cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de … · • quando o íon molecular não é...
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CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE
MASSAS – GC‐MSPrincípios e Aplicaçõesp p ç
Elias Paulo TessaroElias Paulo [email protected]
1
1. Introdução
Instrumentação
Direto EI B Multiplicador e‐GCHPLC
CIAPCIAPPI
QTofIT
MCP
APPIESIMALDI
ITLITICRMALDI ICROrbitrap
2
1. Introdução
O que é cromatografia??
• 1906 – Botânico russo Mikhail Tswett
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1. Introdução
4
2.Cromatografia Gasosa
O principal mecanismo de separação da Cromatografia Gasosa (CG) está baseadona partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a faseestacionária (líquida ou sólida)estacionária (líquida ou sólida).
• Alto poder de resolução;• Alto poder de resolução;• Alta sensibilidade;
•A amostra e/ou seus componentes devem ser voláteis e termicamenteestáveis!!! (temperaturas até 300 °C);• Tempos razoavelmente longos de analise.
5
2.Cromatografia Gasosa
Sinal Registrado
Introduçãode amostra
Conversor de sinal
Gás de ArrasteColuna Cromatográfica DetectorColuna Cromatográfica
e FornoDetector
6
Instrumentação
Instrumentação
DiretoGCHPLC
EICIAPCIAPPI
BQTofIT
Multiplicador e‐MCP
Sinal Registrado
Introduçãode amostra
ESIMALDI
LITICROrbitrap
Conversor de sinal
Gás de ArrasteColuna Cromatográfica
e FornoDetector
7
3. Ionização por Elétrons
8
3. Ionização por Elétrons
Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção térmica), a uma
pressão típica de 10‐5 torr, são bombardeadas por elétrons, com
i í i d 70 V O i i l i denergia típica de 70 eV. Ocorre principalmente a retirada ou captura
de um elétron formando íons M+. ou M‐.. Íons positivos são
predominantes. M‐. se tornam importantes para moléculas com alta
EAEA.
M + e‐ (70 eV) → M+. (~ 5‐10 eV) + 2e‐ (~60‐65 eV)
9
3. Ionização por Elétrons
Fonte de EI
10
3. Ionização por Elétrons
I i ãIonização70 eV
• Os espectros de massas
70 eV
são reprodutíveis emequipamentos similares
• Existem uma variedadesde bibliotecas deespectros de massas:Wil Ni t t tWiley, Nist, entre outras
11
3. Ionização por Elétrons
Energia x Fragmentação
12
3. Ionização por Elétrons
E lExemplos
C7H16 m=10013
3. Ionização por Elétrons
Características• Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos da fonte deionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller“).
Í• Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e se fragmentamtotal ou parcialmente.
• EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como também• EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como tambémfragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a70 eV; estável; fácil de operar; alta sensibilidade.
• Aplica‐se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular(~500u), voláteis e termo‐estáveis: moléculas orgânicas relativamente pequenas.
• Quando o íon molecular não é observado (devido a dissociação excessiva),existe um processo dissociativo exotérmico e portanto M+. é uma espécie instável.
EI ~10‐16 U d 103 105 lé l t f t d• EI ocorre em ~10‐16 s. Uma em cada 103‐105 moléculas que entram na fonte deEI é ionizada.
14
4. Ionização QuímicaMunson and Field ‐ 1966
• EI:
– SimplesSimples
– Produz extensa fragmentação
– Muitas vezes tem M+.
– Quando não tem M+. ???
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4. Ionização Química
Fonte de CI
16
I i ã4. Ionização Química
Ionização
• Pressão ~ 10‐3 mbar;• Método de ionização indireta e branda;• Transferência de um próton do gás reagente à molécula ‐p g gíon molecular protonado [M‐H]+;• Fragmentação leve ou quase ausente, ideal para obter oFragmentação leve ou quase ausente, ideal para obter oíon molecular
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4. Ionização Química
CH44
ExemplosExemplos Iso‐C4H10
NH3
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EI vs CI
E t d M C ã t EI CIEspectro de Massas: Comparação entre EI e CI
I i ã El t ô i• Fragmentação intensa – maisinformações sobre a molécula;
Ionização Eletrônica
• Muitas vezes não é encontrado oíon molecular.
• Fragmentação branda espectroIonização Química
• Fragmentação branda – espectromais limpo;
• Sempre é encontrado o íonmolecular;
• Necessário a utilização de um gásreagentereagente.
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Instrumentação
Instrumentação
DiretoGCHPLC
EICIAPCIAPPI
BQTofIT
Multiplicador e‐MCP
Sinal Registrado
Introduçãode amostra
ESIMALDI
LITICROrbitrap
Conversor de sinal
Gás de ArrasteColuna Cromatográfica
e FornoDetector
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5. Setor Magnético
S M é iSetor Magnético
21
S Elé i5. Setor Magnético
Setor Elétrico
Devido a problemas de focalização dos íons apósDevido a problemas de focalização dos íons apóspassar pelo Setor Magnético 22
D l F li ã5. Setor Magnético
Dupla Focalização
23
F i A
5. Setor Magnético
•1919
Francis Aston
•1919Francis Aston constrói o primeiro espectrógrafo demassa com focalização de velocidade com poder de
l ã d 130resolução de 130.
•1937Aston constrói um espectrógrafo de massa com poderde resolução de 2000
• Descobriu 212 dos 287 isótopos naturais 1922
•Nobel Prize in Chemistry "for his discovery, by means ofNobel Prize in Chemistry for his discovery, by means ofhis mass spectrograph, of isotopes, in a large number ofnon‐radioactive elements, and for his enunciation of thewhole number rulewhole‐number rule
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F i A
5. Setor Magnético
Francis Aston
25
Mi ã Viki
5. Setor Magnético
Missão Viking
26
C l
5. Setor Magnético
Calutron
M i C lMain Calutron patents:U.S. Patent 2709222 Methods of and apparatus for separating materials (Ernest O. Lawrence)U.S. Patent 2719924 Magnetic shims (Robert Oppenheimer and Stanley Frankel)U S Patent 2847576 Calutron system (Ernest O Lawrence)U.S. Patent 2847576 Calutron system (Ernest O. Lawrence)
27
R ã I tó i6. Razão Isotópica
Razão Isotópica
28
R ã I tó i6. Razão Isotópica
Razão Isotópica
29
R ã I tó i6. Razão Isotópica
Razão Isotópica
30
R ã I tó i6. Razão Isotópica
Razão Isotópica
31
6. Razão Isotópica
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6. Razão Isotópica
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6. Razão Isotópica
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6. Razão Isotópica
Características
( )• Alta resolução (~50.000)
• Alta exatidão (~ 10 20 ppm)• Alta exatidão ( 10‐20 ppm)
• Analizador discriminativo Analizador discriminativo
• Feixe contínuo
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7. Quadrupolo
QuadrupoloQuadrupoloQuatro pólos acoplados diagonalmenteQuatro pólos acoplados diagonalmente
• Idealmente hiperbólicos
– Substitui‐se por circulares
• Voltagem RF e DC
Para Quadrupolos Circulares
D/d = 1.148
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7. Quadrupolo
Dimensões
Quadrupolo sintonizado para m/z 200 e íon de m/z 200
Freqüência = 880 kHz
Comprimento = 20 cm
Potencial de aceleração = 10 VPotencial de aceleração = 10 V
Tempo de permanência aproximado = 64 s
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C t í ti7. Quadrupolo
Características
• Resolução unitária (1 Da) ~ número de ciclos RFResolução unitária (1 Da) número de ciclos RF
• Paralelismo é muito importante !p
• Simples
• Varredura discriminatória
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E t t i d M7. Quadrupolo
Espectrometria de Massas SequencialSequencial
39
Tipos de Experimentos MS/MS7. Quadrupolo
Tipos de Experimentos MS/MS
Experimentosp
– Varredura (MS)
– SIM (MS)SIM (MS)
– SRM / MRM (MS/MS)
Varredura de Íons Produtos (MS/MS)– Varredura de Íons Produtos (MS/MS)
– Varredura de Íons Precursores (MS/MS)
V d d P d N t (MS/MS)– Varredura de Perda Neutra (MS/MS)
40
7. Quadrupolo
41
8. Ion Trap
Ion Trap 3D
42
I T 3D8. Ion Trap
Ion Trap 3DArmadilha iônica desenvolvida porWolfgang Paul (Nobel de Física de 1989)g g ( )
43
I T 3D8. Ion Trap
Ion Trap 3D
• Consiste de um eletrodo em forma de Anel e dois eletrodos “tampa”• Consiste de um eletrodo em forma de Anel e dois eletrodos tampa
• Conectados à uma voltagem RF/AC
• Forma um potencial oscilante de aprisionamento• Forma um potencial oscilante de aprisionamento
• Segue a equação de Mathieu 44
8. Ion Trap
Sequência de Eventos (MS)
• Aprisionamentop
• Resfriamento
• Varredura
• Detecção (por instabilidade de órbita)
Sequências no Tempo !!! 45
8. Ion Trap
Desvantagens
Chemical Shift
• Interações entre os íons causam desvio de órbita dentro do trap;
• Provoca um erro de massa em alguns casos.
FonteFonte
• Fonte de íons deve ficar afastada do trap; p;
• Possibilidade de reações Íon molécula (CI);
• Usa‐se um guia de íons para fazer a transferência de íons. 46
d l
8. Ion Trap
Espectrometria de Massas Sequencial no Tempo (IT)
/ /
Tempo (IT)
• Eventos de análise de m/z, dissociação e análise de m/z ocorrem
no IT;
• Eventos ocorrem no tempo;
Único anali adorm/ ários e perimentos• Único analizadorm/z, vários experimentos;
• Dissociação é realizada com He;
• Nova fonte de RF excita os íons axialmente, provocando o
aumento da energia interna Dissociaçãoaumento da energia interna Dissociação
47
8. Ion Trap
Desvantagens
Low Mass Cut‐Off (LMCO)Low Mass Cut Off (LMCO)
• Nas condições de CID;ç ;
• Íons de massa baixa não são estáveis nessas condições;
• Íons com massa < 1/3 do precursor são ejetados
48
ff ( )
8. Ion Trap
Low Mass Cut‐Off ‐ (LMCO)
49
8. Ion Trap
MSn
• Experimentos de MS sequencial com n > 2 são possíveissem custo;
B i i l d l ã f i• Basta repetir os ciclos de seleção, resfriamento,dissociação e varredura;
• Limitado pela sensibilidade (somente 1 acumulação !);
• Aplicações c/ n=3, demonstrado c/ n=12.
50
( )
8. Ion Trap
Ion Trap Linear (LIT)
• Outra forma de “Trap”;
• Consiste em um arranjo quadrupolar com lentes de entrada saída;• Consiste em um arranjo quadrupolar com lentes de entrada saída;
• Várias melhorias em relação ao 3D:
– Maior capacidade
– Menor LMCO
– Menor chemical shifts
• Dois tipos extração:
– Radial (Thermo)
– Axial (Applied Biosystems)51
f
8. Ion Trap
Configurações
hThermo52
f
8. Ion Trap
Configurações
AB Sciex
53
8. Ion Trap
54
9. Time‐of‐Flight
Time‐of‐Flight ‐ TOF
• Princípio mais simples dos analizadores; Princípio mais simples dos analizadores;
• Íons são acelerados por uma voltagem constante;
• As velocidades dos íons dependem da razão m/z;
• Mede‐se o tempo que o íon leva para percorrer
uma certa distância.
55
9. Time‐of‐Flight
TOF Linear
• Analisador Pulsado (não‐contínuo)• Grande sensibilidade (Não faz varredura)• Sem limite teórico de massaB i C t• Baixo Custo
•Baixa resolução (100‐400) devido à dispersões56
9. Time‐of‐Flight
TOF Refletor
• Alta resolução (10000‐20000)• Alta exatidão (~ 3‐10 ppm)• Limite de massa (até 8000 a 10000)• Menor sensibilidade 57
Instrumentação
Instrumentação
DiretoGCHPLC
EICIAPCIAPPI
BQTofIT
Multiplicador e‐MCP
Sinal Registrado
Introduçãode amostra
ESIMALDI
LITICROrbitrap
Conversor de sinal
Gás de ArrasteColuna Cromatográfica
e FornoDetector
58
10. Detectores
DDetectores
O detector tem a função de detectar e amplificar o sinald t d í d li d t f ida corrente de íons que vem do analisador e transferir osinal para o sistema de processamento de dados.
Os principais tipos de detectores são:• Multiplicador de elétrons• MCP (micro‐channel plate)• MCP (micro‐channel plate)
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10. Detectores
Multiplicador de Elétrons• Dinodo de conversão que é utilizado para converter íons positivosou negativos em elétrons.
• Potencias mais altos nos dinodos de conversão são utilizados paraacelerar íons de massa altas e assim melhorar a sensibilidade
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M lti li d d Elét10. Detectores
Multiplicador de Elétrons
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10. Detectores
MCPOMCP é lti li d d lét it á id• OMCP é um multiplicador de elétrons muito rápido
• Um único íon pode gerar 107 elétrons sendo produzidos em um• Um único íon pode gerar 107 elétrons sendo produzidos em umperíodo de 4‐5 ns
62
MCP10. Detectores
MCP
63
Instrumentação
Instrumentação
DiretoGCHPLC
EICIAPCIAPPI
BQTofIT
Multiplicador e‐MCP
Sinal Registrado
Introduçãode amostra
ESIMALDI
LITICROrbitrap
Conversor de sinal
Gás de ArrasteColuna Cromatográfica
e FornoDetector
64
11. Acoplamentos
A l tAcoplamentos
65
11. Acoplamentos
GC/MS: The direct coupling of gas chromatography (GC)and TOF MS was achieved in the mid-1950s by Roland S.Gohlke and McLafferty of Dow Chemical Co., Midland, Mich., in
ll b ti ith Wil M L d D H i t tcollaboration with Wiley, McLaren, and Dan Harrington atBendix. At about the same time, GC was coupled to amagnetic sector instrument by Joseph C. Holmes and Frank A.Morrell of Phillip Morris, Richmond, Va., among others.Fred McLafferty
Finnigan 1968 – Hewlett‐|Packard 197166
11. Acoplamentos
The Perfect Couple !The Perfect Couple !67
Configurações
f dConfigurações de Equipamentos
68
Vantagens e Desvantagens
Vantagens• EI fornece fragmentos / Ion molecular• GC tem alta resolução
f f é d d í• Quantificação feita através de monitoramento de 1 ou mais íons• Maior a massa → Maior sele vidade
D tl l
Desvantagens• Tempos razoavelmente longos• Necessidade de derivatização em vários casos
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Hid b t li í li áti
Exemplos
Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
• Amostra – Matriz simples ou complexa? solo, águas, sedimentos, partículas no ar, entre outros
• Monitorados e regulamentados 16 HPAs (7 o to ados e egu a e tados 6 s (HPAs são classificados como carcinogênicos pela – IARC)g p )
• Otimização da separação cromatográfica Quantificação necessárioQuantificação ‐ necessário
• Limites de detecçãoIARC International Agency for Research on Cancer
HPA SeparaçãoExemplos
HPA – Separação
Espectros de massas PHAExemplos
Espectros de massas ‐ PHA
100128
100152
MW: 128 C10H8 (mainlib) Naphthalene20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
0
50
26 3951 64 77 85 89 97
102113
MW: 152 C12H8 (mainlib) Acenaphthylene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
0
50
14 27 37 44 50 55 6376
78 84 89 98 109 120126
50
100
76
153
50
100166
MW: 154 C12H10 (mainlib) Acenaphthene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
014 27 32 39 51
63
76
87 98 110 126 139
MW: 166 C13H10 (mainlib) Fluorene10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
014 26 39 44 51 56
63 69 7482
87 97 115 122139
150
Espectros de massas PHAExemplos
Espectros de massas ‐ PHA
100178
100178
MW: 178 C14H10 (mainlib) Anthracene20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
0
50
27 38 50 63 6976 89
98 110 126 139152
163
MW: 178 C14H10 (mainlib) Phenanthrene20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
0
50
27 39 50 6376 89
98 110 126 139
152
163 184
50
100202
50
100228
(mainlib) Fluoranthene30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210
039 50 62 74 88
101110 122 150 162 174
MW: 228 C18H12 (mainlib) Benz[a]anthracene20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
028 39 50 63 74 88
101114
122 150 163 174 187 200
Drogas de abusoExemplos
Drogas de abuso
b i• Substancias entorpecentes psicotrópicas, e seus metabólitos– Anfetaminas e Metanfetaminas
– Cocaína ‐Metabólitos
– Maconha ‐Canabinoides
Análise por CG/EMExemplos
Acidic/neutral drugs resolved to baseline Acidic / neutro drogas resolvidos com a base de referência
Análise por CG/EM
1.Methprylon2. Butalbital3. Amobarbital4 Meprobamate
5. Glutethimide6. Phenobarbital7. Methaqualone8 Primidone4. Meprobamate 8. Primidone
Figure 1a Analyze underivatized acidic drugs or basic drugs under the same conditions, using an Rxi™‐5ms column (http://www.restek.com/aoi_forensics_A002.asp)
Análise por CG/EMExemplos
Análise por CG/EM
Sensitive analysis for basic drugs in free base form
1. Amphetamine2. Methamphetamine3. Nicotine4 Cotinine
8. Phencyclidine9. Methadone10. Cocaine11 Scopolamine4. Cotinine
5. Caffeine6. Benzphetamine7. Ketamine
11. Scopolamine12. Codeine13. Alprazolam
Figure 1b Analyze underivatized acidic drugs or basic drugs under the same conditions, using an Rxi™‐5ms column (http://www.restek.com/aoi_forensics_A002.asp.)
Análise MS/MSExemplos
Análise MS/MS
Atividades:
• Entregar a Atividade 3;
• 28/09 (sexta) – Reservado para Atividade 4:“Encontrar e resumir em 2‐3 páginas um artigoEncontrar e resumir em 2‐3 páginas um artigo cientifico publicado na Quimica Nova sobre o Uso d GC/MS li â i ”de GC/MS em analises orgânicas”
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