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Comparación HPLC y CG
Volatilidad de la muestra
HPLC
oLa volatilidad no es necesaria
oLa muestras deben ser solubles en la fase
móvil
CG
oLa muestra debe ser volátil
oBajo PM
Fase Normal
•Fase Estacionaria polar
•Fase Móvil no polar a lo polar
incremento de la fuerza
eluotrópica
pigmentos separados
Hidrófilo
Hidrófobo
Ácidos
carboxílicos
volátiles
Sulfonamidas
Cetonas de
aldehídos
Glifosatos
Aminoácidos Iones inorgánicos
Colorantes
alimentarios
sintéticos
Azúcares Alcoholes de
azúcares
Enzimas
PG, OG, DG
fenoles Glicoles
Nitrilos
Nitrosamina
BHT (butilhidroxitolueno),
BHA (butilhidroxianisol),
THBO antioxidantes
Ácidos grasos
Aflatoxinas
Antibióticos
Flavonoides
Colorantes alim. naturales
Vitaminas solubles en grasas
Anabólicos PAHs
Aminas aromáticas
Alcohol Pesticidas
organofósforos TMS derivado
de azúcares
Epóxidos Aceites esenciales
PCB
Monómeros de polímero Triglicéridos Fosfolípidos
C2/C5 hidrocarburos Metiléster
ácidos grasos Ésteres aromáticos
Volátil No volátil Volatilidad
Polaridad
6
Solventes
• Pureza – Grado HPLC
• Filtración – Poro de 0.45 micras
– Nylon
– Teflón
• Desgacificación
Bombas
Se requiere de una bomba que de
una presión alta para forzar al
líquido a pasar por la columna a
una velocidad satisfactoria.
Debe mantener el flujo constante
durante períodos relativamente
largos.
Columnas
acero inoxidable (soportan presiones
hasta 5000 psi)
Diámetro de 1 a 6 mm
Longitud de 10 a 30 cm
El soportes para la fase líquida
tierra de diatomeas, zipax o corasil
Columnas de HPLC
Columna
analítica
Fase móvil
desde la bomba
Precolumna Muestreador
Al detector
Actúa sobre la muestra para
atrapar partículas y
componentes de muestras
retenidos con fuerza.
Las columnas varían en los siguientes aspectos:
• Longitud
• Diámetro interno
• Material de la fase estacionaria
• Tamaño de partícula de la fase estacionaria
La columna
analítica lleva
a cabo la
separación.
17
Columna - Acero inoxidable
estándar
Capilar
Frita de filtro de
acero inoxidable
Tamaño de poro de 2
um
Relleno de
columna
18
Materiales de relleno de columnas -
Sílice
Soles de sílice Xerogeles
Esférico
Irregular Las partículas tienen un diámetro de
3 a 10 mm en las columnas estándar.
19
Materiales de relleno de columnas -
Fases enlazadas
Si R1
R2
Si CH3 H3C
O
O
Si
O O
OH
Poros
Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl
R1
R2
Fase enlazada monomérica
Cadena de carbono
con forma de cepillo
20
Materiales de relleno de columnas - Fases
enlazadas extensamente utilizadas
CH3
|
-0-Si- R
|
CH3
HPLC de fase inversa •C18
•C8
•C4
•C1
•Fenilo
Las columnas de HPLC más utilizadas
Separaciones de proteínas
Dipolo débil - dipolo inducido
Interacciones con analitos polares
HPLC de fase normal o inversa • CN
• NH2
HPLC de fase normal • Diol Separaciones de compuestos con
polaridades muy diferentes
Polaridad intermedia
Intercambio iónico
DEAE (dietilaminoetanol)
QAE (aminoetilo cuaternario)
Carboximetilo
Exclusión de tamaño
Glicerilpropilo
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Materiales de relleno de columnas Rendimiento
mejorado de desoxinucleósidos utilizando fase
enlazada óptima
mAU
-4
0
4
8
12
DAD1 A, Sig=254,16 Ref=360,100 (H:\NUKE\NUKE0061.D)
min0 2 4 6 8
mAU
0
10
20
30
40
DAD1 A, Sig=254,16 Ref=360,100 (H:\NUKE\NUKE0056.D)
G
C A
T Zorbax SB-C18
92% A : 8% B
6 min
2 min
Zorbax SB-CN 97,5% A : 2,5% B
G
C A
T
LC: HP1090
Columnas: 4,6 x 50
mm, 3,5 µM
Flujo: 1,0 ml / min.
A: 0,1% TFA
B: 90% MeOH:
10% H2O (0,1%
TFA)
Temp.: 30 °C
Detec.: 254 nm
22
Materiales de relleno de columnas -
Soportes de polímeros
Admiten:
l Fase normal e inversa
l Intercambiadores iónicos
l Cromatografía por exclusión de tamaño
CH = CH 2
+
- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -
Estireno Divinil benceno
- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -
CH = CH 2
CH = CH 2
Estireno-divinilbenceno
23
Tamaño de partícula - Efecto en la
eficacia
Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA
Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 °C
3 -µm
5 -µm
10 -µm Velocidad de flujo
N
Teórico
Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min
Núm
ero
de
pla
tos/
met
ro/1
03
24
Número aproximado de platos (N) y volumen
vacío (Vm) para columnas de 5 mm y 3,5 mm Si se reducen simultáneamente la longitud de la columna
(N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá:
◦ Mantener la resolución
◦ Reducir el tiempo de análisis
◦ Reducir el uso de disolventes
Tamaño de la
columna Tamaño de partícula
Número de platos
(N)
Volumen vacío
(V m )
4,6 x 250 mm 5- m m 20.000 2,5 ml
4,6 x 150 mm 5- m m 12.000 1,5 ml
4,6 x 150 mm 3.5- m m Resolución rápida 20.000 1,5 ml
4,6 x 75 mm 3.5- m m Resolución rápida 10.000 0,75 ml
4,6 x 50 mm 3.5- m m Resolución rápida 6.000 0,5 ml
4,6 x 30 mm 3.5- m m Resolución rápida 3.600 0,3 ml
4,6 x 15 mm 3.5- m m Resolución rápida 2.000 0,15 ml
25
Aumentar la velocidad de análisis
mientras se mantiene la resolución
Dimensiones 250 x 4,6 mm 150 x 4,6mm 150 x 4,6 mm 75 x 4,6 mm
Tiempo de análisis (min)
30 min 18 min 18 min 9 min
Residuo de disolvente (ml)
30 ml 18 ml 18 ml 9 ml
N 20.000 20.000 12.000 10.000
5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm
40%
Reducción
40%
Reducción
Sin modificar 9% de diferencia
50%
Reducción
50%
Reducción
26
Conseguir todo el potencial con
mayor velocidad de flujo mAU
0 100 200 300
mAU
0 100 200 300
min 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9
mAU
0 100 200 300
0
Velocidad
de flujo
3 ml/min
2 ml/min
4 ml/min
Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm
90 bar
133 bar
181 bar
Presión
30 seg
Rs2,1 = 2,1
Rs2,1 = 2,2
Rs7,6 = 2,2
Rs7,6 = 2,2
27
Columnas con diámetro interno pequeño y muy pequeño
Ventajas:
Consumo reducido de disolvente.
Idóneas para análisis de trazas si la cantidad
de muestra es limitado.
Fácil conversión de velocidad de flujo para
cambiar el método de columna analítica a
columna de diámetro muy pequeño.
Inconvenientes:
La instrumentación debe tener un
volumen externo a la columna muy bajo.
Las fritas se deben cambiar con más
frecuencia.
Convencional
Diámetro interno
muy pequeño
4,6 mm
4,6 mm
2,1 mm
d = 10 dmm p
0 2 4 6 8 10
1,00 ml/min
0 4 6 8 10
0,01 ml/min
2
o
1,0 mm 100 mm 200 mm
d = 5 dmm p
d = 5 dmm p
28
Velocidades de flujo típicas d.i. de columna
(partículas de
5
mm )
Flujo
ml/min 4,6 1 –2
3,0 0,4 - 0,8
2,1 0,2 – 0,4
1,0 0,05 – 0,09
29
Longitud de columna - Adaptar la
longitud a la resolución deseada DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0035.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0032.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0037.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0027.D)
DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0038.D)
min0 1 2 3 4 5 6 7 8
Adso
rba
nce
4,6 x 15 mm
4,6 x 30 mm
4,6 x 50 mm
4,6 x 75 mm
4,6 x 150 mm
Ab
sorb
an
cia
SB-C18
Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100
Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm
Fase móvil: 1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)
UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 °C
Vol. de inyección: 1 µl
Muestra:
1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol)
2. Cafeína
3. 2-Ac2-Acetoamidofenol
4. Acetanilida
5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)
6. Ácido salicílico
7. Fenacetina (acetofenetidina)
1 2 3 4
5 6 7
los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min
30