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Cromatografia em Camada Delgada
Discentes: Daniely de Godoy Silva
Germano Blaquez Junior
Gislaine Ap. da Cunha
Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira
Profª Amanda Coelho Danuello
Histórico da Cromatografia em Camada Delgada
BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos.
Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a Cromatografia em Camada Delgada, para análise de produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os sólidos ao suporte.
Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.
Cromatografia :
Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.
Técnicas cromatográficas
Cromatografia planar: Fase estacionária permanece em um plano
Cromatografia em coluna:
Fase estacionária permanece num tubo
Cromatografia
Planar Coluna
Líquido LíquidoGás
Líquido Fase ligada
Sólido Líquido LíquidoSólido Fase ligada
CP CCD CCD CGL CGS CGFL CLL
Sólido
CLS CE
Fase ligada
CLFLCTI CB
Critério de classificação
Técnica
Fase Móvel
Fase Estacionária
Tipo de cromatografia
Outra Classificação
Fase Normal
Polaridade: FE > FM
FE utilizada : Sílica G
Fase Reversa
Polaridade: FE < FM
FE utilizada: Sílica C18
> polaridade
< polaridade
< polaridade
> polaridade
MECANISMO DE AÇÃO
ABSORÇÃO ADSORÇÃO
Mecanismos
Adsorção Partição Exclusão Líquido/gás sólido
Líquido sólido
+
+
+-
-
Líquido/gás líquidoLíquido/gás gel/sólido
Troca Iônica
FORÇAS INTERMOLECULARES
MOLÉCULAS APOLARES
FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON
Molécula apolar
Molécula apolar
Dipolo instantâneo
Afastadas = Não existe atração
Aproximação = Indução
Atração
Ex: Hidrocarbonetos
Moléculas Polares
Dipolo - Dipolo
Ligação de HidrogênioH ligado a F, ou O, ou N
Molécula polar sem H ligado a F, ou O ou N
Cromatografia em Camada Delgadaem Camada Delgada
Consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.
Aplicações:
Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um extrato orgânico;
Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de estimulantes por atletas;
Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;
Análise da pureza de compostos;
Análise da eficiência de: destilação e cristalização
Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada
a. Simplicidade;
b. Baixo custo;
c. Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o conteúdo de uma mancha ou de uma banda;
ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD
Processo de separação varia em função da quantidade de água presente no adsorvente:
Ausência de água = Adsorção
Presença de água = Partição
Exemplos de adsorventes:
Sílica-Gel ou àcido Silícico;
Óxido de alumínio ou alumina;
Celulose;
Kieselgur;
Poliamida;
Sílica gel
Kieselgur Alumina
Sílica gel ou Ácido silícico
Mecanismo de adsorção:-Si-OH: Interações polares por ligação de hidrogênio, como doador ou aceptor de H.-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo
SiO O Si
O
O O
O
OH
Mais usada na CCD
Substância porosa e amorfa.
Apresenta caráter ácido.
Possui característica polar, devido à presença de grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve apresentar número de hidroxilas razoável para ser seletivo na separação de substâncias de diferentes polaridades
Tratamento térmico eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de 105 a 110ºC)
Caracterização do tipo básico de sílica gel :
G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante);
H: indica ausência de aglutinante;
F: indica adição de substâncias fluorescentes;
P: indica adsorvente para uso preparativo;
R: indica adsorvente de alto grau de pureza;
Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3 mm
CUIDADO! A aspiração da sílica causa silicose, um tipo de inflamação pulmonar crônica!
CH3Si
OSi
OSi
OSi
O
CH3
CH3
OH
CH3
OH
O
CH3
CH3
CH3
CH3
Sílica C18
Usada em cromatografia de fase reversa, em que a fase estacionária é menos polar que a fase móvel
Alumina ou Óxido de AlumínioSegundo adsorvente mais empregado em CCD;
Há três grupos deste adsorvente:
A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.
A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.
Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1.
Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1.
Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.
O Al
AlO
ClAlCH3
Cl
CH3
Cl
ÁCIDApH 4,0
O Al
AlO
ONaAlCH3
ONa
CH3
ONa
BÁSICApH 9,0
NEUTRApH 7,0
Mecanismo de adsorção:
Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)
O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+
Celulose
Existem dois tipos de celulose empregadas em CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose microcristalina.
Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas aplicadas na CCD:
Mecanismo: Partição ou troca iônica.
Kieselgur ou terra de diatomáceasÉ um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.
Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução.
Poliamida
Separação de fenóis e ácidos carboxílicos
A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de hidrogênio com o analito.
Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas
Técnica GeralEscolha da fase estacionária;
Preparação das placas cromatográficas;
Ativação das placas cromatográficas;
Seleção da fase móvel;
Aplicação das amostras nas cromatoplacas;
Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma;
Revelação dos cromatogramas;
Documentação;
Calculo do fator de retenção Rf;
Escolha da fase estacionária
Liofilicidade e liofobicidade
Interação com os componentes (polaridade)
Necessidade de aditivos Aglutinantes Substâncias fluorescentes
Capacidade adsorvedora
Preparação da placas
As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à temperatura e uniformes.
Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.
Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.
Procedimentos para a preparação das placas
Limpeza da placa de vidro detergente e água corrente (eliminação de
gordura);
Secagem em estufa
Preparação das camadas finas dos adsorventes: Utilização de espalhadores ( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.
Riscar as placas, determinando a altura
de ínicio e fim da cromatografia
Ativação das placas
Objetivo: retirar substâncias interferentes e eliminar água
Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.
Exemplo : Sílica e alumina estufa 105 – 110 ºC por 30 – 60 min;
Celulose estufa 105ºC por 10 min;
Seleção da fase móvel Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase móvel.
Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto.
Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: constitui um processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.
Método de seleção
Aplicação das amostras A amostra é aplicada na forma de solução 0,1 – 1%,dependendo A amostra é aplicada na forma de solução 0,1 – 1%,dependendo da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis possíveis.possíveis.
Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos capilares.capilares.
As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte
inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato
direto com o solvente durante o desenvolvimento do direto com o solvente durante o desenvolvimento do
cromatograma.cromatograma.
Alinhamento horizontal uniforme.Alinhamento horizontal uniforme.
Preparação da cuba A cuba deve estar saturada com vapor de fase móvel, para isso, A cuba deve estar saturada com vapor de fase móvel, para isso, coloca-se papel de filtro na cuba, que indica o nível de saturação. coloca-se papel de filtro na cuba, que indica o nível de saturação. A cuba deve ser dotada tampa esmerilhadas de forma a vedá-la A cuba deve ser dotada tampa esmerilhadas de forma a vedá-la hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera interna.interna.
Desenvolvimento de um cromatograma numa cuba
A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar evaporação) e A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar evaporação) e verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase móvel desejadamóvel desejada
A- Procedimentos FísicosA- Procedimentos Físicos: Luz ultravioleta (aromáticos ou dupla ligação conjugada).
B- Procedimentos Biológicos e EnzimáticosB- Procedimentos Biológicos e Enzimáticos: Antibióticos, Enzimas e Substratos.
C- Procedimentos QuímicosC- Procedimentos Químicos: Aplicação de um reativo químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.
Revelação dos cromatogramas
Reveladores Físicos
Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes.Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes.
Ex: clorofila.Ex: clorofila.
Reveladores QuímicosConsiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com Consiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis.as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis.
Tipos de reveladores químicos Tipos de reveladores químicos Alcalóides:Alcalóides: Dragendorff, iodoplatinato Dragendorff, iodoplatinatoFlavonóides:Flavonóides: NP-PEG NP-PEGAnti-oxidantes: ββ-caroteno-carotenoSaponinas, terpenos e esteróides:Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico anisaldeído sulfúricoAntraquinonas e cumarinas:Antraquinonas e cumarinas: vapor de amônia vapor de amôniaFenólicos, saponinas e terpenóides:Fenólicos, saponinas e terpenóides: vapor de iodo e solução de CeSO vapor de iodo e solução de CeSO44
Compostos fenólicos:Compostos fenólicos: FeCl FeCl33
Ani
sald
eído
Iodo
Ác.
fos
fom
olib
dico
Reveladores Biológicos
Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível.tornar a mancha visível.Ex.: para testar se uma amostra contém substância anti-Ex.: para testar se uma amostra contém substância anti-fúngica, revela-se o cromatograma com esporos de fúngica, revela-se o cromatograma com esporos de fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas substâncias.substâncias.
Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate factor)
Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase móvel.
Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a vírgula.
dr1
dm
dr2
Ws1
Linha de chegada da FM
Profundidade da FMPonto de partida da amostra
Ws2
• Fartor de Retenção (RFartor de Retenção (Rff):):
• Rf = dr / dm
• Resolução (RResolução (Rss):):
• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2)
• Eficiência:Eficiência:
• n = 16 (dr – Ws)2
Parâmetros Utilizados na Cromatografia PlanarParâmetros Utilizados na Cromatografia Planar
Desvantagens da CCDDifícil reprodutibilidade:Difícil reprodutibilidade:
quantidade de amostra aplicada quantidade de amostra aplicada obtenção de cromatoplacas com características idênticas.obtenção de cromatoplacas com características idênticas.
Dificuldade de detecção devido à difusão da amostraDificuldade de detecção devido à difusão da amostra
Difícil determinação exata do Rf.Difícil determinação exata do Rf.
Constantes Físicas
Bibliografia
•COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed. COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed. Unicamp,Campinas,1995.Unicamp,Campinas,1995.
•NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005 NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005
•THE MERCK INDEX, 13th, ed. Merck & CO., Inc., Usa, 2001.THE MERCK INDEX, 13th, ed. Merck & CO., Inc., Usa, 2001.
•Labjeduardo.iq.unesp.brLabjeduardo.iq.unesp.br
Agradecimentos
• Marquinho
• Alberto Camilo Alécio
• Amanda Coelho Danuello