INSITITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS Camacho Bravo Dulce Argelia

Seccin 5, 5QM2

SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR

CORMATOGRAFA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA

INTRODUCCIN

Cuando se desean separar los componentes de una mezcla compleja generalmente no se logra con una cromatografa

unidimensional, ya que con sta no se separaran totalmente los componentes y sera necesario realizar varios

cromatogramas; esto se soluciona realizando una cromatografa bidimensional en placa. En esta tcnica, se realiza el

cromatograma como en el unidimensional, es decir, se coloca la mezcla a separar sobre la placa, luego de secar, ese borde

del papel se sumerge en una mezcla de solventes que contiene componentes acuosos y orgnicos. Adems el papel debe

estar en contacto con los vapores del solvente en equilibrio. El solvente moja al papel por capilaridad debido a su

naturaleza fibrosa. El componente acuoso del solvente se une a la celulosa del papel y forma con ste una fase estacionaria

de tipo gel. El componente orgnico del solvente contina migrando, lo que constituye la fase mvil.

Las velocidades de migracin de las distintas sustancias que se quieren separar estn gobernadas por sus solubilidades

relativas en la fase estacionaria polar y la fase mvil no polar. En un solo paso del proceso de separacin cada soluto se

distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de particin, una constante de equilibrio definida como:

Por lo tanto, las molculas se separan de acuerdo con sus polaridades, de manera que las no polares se mueven ms rpido

que las polares. Luego de que el solvente migr a una distancia adecuada, se retira el cromatograma del solvente y se seca.

En caso de ser incoloros, los materiales separados pueden detectarse por caractersticas como su radiactividad,

fluorescencia etc. o puede rociarse el cromatograma con una solucin que forme un producto coloreado al reaccionar con

la sustancia investigada. Pero a diferencia de la unidimensional en la cromatografa bidimensional la muestra se aplica en

una esquina de la placa y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel. Luego de que el

cromatograma est completo y el papel se sec, la placa se rota 90 y se realiza una cromatografa paralela al segundo

borde utilizando otro sistema de solventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad caracterstica en un sistema

de solventes determinado, la segunda cromatografa debera incrementar en grado sustancial la separacin de la mezcla en

sus componentes.

OBJETIVOS

Separar los aminocidos presentes en jugo de jitomate por cromatografa bidimensional en capa fina.

Identificar los aminocidos separados por comparacin de sus valores de Rf con los de soluciones tipo de

aminocidos.

Comparar el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional, con la de la unidimensional.

DIAGRAMA DE FLUJO (anexado en la siguiente pgina)

RESULTADOS

1.- Representacin esquemtica de los cromatogramas.

Figura 1. Cromatograma unidimensional 1fase Figura 2. Cromatograma unidimensional 2fase

Figura 3. Cromatograma bidimensional tipo Figura 4. Cromatograma bidimensional problema

2.- Calculo de los valores de Rf

Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las dos fases mviles.

Aminocido 1 fase mvil 2 fase mvil

Frente del

soluto

Frente del

disolvente

Rf Frente del

soluto

Frente del

disolvente

Rf

Arginina 1.5 7.7 0.19 1 7.3 0.13

Lisina 1.9 7.7 0.24 0.7 7.3 0.09

Glicina 4.4 7.7 0.57 2 7.3 0.27

Prolina 4.5 7.7 0.58 2 7.3 0.27

c.glutmico 5.3 7.7 0.68 2.5 7.3 0.34

Histidina 5.5 7.7 0.71 0.8 7.3 0.11

Treonina 5.6 7.7 0.72 2.4 7.3 0.32

Tirosina 5.9 7.7 0.76 4.3 7.3 0.6

Metionina 6.3 7.7 0.81 4.1 7.3 0.56

Fenilalanina 6.7 7.7 0.87 4.6 7.3 0.63

Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases mviles.

No. de

mancha

1 fase mvil 2 fase mvil Aminocido

correspondiente Frente del

soluto

Frente del

disolvente

Rf Frente del

soluto

Frente del

disolvente

Rf

1 1.6 8 0.2 1.7 7.3 0.23 Arginina

2 1.9 8 0.23 0.8 7.3 0.11 Lisina

3 3.9 8 0.48 1.9 7.3 0.26 Glicina

4 4.3 8 0.53 2.1 7.3 0.28 Prolina

5 4.8 8 0.6 2.4 7.3 0.32 Histidina

6 5.3 8 0.66 2.5 7.3 0.34 c. glutmico

7 5.6 8 0.7 2.7 7.3 0.37 Treonina

8 5.7 8 0.71 4.5 7.3 0.62 Tirosina

9 6 8 0.75 4.2 7.3 0.57 Metionina

10 6.7 8 0.83 4.9 7.3 0.67 Fenilalanina

Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las dos fases mviles.

No. de

mancha

1 fase mvil 2 fase mvil

Frente del

soluto

Frente del

disolvente

Rf Frente del

soluto

Frente del

disolvente

Rf

1 1.7 7.9 0.21 0.9 7.2 0.12

2 3.6 7.9 0.45 1.8 7.2 0.25

3 3.6 7.9 0.45 2.5 7.2 0.34

4 5.3 7.9 0.67 2.5 7.2 0.34

5 6 7.9 0.75 3.3 7.2 0.45

6 6.5 7.9 0.82 3.9 7.2 0.54

7 6.6 7.9 0.83 4.7 7.2 0.65

Tabla 4. Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las 2 fases mviles.

No. de

mancha

Rf creciente en la 1 fase

mvil

Rf en la 2 fase mvil Aminocido correspondiente

1 0.21 0.12 Lisina

2 0.45 0.25 Glicina

3 0.45 0.34 Prolina

4 0.67 0.34 cido glutmico

5 0.75 0.45 Treonina

6 0.82 0.54 Metionina

7 0.83 0.65 Fenilalanina

DISCUSIN

Lo primero que se realiz despus de la parte experimental, es el clculo del Rf en los cromatogramas unidimensionales de

ambas fases( Figuras 1 y 2), en los cuales el aminocido es conocido, as que estos valores los tomamos como referencia

para determinar de qu aminocido se trata en el cromatograma bidimensional tipo ( Figura 3); al comparar las tablas 1 y

2 nos muestra que algunos valores fueron bastante cercanos y por tanto la identificacin fue sencilla, tenemos por ejemplo

los casos de la arginina, lisina, tirosina, metionina etc., pero si observamos el caso de la histidina, los Rf no son muy

parecidos, as que este aminocido se determin as por descarte, esto se pudo dar por una mala preparacin del

cromatograma al agregar los l de ese aminocido, o incluso un desarrollo no adecuado, pero esta opcin se descarta

porque los dems valores no estn tan alejados.

Por otra parte, ya con nuestro cromatograma bidimensional tipo establecido pasamos a la identificacin de los

aminocidos del jitomate, que fue la fruta que elegimos; en la Tabla 3 podemos observar los valores de Rf obtenidos de

las manchas que se desarrollaron de la muestra en ambas fases, al comparar esta tabla con la tabla 2, podemos hacer una

identificacin aproximada de los aminocidos, ya que en realidad con estos resultados no podemos decir con certeza los

componentes, tal vez para esto es necesario hacer mnimo 2 rplicas de la cromatografa bidimensional o hacer otras

pruebas.

Entonces se comparan los valores del cromatograma bidimensional tipo y del problema, se observa que en la mayora de

los casos los valores son cercanos como por ejemplo el de la lisina que tiene un Rf 1 fase de 0.23 y de 2 fase 0.11 en la

tabla tipo y en el problema 1 fase 0.21 y 2 fase 0.12, de hecho son cercanos en todos a excepcin de la Prolina que son

los valores ms alejados 1 fase 0.53 y 2 fase 0.28 en la tabla tipo, ahora 1 fase 0.45 y 2 fase 0.34 en la tabla problema;

a pesar de esto siguen siendo los valores ms aproximados para prolina.

Cabe destacar que los valores de la muestra van a depender del contenido de los aminocidos del jitomate, que a su vez es

dependiente de la maduracin del mismo y de la especie, se sabe que durante la maduracin, los aminocidos libres totales

permanecen relativamente constantes, pero la concentracin de cido glutmico, que es el predominante en el jitomate

maduro aumenta, mientras el cido glutmico disminuye; en cuanto a la serina y treonina stos alcanzan un mximo antes

de la completa madurez y los aminocidos restantantes disminuyen. 2 Aunque estos datos no son de tanta utilidad puesto

que no cuantificamos concentracin de aminocidos.

CONCLUSIONES

Separamos los aminocidos del jitomate utilizando las tcnicas de cromatografa unidimensional y cromatografa

bidimensional en capa fina, los cuales nos proporcionan los valores de Rf que al compararlos entre s nos permiten la

identificacin de los aminocidos. As mismo concluyo que la mejor opcin tanto para la separacin, como la

identificacin es el mtodo de la cromatografa bidimensional ya que tiene una mayor resolucin y confiabilidad al ser

desarrollado el mismo cromatograma en ambas fases.

PREGUNTAS EXTRA

1.- Investigar en la literatura los aminocidos que contiene el jugo empleado como problema

En nuestros resultados experimentales observamos la

presencia de los siguientes aminocidos: lisina, glicina,

prolina, c. glutmico, treonina, metionina y fenilalanina;

todas stas estn presentes en el jitomate segn lo reportado

en la literatura, ya sea en mayor proporcin como el cido

glutmico, lisina etc. o en menor como la Metionina, entre

otros aminocidos que no utilizamos en la prctica.

2.- Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminocido.

3.- Es posible cambiar el orden de las fases mviles?

Si es posible, debido a que sea cual sea la primera, las molculas se separan por su solubilidad de acuerdo a la mezcla de

la fase mvil y en la direccin que se desarrolle el cromatograma.

4.- Indique las posibles fuentes de erro de esta tcnica

Mala preparacin del cromatograma al colocar las muestras.

Al desarrollar la cromatografa es importante la direccin en la que se colocar el cromatograma, sobre todo para

no repetir la direccin ya desarrollada, sino no habr una separacin real de los componentes.

Preparacin deficiente de las fases mviles.

BIBLIOGRAFIA

1. Voet, D., Voet, J. Bioqumica, 3 edicin, Editorial Mdica Panamericana, 2006; pgs. 150-151.

2. Nuez, F. El cultivo del tomate, Grupo Mundi Prensa, 2005, pgs.. 80-82

3. http://alimentos.org.es/aminoacidos-tomate

Aminocido Cantidad Aminocido Cantidad

cido glutmico 314 mg Prolina 15mg

cido asprtico 113 mg Glicina 17 mg

Leucina 28 mg Metionina 7 mg

Lisina 27 mg Tirosina 11 mg

Alanina 24 mg Serina 26 mg

Fenilalanina 22 mg

Treonina 21 mg

Ninhidrina Aminocido Aldehdo