99.6%) had DVT over next 3 monthsnext 3 months

• Sensitive d-dimer testing can rule out DVT in low-moderate risk patients

Bates SM, Kearon C, Crowther M, et al. Ann Intern Med. 2003;138:787-94

eparine: struttura proprietà generalieparine: struttura proprietà generalieparine: struttura, proprietà generalieparine: struttura, proprietà generali

Titolo diagramma

eparine

non frazionate12 000 16 000

frazionate5 500 7 500

eparine

p.m. 12.000-16.000dalton

(polisaccaridi)

p.m. 5.500-7.500dalton

(oligosaccaridi)

sale sodico

(polisaccaridi)

sale

(oligosaccaridi)

ecalcico calcico

maggiore attività antimaggiore attività anti--IIaIIa maggiore attività antimaggiore attività anti--XaXa

i f i t tt i ti hi f i t tt i ti heparine frazionate: caratteristicheeparine frazionate: caratteristiche

i ii i t it imeccanismi:meccanismi:

•• inferiore legame alleinferiore legame alle

vantaggi:vantaggi:

•• risposta anticoagulanterisposta anticoagulante•• inferiore legame alle inferiore legame alle proteine plasmaticheproteine plasmatiche

•• risposta anticoagulante risposta anticoagulante predicibilepredicibile

•• minore legame endotelialeminore legame endoteliale •• migliore biodisponibilitàmigliore biodisponibilità

•• minore legame ai minore legame ai macrofagimacrofagi

•• clearance doseclearance dose--indipendenteindipendente

•• maggiore emivitamaggiore emivita

eparina: farmacocinetica eparina: farmacocinetica pp(infusione continua e.v. con pompa elettronica)(infusione continua e.v. con pompa elettronica)

120%%c.c.

80

100PPll

60

80aassmm

20

40mmaattii

00' 30' 1h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h

iiccaa

tempotempo

Eparina: farmacocinetica Eparina: farmacocinetica (somministrazione sottocutanea)(somministrazione sottocutanea)

90100

%%c.c.

708090

PPllaa

405060

aassmm

102030

aattii

010

0' 2h 4h 6h 8h 12h 14h 18h 22h 24h

ccaaC

(%)onc

(%)tempotempo

terapia con ENFterapia con ENFppcontrollo di laboratoriocontrollo di laboratorio

PTTPTTaPTTaPTT

R = 1 5R = 1 5 2 5 volte2 5 volteR = 1.5 R = 1.5 -- 2.5 volte2.5 volteil valore basaleil valore basaleil valore basaleil valore basale

monitoraggio

profilassi TVP

Indicazione

nessuno

UFH

nessuno

LMWH

somministrazione

profilassi TVP

2-3lt l dì

nessuno

una voltal dì

nessuno

trattamento TVP aPTT

volte al dì

nessuno

al dì

posologia aggiustatasu aPTT

2 volte/dìaggiustatasu aPTT aggiustata

su peso corporeo

ENF: monitoraggioENF: monitoraggioENF: monitoraggioENF: monitoraggio

InfusioneInfusionecontinua

sottocute

e.v.

ogni 6 ore (induzione)ogni 6 ore (induzione) i 24i 24g ( )g ( )ogni 12ogni 12--24 ore (mantenimento)24 ore (mantenimento) ogni 24 oreogni 24 ore

consensus: raccomandazioniconsensus: raccomandazioniconsensus: raccomandazioniconsensus: raccomandazionieparine a basso peso molecolareeparine a basso peso molecolare (EBPM)(EBPM)

• La profilassi del tromboembolismo non richiede alcun controllo di laboratorio (livello 1)

• pazienti non complicati, trattati con dose fissa di EBPM aggiustata al peso corporeo non richiedono controllo diaggiustata al peso corporeo non richiedono controllo di laboratorio (livello 1)

• il controllo di laboratorio (anti-Xa) può essere indicato in alcune situazioni a rischio (insufficienza renale, gravidanza, ecc.)