crzp.uniag.skcrzp.uniag.sk/prace/2011/l/2af4ec9d17194dc8bc6d3200eb6… · web viewsýtosť leptín...
TRANSCRIPT
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE
NÁZOV FAKULTYNÁZOV VYSOKEJ ŠKOLY
3132815
DIZERTAČNÁ PRÁCA
2011 Ing. Zuzana LIESKOVSKÁ
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE
FAKULTA AGROBIOLÓGIE A POTRAVINOVÝCH ZDROJOV
GENETICKÉ MARKERY PORÚCH METABOLIZMU
LIPIDOV A VÝŽIVY ĽUDÍ
DIZERTAĆNÁ PRÁCA
Študijný program: Výživa
Pracovisko (katedra/ústav): Katedra genetiky a plemenárskej biológie
Vedúci dizertačnej práce: doc. Ing. Anna Trakovická, CSc.
Nitra 2011 Ing. Zuzana LIESKOVSKÁ
Čestné vyhlásenie
Podpísaná Zuzana Lieskovská vyhlasujem, že som záverečnú prácu na tému
„Genetické markery porúch metabolizmu lipidov a výživy ľudí“ vypracovala
samostatne s použitím uvedenej literatúry. Som si vedomá zákonných dôsledkov
v prípade, ak uvedené údaje nie sú pravdivé.
V Nitre 30. júna 2011
......................................
Poďakovanie
Ďakujem svojej školiteľke, doc. Ing. Anne Trakovickej, CSc. za vytvorenie
podmienok pre úspešné riešenie dizertačnej práce a konzultantovi Ing. Michalovi
Gáborovi, PhD. za odborné rady a nápady. V neposlednom rade chcem poďakovať
mojej rodine, priateľom a kolegom za celkovú podporu pri dokončení mojej dizertačnej
práce.
Abstract
Cieľom dizertačnej práce bola analýza génov LEP, LEPR a GHSR, ako
genetických markerov porúch metabolizmu lipidov a výživy ľudí.
Polymorfizmus génov bol identifikovaný metódami PCR-RFLP a HRM. Asociačné
štúdie boli zamerané na hodnotenie vplyvu génov LEP, LEPR a GHSR na body mass
index a hladinu cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu, triacylglyceridov
a glukózy v krvi .
Pri polymorfizme LEP génu (G-2548A) bol analyzovaný fragment s veľkosťou
242 bp. V experimentálnej skupine bola frekvencia alely A 0,46 a frekvencia alely G
0,54. Asociačné štúdie zamerané na sledovanie vplyvu genotypu na biochemické
parametre potvrdili, že ľudia s genotypom AG mali hladiny biochemických parametrov
v referenčnom intervale. Genotyp GG mal negatívny vplyv na hodnotu body mass
indexu (+2,0499), hladinu triacylglyceridov (+0,1445) a hladinu glukózy (+0,3971).
Pri polymorfizme LEPR génu (Gln223Arg) bol analyzovaný fragment s veľkosťou
416 bp. Frekvencia alely A aj alely G bola 0,50. Asociačné štúdie zamerané na
sledovanie vplyvu genotypu na biochemické parametre potvrdili, že ľudia s genotypom
AG mali hladiny biochemických parametrov v referenčnom intervale. Asociačnými
štúdiami zameranými na vplyv genotypu na biochemické parametre sme zistili
negatívny vplyv pri genotype GG, pretože zvyšuje hodnotu body mass indexu
(+1,2774), hladinu celkového cholesterolu (+0,1266), hladinu LDL cholesterolu
(+0,1108), triacylglyceridov (+0,0229) a glukózy (+0,3133).
V prípade polymorfizmu GHSR génu (T171C) bol analyzovaný fragment s
veľkosťou 593 bp. Frekvencia alely T bola 0,51 a prevažovala nad frekvenciou alely C,
ktorá bola 0,49. Asociačnými štúdiami v populácii bol zistený negatívny vplyv
genotypu CC, nakoľko zvyšuje biochemické parametre na hodnotu body mass indexu
(+2,8442), hladinu celkového cholesterolu (+0,2598), hladinu HDL cholesterolu
(+0,0123), LDL cholesterolu (+0,2902) a glukózy (+0,3766). Pri genotype TC boli
hodnoty biochemických parametrov v referenčnom intervale.
Analýzou polymorfizmov génov a asociačnými štúdiami bol potvrdený vplyv
genotypov na výživový stav organizmu, preto ich môžeme považovať za kandidátske
gény porúch metabolizmu lipidov a vzniku obezity.
Táto práca bola vytvorená realizáciou projektu „Excelentné centrum ochrany
a využívania agrobiodiverzity“ ITMS: 26220120015, na základe podpory operačného
programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja
a projektu VEGA – 1/0061/10.
Kľúčové slová: genetické markery, LEP, LEPR, GHSR,
Abstract
The aim of the thesis was to analyze the LEP, LEPR and GHSR genes as
markers for genetic disorders of lipid metabolism and human nutrition. Polymorphism
of genes was identified by PCR-RFLP and HRM. Association studies were aimed at
assessing the impact of genes LEP, LEPR and GHSR on body mass index and
cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triacylglycerids and blood glucose.
In the LEP gene polymorphism (G2548A) was analysed 242 bp lenght fragment.
In a experimental group was frequency of allele A 0.46 and frequency of allele G 0.54.
Association studies aimed at monitoring the impact of genotype on biochemical
parameters confirmed that people with genotype AG had biochemical parameters in the
reference interval. GG genotype had a negative impact on the value of body mass index
(+2.0499), level of triacylglycerides (+0.1445) and glucose (+0.3971).
In LEPR gene polymorphism (Gln223Arg) was analysed 416 bp lenght
fragment. Frequency of allele A also allele G was 0.50. Association studies aimed at
monitoring the impact of genotype on biochemical parameters confirmed that people
with genotype AG had biochemical parameters in the reference interval. On the basis of
association studies focused on the impact of genotype on biochemical parameters, we
found a negative influence of the GG genotype, because it increased the body mass
index (+1.2774), total cholesterol (+0.1266), LDL cholesterol (+0.1108)
triacylglycerides (+0.0229) and glucose (+0.3133).
In the event of GHSR gene polymorphism (T171C) was analysed fragment with
length 593 bp. Frequency of allele T was 0.51 and it was in majority over frequency of
allele C, which was 0,49. Association studies in population presented negative effects of
genotype CC as it increases the value of biochemical parameters to body mass index
(+2.8442), total cholesterol (+0.2598), HDL cholesterol (+0.0123), LDL cholesterol
(+0.2902) and glucose (+0.3766). When genotype TC values were biochemical
parameters in the reference interval.
Analysis of gene polymorphisms and association studies of genotypes was
confirmed by the impact of the nutritional condition of the body, so they can be
considered as candidate genes of lipid metabolism disorders and obesity.
This work has been supported by the Excellence Center for Agrobiodiversity
Conservation and Benefit project ITMS: 26220120015 implemented under the
Operational Programme Research and Development financed by European Fund for
Regional Development and VEGA project 1/0061/10.
Key words: genetic markers, LEP, LEPR, GHSR
Obsah
Obsah.................................................................................................................................8Zoznam skratiek a značiek..............................................................................................10Úvod................................................................................................................................131 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí............................................15
1.1 Výživa a zdravie..................................................................................................151.2 Metabolizmus lipidov..........................................................................................16
1.2.1 Poruchy metabolizmu lipidov ľudí..............................................................171.3 Obezita a metódy jej merania a vyjadrenia.........................................................21
1.3.1 Fyziologická regulácia príjmu potravy a výdaja energie............................211.3.2 Genetická determinácia obezity..................................................................24
1.4 Genetická determinácia porúch metabolizmu lipidov.........................................281.5 Genetické markéry...............................................................................................29
1.5.1 Jednonukleotidový polymorfizmus – SNP- Single nukleotid polymorphism.................................................................................................................................30
1.6 Gény obezity a metabolizmu lipidov....................................................................311.6.1 Leptín a leptínový receptor..........................................................................32
1.6.1.1 Biologická funkcia leptínu a leptínového receptoru......................................321.6.1.2 Polymorfizmus leptínu a leptínového receptoru............................................361.6.1.3 Leptín a lipidový metabolizmus....................................................................38
1.6.2 Ghrelín a ghrelínový receptor......................................................................381.6.2.1 Biologická funkcia ghrelínu a ghrelínového receptoru.................................381.6.2.2 Polymorfizmus génov ghrelínu a ghrelínového receptoru............................421.6.2.3 Ghrelín a lipidový metabolizmus..................................................................44
1.7 Metódy molekulovej diagnostiky......................................................................441.7.1 PCR - Polymerázová reťazová reakcia........................................................451.7.2 RFLP - Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov.............................491.7.3 PCR – RFLP................................................................................................501.7.4 Real- time PCR............................................................................................501.7.5 HRM - High Resolution Melting.................................................................51
2 Cieľ.............................................................................................................................523 Materiál a metodika....................................................................................................53
3.1 Študovaná populácia..........................................................................................533.2 Metódy molekulovo-genetickej analýzy.............................................................55
3.2.1 Izolácia DNA...............................................................................................553.2.1.1 Izolácia DNA vysoľovacou metódou (Miller et al., 1988)...........................553.2.1.2 Izolácia DNA komerčným kitom NucleoSpin Blood....................................563.2.1.3 Overenie prítomnosti DNA.................................................................................573.2.1.4 Meranie koncentrácie a čistoty vzoriek...............................................................57
3.2.2 Polymerázová reťazová reakcia a jej modifikácie.........................................583.2.2.1 Leptín (LEP)..................................................................................................583.2.2.2 Leptínový receptor (LEPR)..........................................................................603.2.2.3 Ghrelínový receptor (GHSR).......................................................................62
3.2.3 Elektroforéza.................................................................................................633.3 Biochemická analýza...........................................................................................633.4 Matematicko – štatistické vyhodnotenie výsledkov............................................64
3.4.1 Genetická štruktúra.......................................................................................643.4.2 Variabilita biochemických parametrov a asociačné štúdie.........................66
8
4 Výsledky a diskusia....................................................................................................674.1 Analýza génu LEP...............................................................................................68
4.1.1 PCR-RFLP analýza.....................................................................................684.1.2 PCR-HRM analýza......................................................................................694.1.3 Genotypová štruktúra podľa génu LEP.......................................................704.1.4 Vplyv génu LEP na variabilitu biochemických parametrov........................724.1.5 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty..............74
4.2 Analýza LEPR génu............................................................................................754.2.1 Genotypová štruktúra podľa génu LEPR.....................................................764.2.2 Vplyv génu LEPR na variabilitu biochemických parametrov.....................784.2.3 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty.............79
4.3 Analýza GHSR génu...........................................................................................804.3.1 Genotypová štruktúra podľa génu GHSR....................................................814.3.2 Vplyv génu GHSR na variabilitu biochemických parametrov....................834.3.3 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty.............85
4.4 Analýza diferencií medzi skupinami...................................................................854.4.1 Korelačná analýza.......................................................................................87
5 Záver...........................................................................................................................906 Návrh na využitie výsledkov......................................................................................92Zoznam použitej literatúry..............................................................................................93Prílohy...........................................................................................................................115
9
Zoznam skratiek a značiek
A, G, T, C, U dusikaté bázy (adenín, guanín, tymín, cytozín, uracil)
ACD antikoagulačný roztok
ACTH adrenokortikotropný hormón
AFLP Amplified Fragment Lenght Polymorphism –
polymorfizmus dĺžky amplifikovaných fragmentov
AgRP Agouty-related Proteín – agouti-súvisiaci proteín
AMK aminokyselina
ARC arcuate nucleus
ATP adenozín trifosfát
BE tlmivý roztok
BMI body mass index
bp base pairs – bázový pár
BSA bovinný sérový albumín
CHOL cholesterol
CTP cytozín trifosfát
db diabetes
DGGE denaturačná gradientová gélová elektroforéza
DMSO dimetylsulfoxid
DNA deoxyribonukleová kyselina
dNTP doexyribonukleotid trifosfát
GHRL ghrelínový gén
GHSR ghrelínový receptor
GLU glukóza
GTP guanín trifosfát
Hae III reštrikčný enzým
HCl kyselina chlorovodíková
HhaI reštrikčný enzým
HpaII reštrikčný enzým
HRM High Resolution Melting – analýza teploty topenia pri
vysokom rozlíšení
HVI hmotnostnovýškový index
EDTA kyselina etyléndiamíntetraoctová
10
ETL lokusy ekonomických znakov
HDL high density lipoprotein – lipoproteín s vysokou hustotou
Hinf I reštrikčný enzým
HVI hmotnosť výškového indexu
kb kilo base pairs – počet bázových párov
KHCO3 hydrogénuhličitan draselný
LDL low density lipoprotein – lipoproteín s nízkou hustotou
LEP leptín
LEPR leptínový receptor
LweI reštrikčný enzým
MAS marker assisted selection – markermi podporovaná
selekcia
MC4R melanokortínový receptor 4
Mg2+ horečnatý katión
MspI reštrikčný enzým
NaCl chlorid sodný
NaOH hydroxid sodný
NH4Cl chlorid amónny
NHT normálna hmotnosť tela
NPY neuropeptid Y
ob obezita
PCR Polymeraze Chain Reaction – Polymerázová reťazová
reakcia
POMC pro-opiomelanokortín
QTL lokusy kvantitatívnych vlastností
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA – polymorfizmus
náhodne amplifikovanej DNA
RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism –
Polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov
RHT relatívna hmotnosť tela
SDS sodná soľ dodecylsulfátu
SNP Single Nucleotid Polymorphism – polymorfizmus jedného
nukleotidu
11
SSCP Single strand conformational polymorphism – analýza
jednovlákonového konformačného polymorfizmu
TAE elektrolyt
TAG triacylglyceridy
Taq polymeráza
TBE vodivý roztok
TE elučný roztok
TGGE teplotná gradientová gélová elektroforéza
Tm temperature of melting – teplota topenia
Tris tris-hydroxymetyl aminometán
TTP tymín trifosfát
VLDL very low density lipoprotein – lipoproteín s veľmi nízkou
hustotou
WHR pomer obvodu pásu a bokov
12
Úvod
Úvod
Vo výžive organizmov platia všeobecné zákony, ktoré sa uplatňujú aj vo výžive
človeka. Ich poznanie je základným predpokladom poznania existencie životných dejov
života samotného. Podľa nich možno poznať povahu dejov, zaradiť ich do jednotlivých
kategórií a využiť k prospechu zvierat a človeka. Aby bolo možné jednotlivé deje
skúmať, je potrebné poznať najprv činitele, ktoré ich ovplyvňujú, podmieňujú a určujú.
Výživa je súbor nevyhnutných látok na rast, vývoj, stavbu a obnovu tkanív, na
zabezpečovanie a udržiavanie fyziologických funkcií organizmu. Výživou organizmy
dostávajú energiu potrebnú na vykonávanie životných funkcií.
Veľký vplyv na vznik chorôb má výživa, životospráva, životné prostredie, ale aj
infekčné choroby a lieky.
Choroby ontogenetické sú nadobudnuté počas prenatálneho vývoja a počas post
natálneho života človeka, sú súčasťou fenotypu človeka. Veľká časť nadobudnutých
chorôb sa nededí z dôvodu, že ich nositelia sú postihovaní vysokou chorobnosťou
(morbiditou), neplodnosťou (sterilitou) alebo včasnou úmrtnosťou (mortalitou).
Hlavným predpokladom fungovania organizmu je prijímanie potravy v súlade
s geneticky danými požiadavkami druhu a organizmu podľa jeho veku, pohlavia,
činnosti, zdravotného stavu a prostredia, v ktorom žije.
Obezita v súčasnosti predstavuje globálny celospoločenský problém. Ide
o nadmerné ukladanie energetických zásob v podobe tuku z rôznych príčin. Dochádza
k nej ak je príjem energie väčší ako výdaj. Obezita je fenoménom modernej doby a patrí
medzi multifaktoriálne ochorenia, pričom na jej vzniku sa podieľa aj genetika.
Charakteristická je etiopatogenetická zložitosť obezity, jej nenápadný a pomalý priebeh
s ničivými zdravotnými dôsledkami. Výskumami sa zistilo, že významnú úlohu
v regulácii príjmu a výdaja energie zohrávajú molekuly hormonálnej povahy ako leptín,
ghrelín a iné.
Tukové tkanivo nie je len zásoba nadbytočnej energie. Je to plnohodnotný orgán,
ktorý úzko komunikuje s mozgom a zásadne zasahuje do celkového metabolizmu
organizmu. Čím je toto tkanivo väčšie, tým viac narušuje fyziologickú rovnováhu vo
viacerých systémoch a tým sa stáva rizikovejším pre organizmus ako celok.
13
Úvod
Leptínový gén bol identifikovaný v roku 1994 pomocou pozičného klonovania.
Jeho mutácia sa pokladá za podklad fenotypu extrémnej obezity a neplodnosti ob/ob
myší. Po klonovaní leptínového génu myší, potkanov a ľudí, boli vyklonované viaceré
homológy niektorých cicavčích druhov, vrátane domácich zvierat. Väčšina výskumu,
ktorý nasledoval po objavení tohto hormónu, sledoval úlohu leptínu v regulácii telesnej
hmotnosti, zameriavajúc sa na objasnenie patofyziológie obezity.
Ghrelín popísali japonskí vedci v roku 1999 ako fyzický ligand z "orphan"
receptoru GHS1a, ktorý je špecifický pre skupinu syntetických peptidov (rastový
hormón secretagogues - GHS) stimulujúci sekréciu rastového hormónu. Plazmatické
hladiny ghrelínu odrážajú krátkodobé zmeny príjmu potravy, rovnako ako dlhodobé
zmeny vo výživovom stave organizmu. Bolo potvrdené, že sa znížili po príjme potravy
u zdravých jedincov. U obéznych ľudí a tiež u pacientov s mentálnou anorexiou sú
zvýšené počas hladovania. Plazmatické hladiny ghrelínu človeka negatívne korelujú s
indexom telesnej hmotnosti, množstvom telesného tuku, veľkosťou adipocytov a
plazmatickou hladinou inzulínu, glukózy a leptínu. Preto ghrelín zrejme hrá úlohu ako
metabolický signál hladu.
14
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
1 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
1.1 Výživa a zdravie
Organizmus človeka potrebuje pre svoje fungovanie sedem základných
komponentov: bielkoviny, sacharidy, tuky, vitamíny, minerálne látky, stopové prvky
a voda, ktoré plnia rôzne funkcie.
Kaput (2006) popísal, že nutričný stav je komplexný fyziologický a morfologický
stav, ktorý je podmienený genetickou výbavou, fyziologickou aktivitou a množstvom
a kvalitou prijatej stravy.
Už vyše 20 rokov je v oblasti verejného zdravia problém, ktorý spôsobuje
ochorenia vyplývajúce z nekvalitnej stravy, nadmerného kalorického príjmu a sedavého
spôsobu života. Z toho dôvodu vyplýva nutnosť nutričného výskumu. Rýchly vývoj
v oblasti prírodných vied, predovšetkým genetiky, vytvorili významné príležitosti pre
výživu.
Napriek mnohým významným pokrokom, vnímanie verejnosti je jedným
z konfliktných a mätúcich výživových a zdravotných správ, ktoré môžu naďalej
zhoršovať nepodložené zdravotné tvrdenia ohľadom funkčných potravín a doplnkoch
stravy (Hooper, 2006; Howard, 2006) a nedostatočné nároky na osobné zdravie
(Janssens, 2008; Katsanis, 2008).
Rovnako ako výskum v úlohe výživy v prevencii chorôb (Green, 2003), je rastúci
záujem o úlohu výživy v optimalizácii zdravia vo všetkých fázach života a s tým
súvisiace nástroje potrebné pre riadne vyčíslenie zdravia s cieľom preukázať blahodárny
vplyv diétnych zmien. Nutričný stav vyvoláva nepatrné zmeny vo funkciách organizmu,
ktoré sú ťažko odhaliteľné. Tieto malé rozdiely sú však extrémne dôležité v určovaní
rizika chronických ochorení v dlhšom časovom horizonte. V dôsledku toho značné
úsilie bolo vyvinuté na charakterizovanie vzťahu stravy a zdravia prostredníctvom
rozvoja pohybu a ostatných funkčných biomarkerov (Williams, 2008).
15
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
1.2 Metabolizmus lipidov
Lipidy sú najdôležitejšou energetickou rezervou organizmu a podieľajú sa až 50%
na získavaní energie v biologických oxidáciách. Denne sa metabolizuje 100g lipidov, z
ktorých sa uvoľňuje 3760 kJ (900 kcal). Asi polovica tukov organizmu je uložená v
podkožnom tkanive, ďalej sa nachádzajú okolo obličiek, v brušnej dutine (omentum), v
oblasti pohlavných orgánov a vo svaloch (Zadák, 2002).
Lipidy sú dôležitou zložkou všetkých buniek a majú významnú úlohu ako stavebné
látky tela. Popri bielkovinách a sacharidoch patria k základných výživným látkam,
ktorými naše telo kryje spotrebu svojej energie. Odhliadnúc od esenciálnych mastných
kyselín, ktoré sa musia privádzať stravou, príjem tukov nie je bezpodmienečne
potrebný, pretože ich môžu nahradiť sacharidy. Denný príjem tukov závisí vo veľkej
miere od výživy, preto je individuálne veľmi rozdielny (Burkhardtová, 2007).
Lipidy sa neustále obmieňajú, uvoľňujú zo zásob, transportujú krvou a
metabolizujú, alebo sa opäť ukladajú do iných tukových tkanív. Ľudský organizmus ich
uskladňuje vo veľkom množstve, na rozdiel od malých zásob glykogénu. Uvoľňujú
najväčšie množstvo energie, ale aj napriek tomu sú po sacharidoch druhým
bezprostredným zdrojom energie pre človeka (Zadák, 2002).
Periférny metabolizmus lipidov riadi hypotalamus cez sympatický nervový
systém, a tieto akcie sú nezávislé od príjmu potravy (Diéquez, 2011).
Lipidy ľudského organizmu sa rozdeľujú na triacylglyceroly (neutrálne tuky),
fosfolipidy a cholesterol.
Triacylglyceroly slúžia predovšetkým ako energetická zásoba, fosfolipidy a
cholesterol sa zúčastňujú na výstavbe bunkových membrán, hormónov a iných
funkčných molekúl. Organizmus človeka je schopný syntetizovať väčšinu vyšších
karboxylových kyselín, okrem tých, ktoré majú v molekulách prítomnosť dvojitých
väzieb. Sú to esenciálne vyššie karboxylové kyseliny, ktoré sa využívajú pri syntéze
dôležitej skupiny lipidov prostaglandínov. Z vyšších karboxylových kyselín sa v
potrave človeka vyskytujú najčastejšie kyselina stearová C18, kyselina palmitová C 16 a
nenasýtená kyselina olejová s C18 (Zadák, 2002).
Cholesterol, látka podobná tuku, je dôležitý stavebný prvok bunkových membrán,
vytvára základnú konštrukciu pre niektoré hormóny. Najväčšia časť cholesterolu sa
tvorí v pečeni. Vyskytuje sa predovšetkým v živočíšnych tukoch. Tvorbu ďalšieho
cholesterolu spúšťajú výlučne nasýtené mastné kyseliny (Burkhardtová, 2007).
16
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Lipoproteíny možno izolovať z krvi a stanoviť ich koncentráciu (množstvo)
rôznymi laboratórnymi metódami. Medzi najčastejšie používané techniky patrí
ultracentrifugácia pri vysokých otáčkach a elektroforéza. Podľa použitej techniky sa
lipoproteíny aj označujú. V súčasnosti prevláda označenie podľa ultracentrifugačného
delenia, a preto sa stretávame s pojmami lipoproteíny s veľmi nízkou, nízkou alebo
vysokou hustotou a pod. (Kopecká et al., 2003).
Lipidy sú jednou z tried veľkých biologických molekúl. Sú to estery vyšších
karboxylových kyselín (nasýtených alebo nenasýtených) a alkoholov, respektíve ich
derivátov. Patria do skupiny nepolárnych molekúl biogénneho pôvodu. Tieto zlúčeniny
zdieľajú jednu dôležitú vlastnosť: majú malú alebo žiadnu afinitu k vode. Hydrofóbne
chovanie lipidov je založené na ich molekulovej štruktúre. Napriek tomu môžu mať
niektoré polárne väzby spojené s kyslíkom, preto sa skladajú väčšinou z uhlovodíkov.
I keď sú menšie ako skutočné (polymérne) makromolekuly, sú lipidy vysoko
rozmanitou skupinou, líšiacou sa ako v tvare, tak vo funkcii. Medzi lipidy zaraďujeme
vosky a niektoré pigmenty (Campbell a Reece, 2006).
Vysoký príjem tukov stravou je veľmi vážny výživový problém vo väčšine
vyspelých štátov sveta.
1.2.1 Poruchy metabolizmu lipidov ľudí
Najdôležitejšou poruchou metabolizmu lipidov sú hyperlipidémie, ktoré sa
vyznačujú:
1. zvýšením hodnoty jednej alebo viacerých sérových frakcií lipidov (sérové
frakcie lipidov sú : cholesterol, triacyglyceroly, estery cholesterolu, fosfolipidy)
2. zmenou ich väzby na proteínový nosič. Táto väzba je veľmi dôležitá, v nej
spočíva podstata metabolickej poruchy. Pre hyperlipidémie sa preto zvyčajne
používa výstižnejší názov hyperlipoproteinémie.
Hyperlipoproteinémie sa delia na primárne a sekundárne.
1.Primárne hyperlipoproteinémie sú geneticky podmienené a väčšina z nich sa
vyskytuje familiárne (familiárne hyperlipoproteinémie).
2.Sekundárne hyperlipoproteinémie vznikajú druhotne pri niektorých iných
ochoreniach.
Primárne hyperlipoproteinémie sú veľmi častou metabolickou poruchou, u nás
postihujú asi 5% obyvateľstva. Sú významným rizikovým faktorom predčasného vzniku
17
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
aterosklerózy. Poznanie spôsobu ich dedičnosti má veľký preventívny význam, pretože
klinické a laboratórne vyšetrenie členov rodiny pacienta umožní zistiť ich prípadné
postihnutie často už v predklinickom štádiu ochorenia a uplatniť u nich preventívne
opatrenia (Kopecká et al., 2003).
Tuk je organická látka, ktorú orgány tela využívajú na zabezpečenie energie pre
svoju činnosť. Rezervný telesný tuk má veľký energetický potenciál, a preto je pre
organizmus veľmi významný. Tuky sa zúčastňujú aj na tvorbe štruktúr orgánov
a zabezpečovaní ich funkcie, sú nosičmi iných látok, ktoré sú v nich rozpustné (napr.
vitamíny), ovplyvňujú imunitu, inflamáciu, karcinogenézu a iné fyziologické
a patologické procesy (Beňo, 2008).
Tuk uložený v tukovom tkanive je výnimočný systém energetickej zásoby, ktorý
môže byť použitý na látkovú premenu, ak si to bude vyžadovať momentálna situácia,
napríklad pri dlhotrvajúcom hladovaní. Za normálnych podmienok existuje rovnováha
medzi tukovými zásobami a energetickými požiadavkami organizmu.
Môžeme rozlišovať dva typy tuku:
Biely tuk: je bohatý na TAG, uložený v podkoží a okolo orgánov ľudského tela.
Má ochrannú úlohu a slúži ako zásobáreň energie
Hnedý tuk: chudobný na TAG. Je uložený na určitých miestach organizmu ako
šija, pazuchy, medzi lopatkami a rebrami. Je významný pre tvorbu tepla s cieľom
udržať telesnú teplotu v normálnom rozmedzí (Covisa, 2006).
Tuk vytvorený z nasýtených kyselín označujeme ako nasýtený tuk. Väčšina
živočíšnych tukov je nasýtená ich mastné kyseliny nemajú dvojité väzby. Nasýtené
živočíšne tuky, ako napríklad masť alebo maslo, sú pri izbovej teplote pevné. Naopak
rastlinné a rybie tuky sú obvykle nenasýtené, čo znamená, že sú vytvorené z jedného
alebo viacerých typov nenasýtených mastných kyselín. Pretože sú pri izbovej teplote
obvykle tekuté, sú označované rybie a rastlinné tuky ako oleje – napríklad kukuričný
olej alebo olej z treščích pečienok. Ohyby, v ktorých sa nachádzajú dvojité väzby,
zabraňujú molekulám aby sa k sebe tesne priblížili, a stali sa tak pri izbovej teplote
tuhými. Termín „hydrogenované rastlinné oleje“ na štítkoch potravín znamená, že
nenasýtené oleje boli synteticky premenené na nasýtené tuky pridaním vodíkov.
Arašidové maslo, margarín a mnohé ďalšie produkty sú hydrogenované, aby lipidy
neboli schopné premeny na tekutú (olejovú) formu (Campbell a Reece 2006).
Diéta bohatá na nasýtené tuky je jedným z niekoľkých faktorov, ktoré môžu
prispievať ku kardiovaskulárnemu ochoreniu známemu ako ateroskleróza. Pri tejto
18
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
chorobe sa na vnútornej výstelke krvných ciev vytvárajú usadeniny označované ako
pláty, čím bránia prietoku krvi a znižujú pružnosť ciev (Campbell a Reece, 2006).
Cholesterol je lipid zo skupiny steroidov. Sumárny vzorec je C27H45OH. Jeho
názov pochádza z gréčtiny: chole znamená žlč a stereos znamená pevný, pretože
cholesterol prvýkrát izolovali zo žlčových kameňov.
Cholesterol je bežnou zložkou membrán živočíšnych buniek a slúži tiež ako
prekurzor, z ktorého sú syntetizované ostatné steroidy. Cholesterol je významnou
molekulou u živočíchov, pretože jeho vysoká hladina v krvi môže viesť k ateroskleróze.
Cholesterol sa nachádza v bunkovej membráne eukaryotických buniek. V ľudskom
tele sa nachádza vo všetkých tkanivách vrátane krvi. Väčšina telesného cholesterolu
nepochádza zo stravy, ale syntetizuje sa priamo v organizme. Najväčšia koncentrácia
cholesterolu je v tkanivách, kde sa cholesterol syntetizuje (pečeň), alebo kde sa
nachádzajú pevnejšie bunkové membrány (mozog, miecha).
Cholesterol je známy v súvislosti s kardiovaskulárnymi ochoreniami spojenými so
zvýšenou hladinou LDL v krvi (ateroskleróza, hypercholesterolémia) (Campbell
a Reece, 2006).
Cholesterol hrá niekoľko štrukturálnych a metabolických rolí, ktoré sú v ľudskej
biológii životne dôležité. Hoci sa cholesterol šíri po celej plazmatickej membráne
bunky, kde sa moduluje fluidita, tiež sa koncentruje v špecializovaných
sfingolipidových doménach (Podar, Anderson, 2006). Okrem toho, cholesterol je
substrátom pre steroidné hormóny (Pasqualini, 2005). Príliš veľa cholesterolu
v bunkách môže mať patologické dôsledky. To platí najmä pre bunky v stenách tepien,
kde nahromadenie cholesterolu spúšťa aterosklerotické kardiovaskulárne ochorenie
(Yuan et al., 2006).
19
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Obrázok 1: Štruktúra cholesterolu
(prekreslené podľa Campbell a Reece, 2006)
HDL je skratka pre anglický názov "high density lipoprotein" a znamená
lipoproteín s vysokou hustotou. HDL cholesterol je odborný názov pre "dobrý"
cholesterol a v krvi je transportovaný HDL lipoproteínmi z jednotlivých buniek do
pečene, kde sa vylučuje do žlče a premieňa na žlčové kyseliny potrebné pri trávení
tukov (Kollár, 1996).
LDL je skratka pre anglický výraz "low density lipoprotein" a v preklade znamená
lipoproteín s nízkou hustotou. LDL cholesterol je odborný názov pre "zlý" cholesterol,
ktorý je transportovaný LDL lipoproteínmi k jednotlivým bunkám. Lipoproteíny sú
častice, ktoré sú rozpustné v krvi. Cholesterol ich potrebuje, aby mohol putovať v krvi,
je nimi obalený, pretože sám je v krvi nerozpustný. Z VLDL vzniká LDL. Obsah
triglycerolov v LDL je 10 %. Vysoké hodnoty LDL znamenajú vysoké hodnoty
cholesterolu v krvi (Kollár, 1996).
VLDL (veľmi nízka hustota lipoproteínov) sú tvorené pečeňou a transportujú
tuky, ktoré sa do pečene dostali s chylomikrónmi, k iným orgánom a tkanivám. VLDL
obsahujú 65 % triglycerolov a 15 % cholesterolu (Kollár, 1996).
Triglyceridy (neutrálne tuky) slúžia bunkám ako palivo na získavanie energie.
Prijímajú sa potravou (mäso, údeniny, mlieko, syry, orechy, rastlinné oleje) alebo sa
tvoria z alkoholu a sacharidov v tele. Hodnoty triglyceridov sú teda závislé od vnútornej
regulácie metabolizmu tukov a od vonkajších vplyvov. Pri výžive bohatej na tuky sa
trigylceridy čiastočne usadzujú ako zásoba energie v tukovom tkanive a v pečeni.
K zvýšeniu (hypertriglyceridémia) dochádza pri výžive bohatej na tuky, nadváhe,
zvápenatení ciev, cukrovke, zníženej činnosti štítnej žľazy, ochoreniach obličiek
a podžalúdkovej žľazy, zdedených poruchách metabolizmu tukov a nadmernom
používaní alkoholu. K zníženiu môže dôjsť pri zvýšenej činnosti štítnej žľazy
(Burkhardtová, 2007).
Tabuľka 1: Hodnoty lipidov v mmol.l-1 a rizikových indexov (Beňo, 2008)
N R L
Celkový cholesterol (T-CH) <5,2 5,2 – 6,2 6,2 <
20
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Celkové triacylglyceroly (T-TAG) <1,7 1,7 – 2,2 2,2 <
Cholesterol LDL (LDL-Ch) <2,6 2,6 – 3,4 3,4<
Cholesterol HDL (HDL-Ch) >1,3 1,3 – 1,0 1,0 >
Index T-Ch: HDL-Ch N< 5,2< L
Index LDL-Ch : HDL-Ch N < 3,5< L
Hodnota: N – normálna, R – riziková, L – vyžaduje liečbu
1.3 Obezita a metódy jej merania a vyjadrenia
Obezita je metabolické ochorenie charakterizované nadmernou hmotnosťou tela
a vyvolané pozitívnou bilanciou energie, pričom sa extrémne zvyšuje množstvo
zásobného tuku v podkoží (subkutánne) a vnútrobrušne (intraabdominálne). Následkom
pozitívnej dusíkovej bilancie môže byť súčasne aj nárast svalovej hmoty, najmä
u mužov (Beňo, 2008).
Obezita je výsledkom kombinovaného účinku génov, životného prostredia
a životného štýlu (Kopelman, 2000).
1.3.1 Fyziologická regulácia príjmu potravy a výdaja energie
Obezita sa stala hlavným problémom verejného zdravia ako dôsledok narastajúcej
prevalencie a je významnou príčinou morbidity a mortality vo väčšine rozvinutých
krajín sveta. Vzniká ako dôsledok porušenej rovnováhy medzi príjmom potravy
a výdajom energie organizmu. Udržiavanie energetickej rovnováhy je komplexne
regulovaný proces, na ktorom sa zúčastňujú neuróny syntetizujúce široké spektrum
neurotransmiterov (Kalra et al., 1999; Berthoud, 2002). Neurálna kontrola a regulácia
príjmu potravy a výdaja energie spočíva v troch úzko prepojených procesoch: vstup –
integrácia – výstup. Vstup predstavuje prísun informácií z periférie do mozgu, a to
humorálnou a nervovou cestou prostredníctvom signálnych látok akými sú inzulín,
ghrelín, leptín. Experimentálne práce ukázali, že mozog nie je schopný bez týchto
signálov samočinne regulovať energetické pomery v organizme. Integrácia je zložitý
proces, v ktorom majú významnú úlohu viaceré nervové okruhy vychádzajúce z
21
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
rôznych oblastí mozgu, ktoré spracúvajú množstvo informácií. Výstup je odpoveď
regulačného centra smerom k periférii, pričom cieľom výstupu je aktivácia takých
regulačných a kompenzačných mechanizmov na periférii, aby sa v daných podmienkach
dosiahol čo najoptimálnejší stav energetických pomerov v organizme (Bell et al., 2005).
Predpokladá sa, že hlavným regulačným centrom pre reguláciu príjmu potravy a
výdaja energie je hypotalamus (Kalra et al., 1999; Wilding, 2002). Zo 40 štruktúr
hypotalamu má významnú úlohu v regulácii príjmu potravy a výdaja energie najmenej 5
oblastí: nucleus arcuatus, nucleus paraventricularis, nucleus ventromedialis, nucleus
dorsomedialis a laterálny hypotalamus (Kalra et al., 1999; Berthoud, 2002). Tieto
oblasti obsahujú neuróny, ktoré na základe účinku na reguláciu príjmu potravy možno
rozdeliť na dve veľké skupiny, orexigenické a anorexigenické. Orexigenické neuróny
syntetizujú orexigenicky pôsobiace látky agouti-podobné proteíny - AgRP a
neuropeptid Y - NPY, ktoré zvyšujú príjem potravy, a tým aj telesnú hmotnosť.
Anorexigenické neuróny syntetizujú anorexigenické látky (pro-opiomelanokortín –
POMC, a kokaínu a amfetamínu podobné transkripty - CART), ktoré pôsobia opačne
(Obrázok 2).
22
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Obrázok 2: Schématické znázornenie regulácie príjmu potravy a výdaja energie
(prepracované podľa Bell et al., 2005)
Najväčší význam pri vzniku obezity majú faktory prostredia (Obrázok 3), kam
radíme prísun vysoko energetickej potravy, nesprávne stravovacie návyky ľudí,
používanie jedla na zvládanie stresu a podobne. Hoci sa faktory prostredia podieľajú na
vzniku obezity až 75%, genetické faktory majú takisto značný podiel na jej vzniku
(Ichihara a Yamada, 2008).
23
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Obrázok 3: Vplyv genetických a negenetických faktorov na vznik obezity
(upravené podľa Heather Dodds, 2007)
1.3.2 Genetická determinácia obezity
Podľa typu dedičnosti delíme obezitu na monogénnu, syndrómovú a polygénnu.
Monogénna obezita vyplýva z alterácie jedného génu. Viaceré monogénne formy
ľudskej obezity boli identifikované vďaka objavu mutácií homologických segmentov
spôsobujúcich obezitu myší. Medzi najvýznamnejšie mutácie spájané s monogénnou
obezitou patria mutácie leptínu (LEP), leptínového receptora (LEPR), ghrelínu (GHRL)
a ghrelínového receptora (GHSR), pro-opiomelanokortínového génu (POMC),
melanokortínového receptora 4 (MC4R), prohormón konvertázy 1 (PC1), mutácia
SIM1 a neurotropného tyrozín-kinázového receptora 2 (Bell et al., 2005).
Monogénová obezita je podmienená mutáciou v jednom z 11 doteraz známych
génov (Farooqi et al., 2008; Tolston et al., 2010). Patofyziológia excesívneho ukladania
tuku u monogénových obezít je pomerne dobre objasnená: v dôsledku mutácie
dochádza k narušeniu leptín-melanokortínovej osi (Hochberg et al., 2010; Bochukova et
al., 2010), ktorá zohráva veľmi dôležitú úlohu v neuronálnej kontrole pocitu sýtosti
a hladu, teda udržiavaní energetickej homeostázy organizmu (Coll et al., 2007; Lee
24
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
2009). Podľa Farooqi (2008) a Ichiharu a Yamada (2008) možno na základe miesta
porušenia leptín-melanokortínovej osi rozdeliť obezitu na obezitu spôsobenú:
1.Mutáciou génu leptín a mutáciou leptínového receptora
2.Mutáciou POMC (proopiomelanokortín)
3.Mutáciou PC1 ( prohormón konvertáza 1)
4.Mutáciou MC4R (melanokortínový receptor 4)
5.Mutáciou BDNF (mozgový neurotropný faktor) a jeho receptora
TrkB (tyrozín kinázový receptor B)
Podľa odhadov sa monogénovo podmienená obezita vyskytuje u 3-4% všetkých
obéznych pacientov (Farooqi et al., 2005; Ranadive a Vaise, 2008).
Za syndrómovú obezitu považujeme obezitu, ktorá sa vyskytuje v kontexte
rôznych iných klinických príznakov, akými sú napríklad mentálna retardácia, vývinové
abnormality a iné. V dnešnej dobe je známych viac ako 20 rôznych syndrómov
charakterizovaných obezitou, ktoré súvisia s genetickými poruchami, chromozómovými
aberáciami, môžu byť autozomálne aj gonozomálne. Najčastejšie sa vyskytujú Prader-Williemsov, Cohenov, Alströmov a Bardet-Biedlov syndróm (Ichihara a Yamada, 2008; Lee, 2009 ).
Posledným typom je polygénna obezita, ktorá je spôsobená poruchou viacerých génov súčasne, pričom tieto gény jednotlivo majú iba malý efekt na telesnú hmotnosť (Willer et al., 2009; Hinney et al., 2010). Kumulatívny efekt génov sa stáva signifikantný vtedy, keď je prítomná interakcia s faktormi prostredia (prejedanie sa, redukcia telesnej aktivity, hormonálne zmeny a socioekonomické faktory predisponujúce k ich fenotypovej expresii) (Willer et al., 2009; Hinney et al., 2010; Hetherington a Cecil, 2010).
Obezita je rizikovým faktorom pre hypertenziu, diabetes mellitus II. typu,
hyperlipidémiu, aterosklerózu, ako aj obličkové a žlčníkové kamene. Nadváha o viac
ako 40 % je spojená s dvojnásobnou pravdepodobnosťou predčasnej smrti. Príčiny
obezity sú málo známe. U dvoch kmeňov myší s extrémnou obezitou a diebetes mellitus
II. typu boli objavené po jednom defektnom géne pričom defektný gén ob[obezita],
ktorý je exprimovaný iba v bielom tukovom tkanive, potom v plazme chýba proteín
leptín s molekulovou hmotnosťou 16 kDa kódovaný práve génom ob. Injekcie leptínu
myšiam s homozygotnou mutáciou génu ob normalizuje symptómy génového defektu,
25
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
podaním normálnym myšiam vedie k ich chudnutiu. Ak je naproti tomu mutovaný gén
db, je defektný leptínový receptor v hypotalame. V plazme síce cirkulujú vysoké
koncentrácie leptínu, ale hypotalamus na ne nereaguje. U niektorých obéznych ľudí je
defektný tiež gén pro leptín, u väčšiny ostatných je však zvýšená koncentrácia leptínu
v plazme. U týchto ľudí sa predpokladá prerušená spätnoväzbová reťaz za leptínom.
Predpokladajú sa nasledujúce možnosti defektu :
Leptín už nemôže prechádzať hemato-encefalickou bariérou
Je porušený inhibičný účinok leptínu na sekréciu neuropeptidu Y (NPY)
v hypotalame, ktorý stimuluje príjem potravy a znižuje spotrebu energie
Leptín nevyvoláva v hypotalame uvoľnenie α-MSH (hormón stimulujúci α-
melanocyty = melanokortínu), ktorý tam pôsobí prostredníctvom receptorov MCR4
a má opačný účinok než NPY (Silbernagl a Lang, 2001).
Body Mass Index (BMI)
Bežne užívaný parametra BMI vyjadruje jednoduchý prepočet hmotnosti jedinca
na štvorcový meter jeho povrchu. Je najčastejšie používaným parametrom v diagnostike
nadváhy a obezity u detí aj dospelých. WHO stanovilo určité hraničné hodnoty BMI,
ktoré sú spätá s vyššou morbiditou a mortalitou prípadne metabolickými
a kardiovaskulárnymi chorobami a ďalšími pridruženými ochoreniami (Bienertová-
Vaškú, 2009).
Tabuľka 2: Doporučená klasifikácia podváhy, nadváhy a obezity podľa BMI
Klasifikácia BMI [kg.m-2]podváha < 18,50
normálna hmotnosť 18,50 – 24,99
ľahká nadváha 25,00 – 29,99
obezita I. triedy 30,00 – 34,99
obezita II. triedy 35,00 – 39,99
obezita III. triedy ≥ 40,00
Zdroj: podľa WHO
26
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Hodnoty BMI nemusia bezprostredne zodpovedať stupňu akumulácie tukového tkaniva
u niektorých populácii rôznych etník. Na základe rôznej telesnej konštitúcie môžu byť
medzi etnikami rozdiely vzájomnom pomere tukového a netukového tkaniva a ich
celkovom podiele na hmotnosti organizmu. Bolo potvrdené, že asociácia medzi BMI,
percentom telesného tuku, distribúciou telesného tuku a kardiovaskulárnym rizikom sa
medzi populáciami líši napr. v ázijskej populácii pri BMI hlboko pod 25 kg.m-2 je
vysoký výskyt diabetes mellitus II. typu a kardiovaskulárnych chorôb, pričom
v černošskej populácii nie je tento vzťah pozorovaný ani pri zvýšenom BMI
(Eisenmann et al.,2004).
V praxi sú využívané aj ďalšie indexi:
Rohrerov ponderálny index (Rohrerov index RI alebo ponderálny index PI)
definovaný ako hmotnosť.výška-3. Jeho použitie je časté v neonatológii.
Benneov index definovaný ako hmotnosť/výškap, kde je p populačný špecifický index
nezávislý na výške (Chinn et al., 1992; Poskitt, 1995).
Podľa relatívnej hmotnosti tela (RHT) vypočítanej kalkuláciou z hmotnostno-
výškového indexu (HVI) alebo z hmotnostno-výškových tabuliek, pričom normálna
hmotnosť tela NHT = 100 %, sa obezita klasifikuje do 3 stupňov.
Tabuľka 3: Relatívna hmotnosť tela a klasifikácia obezity (Beňo, 2008)
Stupeň RHT[%] Obezita
I 120-140 ľahkáII 140-200 výraznáIII viac ako 200 chorobná
Podľa distribúcie tuku zistenej na základe pomeru obvodu pásu a obvodu bokov (WHR)
sa rozlišuje obezita:
androidná (viscerálna, abdominálna) s tukom lokalizovaným predovšetkým na
trupe a v abdominálnej (viscerálnej) oblasti,
27
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
gynoidná (periférna) s tukom lokalizovaným najmä v oblasti bedier a stehien,
teda v gluteofemorálnej oblasti (Beňo, 2008).
1.4 Genetická determinácia porúch metabolizmu lipidov
Genetická informácia organizmu uložená v jadre sa nazýva genóm. Ľudský genóm
je zložený z 23 chromozómových párov a ich analýzou sa zaoberá Projekt ľudského
genómu, ktorý bol zahájený v roku 1990. Jedná sa o medzinárodný vedecký výskumný
projekt s hlavným cieľom zmapovať celý ľudský genóm, hlavne určiť úplné
nukleotidové sekvencie DNA na každom ľudskom chromozóme. V roku 2003 bolo
oficiálne ukončené sekvenovanie ľudských chromozómov. Napriek tomu ale do
dnešného dňa nie je známy presný počet génov. Predpokladaný počet je 30 000 – 40
000, potvrdených bolo 19 533 proteín-kódujúcich sekvencií a identifikovaných bolo
ďalších 2 188 úsekov DNA, pri ktorých je predpoklad, že sa tiež jedná o kódujúce
sekvencie. Tento počet je oveľa nižší než sa predpokladalo pred Projektom ľudského
genómu (Little, 2005).
Z celého genómu tvoria kódujúce oblasti len 2%, ostatné časti sú tvorené
nekódujúcimi sekvenciami, intrónmi, pseudogénmi, ktoré majú význam z hľadiska
ochrany genómu a regulačnými úsekmi, ktoré kontrolujú expresiu génov (Makałovski,
2001).
Obrázok 4 : Schéma rôznych častí sekvencií v ľudskom genóme ( Makałovski, 2001)
28
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Obrázok 5: Karyotyp a Idiogram človekaZdroj: bioweb.genezis.eu
1.5 Genetické markéry
Súčasný rozvoj molekulovej genetiky a rastúce množstvo poznatkov
o polymorfizme DNA vedie k uplatňovaniu molekulovo-genetických metód
v diagnostike porúch metabolizmu. Základná cesta vedie cez identifikáciu genetických
markérov, ktoré ovplyvňujú základné metabolické dráhy (Trakovická et al., 2005).
Genetický markér je molekulárna charakteristika na úrovni DNA, ktorou sa dajú
jedinci rozlíšiť. Vykazuje monogénnu dedičnosť a je v asociácii s genetickou
variabilitou fyziologického alebo morfologického znaku (Bežo et al., 2010).
V súčasnosti sa metódy molekulovej genetiky využívajú predovšetkým na
testovanie a vyhľadávanie genetických markérov (mapovanie génov a QTL, asociačné
vzťahy), ktoré v spojení s fyziologickou funkciou génov. Takéto informácie sú
významným zdrojom k skvalitneniu diagnostiky ukazovateľov zdravia a nutričného
stavu organizmu (Sršeň a Sršňová, 2005).
Podľa Knoll a Urban, (2002) sú pre využívanie genetických markérov
v diagnostike dôležité ich základné charakteristiky:
- musia byť tvorené sekvenciami báz na špecifickom mieste genómu (lokus), ktoré
vykazujú individuálnu variabilitu
- môžu byť súčasťou exónovej alebo intrónovej časti genetickej informácie
- majú kodominantný typ dedičnosti, na základe ktorej možno rozlíšiť homozygota od
heterozygota
29
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
- možno ich testovať bez ohľadu na vek a fyziologický stav organizmu a pohlavie
Z uvedených dôvodov sa do popredia dostávajú nové typy genetických
markérov, ktoré boli v minulosti označované ako markéry I a III. typu
- SNP (Single Nucleotid Polymorphism): jedná sa o polymorfizmus jednotlivých
nukleotidov, ktorý je výsledkom bodových mutácií. SNP sekvencie sú ľahko
detekovateľné a zvyčajne sa vyskytujú v rámci kódujúcich sekvencií funkčných génov
(Čepica, 2002).
- EST (Expressed Sequence Tags) predstavujú krátke jedinečné sekvencie cDNA
používané na identifikáciu exprimovaného génu a jeho sekvencií. V budúcnosti sa
predpokladá využitie EST pre štúdium organizácie a regulácie génov, ako aj pre rýchlu
selekciu zvierat v rannom veku (Webb, 2000).
Gén, pri ktorom sa predpokladá významný vplyv na fyziologickú vlastnosť je
označovaný ako kandidátny gén.
Kandidátne gény sú sekvencie úsekov DNA, pri ktorých je známy
polymorfizmus (vyskytujú sa vo viacerých formách v populácii), ich transkripčný
(mRNA) alebo translačný produkt (proteín, enzým, hormón) sa priamo alebo nepriamo
podieľa na fenotypovom prejave znaku resp. vlastnosti organizmu. Pri výbere
kandidátnych génov je dôležité poznať ich fyziologickú a biochemickú funkciu. Pri
využívaní kandidátnych génov vychádzame z porovnávacích štúdií príbuzných druhov
(Trakovická et al., 2005; Miluchová et al., 2009).
1.5.1 Jednonukleotidový polymorfizmus – SNP- Single nukleotid polymorphism
Jednonukleotidové polymorfizmy (Single Nucleotide Polymorphisms – SNPs)
predstavujú najfrekventovanejší typ polymorfizmu vyskytujúcich sa každých 50 až 500
bp. Početné zastúpenie a vysoká variabilita SNP markérov v genóme organizmov
umožňuje ich použitie pri identifikácii ľudí a zvierat (Syvänen, 2001). Vznikajú
bodovou mutáciou. SNP sú najčastejšie bialelické avšak môžu byť aj tri- alebo tetra-
alelické avšak sú veľmi zriedkavé. K mutáciám, ktoré podmieňujú vznik SNPs patria
30
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
tranzície (výmena C za T, G za A), tranverzie ( C za G, A za T, C za A, T za G) a
inzercie/delécie (vloženie/ strata nukleotidu) (Duran et al., 2009).
SNP genotypizácia je meranie genetických variácií jednonukleotidových
polymorfizmov (SNPs) medzi členmi druhu. SNP je jediná mutácia bázových párov na
konkrétne miesto, zvyčajne sa skladá z dvoch alel (kde frekvencia alely je > 1%). SNP
je možné zistiť, že etiológia mnohých ľudských chorôb je stále predmetom osobitného
záujmu vo farmakogenetike. SNPs boli zachované v priebehu evolúcie a boli navrhnuté
ako markery pre použitie lokusov kvantitatívnych vlastností (QTL) analýzy a asociačné
štúdie v mieste mikrosatelitov. Použitie SNP je rozšírené v projekte HapMap, ktorý má
za cieľ poskytnúť minimálnu sadu SNP potrebných ku genotypovaniu ľudského
genómu. SNP môžu tiež slúžiť ako genetický odtlačok pre použitie testovania identity
(Rapley a Harbron, 2004).
Zvýšený záujem o SNP sa odrazil v rýchlom vývoji rôznorodých metód SNP
genotypizácie.
1.6 Gény obezity a metabolizmu lipidov
Systém regulácie metabolických dráh lipoidov a udržiavanie telesnej hmotnosti si
vyžaduje integráciu periférnych signálov a ich centrálnu koordináciu v mozgu. Klúčové
postavenie v tomto systéme má hypotalamus, ktorý funguje ako centrálny regulátor.
Informácie o energetickom stave organizmu sa dostávajú do hypotalamu cestou
neuronálnou a cestou humorálnych signálov (Bell et al., 2005).
Kľúčovú úlohu humorálnej signalizácii zabezpečujú gény leptín a jeho receptor
a ghrelín a jeho receptor.
31
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Tabuľka 4: Gény súvisiace s obezitou a metabolizmom lipidov (Bell et al., 2005; Ichihara a Yamada, 2008)
Gén Lokus Polymorfizmus Popis dbSNP
Angiotensin-converting enzyeme (ACE) 17q23 240 A-T súčasť metabolizmu
angiotenzinogénu rs4291
Β2-Adrenergic receptor (ADRB2)
Β3-Adrenergic recptor (ADRB3)
5q31-q32
9p12
Arg16GlyGln27Glu
znižujú aktivitu receptoru
rs1042713rs1042714
rs4994
Ghrelín (GHRL) 3p26 Gln90LeuLeu72Met
reguluje príjem potravy a telesnú váhu,
ovplyvňuje žalúdočnú motilitu
rs4684677rs696217
Ghrelín receptor (GHSR) 3p26 171 T-C reguluje príjem potravy a telesnú váhu rs495225
Leptín (LEP) 7q31.3 G2458Aovplyvňuje výšku BMI, je spájaný s nadváhou a
obezitours7799039
Leptín receptor (LEPR) 1p31 Gln223Arg ovplyvňuje výšku BMI a množstvo tuku rs1137101
Melanocortine receptor 4 (MC4R) 18q22 Arg7Cys
podieľa sa na centrálnej regulácii energetickej homeostázy a telesnej
hmotnosti
rs1047214
Proopiomelanocortin (POMC) 2p23.3 G7013T
podieľa sa na regulácii energetického príjmu a
vedie k obezite
rs121918111
Tumor necrosis factor-α (TNFA) 6p21.3 308A-G mení transkripčnú
aktivitu rs1800629
Uncoupling protein 1 (UCP1)Uncoupling protein 2 (UCP2)Uncoupling protein 3 (UCP3)
4q28-q31
11q1311q13
3826A-G866G-A55C-T
ovplyvňujú váhu, BMI, WHR a sú spájané s
obezitou
rs1800592rs659366rs1800849
1.6.1 Leptín a leptínový receptor
1.6.1.1 Biologická funkcia leptínu a leptínového receptoru
Leptín ako signál pocitu nasýtenia – saturácie tukových zásob organizmu, je
produkovaný najmä bunkami bieleho tukového tkaniva, ale bola zistená syntéza leptínu
aj v iných tkanivách, napríklad v placente. Koncentrácia leptínu v krvnej plazme myší a
ľudí koreluje s triglyceridovou saturáciou tukových buniek, množstvom tukového
tkaniva a teda s výživným stavom alebo so stavom telesnej kondície. Koncentrácia
leptínu klesá pri zníženom príjme potravy a stúpa pri jeho zvýšení. Koordinová zmena
sekrécie a koncentrácie leptínu s hladinou inzulinémie a úrovňou látkovej výmeny
organizmu poukazuje na to, že jeho syntéza a inkrécia je regulovaná hormonálne
32
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
(inzulín, glukokortikoidy, inzulínu podobné rastové faktory IGF-I a pravdepodobne aj
rastový hormón) a metabolicky (Maraček et al., 2004).
Leptín je tiež známy svojou úlohu v rôznych častiach tela, ako sú mužské
a ženské pohlavné orgány, prsné žľazy, minerálna kostná denzita (hustota), imunitný
systém, črevá, obličky a pľúca (Baratta, 2002).
Jeho opis bol publikovaný v roku 1994, ale už v roku 1950 bola popísaná génová
mutácia v leptínovom géne (ob gén) u myší, ktorá viedla k rozvoju morbídnej obezity
a diabetu už v skorom veku. Leptín má v organizme radu receptorov. Dlhá forma
leptínového receptoru má v intracelulárnej doméne 303 aminokyselinových zvyškov,
zatiaľ čo krátka forma iba 34. Extracelulárne domény oboch receptorov sú zhodné
(Bronsky a Průša, 2008).
Mechanizmus účinku leptínu je známy na centrálnej a periférnej úrovni. Leptín
produkovaný bunkami tukového tkaniva sa prostredníctvom väzobných a transportných
proteínov dostáva krvným obehom do ventromediálneho jadra (nucleus ventromedialis)
hypotalamu, kde pomocou receptorov signalizujú dobrú saturáciu tukovými zásobami.
Sýtosť leptín signalizuje účinkom orexigenických peptidov na sekréciu neuropeptidu Y
(NPY), melanín-koncentrujúci hormón, AgRP, galanín a orexín, pričom menšia časť
leptínu sa dostáva aj do periférnych tkanív ako je pankreas, pečeň a svalstvo (Sahu et al.
2003, Maraček et al., 2004). Anorexigenické peptidy, ktorých expresia je ovplyvňovaná
leptínom sú pro-opimelanokortín (POMC), kortikotropín – uvoľňujúci hormón
a neurotenzín (Klok et al., 2006).
V súčasnom období je už dostatočne zrejmé, že hypotalamus zodpovedá za
reguláciu príjmu potravy a neuroendokrínnu reguláciu homeostázy energie. Ale
vzájomný vzťah medzi leptínom a ostatnými hypotalamickými mediátormi regulácie
hmotnosti tela nie sú dostatočne objasnené (Soares a Guimaraes, 2001).
Leptín je proteín produkovaný v adipocytoch. Krvou sa transportuje do mozgu,
kde pôsobí na leptínové receptory a reguluje tým apetít. Nesie v sebe informáciu o stave
tukových zásob (význam v prípade nadbytku), indukuje redukciu príjmu jedla a zvyšuje
energetický výdaj. Leptínový receptor je exprimovaný hlavne v oblastiach mozgu, ktoré
regulujú príjem jedla – neuróny oblúkovitého jadra v hypotalame a tu stimuluje
produkciu anorexigenických peptidových hormónov (Lönngvist, 1996; Bray a York,
1997; Fried et al., 2000).
33
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Niekoľko štúdií ukázalo, že diétou u obéznych je znížená schopnosť leptínu
aktivovať primerané signalizácie v hypotalame (Van Heek et al., 1997; El-Haschimi et
al., 2000; Munzberg et al., 2004).
Leptín tiež zvyšuje aktivitu sympatika na netermogénne tkanivá, vrátane obličiek
a nadobličiek (Dunbar et al., 1997). Obličky majú dôležitú úlohu v kontrole krvného
tlaku a stimuláciu sympatika, ktoré aktivuje procesy v obličkách čo vedie ku zvýšeniu
krvného tlaku (DiBona, 2004).
Leptín má zrejme priamy vplyv na krvný obeh. Leptín podporuje nahromadenie
krvných doštičiek a trombóz v mieste poranenia cievy (Nakata, 1999; Konstantinides,
2001), a indukuje oxidačný stres v rôznych endoteliálnych bunkách in vitro
(Bouloumie, 1999; Yamagishi, 2001). Obezita je spojená so zrýchlením aterotrombózy
a so zvýšeným systémovým oxidačným stresom. Je preto možné tvrdiť, že vysoká
hladina leptínu zistená u obéznych jedincov môže mať patologický efekt na cievy,
najmä ak cievny systém nie je schopný rezistencie. Preto budú potrebné ďalšie štúdie k
úplnému pochopeniu účinku leptínu a rezistencie leptínu na vaskulárne funkcie.
Ľudský LEP gén je lokalizovaný na 17. chromozóme v regióne 7q31.1 (Zhang et
al., 1994). Mammès et al. (1998) zistili, že v populácii ľudí je v promótorovom géne pre
leptín polymorfizmus G ―› A lokalizovaný na lokuse 2548. Ni et al., (2009) potvrdili
súvis polymorfizmu G2458A s nárastom BMI a WHR u ľudí s alelou G a alela A bola
frekventovanejšia u chudých ľudí.
Leptín, ako kandidátny gén pre signál pocitu nasýtenia je využívaný aj v šľachtení
hospodárskych zvierat. Expresia a sekrécia leptínu je preukazne korelovaná s reguláciou
príjmu potravy, energetickým metabolizmom a hmotnosťou tela (Campfield et al.,
1995; Remesar et al., 1997), preto je LEP gén využívaný ako markér pre hrúbku
chrbtovej slaniny, spotrebu krmiva a prírastok hmotnosti u ošípaných a hovädzieho
dobytka.
Leptínový receptor hrá dôležitú úlohu v oblasti ľudského zdravia, preto je spájaný
najmä s energetickou homeostázou, kde je jeho funkcia veľmi dôležitá. Leptínový
receptor súvisí s obezitou u ľudí. Mutácia, ktorá vedie k strate transmembránovej
a intracelulárnej domény receptora, je dávaná do súvislosti s fenotypom, ktorý zahŕňa
morbídnu obezitu a neplodnosť (Clement et al., 1998).
Okrem zapojenia leptínového receptoru do obezity, je zvýšená koncentrácia
leptínového receptoru spojená so spánkovým apnoe, nezávisle od BMI (Manzella,
34
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
2002). Výrazne nízka koncentrácia leptínu je pozorovaná u žien s endometriózou (Muy-
Rivera, 2005).
Pri mapovaní ľudského genómu bol LEPR lokalizovaný na chromozóme 1 v
oblasti 1p31 a má najmenej 5 izoforiem. Extracelulárne a transmembránové domény sú
zhodné medzi krátkou a dlhou izoformou, rozdiely sú spôsobené zmenami dĺžky
cytoplazmatickej domény. Dlhá forma (LEPR1) má 302 cytoplazmatických zvyškov
v porovnaní s krátkou formou (LEPRs), ktorej cytoplazmatické zvyšky majú rozmedzie
32 až 40 aminokyselín. Iná forma leptínového receptoru, rozpustná forma (LEPRe),
pozostávajúca z extracelulárnej domény receptoru by mala obsahovať nonintracelulárne
alebo transmembránové reziduá (Houseknecht a Prtocarrero, 1998). Baratta (2002)
identifikoval izoformy receptorov vo viacerých tkanivách, ako je hypofýza, mužské
a ženské reprodukčné orgány, prsné žľazy, imunitný systém, črevá, obličky a pľúca.
Štúdie vykonávané na myšiach ukázali, že dlhá forma by mala byť najdôležitejšia pre
prenos leptínového signálu do buniek, ktoré sa nachádzajú prevažne v hypotalame a nie
vo väčšine iných tkanív (Schwartz, 1996), zatiaľ čo krátka forma sa nachádza v celom
tele, najmä v obličkách, pľúcach a choroid plexus (Tartaglia et al., 1995). Štruktúra
leptínového receptoru je podobná ako u špirálových cytokínových receptoroch (1.
trieda). Homodimérová forma leptínového receptoru, je schopná aktivovať Janus
kinázy. Janus kináza potom začína aktiváciu transkripčnej rodiny. Leptínovú
signalizáciu pomocou Janusových kináz – štart aktivácie transkripčného systému je do
značnej miery spojená s formou LEPR 1 (Watowich a Socolovsky, 1996).
Leptínový receptor je členom rodiny cytokínov prvej triedy, tiež známy ako gp130
receptor rodiny. Na rozdiel od iných členov rodiny leptínový receptor nevytvára
oligoméry s gp130 (Nakashima et al., 1997).
35
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Obrázok 6: Biologická funkcia leptínu
1.6.1.2 Polymorfizmus leptínu a leptínového receptoru
Polymorfizmus leptínu a jeho receptora je najlepšie preštudovaný pri druhoch
mus muscullus, sus scrofa, homo sapiens.
V géne humánneho LEP boli popísané dva typy mutácií, pričom polymorfizmus
v nekódujúcej 5´ oblasti je v asociácii s nižšou koncentráciou leptínu a tým aj
s obéznym fenotypom (Mammès et al., 2000).
Je známe, že sekrécia leptínu je veľmi úzko spojená s množstvom telesného tuku
u myší, prežúvavcov a u ľudí. Existuje pozitívny vzťah medzi cirkulujúcim leptínom
a obsahom tuku (Brockman et al., 2000).
Polymorfizmus LEP génu ošípaných je známy vo viacerých substitúciách: C/T,
A/G, C/T, G/T, A/T, T/C a G/A na pozíciach 867, 1112, 3469, 3714, 2845, 3996 a 2728
(Stratil et al., 1997; Robert et al., 1998; Jiang a Gibson, 1999; Kennes et al., 2001).
Stepien-Poleszak et al. (2009) identifikovali LEP gén s využitím reštrikčného
enzýmu HinfI v pozícii 3469 pomocou PCR-RFLP. U LEP génu identifikovali 2 alely T
(0,94) a C (0,06), ktoré mali za následok dva genotypy : TC (0,12) a TT (0,88).
Metódou hybridizácie somatickej bunky bol v roku 1996 gén pre leptín
lokalizovaný na 18. chromozóme ošípanej (Neuenschwander et al., 1996). Úplnú
nukelotidovú sekvenciu leptínového génu ošípanej ako prvý popísali Ramsay et al.,
(1998).
36
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Amills (2008) uvádza, že C3469T mutácia na exóne 3 prasačieho LEP génu bola
u rozličných plemien prasiat kontroverzná vzhľadom na spojitosť s rastom, tučnotou
a úmrtnosťou. Hlavným cieľom ich práce bolo zistiť či koncentrácia leptínovej plazmy
sa líši u prasiat v závislosti od C3469T a Lepr HpaII RFLP genotypou. S týmto cieľom
boli merané hladiny plazmy leptínu 160 dní u prasiat s rozličnými Lep C3469T a Lepr
HpaII RFLP genotypomi. Ani Lep (TT: 11,68 ng.ml-1, TC: 10,71 ng.ml-1) ani Lepr (AA:
12,6 ng.ml-1, AB: 10,93 ng.ml-1, BB: 11,74 ng.ml-1) genotypy zásadne neovplyvnili
koncentráciu plazmy leptínu. Nenašli ani žiadnu spojitosť medzi Lep a Lepr genotypmi
a fenotypová odchýlka v raste a tučnote v bežnej populácii prasiat plemena Landrace.
Významné sú polymorfizmy Lys109Arg a Gln223Arg v géne leptínového
receptoru, ktoré majú typický efekt na extracelulárnu časť receptora a ktoré nevedú
k strate funkcie (van Rossum et al., 2003; Takahashi-Yasuno et al., 2004).
Mutácia Q223R bola spojená s obezitou, priberaním na váhe, zvýšením telesného
tuku aj zvýšením abdominálneho tuku (Chagnon a Wong, 2000; Wauters et al., 2001;
Yiannakouris et al., 2001; van Rossum et al., 2003; Guizar-Mendoza et al., 2005), aj
keď asociácie s obezitou v iných štúdiách potvrdené neboli (Considine et al., 1996;
Silver et al., 1997; Heo et al., 2002). Okrem toho, polymorfizmus Q223R leptínového
receptoru v kombinácii s mutáciou leptínu, bol spojený so zvýšeným výskytom non-
Hodgkinového lymfómu (Skibola et al., 2004). Polymorfizmus Q223R je tiež spojený
so zvýšenou kostnou denzitou (Koh et al., 2002), zatiaľ čo polymorfizmus A861G
súvisí s osifikáciou chrbtice (Tahara et al., 2005).
Štúdie polymorfizmu leptínového receptoru (Gln223Arg) u ľudí preukázali
spojenie s obezitou a predpovedajú variabilitu malého percenta telesnej hmotnosti a
zloženia tela v geneticky homogénnej populácii (Quinton et al., 2001; Yiannakouris et
al., 2001; van Rossum et al., 2003; Ni et al., 2009).
Analýza polymorfizmu Gln223Arg preukázala vyššiu frekvenciu genotypu GG
(69,1%) v celej sledovanej populácii. V populácii obéznych a neobéznych mužov a žien
bola vyššia frekvencia genotypu GG (Ni et al., 2009).
V asociačnej štúdii polymorfizmu Gln223Arg pre leptínový receptor Guízar-
Mendoza et al., (2005) potvrdili výrazne vyššiu frekvenciu alely G (0,70) nad alelou A
(0,30) v skupine obéznych a v skupine s normálnou hmotnosťou bola tiež potvrdená
vyššia frekvencia alely G (0,63) nad alelou A (0,38). Hodnota BMI bola v tejto štúdii
zvýšená u jedincov s genotypom GG (27,1 kg.m-2) a potvrdila sa aj vyššia hladina
glukózy (4,8 a 5,0 mmol.l-1) v krvi u obéznych jedincov.
37
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Richert et al. (2007) potvrdili v štúdii polymorfizmu malých chlapcov vyššiu
frekvenciu alely G (0,70) nad alelou A (0,30), hodnota BMI boli pre genotyp AG
najvyššia (16,1%), pre genotyp GG (15,9%) a pre genotyp AA bola hodnota najnižšia
(15,5%).
V pozorovaní starších mužov pre polymorfizmus Gln223Arg bola najvyššia
hodnota BMI pre genotyp AA (26,1), AG (25,9) a najnižšia hodnota bola pre genotyp
GG (25,4) (Crabbe et al., 2006).
Leptínový receptor je dôležitý aj v živočíšnej výrobe. U ošípaných polymorfizmus
génu leptínového receptoru bol spojený s veľkosťou vrhu, hrúbkou chrbtovej slaniny
a konverziou krmiva (Chen, 2004; Mackowski, 2005). Pri dojniciach polymorfizmus
leptínového receptoru súvisí s koncentráciou leptínu v neskorej gravidite (Liefers,
2004).
1.6.1.3 Leptín a lipidový metabolizmus
Bolo zistené, že leptín má vplyv na lipidy, ktoré môžu byť čiastočne nezávislé na
centrálne sprostredkovaných účinkoch na energetickú bilanciu (Riedy a Webwe, 2000;
Bjorbaek a Khan, 2004). Niekoľko štúdií potvrdilo účinok leptínu na metabolizmus
tukov u zvierat (Silver et al., 1999; Silver et al., 2000; Wiegman et al., 2003) aj u ľudí
(Faroogi et al., 2002).
Leptín je silný stimulátor lipolýzy a oxidácie mastných kyselín v adipocytoch a
ďalších bunkových typov. V dôsledku toho je Leptín regulátorom bunkového obsahu
triacylglyceridov (Reidy a Webwe, 2000).
Štúdia Prierue et al., (2008) naznačuje, že podávanie leptínu v krátkom období má
účinky na metabolizmus tukov.
1.6.2 Ghrelín a ghrelínový receptor
1.6.2.1 Biologická funkcia ghrelínu a ghrelínového receptoru
Ghrelín popísali japonskí vedci v roku 1999 ako fyzický ligand z "orphan"
receptoru GHS1a, ktorý je špecifický pre skupinu syntetických peptidov (rastový
hormón secretagogues - GHS) stimulujúci sekréciu rastového hormónu. Ghrelín je
multifunkčný peptidový hormón produkovaný bunkami sliznice žalúdka.
38
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Plazmatické hladiny ghrelínu odrážajú krátkodobé zmeny príjmu potravy,
rovnako ako dlhodobé zmeny vo výživovom stave organizmu. Bolo potvrdené, že sa
znížili po príjme potravy u zdravých jedincov. U obéznych ľudí a tiež u pacientov s
mentálnou anorexiou sú zvýšené počas hladovania. Plazmatické hladiny ghrelínu
človeka negatívne korelujú s indexom telesnej hmotnosti, množstvom telesného tuku,
veľkosťou adipocytov a plazmatickou hladinou, glukózy, inzulínu a leptínu. Ghrelín
hrá úlohu ako metabolický signál hladu (Bronský et al., 2004).
Vzhľadom k tomu, že úrovne ghrelínu v plazme sú úplne závislé na nedávnom
príjme potravy, tento hormón hrá zásadnú úlohu v chuti do jedla. Nedostatok spánku
podporuje tvorbu hormónu ghrelínu a tlmí produkciu hormónu leptínu. Funkciou
ghrelínu je dávať signály o príjme potravy do mozgu. Úroveň sekrécie sa zvyšuje pred
jedlom a klesá po príjme jedla. Zohráva úlohu pri vzniku obezity stimuláciou chuti do
jedla, a s tým súvisiacou zvyšujúcou sa hmotnosťou (Lakar a Fundazioa, 2009a).
Ghrelín je zložený z 28 zvyškov aminokyselín, v ktorom tretia aminokyselina,
zvyčajne serín, ale pri niektorých druhoch treonín, je modifikovaná mastnými
kyselinami; táto úprava je potrebná pre fungovanie ghrelínu. Uvoľňovanie GH z
hypofýzy môže byť regulované nielen GH uvoľňujúcim hormónom z hypotalamu, ale
aj ghrelínom pochádzajúcim zo žalúdka (Kojima et al., 1999). Ghrelín je produkovaný
na viacerých miestach, napr. v enteroendokrinných bunkách žalúdka a čriev, v
pankrease, obličkách, placentárnom tkanive štítnej žľazy, hypotalame a hypofýze. V
ľudskom organizme, ghrelín stimuluje sekréciu rastového hormónu, prolaktínu a
ACTH. Ghrelín má tiež orexigenickú činnosť (zvýšenie príjmu potravy), ovplyvňuje
spánkový cyklus, žalúdočnú motilitu a sekréciu, kardiovaskulárne funkcie, reguluje
endokrinné funkcie pankreasu, metabolizmus glukózy a má antiproliferatívny účinok.
Zohráva významnú úlohu pri energetickej homeostáze, glukózovom a lipidovom
metabolizme, reprodukcii, kardiovaskulárnej funkcii a imunite (Buczkowska, 2005).
Ghrelín je dôležitým regulátorom v rámci homeostázy v organizme a prepája
neuroendokrínne a metabolické reakcie organizmu na hladovanie, a je považovaný za
antagonistu leptínu.
Ghrelín je peptidový hormón produkovaný bunkami žalúdka, ktorý povzbudzuje
chuť do jedla tým, že pôsobí na arcuate nucleus, čo je oblasť kontrolujúca príjem
potravy. Jedná sa o orexigén, ktorý za podmienok hladu cirkuluje v krvi. To naznačuje,
že odovzdáva signál hladu z periférií do centrálneho nervového systému. Ghrelín hrá
39
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
dôležitú úlohu pre udržanie uvoľňovania a energetickej homeostázy stavovcov (Kojima
a Kangawa, 2008).
Stimulácia ghrelínom v mozgu, vedie k zvýšenému apetítu a tiež podporuje
ukladanie tukov vo viscerálnych tukových tkanivách, ktoré sú lokalizované
v abdominálnej časti tela. Zvýšené riziko vzniku diabetes mellitus II. typu, zvýšenie
krvného tlaku, zvýšenie triglyceridov, hypercholesterolémia a vznik metabolického
syndrómu súvisí so zvýšeným ukladaním tukových zásob práve v abdominálnej oblasti
(Lakar a Fundazioa, 2009b).
Po príjme glukózy alebo jedla s vysokým obsahom tuku, výrazne klesá hladina
ghrelínu. Bielkoviny na výšku hladiny ghrelínu nemajú vplyv (Greenman et al., 2004).
Patterson et al., (2005) zistil, že u jedincov s normálnou hmotnosťou postupné
zníženie hladinu ghrelínu spôsobuje zvýšenie kalorickej hodnoty potravín.
Ghrelínový gén sa skladá zo štyroch exónov a troch intrónov a vytvára
rôznorodosti orexigenických peptidov rovnako ako des-acyl ghrelín a obestatin, ktoré
vykazujú vlastnosti spôsobujúce anorexiu. Ghrelín stimuluje syntézu neuropeptidu Y
(NPY) a agouti-súvisiaci proteín (AgRP) arcuate nucleus v hypotalame a zadnom
mozgu prostredníctvom svojho receptora (GHSR).
Ghrelínový receptor produkujúce neuróny modulujú činnosť orexigénnych NPY /
AgRP a anorexigénnych POMC / CART pro-opiomelanocortin neurónov (Kojima
a Kangawa, 2008).
Apetít je stimulovaný pozitívnym účinkom na NPY/AgRP neuróny, ktoré
exprimujú ghrelínové receptory. Pôsobí kratšie ako leptín a inzulín. Ghrelínové
receptory sú situované v hypofýze (sprostredkujú uvoľňovanie rastového
hormónu), v hypotalame na NPY neurónoch (stimulujú príjem potravy) a tiež v srdci
a svaloch. Jeho sérové hladiny sa zvyšujú medzi jedlami, tesne pred jedlom stúpa a po
jedle prudko klesá (Bouchard et al., 1993; Cummings a Schwartz, 2003; Cowley a
Grove, 2004).
Úloha ghrelínu ako stimulantu chuti do jedla sa opiera o súčasné výsledky
potvrdené u potkanov, ktoré odhalili zrušenie cirkulácie endogénneho ghrelínu
s neutrálnymi protilátkami, a taktiež bola pozorovaná znížená chuť do jedla a príjem
potravy (Zorrilla et al., 2006).
Ghrelínový receptor sprostredkováva signalizáciu prechodu cez hematoencefalickú
bariéru a týmto spôsobom môže mať ghrelín vplyv v oblasti mozgu, ktorá je chránená
hematoencefalickou bariérou (Banks et al. 2002).
40
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Periférny účinok ghrelínu sa realizuje prostredníctvom svojho pôsobenia na
blúdivý nerv (leRoux et al., 2005).
Ghrelín a leptín nie sú len molekuly schopné ovplyvniť činnosť neurónov
NPY/AgRP v ARC, ale ghrelín je jediný známy periférny signál, ktorý stimuluje chuť
do jedla a zvýšenie príjmu potravy, t.j. orexigenický efekt sprostredkovaný týmito
neurónmi. Avšak pridaním leptínu vzniká anorexigenický efekt týchto neurónov
sprostredkovaný pri niekoľkých ďalších metabolických signáloch, napr. glukóza,
inzulín, cholecystokonín, pankreatický polypeptid (PP), peptid YY (PYY) a leptín
(Tung et al., 2001; Traebert et al., 2002; Abizaid a Horváth, 2008).
V posledných štúdiách sa uvádza, že podávaný ghrelín zvyšuje vyprázdňovanie
žalúdka pri normálnej hmotnosti zdravého človeka (Levin et al., 2006).
Rovnaké pozorovania boli zaznamenané u osôb s diabetom a idioplastickou
gastroparézou (Murray et al., 2005; Tack et al., 2005). Okrem toho, plazmická
koncentrácia endogénne acetylovaného ghrelínu bola negatívna a koreluje s polčasom
vyprázdňovania žalúdku. Zaujímavé je, že toto spojenie nebolo pozorované u obéznych
jedincov a že akcia ghrelínu by sa mohla zmeniť v závislosti od úrovne obezity (Valera
et al., 2005).
Bolo potvrdené, že podávaný ghrelín (0,33µg.kg-1) nemal významný vplyv na
zmeny v objeme žalúdku pred a po jedle. Tiež nebol zistený vplyv na vyprázdňovanie
žalúdka u obéznych alebo pri jedincoch s normálnou hmotnosťou (Cremonini et al.,
2006). Rozpory v týchto výsledkoch by mohli byť závislé v množstve podávaného
ghrelínu. Väčšina publikovaných štúdií sa zaoberá úlohou ghrelínu v regulácii pohybov
a sekrécie žalúdočnej kyseliny. Avšak účinky ghrelínu sa môžu líšiť u obéznych
jedincov v porovnaní s osobami s normálnou telesnou hmotnosťou.
Funkcia ghrelínu je najlepšie preštudovaná na experimentálnych zvieracích
modeloch. Napríklad u potkanov ako žalúdočný hormón reguluje príjem potravy
a energetický metabolizmus prostredníctvom centrálneho mechanizmu, ale významne
zoslabuje diferenciáciu preadipocytov do adipocytov tukového tkaniva (Zhang et al.,
2004).
Štúdiom genómov stavovcov (myš, potkan) bolo potvrdené, že účinok GRHL a
GHSR je spojený s obezitou alebo celým radom metabolických syndrómov a
metabolizmom lipidov (Kissebah et al., 2000; Wu et al., 2003).
41
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Tieto zistenia a poznanie biologickej funkcie týchto proteínov predurčujú gény
kódujúce ghrelín a ghrelínový receptor, za kandidátske gény pre štúdium obezity
a chorobami súvisiacimi s poruchami metabolizmu lipidov.
1.6.2.2 Polymorfizmus génov ghrelínu a ghrelínového receptoru
Gén ghrelínu je lokalizovaný na chromozómovom lokuse 3p26-p25, prekurzor
proteínového hormónu je kódovaný 4 exónmi, ktoré majú dĺžku 5kb a obsahuje 20 bp
nekódujúceho prvého exónu (Seim et al., 2007; Marger, 2008).
Obrázok 7: Gén ghrelínu a obestatínu (chromozóm 3p25.3) (prerobené podľa
Gueorguiev et al., 2009)
Gén ghrelínového receptoru je lokalizovaný na krátkom ramene 3. chromozómu
v lokuse 3p26.
Pre gén ghrelínového receptoru boli pozorované viaceré genetické varianty
(obrázok 8). Bolo nájdených 7 variant, z ktorých 5 bolo jednonukleotidového
polymorfizmu (SNPs), ktorým sa nemenil aminokyselinový kód bielkovín. Týchto 5
mutácií sa nespája s obezitou alebo s rastom. Avšak, boli nájdené dve genetické
varianty, ktoré spôsobujú zmenu poradia aminokyselín vo funkčnom proteíne a majú za
následok zníženie aktivity receptora. Mutácia Ala204Glu vplývala na rozvoj morbídnej
obezity a Phe279Leu mala vzťah k retardácii rastu u detí (Wang et al., 2004; Pantel et
al., 2006).
42
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Obrázok 8: Ghrelínový receptor (chromozóm 3q26.2) (prerobené podľa Gueorguiev, 2009)
Vartainen et al., 2004 vo svojej štúdii potvrdili pre polymorfizmus 171C >T vyššiu
frekvenciu alely T (68,5). Hodnota BMI bola najvyššia v genotype CC a najnižšia
v genotype CT, rovnako ako hladina HDL cholesterolu v krvi bola najvyššia pri
genotype CC a najnižšia pri genotype TC.
Na základe jednonukleotidového polymorfizmu identifikovali mutáciu
polymorfizmu 171T/C Wang et al., (2004) a Miyasaka et al., (2006).
Analýzu mutácie Phe279Leu v géne ghrelínového receptora popísal Holst et al.,
(2004). Uvádzajú, že aminokyselina 279 je lokalizovaná v ligande väzbového klbka
v receptore a hrá kľúčovú úlohu v jeho aktivite. Z uvedeného vyplýva, že mutácia
Phe279Leu významne ovplyvňuje konštruktívnu aktivitu ghrelínového receptora.
Wang et al., (2004) potvrdil vplyv alely T na nárast telesnej hmotnosti a vysoké
BMI.
Miyasaka et al., (2006) uvádzajú, že vplyv mutácie T v polymorfizme 171T/C na
rozvoj bulímie, a asociácia s anorexiou a poruchami príjmu potravy nebola potvrdená.
Autori uvádzajú až 45,4% v testovanej skupine malo rizikový genotyp TT.
Gueorguiev et al., 2009 vo svojej štúdii nepotvrdili žiadne významné asociácie
polymorfizmu rs 495225 s hladinou insulinémie a glykémie.
Vyššiu frekvenciu alely T (0,70) nad alelou C (0,30) pre polymorfizmus
ghrelínového receptoru 171T/C potvrdila aj štúdia Campa et al., (2010).
43
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Campa et al., (2010) zrovnávacou štúdiou českej a nemeckej populácie obéznych
pacientov potvrdili asociáciu polymorfizmov rs27647 a rs35683 (GHSR a GHRL)
s vysokým rizikom vzniku rakoviny. Významným bol predovšetkým polymorfizmus
rs27647 pričom má uplatnenie v ochrane pred iniciáciou karcinogenézy.
Hubáček et al., (2007) analyzovali ghrelínový polymorfizmus Arg51/Gln
a Leu72/Met metódou PCR, a hodnotili asociáciu identifikovaných mutácii s body
mass indexom (BMI). Okrem toho hodnotili albumín ako marker malnutrície a plazmu
lipidov ako rizikový faktor pre aterosklerózu pacientov s hemodyalýzou, u ktorých
malnutrícia a intenzívna ateroskleróza prináša komplikácie. Zistili, že nositeľ najmenej
jednej Gln51 a Met72 alely stráca telesnú hmotnosť rýchlejšie ako Arg51Gln, Leu72Met
homozygot. Nositeľ Gln51 alely bol vo vyššom riziku rozvinutia vysokej hladiny
cholesterolu.
1.6.2.3 Ghrelín a lipidový metabolizmus
Nezávisle od zmien v príjme potravy bol zistený účinok ghrelínu na zvyšovanie
telesného tuku (Tschop et al., 2001).
Aj autori Muccioli et al., (2002), Ukkola (2003), Van Der Lely et al., (2004),
Chanoine a Wong (2004), a Gauna et al., (2004) potvrdili významný vplyv ghrelínu na
metabolizmus lipidov a glukózy.
Ghrelín má špecifický účinok na metabolizmus lipidov, ktorý bol potvrdený aj pri
liečbe hlodavcov (AG), u ktorých nastalo zvýšenie obsahu tuku nezávisle od prijatého
množstva krmiva (Tschop et al., 2001; Lall et al., 2001; Tschop et al., 2002; Korbonits,
2004).
1.7 Metódy molekulovej diagnostiky
Metódy molekulovej diagnostiky sa zameriavajú na vyhľadanie rozdielov
v sekvenciách DNA a identifikáciu polymorfizmu v celej genómovej, chromozómovej,
mitochondriálnej, chloroplastovej alebo plazmidovej DNA alebo polymorfizmus
špecifických génov, prípadne ich častí. Za predpokladu, že rozdiely v sekvencii DNA
ovplyvňujú určité fenotypové znaky, môžu tieto metódy nahradiť iné diagnostické
techniky (napr. biochemické alebo sérologické). Zámerom použitia jednotlivých metód
44
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
je spravidla identifikácia alebo typizácia študovaných vzoriek, ktoré môžu poskytnúť
informácie dôležité pre rozlíšenie jedincov, liečbu chorôb, vyhľadanie zdroja
patogénnych organizmov, uskutočnenie preventívnych opatrení alebo fylogenetické
štúdie. Metódy založené na analýze DNA majú na rozdiel od fenotypových metód
100% typovateľnosť, pretože všetky organizmy DNA obsahujú. Genotypové
diagnostické metódy sú rýchle a často nevyžadujú kultiváciu buniek (Šmarda et al.,
2005) .
1.7.1 PCR - Polymerázová reťazová reakcia
Polymerázová reťazová reakcia (PCR – Polymerase Chain Reaction) je
v súčasnosti jednou z najpoužívanejších techník v molekulovej biológii a v molekulovej
genetike. Využíva sa na amplifikáciu t. j. namnoženie špecifických úsekov DNA
pomocou enzymatickej syntézy in vitro (Trakovická et al., 2005). Výhodou PCR je to,
že umožňuje získať požadovanú a špecifickú sekvenciu genómovej DNA bez
predchádzajúceho klonovania vo vektoroch (Šmarda et al., 2005).
Metóda PCR (Polymerase Chain Reaction) bola vyvinutá americkým vedcom K.
B. Mullisom v roku 1986, za čo bol ocenený Nobelovou cenou za chémiu v roku 1993.
Podstatou PCR metódy je in vitro syntéza definovaného úseku DNA vo veľkom
množstve kópií. Množí sa iba definovaný úsek do takého množstva kópií, ktoré je
potom možné elektroforeticky identifikovať.
Princípom PCR metódy je syntéza DNA rýchlou zmenou teploty reakčnej zmesi
cyklickým opakovaním. Jeden cyklus sa skladá z nasledovných krokov: denaturácia
DNA, annealing (hybridizácia oligoprimerov) a polymerizácia (syntéza DNA na
matrici).
V prvom kroku sa pôvodná dvojvláknová molekula DNA denaturuje na jednotlivé
vlákna. V druhom kroku sa znížením teploty primery (špecifické oligonukleotidové
sekvencie) selektívne hybridizujú podľa princípu komplementarity s denaturovanou
jednovláknovou DNA. Rýchlosť a špecifickosť hybridizácie závisí od veľkosti primerov
a hybridizačnej teploty. Hybridizačná teplota je volená na základe špecifických
vlastností konkrétnych primerov. V treťom kroku sa pri zvýšení teploty stáva vzniknutý
komplex substrátom pre DNA polymerázu, ktorá syntetizuje dvojvláknovú DNA
identickú s pôvodnou DNA. Novosyntetizované PCR produkty následne slúžia ako
45
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
templáty, takže počet molekúl sa za optimálnych podmienok v každom cykle
zdvojnásobí (Griffiths et al., 2002).
PCR reakcia si vyžaduje tieto nevyhnutné zložky:
Templátová DNA: na amplifikáciu špecifického úseku stačí malé množstvo DNA
s nízkou kvalitou, izolovaná z periférnej krvi, semena, chlpov alebo sterov z ústnej
dutiny. Čistota DNA zvyšuje špecifitu reakcie. Používaná DNA nesmie byť
kontaminovaná a krvné vzorky musia byť bez hemoglobínu (proteolýza, extrakcia
organickými rozpúšťadlami), ktorý inhibuje PCR (Higuchi, 1989).
Taq DNA polymeráza: termostabilná DNA polymeráza je kľúčovou zložkou úspešnej
PCR reakcie. Predstavuje vysoko aktívnu, 5´→3´ DNA závislú DNA polymerázu, ktorá
katalyzuje postupné pripájanie nukleotidov k templátu (denaturovaná jednovláknová
DNA). Rýchlosť polymerizácie je 60 – 150 nukleotidov za sekundu, pričom
polymerizačná rýchlosť závisí od teplotných a chemických podmienok. Reakčné
optimum vykazuje Taq DNA polymeráza v intervale 70 - 80 oC, pri 37 oC nemá 5
´exonukleázovú aktivitu (Tindal a Kunkel, 1988).
Horčík (MgCl2): koncentrácia horčíkových iónov má výrazný vplyv na špecifitu
amplifikácie. Optimálnou koncetráciou je spravidla 1 - 2 mM (pre 200 μM dNTP a 1 -
2 U enzýmu). Nadbytok horčíkových iónov vedie k akumulácii nešpecifických
produktov, nízka koncentrácia redukuje alebo úplne eliminuje výťažnosť PCR reakcie
(Petruska a Goodman, 1988). Výsledná koncentrácia Mg2+ sa pre každý templát a pár
primerov stanovuje empiricky. Potrebné je zohľadniť fakt, že dNTP viažu ióny horčíka,
preto by mala byť koncentrácia Mg2+ vyššia ako koncentrácia dNTP (o 0,5 – 1,0 mmol).
Nukleotidy (dNTP): sú zmesou voľných deoxyribonukleotidov: ATP, GTP, TTP, CTP.
Optimálna koncentrácia dNTP sa pohybuje v rozmedzí 50 - 200 μM. Nadmerná
koncentrácia vedie k vyššej miere chybného zaradenia (Petruska a Goodman, 1988).
Zvyšovanie koncentrácie nukleotidov v reakčnej zmesi je neopodstatnené. Ak by bola
koncentrácia každého nukleotidu 0,2 mmol-1 postačovalo by to na syntézu až 12,5 g
DNA, pričom by sa inkorporovala iba polovica nukleotidov a zároveň inhibovala
aktivita Taq DNA polymerázy (Gefland, 1989).
Primery: vymedzujú amplifikovaný úsek templátovej DNA, pričom priamy primer
(FOR) sa viaže na jedno vlákno, spätný primer (REV) na druhé vlákno podľa princípu
komplementarity. Veľkosť primerov sa pohybuje v rozsahu 15 - 30 nukleotidov, s
46
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
rovnakým obsahom GC párov. Vhodná koncentrácia primerov v PCR reakčnej zmesi je
10 -100 pmol.
Základné požiadavky na primery zosumarizovali Saiki a Gefland (1988):
1. primery musia hybridizovať na jednotlivých reťazcoch 3´ koncami oproti
sebe, aby tak ohraničili úsek určený na amplifikáciu. Optimálna dĺžka na
amplifikáciu je 300 bp, max. do 1500 bp
2. vhodná dĺžka primera je 18 - 25 báz. Kratšie primery môžu hybridizovať na
inom úseku, dlhšie primery sa reasociujú dlhšie a teplota annelingu musí byť
vyššia, čo nie je výhodné
3. teplota topenia (Tm – melting point) obidvoch primerov by mala byť
rovnaká, aby zabezpečila hybridizáciu v rozsahu teplôt 45 - 60 oC, ale
zároveň uchovala hybrid stabilný (72 oC)
4. obsah G a C párov by mal byť zhodný a mal by sa pohybovať v rozsahu 40 -
60 %
5. prísne komplementárne k sekvencii templátu na 3´ konci primeru (počiatok
polymerizácie), na 5´ konci naopak môžu byť modifikované. Doporučuje sa
aby 3´ koniec obsahoval 2 - 3 G alebo C nukleotidy
6. primery nesmú tvoriť slučku, sekundárne útvary, diméry a pod.
7. pri výbere miesta hybridizácie na templáte DNA je vhodné zvoliť na jeho 3´
konci prvú, alebo druhú polohu AK kodónu, lebo v týchto miestach čítacieho
rámca je vyššia pravdepodobnosť konzervácie bázy
Teplotný a časový režim: úspešnosť amplifikácie závisí od vhodného teplotného
režimu, zahŕňajúceho denaturačnú, hybridizačnú a polymerizačnú teplotu. Denaturačná
teplota má byť čo najvyššia, no nesmie inaktivovať enzým (90 - 95 oC).
Vysokomolekulárna DNA vyžaduje o niečo vyššiu denaturačnú teplotu, dlhšiu dobu,
aby bola zaistená kompletná denaturácia, (napr. pre DNA eukaryí 95 oC po dobu 5 min.)
(Saiki a Gelfand, 1988). Hybridizačná teplota sa vypočítava z Tm (teplota topenia,
melting temperature) pre konkrétne sekvencie primerov a pre dané reakčné podmienky.
Platí čím menšia je komplementarita medzi primermy a templátovou DNA, tým nižšia
je hybridizačná teplota v porovnaní s vypočítanou Tm (Petruska a Goodman, 1988).
Polymerizačná teplota je 72 - 75 oC.
Špecifita amplifikácie: je určovaná predovšetkým výberom primerov. Primery dlhšie
ako 18 báz by mali teoreticky zaistiť dostatočnú špecifitu amplifikovaného úseku
v rámci DNA eukaryí. Použitie čo najnižšej koncentrácie primerov a čo najvyššej
47
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
teploty annealingu zabraňuje nešpecifickej hybridizácii primerov (mispriming).
Zníženie koncentrácie solí a množstva enzýmu má tiež obdobný vplyv. Zdrojom
nešpecifických produktov môže byť aktivita Taq DNA polymerázy pri laboratórnej
teplote, kedy pred PCR vznikajú rôzne artefakty, pretože pri nízkej teplote sa viažu na
rôznych miestach templátu. Uvedený jav eliminuje horúci štart (hot start), pri ktorom sa
niektoré kľúčové zložky pridávajú až pri dosiahnutí teploty blízkej denaturačnej.
Reakcia teda nemôže začať skôr ako sú dosiahnuté optimálne podmienky. Pre zvýšenie
špecifity amplifikácie sa vo veľmi dôležitých prípadoch používajú jeden alebo dva tzv.
vnútorné primery (nested primer), ktoré zabezpečia namnoženie vnútorného úseku
cieľovej sekvencie. Teplotný režim je upravený tak, že najprv sa hybridizujú len
vonkajšie primery, v ďalších cykloch len vnútorné primery, (Grankvist, 1992; Zazziet a
Romano, 1992).
V prípade slabého výsledku je možné do reakčnej zmesi pridať špecifické
enhancery, napr. glycerol, formamid, BSA, DMSO alebo PEG, ktoré zvyšujú špecifitu
reakcie (Mullis, 1990). V dnešnej dobe je PCR metóda považovaná za základnú metódu
pre takmer všetky molekulovo-genetické analýzy (RFLP, RAPD, AFLP, SSCP, DGGE,
HRM a iné).
Identifikácia a analýza PCR produktov
Kvalitatívna analýza sa uskutočňuje elektroforézou v agarózovom géli, farbením
etídium bromidom (EtBr) a vizualizáciou UV žiarením. Koncentrácia agarózových
gélov závisí od dĺžky separovaných DNA molekúl. Platí, že so zmenšujúcou sa
veľkosťou DNA fragmentov, priamoúmerne narastá koncentrácia gélu (Maniatis, 1982).
V prípade veľmi malých fragmentov (približne 50 bp) je vhodnejšie použitie 10-
12% polyakrylamidového gélu.
Tabuľka 5: Vzťah koncentrácie agarózového gélu k veľkosti separovanej molekuly DNA (Sambrook a Russel, 2001)
48
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
Koncentrácia agarózového gélu(%[w/v])
Veľkosť separovanej molekuly DNA(kb)
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-4
2,0 0,1-2
1.7.2 RFLP - Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov
Metóda RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) využíva existenciu
reštrikčných endonukleáz, ktoré štiepia polynukleotidový reťazec prerušením
fosfodiesterových väzieb v určitých špecifických sekvenciách. V dôsledku uvedeného
sa DNA rozpadne na fragmenty rôznej dĺžky. Ak na štiepnom mieste dôjde k zámene
báz, enzým neštiepi, alebo vzniká nové štiepne miesto, čím dochádza k zmene dĺžky
fragmentov. Fragmenty DNA možno podľa veľkosti rozdeliť pomocou elektroforézy na
agarózovom géle a vizualizovať etídium bromidom pod UV svetlom (Sambrook et al.,
1989).
Štiepením PCR produktu RFLP metódou a následným elektroforetickým delením
fragmentov môžeme alely skúmaného génu, ako v homozygotnom, tak
i v heterozygotnom stave identifikovať.
Klasickou RFLP je genomická DNA štiepená endonukleázou a vzniknuté
fragmenty sa po elektroforetickej separácii blottingom prenášajú na pevnú membránu
(Southern blotting). Polymorfizmus vo veľkosti fragmentov možno zistiť po
hybridizácii značenou sondou.
Podstatou RFLP sú buď mutácie, ktoré vedú k vytvoreniu alebo k strate
rozpoznávacích miest pre reštrikčnú endonukleázu, alebo vznikajú ako dôsledok
prítomnosti rôzneho počtu repetitívnych sekvencií, delécií, inzercií alebo prestavieb
v špecifických oblastiach chromozómov (Šmarda et al., 2005).
Analýza RFLP je dôležitým nástrojom na mapovanie genómu, lokalizáciu
genetických ochorení génov, stanovenie rizika pre ochorenia, genetické mapovanie a
testovanie otcovstva.
49
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
1.7.3 PCR – RFLP
PCR-RFLP je modifikácia štandartnej PCR používaná pre typizáciu cieľovej
sekvencie, obvykle určitého génu, obsahujúceho sekvenčný polymorfizmus.
V závislosti na voľbe primerov môže byť prevedená analýza akéhokoľvek génu. Táto
sekvencia o dĺžke až 5 kb sa amplifikuje za prísnych podmienok pomocou primerov
pripájajúcich sa ku koncovým konzervovaným oblastiam. Výsledkom amplifikácie sú
produkty PCR o rovnakej dĺžke, ktoré sa detekujú elektorforeticky. Amplifikované
produkty sú štiepené reštrikčnou endonukleázou a potom sú znova analyzované
elektroforézou na agarózovom alebo polyakrylamidovom gély (Šmarda et al., 2005).
PCR-RFLP metóda sa využíva napríklad na analýzu geneticky podmienených
chorôb v humánnej i veterinárnej medicíne, na detekciu onkogénov, pri mapovaní
génov, pri štúdiu asociačných vzťahov kandidátnych génov k ukazovateľom
úžitkovosti.
Pri identifikácii polymorfných génov sa používajú i ďalšie metódy:
konformačný polymorfizmus jednoreťazcovej DNA (SSCP), denaturačná gradientová
gélová elektroforéza (DGGE), teplotná gradientová gélová elektorforéza (TGGE) a i
(Trakovická et al., 2005).
1.7.4 Real- time PCR
PCR-RT (Real-time PCR) predstavuje modernú metódu umožňujúcu sledovanie
priebehu PCR reakcie v reálnom čase na základe sledovania intenzity fluorescenčného
signálu. Využíva sa pre kvantitatívnu PCR, pre stanovenie bodu topenia (Tm) a pre
priamu detekciu genotypu. Technika vyžaduje nákladné zariadenie (Knoll a Urban,
2002). Bolo vyvinutých veľa modifikácii tejto metódy s hlavným dôrazom na to aby
bola viac kvantitavívna. Napríklad môžeme analyzovať známe množstvo študovanej
RNA za účelom stanovenia pomeru medzi RNA vstupujúcej do analýzy a DNA
získanej ako výsledok reakcie. Vďaka znalosti tohto pomeru môžeme znížiť množstvo
DNA, vytvorenej z experimentálnej vzorky, na množstvo RNA, ktoré bolo prítomné
v tejto vzorke na začiatku (Snustad a Simmons, 2009).
50
Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí
1.7.5 HRM - High Resolution Melting
Táto metóda bola po prvýkrát predstavená v roku 2002 a svoje uplatnenie našla pri
genotypovaní a detekcii známych aj neznámych mutácií prevažne v humánnej medicíne.
Ide o metódu vhodnú pri identifikácii kandidátskych génov, DNA fingerpritingu,
analýze DNA metylácie, detekcii mutácií, DNA mapovanie alebo skríning LOH.
Vzorky sú analyzované na základe ich správania sa počas denaturácie vysokou teplotou,
kedy sa dvojvláknová DNA mení na jednovláknovú, dáva oveľa viac informácií ako
prístroje predtým. Využívajú sa pri tom špeciálne fluorescenčné saturačné farbivá
(SYBER green, EvaGreen,...), ktoré vysielajú signál v prostredí jednovláknovej DNA.
Farbivá sa pridávajú do PCR amplifikačnej reakcie. Pri zvyšujúcej sa teplote, kedy
DNA denaturuje a rozpadáva sa dvojvláknová štruktúra, je toto farbivo postupne
uvoľňované z DNA. HRM prístroj s vysokou presnosťou zachytáva uvoľnený signál
a vzniká krivka. Keďže každá genetická sekvencia reaguje trochu odlišne, vznikajú
rôzne krivky, ktoré môžu byť medzi sebou porovnávané a teda detegované mutácie
(Montgomery et al. , 2007).
Obrázok 9: Schématické znázornenie HRM krivkyZdroj: prekreslené podľa http://www.gene-quantification.de/hrm-protocol-cls.pdf
51
Cieľ
2 Cieľ
Štúdia o súčasnom stave riešenej problematiky predstavuje východisko pre
formulovanie cieľov doktorandskej práce.
Leptín, leptínový receptor a ghrelínový receptor sú kandidátske gény, ktoré
významne vstupujú do regulácie príjmu potravy a výdaja energie a podieľajú sa na
metabolizme lipidov. Vykazujú polymorfizmus, a preto ich identifikácia a určenie
genotypu jedinca môže byť využitý na formulovanie preobezitogénneho efektu, ako
hlavného efektu porúch metabolizmu lipidov v dôsledku jednonukleotidových
polymorfizmov v ich génoch.
Cieľom práce bolo identifikovať jednonukleotidové polymorfizmy (SNPs) v
génoch LEP, LEPR a GHSR, ktoré sa podieľajú na regulácii metabolizmu lipidov,
apetítu alebo determinujú niektorý z fenotypických znakov obezity a analyzovať ich
vplyv na vybrané ukazovatele nutričného stavu.
Práca bola riešená v nasledovných čiastkových cieľoch:
1.Optimalizácia molekulovo-genetických metód PCR-RFLP a HRM pre
diagnostiku polymorfizmu v génoch LEP, LEPR a GHSR .
2. Vyhodnotenie polymorfizmov v génoch LEP, LEPR a GHSR na základe
génovej a genotypovej frekvencie a vyhodnotenie genetickej záťaže v sledovanej
populácii z hľadiska mutácií génov podmieňujúcich poruchy metabolizmu lipidov.
3. Vyhodnotenie vplyvu génov LEP, LEPR a GHSR na variabilitu vybraných
ukazovateľov nutričného stavu organizmu človeka (BMI, CHOL, HDL, LDL, TAG
a GLU).
52
Materiál a metodika
3 Materiál a metodika
3.1 Študovaná populácia
Pre molekulárno-genetickú analýzu LEP, GHSR a LEPR génov bol použitý
biologický materiál získaný z krvi humánnych vzoriek. Krv bola opakovane odobratá
po podpísaní informovaného súhlasu so zaradením do výskumu nameraných
biochemických parametrov a molekulovo-genetických analýz. Po odbere bola krv
rozdelená do dvoch skúmaviek, jedna na rozbor biochemických parametrov a druhá na
molekulovo-genetickú analýzu. Biochemické analýzy na celkový cholesterol, HDL
cholesterol, triglyceridy a glukózu boli vykonané na katedre Výživy ľudí.
Sledovaná populácia bola rozdelená na skupiny podľa pohlavia a podskupiny
podľa BMI.
Tabuľka 6: Pozorované skupinyPohlavie Priemerný vek Skupina Počet
Muži(29)
38,24
športovci 12normálna váha 13ľahká nadváha 8
obezita 8
Ženy(27)
44,85
športovci 0normálna váha 7ľahká nadváha 7
obezita 12
Tabuľka 7: Rozpätie biochemických parametrov v celej populácii (n=56)Parameter Minimum Maximum
BMI kg.m-2 18,60 40,40
Vek 19,00 63,00
CHOL mmol.l-1 2,93 7,61
HDL mmol.l-1 0,89 2,54
LDL mmol.l-1 0,93 4,92
TAG mmol.l-1 0,44 4,52
GLU mmol.l-1 3,52 7,02
53
Materiál a metodika
Tabuľka 8: Rozpätie biochemických parametrov podľa pohlaviaPohlavie Parameter Minimum Maximum
Muži (29)
BMI kg.m-2 20,02 36,39Vek 19.00 63.00CHOL mmol.l-1 2,93 7,43HDL mmol.l-1 0,89 2,24LDL mmol.l-1 0,93 4,02TAG mmol.l-1 0,67 4,52GLU mmol/l 4,63 7,02
Ženy (27)
BMI kg.m-2 18,60 40,40Vek 21.00 60.00CHOL mmol.l-1 3,50 7,61HDL mmol.l-1 1,55 2,54LDL mmol.l-1 1,25 4,92TAG mmol.l-1 0,44 2,20GLU mmol.l-1 3,52 6,83
Rozpätie diagnostikovaných biochemických parametrov bolo nasledovné.
V skupine športovcov bola nadlimitná hodnota u jedného jedinca a to pri glukóze
(6,32) toto zvýšenie mohlo byť spôsobené konzumáciou jedla pred odberom.
V skupine ľudí s normálnou váhou s BMI od 20 do 25 bolo zvýšenie glukózy
(6,32) a triglyceridov (3,18) u mužského pohlavia. Zvýšená hladina cholesterolu bola
nameraná aj u jedného muža (6,11) a u dvoch žien (6,23;6,82). Pri HDL cholesterole
boli namerané aj zvýšené aj znížené hodnoty. Zvýšenie bolo pri štyroch ženách (2,14;
2,47; 2,23 a 2,23) a jednom mužovi (2,23). Veľmi nízke hodnoty boli pri štyroch
mužoch (0,92; 0,94; 0,95 a 0,89). Takto nízke hodnoty HDL svedčia o zvýšenom riziku
vzniku aterosklerózy.
V pozorovanej skupine ľudí s ľahkou nadváhou a hodnotou BMI od 25 do 30 sme
zistili nasledovné hodnoty: LDL cholesterol bol zvýšený u dvoch žien (4,14 a 4,53)
zároveň u týchto dvoch žien bol zvýšený aj celkový cholesterol (6,8 a 7,18) a okrem
nich mal celkový cholesterol zvýšený aj ďalších päť žien (5,91; 6,08; 6,2; 5,53 a 6,48).
Pri HDL cholesterole sme spozorovali mierne zvýšenie u troch žien čo nenesie so sebou
zdravotné riziko (2,08; 2,3 a 2,19). Len v jednom prípade bola nameraná zvýšená
hladina glukózy u muža a to 6,48.
V súbore obéznych osôb s BMI nad 30 sme zistili nadlimitné hodnoty: celkový
cholesterol malo zvýšený z 20 pozorovaných (8 mužov a 12 žien) až 18 jedincov a to 7
mužov a 11 žien. LDL cholesterol mali zvýšený 2 muži a 7 žien, triglyceridy mali
54
Materiál a metodika
zvýšené 3 muži a HDL cholesterol 5 žien a 1 muž. Pri glukóze boli zvýšené hodnoty u 4
mužov a u 7 ženách.
3.2 Metódy molekulovo-genetickej analýzy
3.2.1 Izolácia DNA
DNA bola izolovaná z periférnej krvi pomocou izolačného setu NucleoSpin Blood
od firmy Macherey – Nagel podľa priloženého protokolu. Použitá bola tiež klasická
vysoľovacia metóda.
3.2.1.1 Izolácia DNA vysoľovacou metódou (Miller et al., 1988)
Vysoľovacia metóda izolácie DNA sa skladá z lýzy buniek a odstránenia
hemoglobínu zo vzorky, precipitácie proteínov, precipitácie DNA, premývanie DNA,
sušenia a rozpustenia DNA v elučnom roztoku.
Lýza buniek:
1. 300µl krvi + 1000µl RBC sme inkubovali 1-3 min. pri laboratórnej teplote.
2. Centrifugovali sme pri 13 000 otáčkach 2 minúty a odstránili sme supernatant.
3. Vzorky sme premiešali na vortexe 10-20 sekúnd, kým sme nezískali homogénny
roztok.
4. Pridali sme 600 µl lyzačného roztoku a pipetovaním lyzovali.
Precipitácia (zrážanie) proteínov:
1. Pridali sme 200 µl roztoku na precipitáciu proteínov.
2. Vzorky sme premiešali na vortexe.
3. Centrifugovali sme pri 13 000 otáčkach pri teplote 20-25ºC po dobu 20 minút,
čím precipitované proteíny vytvorili pevný tmavohnedý pelet na dne.
Precipitácia DNA:
1. Supernatant s DNA sme odliali do čistej eppendorfky, v ktorej je 600µl 100%
izopropanolu.
2. Vzorky sme premiešali.
3. Centrifugovali sme 5 minút pri 13 000 otáčkach, DNA bola viditeľná ako malý
biely pelet.
55
Materiál a metodika
4. Odpipetovali sme supernatant a pridali sme 600 µl 70% etanolu.
5. Po 5 minútovom centrifugovaní pri 13 000 otáčkach sme dôkladne odpipetovali
etanol.
6. Vzorky sme vysušili v termostate pri 37 ºC 10-15 minút.
Rozpustenie DNA:
1. Pridali sme 30µl 10nM Tris-HCl pH 8,5.
2. Inkubovali sme 30-60 minút pri teplote 65 ºC.
Použité roztoky:
Roztok na lýzu červených krviniek - 5x RBC roztok
0,77M NH4Cl
0,046M KHCO3
0,01M EDTA pH 8.0
Sterilizované filtráciou
Lyzačný roztok
50mM Tris-HCl pH 8,0
100mM EDTA pH 8,0
100mM NaCl
1% SDS
H2O MilliQ
Roztok na precipitáciu proteínov
10M CH3COONH4
Roztok na rozpúšťanie DNA
10mM Tris- HCl pH 8,5
3.2.1.2 Izolácia DNA komerčným kitom NucleoSpin Blood
DNA bola izolovaná z krvi pomocou izolačného kitu NucleoSpin Blood od firmy
Machery-Nagel podľa priloženého protokolu.
Pred začatím izolácie sme nastavili inkubátor na 70 oC a zohriali tlmivý roztok
BE na 70 oC.
Lýza buniek:
Do 1,5 ml epedorfiek sme dali 200 μl krvi, 25 μl proteinázy K a 200 μl lyzačného
roztoku B3 a vortexovali 10 – 20 s. Následne sme vzorky inkubovali 15 min. pri 70 oC.
56
Materiál a metodika
Úprava podmienok na naviazanie DNA:
Po skončení inkubácie sme pridali 210 μl 96 % etanolu a vortexovali.
Naviazanie DNA na silikátovú membránu:
Vzorky sme preniesli do separačnej kolónky vloženej do 2 ml skúmaviek
a centrifugovali 1 min. pri 11 000 g.
Premytie silikátovej membrány:
Následne sme kolónky vybrali a vzorky preložili do nových 2 ml skúmaviek.
Do separačnej kolónky sme pridali 500 μl premývacieho roztoku BW
a centrifugovali 1 min pri 11 000 g. Po centrifugácii sme kolónky vybrali a vložili do
nových skúmaviek, pridali 600 μl premývacieho roztoku B5 a centrifugovali 1 min. pri
11 000 g.
Sušenie silikátovej membrány:
Vzorky sme opäť centrifugovali 1 min. pri 11 000g.
Uvoľnenie DNA zo silikátovej membrány:
Do separačných kolóniek sme pridali 100 μl tlmivého roztoku BE (predhriateho na
70 oC) a vložili do uzatvárateľných 1,5 ml ependorfiek. Vzorky sme inkubovali 1 min.
pri laboratórnej teplote. Potom sme ich centrifugovali 1 min. pri 11 000 g. Koncentrácie
a čistotu získanej DNA sme premerali na prístroji NanoPhotomerTM (Implen, Nemecko)
a uskladnili pri teplote 4 oC. Pre dlhodobejšie uskladnenie sme použili teplotu -20 oC.
3.2.1.3 Overenie prítomnosti DNA
Po skončení izolácie DNA sme izoláciu overili elektroforeticky. Vzorky (4 µl) sme
zmiešali s brómfenolovou modrou a nanášali ich na 1% agarózový gél s prídavkom
interkalačného činidla GelRed (Biotium). Elektroforéza prebieha v prostredí 0,5 x TBE
pufru, pri elektroforetickom napätí 130V, po dobu 20 – 30 minút.
3.2.1.4 Meranie koncentrácie a čistoty vzoriek
Princípom spektrofotometrického merania koncentrácie a čistoty DNA je prechod
UV žiarenia meranou vzorkou, pričom časť žiarenia je absorbovaná nukelovými
kyselinami. Detektor meria množstvo svetla, ktoré prejde vzorkou. Čím viac UV svetla
sa vo vzorke zachytí, tým je koncentrácia nukleových kyselín vyššia. Absorbcia sa
57
Materiál a metodika
meria pri vlnovej dĺžke 260/280 nm (DNA absorbuje žiarenie s vlnovou dĺžkou 260 nm,
proteíny žiarenie s vlnovou dĺžkou 280 nm). V tabuľke 9 sú uvedené pomery absorbcie
a množstvo DNA a proteínov po meraní na spektrofotometri (NanoPhotometer,
Implen).
Tabuľka 9: Vzťah absorbancie (A260/280) k čistote vzorky (Sambrook a Russel, 2001)A(260/280) % nukleových kyselín % proteínov
2 100 01,98 90 101,91 60 401,81 60 40
Platí, že ak sa hodnoty A260/280 rovnajú dvom, vo vzorke sa nachádza RNA. Ak
dosahuje A260/280 hodnotu 1,80 vo vzorke je čistá DNA a ak hodnota klesne pod 1,80
vzorka je kontaminovaná proteínmi a je potrebné vzorku purifikovať.
3.2.2 Polymerázová reťazová reakcia a jej modifikácie
Základom identifikácie polymorfizmu v génoch LEP, LEPR a GHSR bola
polymerázová reťazová reakcia. Získané PCR produkty boli následne analyzované
metódami PCR-RFLP (gén LEP, gén LEPR a gén GHSR) a HRM (gén LEP).
3.2.2.1 Leptín (LEP)
Po vyizolovaní DNA zo vzoriek prebehla optimalizácia PCR reakcie. Použili sme
oligonukleotidové primery prevzaté z práce Mammès et al., (1998). PCR reakcia
prebehla v objeme 25µl, v prístroji MJ Mini – Personal Thermal Cycler (Bio-Rad).
LEP FOR: 5´ - TTTCCTGAATTTTCCCGTGAG – 3´
LEP REV: 5´ - AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA - 3´
Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v tabuľke 10. Teplotný a časový profil PCR
použitý pre optimalizáciu analýzy bol nasledovný:
1. 94oC – 3 minúty
58
Materiál a metodika
2. 94oC – 10 sekúnd
3. 60oC - 30 sekúnd 30 cyklov
4. 72oC – 45 sekúnd
5. 72oC - 5 minút
6. 15 oC – chladenie
Tabuľka 10: Zloženie reakčnej zmesi PCR reakcie LEP génu
Zložka PCR zmesiKoncentráci
aMnožstvo na 1 vzorku
10X PCR pufor (NH4)2SO4 1x 2,5 µlMgCl2 (Fermentas) 1,7 mM 1,7 µldNTP (Fermentas) 0,2 mM 0,5 µlPrimer FOR a REV (KRD) 20 pM 2 µlTaq polymeráza (Fermentas) 1U 0,2 µlDNA 100 ng 2 µlSuperčistá voda do objemu 25 µl
Prítomnosť PCR produktu bola overená elektroforeticky na 2% agarózovom géle
s prídavkom interkalačného farbiva GelRed a vo vodivom roztoku TBE.
Po úspešnom získaní PCR produktu, sme tento štiepili 10U reštrikčného enzýmu
HhaI (Fermentas) pri teplote 37oC, cez noc. Charakteristika enzýmu a štiepiacej zmesi
je uvedená v tabuľkách 11 a 12 . Následne sme štiepenú DNA vizualizovali na 2%
agarózovom géle.
Tabuľka11: Charakteristika enzýmu HhaI
Enzým Zdroj Štiepne miesto
HhaIHaemophilus haemolyticus
5´...GC G↓C...3´
3´...C↑G CG...5´
Tabuľka 12: Zloženie štiepiacej zmesi RFLP s objemom 25 µl
Množstvo na 1 vzorkuSterilná voda(Milli Q)
12 µl
Pufor 2 µlEnzým HhaI 1 µlPCR produkt 10 µl
59
Materiál a metodika
Ďalšou metódou, ktorú sme použili k štúdiu polymorfizmu LEP génu bola PCR-
HRM analýza. Použili sme oligonukleotidové primery prevzaté z práce Mammès et al.,
(1998). PCR-HRM reakcia prebehla v objeme 25µl, v prístroji RotorGene 6000
(Corbett), ktorý bol zakúpený s finančnou podporou projektu Excelentného centra
ochrany a využívania agrobiodiverzity. Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v tabuľke
13.
Tabuľka 13: Zloženie reakčnej zmesi PCR-HRM reakcie LEP génu
Zložka PCR zmesiKoncentrácia
Množstvo na 1 vzorku
HRM SensiMix (Biotium) 1x 12,5 µlEvagreen (Biotium) - 1µlPrimer (KRD) 10 pM 0,8 µlDNA 50 ng.µl-1 1 µlSuperčistá voda do objemu 25 µl
Teplotný a časový profil PCR, použitý pre optimalizáciu HRM analýzy pozostával
z amplifikácie fragmentu, ktorého koncentrácia bola meraná použitím fluorescenčného
farbiva Evagreen (Biotium) a následnej analýzy topenia amplifikovaného PCR
produktu. Presný popis teplôt a časov je nasledovný :
Preamplifikácia:
1. 95oC – 10 minúty
2. 95oC – 10 sekúnd
3. 54oC - 20 sekúnd 40 cyklov
4. 70oC – 30 sekúnd
HRM analýza:
5. 75 – 86 oC – meranie po 0,2 oC, doba načítania 2 sekundy
3.2.2.2 Leptínový receptor (LEPR)
DNA, získaná z krvi bola použitá pre PCR reakciu s celkovým objemom 25 µl.
Boli použité nasledovné primery (Guízar – Mendoza et al., 2005):
LEPR FOR: 5´ - ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG - 3´
60
Materiál a metodika
LEPR REV: 5´ - AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT- 3´
Zloženie reakčnej zmesi uvádza tabuľka 14, teplotný a časový profil reakcie bol
nasledovný:
1. 95oC – 3 minúty
2. 95oC – 10 sekúnd
3. 59oC - 30 sekúnd 30 cyklov
4. 72oC – 35 sekúnd
5. 72oC - 5 minút
6. 15 oC - chladenie
Tabuľka 14: Zloženie reakčnej zmesi PCR reakcie LEPR génu
Zložka PCR zmesiKoncentrácia
Množstvo na 1 vzorku
10x PCR pufor (NH4)2SO4 1x 2,5 µlMgCl2 (Fermentas) 1,5 mM 1,5 µldNTP (Fermentas) 0,2 mM 0,5 µlPrimer FOR (KRD) 5 pM 0,5 µlPrimer REV (KRD) 5 pM 0,5 µlTaq polymeráza (Fermentas) 1U 0,2 µlDNA 100 ng 1 µlSuperčistá voda do objemu 25 µl
Prítomnosť PCR produktu bola overená elektroforeticky na 1% agarózovom géle
s prídavkom interkalačného činidla GelRed a vodivého roztoku TBE.
Na analýzu LEPR génu sme použili reštrikčný enzým FastDigest HpaII
(Fermentas). PCR produkt sme štiepili pri teplote 37oC po dobu 5 minút. Charakteristika
enzýmu a štiepiacej zmesi je uvedená v tabuľkách 15 a 16. Výsledok štiepenia sme
vizualizovali na 2% agarózovom géle.
Tabuľka 15: Charakteristika enzýmu HpaII
Enzým Zdroj Štiepne miesto
HpaII Haemophilus parainfluenzae
5'...C↑C G G...3'3'...G G C↑C...5'
61
Materiál a metodika
Tabuľka 16: Zloženie štiepiacej zmesi RFLP s objemom 25 µl
Množstvo na 1 vzorkuSterilná voda
(Milli Q)12 µl
Pufor 2 µlEnzým HpaII 1 µlPCR produkt 10 µl
3.2.2.3 Ghrelínový receptor (GHSR)
DNA, ktorá bola získaná z krvi bola použitá pre PCR reakciu s celkovým
objemom 25 µl. Pre tento gén boli použité primery prevzaté z práce Wang et al., (2004):
GHSR FOR: 5´ - CGGGGTTCAACCTCACACT - 3´
GHSR REV: 5´ - AGAGCGCACCGCAAACTC - 3´
Zloženie reakčnej zmesi uvádza tabuľka 17, teplotný a časový profil reakcie bol
nasledovný:
1. 94oC – 3 minúty
2. 94oC – 45 sekúnd
3. 60oC - 45 sekúnd 30 cyklov
4. 72oC – 60 sekúnd
5. 72oC - 5 minút
6. 15 oC - chladenie
Tabuľka 17: Zloženie reakčnej zmesi PCR reakcie GHSR génu
Zložka PCR zmesiKoncentráci
aMnožstvo na 1 vzorku
10X PCR pufor (NH4)2SO4 1x 2,5 µlMgCl2 (Fermentas) 1,5 mM 1,5 µldNTP (Fermentas) 0,2 mM 0,5 µlPrimer FOR (KRD) 5 pM 0,5 µlPrimer REV (KRD) 5 pM 0,5 µlTaq polymeráza (Fermentas) 1U 0,2 µlDNA 100 ng 1 µlSuperčistá voda do objemu 25 µl
62
Materiál a metodika
Prítomnosť PCR produktu bola overená elektroforeticky na 1% agarózovom géle
s prídavkom interkalačného činidla GelRed a v roztoku TBE.
Pre reštrikčnú analýzu GHSR génu bol použitý enzým 5U LweI (Fermentas) vo
forme FastDigest. PCR produkt bol štiepený pri teplote 37oC po dobu 10 minút.
Charakteristika enzýmu a zloženie štiepiacej zmesi je uvedená v tabuľkách 18 a 19.
Výsledok štiepenia sme následne vizualizovali na 3% agarózovom géle.
Tabuľka 18: Charakteristika enzýmu LweI
Enzým Zdroj Štiepne miesto
LweI E. coli5´...GCATC(N)5 ↓...3´
3´...CGTAG(N)9↑...5´
Tabuľka 19: Zloženie štiepiacej zmesi RFLP s objemom 25 µl
Množstvo na 1 vzorkuSterilná voda(Milli Q)
12,5 µl
Pufor 2 µlEnzým LweI 0,5 µlPCR produkt 10 µl
3.2.3 Elektroforéza
Identifikácia a analýza produktov po izolácii, amplifikácii a štiepení sa
uskutočňuje elektroforetickou separáciou. Horizontálna gélová elektroforéza prebieha v
TBE tlmiacom roztoku. Koncentrácia agarózy sa volí podľa očakávanej veľkosti
fragmentov. Elektroforéza prebieha pri elektrickom napätí 80-120 V po dobu 30 - 90
minút. Gél môže obsahovať interkalačné činidlo GelRed. Po skončení elektroforézy sa
naštiepené PCR produkty detekujú pod UVtransiluminátor
3.3 Biochemická analýza
V rámci biochemickej analýzy boli sledované nasledovné parametre: celkový
cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triglyceridy a glukóza.
63
Materiál a metodika
Merania boli realizované štandardnými metodickými postupmi na Katedre Výživy
ľudí, preto uvádzame referenčné rozpätie normálnych fyziologických hodnôt.
Tabuľka 20: Referenčné hodnoty sledovaných biochemických parametrov
ParameterReferenčný interval
[mmol.l-1]CHOL 4,2-5,2HDL 1,4-2LDL 0,9-3,9TAG 0,4-2,2GLU 3,5-6,1
Hodnoty LDL [mmol.l-1] boli vypočítané podľa Friedewaldovej rovnice (Friedewald et
al., 1972)
LDL = CHOL – (TAG/2,2) – HDL
Hodnoty BMI [kg.m-2] boli vypočítané vzťahom
BMI=hmotnosť ( kg )výška2 ( m2 )
3.4 Matematicko – štatistické vyhodnotenie výsledkov
3.4.1 Genetická štruktúra
Na základe PCR-RFLP analýzy sme stanovili genotypovú štruktúru populácie
a vypočítali sme frekvenciu alel a genotypov. Významnosť rozdielov medzi
experimentálne pozorovanou a teoreticky očakávanou frekvenciou genotypov sme
overili χ2 – testom.
Frekvencie alel pre dvojalalický systém:
pA = (2.AA + AB) : 2N qB= (2.BB + AB) : 2N
pA, qB – frekvencia jednotlivých alel
N – celkový počet jedincov
64
Materiál a metodika
Overenie genotypovej rovnováhy χ2 - testom:
e – pozorovaný počet genotypov t – teoretický počet genotypov n – počet genotypových tried
Heterozygótnosť lokusu (He) podľa Nei, (1978); Trakovická et al.,( 2005)
He = 1 - ∑(p2 – q2)
Polymorfný informačný obsah lokusu (PIC) podľa Botstein et al., (1980); Trakovická et al., (2005)
1
1 1
2222 2)(1n
i
n
ijji ppqpPIC
Úroveň polymorfnosti lokusu (ENA) podľa Crow a Kimura, (1970); Trakovická et al., (2005)
22
1qp
ENA
Homozygotnosť v lokuse (Ca) podľa Trakovická et al., (2005)
Ca = ∑ pi2
Variabilita realizovanej premenlivosti v lokuse (V) podľa Trakovická et al., (2005)
(%)10011
1
N
CV a
65
Materiál a metodika
3.4.2 Variabilita biochemických parametrov a asociačné štúdie
Základné variačno-štatistické analýzy údajov sme vykonali s podporou programu
SAS Enterprise Guide 3.0. Pre vyhodnotenie vzťahov medzi sledovanými
biochemickými parametrami sme použili korelačnú analýzu. Na testovanie rozdielov
priemerných hodnôt daných ukazovateľov medzi hodnotenými skupinami sme použili
Studentov T-test.
Na základe molekulovo-genetických analýz a matematicko-štatistických výpočtov
sme uskutočnili asociačné štúdie. Pre stanovenie vplyvu genotypov LEP, LEPR
a GHSR na variabilitu biochemických parametrov a BMI boli vypočítané genotypové
hodnoty (G) jednotlivých genotypov.
Genotypová hodnota (G) vyjadruje veľkosť aditívneho efektu alel a varianciu
efektu dominancie alel bez epistatického účinku (Templeton, 2006).
G = a (p-q) + 2pq.d
a – genotypová hodnota homozygotovd – genotypová hodnota heterozygotovp,q – frekvencie alel príslušného lokusu (LEP, LEPR, GHSR)
Aditívna variancia (VA) vyjadruje aditívne pôsobenie alel príslušného lokusu
na variabilitu znaku.
VA = 2pq [ a+d(p+q)]
66
Výsledky a diskusia
4 Výsledky a diskusia
Na izoláciu DNA sme použili dve rôzne metódy, vzhľadom na kvalitu
biologického materiálu. Jednou z metód bola klasická vysoľovacia metóda a druhá
bola izolácia pomocou komerčného kitu NucleoSpin Blood od firmy Machery-
Nagel.
Obrázok 10: Vizuálne hodnotenie kvality extrahovanej DNA na 1 % agarózovom gél.
Tabuľka 21: Meranie koncentrácie a čistoty DNA spektrofotometricky:
Číslovzork
y
Koncenrácia DNA(ng . µl -1)
Čistota
1 253,9 1,772 111,8 1,363 312,9 1,544 21,35 1,815 117,9 1,416 268,9 1,667 85,67 1,688 91,37 1,629 258,3 1,6510 232,6 1,4211 21,96 1,5312 190,2 2,03
Meranie koncentrácie a čistoty sme vykonali na prístroji NanoPhotomter TM (IMPLEN) .
67
Výsledky a diskusia
4.1 Analýza génu LEP
4.1.1 PCR-RFLP analýza
Pre polymorfizmus LEP génu (G-2548A) sme zvolili PCR-RFLP metódu a HRM
analýzu. Pri optimalizácii PCR reakcie sme vychádzali z práce Mammès et al., (1998).
Použili sme nimi navrhnuté primery aj teplotný profil, ktorý sme následne
optimalizovali na naše podmienky. Na rozdiel od Mammès et al., (1998) sme znížili
počiatočnú teplotu z 95oC na 94oC a tiež sme znížili počiatočný čas z 5 minút na 3
minúty. V 30 cykloch sa striedali nasledovné kroky : denaturácia pri 94oC po dobu 10
sekúnd, v annealingu bola teplota zvýšená z 50 oC na 60 oC a jeho doba bola znížená z 1
minúty na 30 sekúnd, polymerizácia mala teplotu 72oC a doba sa znížila z 1 minúty na
45 sekúnd a koncová elongácia 72oC po dobu 5 minút. PCR bola realizovaná v prístroji
MJ Mini Personal Thermal Cycler (Biorad) v objeme 25 µl. Zloženie reakčnej zmesi je
uvedené v kapitole „Materiál a metodika“.
Po PCR analýze sme získaný PCR produkt štiepili 10U reštrikčného enzýmu HhaI.
V analyzovanej skupine sme identifikovali všetky tri genotypy: AA, AG a GG.
V prípade genotypu AA, ktorý nebol štiepený enzýmom vznikol jeden štiepny fragment
s dĺžkou 242 bp, pri genotype AG boli tri fragmenty s dĺžkou 242 bp, 181 bp a 61 bp
a v prípade genotypu GG nám vznikli dva fragmenty s dĺžkou 181 bp a 61 bp. (Obrázok
11).
Obrázok 11: Fotodokumentácia PCR-RFLP (HhaI) génu LEPVýsledky PCR – RFLP analýzy LEP na 2% agarózovom géle
1 – PCR produkt (242 bp), 2 - DNA ladder 50 bp, 3 – genotyp AA ( 242 bp), 4 – genotyp AG (242 bp, 181bp, 61bp), 5 – genotyp GG (181bp, 61bp)
68
Výsledky a diskusia
L100 PCR GG AG AA
Obrázok 12: Schématické zobrazenie štiepnych fragmentov LEP génu 242 bp pomocou reštrikčného enzýmu HhaI
L100 – DNA ladder 100bp, PCR – PCR produkt (242 bp), GG – (181bp, 61bp), AG – 242bp, 181bp, 61bp), AA – (242 bp)
4.1.2 PCR-HRM analýza
Pri optimalizácii amplifikácie sme vychádzali z protokolu kitu SensimixTM.
Prvotnú amplifikáciu v optimalizácii teploty hybridizácie primerov sme vykonali
v gradientovom termocykléri C1000TM (Biorad). Pri optimalizácii časového rozhrania
jednotlivých krokov cyklovania sme vychádzali z protokolu kitu SensimixTM (Biotium)
Po optimalizácii sme použili DNA s koncentráciou 50 ng.µl-1 a koncentrácia primerov
bola 10 pM. Následne sme upravili teplotný a časový profil : počiatočná denaturácia pri
95oC – 10 minút, následne sa v 40 cykloch striedali tri kroky – denaturácia pri 95 oC –
10 sekúnd, annealing pri 54 oC – 20 sekúnd a polymerizácia s meraním nárastu
fluorescencie pri 70 oC – 30 sekúnd. Konečnú elongáciu sme vynechali. Pri uvedenom
profile sme dosiahli dostatočnú amplifikáciu do 45 cyklu, čo je znázornené na obrázku
13.
69
Výsledky a diskusia
Obrázok 13: Fotodokumentácia HRM analýzy LEP génu : Amplifikácia PCR produktu
Následne prebehla HRM analýza. Vykonali sme ju v rozmedzí teplôt od 75-90 oC.
Vzhľadom na veľkosť PCR produktu a obsahu A-G párov, bolo potrebné hornú teplotu
znížiť 75 - 86 oC. Na obrázku je znázornená normalizovaná krivka HRM analýzy troch
vzoriek s rôznym genotypom (Obrázok 14).
Obrázok 14: Reprezentatívne výsledky HRM analýzy LEP génu
4.1.3 Genotypová štruktúra podľa génu LEP
Po identifikácii genotypov, sme vyhodnotili genotypovú štruktúru. Identifikovali
sme tieto genotypy: genotyp AA 14 jedincov z toho 4 mužov a 10 žien, genotyp AG
24 jedincov z toho 17 mužov a 7 žien a genotyp GG 18 jedincov z toho 8 mužov a 10
žien. Zistili sme prevahu genotypu AG nad genotypom GG a nízku frekvenciu genotypu
70
Výsledky a diskusia
AA. Z toho vyplýva aj vyššia frekvencia alely G (0,5357) nad alelou A (0,4642) čo je
uvedené aj v tabuľke 22. Vyššiu frekvenciu alely G potvrdila aj štúdia Ni et al., (2009).
Tabuľka 22: Genetická štruktúra populácie génu LEP
GÉN
LEP
Genotypy (n=56) Alelyχ2
d.f. = 2AA AG GG A G
Muži
N= 29
4 17 8 0,4311±0,0639
0,5689±0,0639
1,1044 –
5,3879 14,2241 9,3879
Ženy
N=27
10 7 10 0,5000±0,0680
0,5000±0,0680 6,2592 +++
6,7500 13,5000 6,7500
Spolu
N=56
14 24 18 0,4642±
0,0470
0,5357±
0,04701,0736 –
12,0714 27,8571 16,0714
P<0,05-, P >0,05+, P>0,01++, P>0,001+++
Obrázok 15: Realizovaná homozygótnosť a heterozygótnosť populácie v % podľa génu LEP
Nami testovanej populácii bola vyššia frekvencia alely G čo potvrdzujú aj štúdie
Mendoza et al., (2005), ktorý uvádza, že alela G mala vyššiu frekvenciu aj u obéznych
(0,70) aj u neobéznych (0,63) osôb. Podobné frekvencie uvádzajú Snoussi et al., (2006),
ktorý zistili v sledovanej populácii frekvenciu alely G (0,554; 0,662) a Richter et al.,
(2007) uvádzajú významne vyššiu frekvenciu alely G (0,700) nad alelou A (0,300).
Rozdiel medzi očakávanými a pozorovanými frekvenciami genotypov sme overili
χ2 – testom, kde výsledná hodnota (1,0736) nie je štatisticky preukazná, teda
71
7
30
14
18
13
18
05
101520253035404550
AA AG GG
muži ženy
Výsledky a diskusia
v analyzovanej populácii sa realizoval rovnovážny stav. Štatisticky významné
vychýlenie z genotypovej rovnováhy môžeme konštatovať iba v skupine žien.
Tabuľka 23: Efektívnosť pôsobenia alel génu LEP Alely He PIC Ca ENA V%
Muži A,G 0,4905 0,3702 0,5095 1,9627 49,14
Ženy A,G 0,5000 0,3750 0,5000 2,000 50,00
Spolu A,G 0,4951 0,3725 0,5049 1,9805 49,60
Efektívnosť pôsobenia alel pre LEP gén je uvedená v tabuľke 23.
Heterozygotnosť lokusu v populácii bola (0,4951), čo potvrdzuje aj zvýšený koeficient
homozygotnosti (0,5049). Hodnota polymorfného informačného obsahu lokusu
(0,3725) sa blíži k hraničnej hodnote rovnovážnej populácie, čo je dôsledok takmer
vyrovnanej frekvencie alel. Potvrdzuje to aj hodnota úrovne polymorfnosti lokusu, ktorá
vyjadruje počet efektívnych alel (1,98). Stupeň realizácie možnej premenlivosti mal
hodnotu 49,60%. Ideálny rovnovážny stav bol zistený v skupine žien. Takáto populácia
je vhodná na asociačné štúdie a odhad priemerného účinku génov.
4.1.4 Vplyv génu LEP na variabilitu biochemických parametrov
V analyzovanej populácii sú priemerné hodnoty sledovaných ukazovateľov v
rozpätí optimálnych hodnôt normálneho nutričného stavu. Zvýšenie bolo zistené iba pri
celkovom cholesterole pri genotype AA(5,87) a GG(5,53). Tieto genotypy sa javia ako
negatívne ovplyvňujúce celkový cholesterol v krvi. Pri genotype GG je hodnota BMI
(29,67) blížiaca sa k 30, čo predstavuje riziko vzniku obezity. Zo zistených výsledkov
môžeme konštatovať, že vo všeobecnosti sa najvyššie hodnoty nami sledovaných
parametrov vyskytujú u homozygotných genotypoch GG a AA a najnižšie boli
u heterozygotného genotypu AG. Z toho hľadiska sa javí najvhodnejší genotyp AG
a predstavuje najnižší dopad na zdravie ľudí.
72
Výsledky a diskusia
Tabuľka 24: Priemerné hodnoty biochemických parametrov celej populácie pre LEP gén
Parameter GenotypyAA (n = 14) AG (n = 24) GG (n = 18)
BMI kg.m-2 27,57 26,45 29,67CHOL mmol.l-1 5,87 5,10 5,53HDL mmol.l-1 1,92 1,69 1,72LDL mmol.l-1 3,34 2,76 3,08TAG mmol.l-1 1,27 1,47 1,61GLU mmol.l-1 5,28 5,20 5,78
Spojitosť alely G s nárastom telesnej hmotnosti a s obezitou potvrdila aj štúdia Ni
et al., (2009), na základe T-testu mali jedinci pri tomto genotype zvýšené hodnoty BMI
25,66±5,86 kg.m-2. Asociačné analýzy medzi GG genotypom v polymorfizme G2548A
LEP génu u jedincou, ktorý mali nadváhu vo francúzskej a americkej populácii robili aj
Mammès et al., (2000); Jiang et al., (2004). V samostatnej štúdii, potvrdil výrazné
spojenie alely G s obezitou v Taiwane aj Wang et al., (2006). Autori uvádzajú, že alela
G zároveň preukazne znižuje hladinu leptínu u mužov, čím možno vysvetliť asociáciu
alely G s nadváhou u obéznych jedincov. Vzhľadom k tomu sa leptín podieľa na znížení
chuti do jedla a zvýšení energetického výdavku Wang et al., (2006), konštatujú, že
nízka úroveň leptínu znižuje účinnosť energetického príjmu, vrátane regulácie chuti do
jedla a metabolizmu a to vedie k rozvoju obezity.
Tabuľka 25: Priemerné hodnoty biochemických parametrov pre LEP gén podľa pohlavia
Parametre
GenotypyMuži Ženy
AA(n = 4)
AG(n = 17)
GG(n = 8)
AA(n = 10)
AG( n = 7)
GG(n = 10)
BMI kg.m-2 28,46 26,73 26,61 27,22 25,78 32,11CHOL mmol.l-1 5,57 4,92 4,62 5,99 5,55 6,26HDL mmol.l-1 1,56 1,57 1,31 2,06 1,98 2,04LDL mmol.l-1 3,30 2,59 2,52 3,36 3,18 3,53TAG mmol.l-1 1,38 1,75 1,75 1,22 0,80 1,50GLU mmol.l-1 6,04 5,27 5,70 4,98 5,05 5,85
V sledovanej populácii rozdelenej podľa pohlavia sme porovnávali priemerné
hodnoty sledovaných ukazovateľov. BMI bolo zvýšené nad 30 u žien s genotypom GG
73
Výsledky a diskusia
(32,11). Podobné zistenia uvádzajú aj Vaškú et al., (2006) a Ni et al., (2009). Alela G je
spojená podľa Li et al., (1999) s obezitou. V hodnotení T-testom pri getopype GG bol
štatisticky preukazný rozdiel pri HDL cholesterole (0,0004), celkovom cholesterole
(0,0059), LDL cholesterole (0,0248) a BMI (0,0266) v prospech mužov. Pri ostatných
genotypoch je BMI zvýšené nad 25 čo predstavuje miernu nadváhu, a tým predstavuje
zvýšené riziko rozvoja obezity a s tým spojené zdravotné riziko. Celkový cholesterol
bol zvýšený u mužov v genotype AA (5,57) a u žien vo všetkých troch genotypoch AA
(5,99), AG (5,55) a GG (6,26). U žien s genotypom AA (2,06) a AG (2,04) je zvýšená
hladina HDL cholesterolu čo je telu prospešné pretože zvýšené hladiny HDL v krvi
chránia ľudí pred aterosklerózou. V T-teste bol preukazný rozdiel v géne LEP pri
glukóze v prospech genotypu AG (0,0123), pri tomto genotype bol štatisticky
preukazný (0,0045) HDL cholesterol v prospech mužov a pri triglyceridoch (0,0012)
v prospech žien. V znaku TAG (triglyceridy) je preukazný rozdiel medzi AA a GG
genotypom v prospech AA genotypu (0,0339). Pri genotype AA (0,0248) bol preukazne
vyšší obsah HDL cholesterolu u žien.
4.1.5 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty
Na základe nameraných biochemických ukazovateľov pre jednotlivé genotypy
bola stanovená ich genotypová hodnota a vyjadrený aditívny účinok a efekt dominancie
alel. Genotypové hodnoty sú uvedená v tabuľke 26. Aditívne hodnoty a efekty
dominancie sú uvedené v prílohe.
Tabuľka 26: Genotypová hodnota biochemických parametrov pre LEP génLEP BMI CHOL HDL LDL TAG GLUAA -0,0419 +0,4773 +0,1714 +0,3653 -0,1998 -0,1069AG -1,1649 -0,2865 -0,0591 -0,2149 +0,0031 -0,1828
GG +2,0499 +0,1381 -0,0261 +0,0981+0,144
5+0,3971
Pre genotyp AA bol potvrdený vplyv na zvyšovanie CHOL v krvi (+0,4773)
a v súvisloti s ním aj hladiny LDL cholesterolu (+0,3653) oproti ostatným genotypovým
kombináciám. Pre ostatné sledované biochemické parametre bol zistený negatívny
vplyv genotypu GG, pri ktorom boli zistené významne vyššie hodnoty BMI, TAG
a glukózy. Aj Mammès et al., (2000) v géne humánneho LEP pri štúdiu dvoch typov
74
Výsledky a diskusia
mutácií zistili, že polymorfizmus A/G je v asociácii s nižšou koncentráciou leptínu a
tým aj s obéznym fenotypom. Podobne Van Rossum, (2003) a Guizar-Mendoza, (2005)
poukázali na spojenie tejto mutácie s obezitou, zvýšením telesného tuku aj
abdominálneho tuku. Asociácie s obezitou v niektorých štúdiách potvrdené neboli
(Considine, 1996; Silver, 1997; Heo, 2002), ale A/G mutácia leptínu v kombinácii
polymorfizmu Q223R leptínového receptoru, spôsobovala zvýšený výskyt non-
Hodgkinového lymfómu (Skibola, 2004).
Pre mutáciu A/G možno konštatovať, že sledované biochemické parametre majú
zhoršujúcu sa tendenciu a u ľudí s genotypom GG možno u nich predpokladať riziko vo
vzťahu k civilizačným ochoreniam. V analyzovanej populácii biochemické parametre
zodpovedajúce referenčnému rozpätiu boli stanovené u jedincov s genotypom AG.
4.2 Analýza LEPR génu
Pre polymorfizmus LEPR génu (Gln223Arg) sme zvolili PCR-RFLP metódu. Pri
optimalizácii PCR reakcie sme vychádzali z práce Guízar – Mendoza et al., (2005).
Použili sme nimi navrhnuté primery aj teplotný profil, ktorý sme následne
optimalizovali na naše podmienky. Na rozdiel od Guízar – Mendoza et al., (2005) sme
zvýšili počiatočnú teplotu z 94oC na 95oC po dobu 3 minúty. V 30 cykloch sa striedali
nasledovné kroky : denaturácia pri 95oC kde sme skrátili dobu zo 45 sekúnd na 10
sekúnd, v annealingu bola teplota zvýšená z 55 oC na 59 oC a jeho doba bola skrátená
zo 45 sekúnd na 30 sekúnd, polymerizácia mala teplotu 72oC a dobu sme skrátili z 90
sekúnd na 35 sekúnd a koncová elongácia 72oC, doba sa skrátila z 10 minút na 5 minút.
PCR bola realizovaná v prístroji C1000 ThermalCycler (Biorad), v objeme 25 µl.
Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v kapitole „Materiál a metodika“.
Po PCR analýze sme získaný PCR produkt štiepili reštrikčným enzýmom HpaII
(FastDigest). V analyzovanej skupine sme identifikovali všetky tri genotypy: AA, AG
a GG. V prípade genotypu AA, ktorý nebol štiepený enzýmom vznikol jeden štiepny
fragment s dĺžkou 416 bp, pri genotype AG boli tri fragmenty s dĺžkou 416 bp, 291bp,
125 bp a v prípade genotypu GG nám vznikli dva fragmenty s dĺžkou 291bp, 125 bp.
(Obrázok 16).
75
Výsledky a diskusia
Obrázok 16: Fotodokumentácia PCR-RFLP (HpaII) génu LEPRVýsledky PCR – RFLP analýzy LEPR na 2% agarózovom gélePCR produkt (416 bp), DNA ladder 100 bp, genotyp AA ( 416 bp), genotyp AG (416 bp, 291bp, 125bp), genotyp GG (291bp, 125 bp)
L100 PCR GG AG AA
Obrázok 17: Schématické zobrazenie štiepnych fragmentov LEPR génu 416 bp pomocou reštrikčného enzýmu HpaII
L100 – DNA ladder 100bp, PCR – PCR produkt (416 bp), GG – (291bp, 125 bp), AG – 416 bp, 291bp, 125 bp), AA – (416 bp)
4.2.1 Genotypová štruktúra podľa génu LEPR
V pozorovanej skupine 56 ľudí bolo 29 mužov, kde sme identifikovali s
genotypom AA - 6 jedincov, pri genotype GG - 9 jedincov a pri genotype AG bolo
pozorovaných 14 jedincov. Žien bolo 27 a pri nich sme identifikovali tiež všetky tri
genotypy. S genotypom AA bolo 8 žien, s genotypom GG bolo 5 žien a najviac bolo
s genotypom AG – 14. Frekvencia genotypov A a G bola rovnaká (0,50), u žien bola
vyššia frekvencia genotypu A (0,5555) a u mužov bola vyššia frekvencia genotypu G
(0,5517), čo potvrdila aj štúdia Ni et al., (2009).
76
Výsledky a diskusia
Tabuľka 27: Genetická štruktúra populácie génu LEPR
GÉN
LEPR
Genotypy (n=56) Alely χ2
d.f. = 2AA AG GG A G
Muži
N= 29
6 14 9 0,4482±0,0690
8
0,5517±0,0690
8
0,0167 –
5,8275 14,3448 8,8275
Ženy
N=27
8 14 5 0,5555±0,6762
0,4444±0,6762
0,0675 –
8,333 13,333 5,333
Spolu
N=56
14 28 14 0,50±0,05
0,50±0,05
0 –
14,0 28,0 14,0
P<0,05-, P >0,05+, P>0,01++, P>0,001+++
Obrázok 18: Frekvencie genotypov na základe génu LEPR v sledovanej populácii v %
Efektívnosť pôsobenia alel pre LEPR gén je uvedená v tabuľke 28. Očakávaná
heterozygotnosť populácie bola (0,5000) tak isto ako ja koeficient homozygotnosti
(0,5000). Hodnota polymorfného informačného obsahu lokusu (0,3725) sa blíži
k hraničnej hodnote rovnovážnej populácie, čo je dôsledok vyrovnanej frekvencie alel.
Potvrdzuje to aj hodnota úrovne polymorfnosti lokusu, čo vyjadruje počet efektívnych
alel (2,0000). Stupeň realizácie možnej premenlivosti mal hodnotu 50,00%. Takáto
pozorovaná populácia je vhodná na asociačné štúdie a odhad priemerného účinku génu.
77
11
2516
14
25
9
05
101520253035404550
AA AG GG
muži ženy
Výsledky a diskusia
Tabuľka 28: Efektívnosť pôsobenia alel génu LEPR v sledovanej populáciiAlely He PIC Ca ENA V%
Muži A,G 0,4947 0,3723 0,5053 1,9790 49,56
Ženy A,G 0,4938 0,3719 0,5062 1,9755 49,47
Spolu A,G 0,5000 0,3750 0,5000 2,0000 50,00
4.2.2 Vplyv génu LEPR na variabilitu biochemických parametrov
Priemerné hodnoty sledovaných ukazovateľov LEPR génu boli v celej populácii
zvýšené pri celkovom cholesterole pri všetkých troch genotypoch AA (5,39), AG (5,39)
aj GG (5,56). Ostatné sledované ukazovatele mali hodnoty v rozsahu referenčného
intervalu. Hodnoty BMI preukázali miernu nadváhu, dokonca pri genotype GG (29,04)
je hodnota na hranici s obezitou (Tabuľka 29).
Tabuľka 29: Priemerné hodnoty biochemických parametrov celej populácie pre LEPR gén
ParameterGenotypy
AA (n = 14) AG (n = 28) GG (n = 14)BMI kg.m-2 28,29 26,87 29,04
CHOL mmol.l-1 5,39 5,38 5,56
HDL mmol.l-1 1,74 1,80 1,68
LDL mmol.l-1 3,02 2,95 3,12
TAG mmol.l-1 1,38 1,40 1,69
GLU mmol.l-1 5,52 5,19 5,72
Aj pri LEPR géne sú priemerné hodnoty celkového cholesterolu zvýšené u žien pri
genotypoch AA (5,84), AG (5,73) a GG (6,86). Hodnota HDL cholesterolu je zvýšená
pri všetkých troch genotypoch AA(2,03), AG (2,03) a GG (2,03).
Pri géne LEPR bola zvýšená priemerná hodnota GLU pri ženách s genotypom GG
(6,17). Pri genotype GG bola zvýšená aj hodnota LDL cholesterolu (4,28), čo môže
viesť k vzniku poruchy metabolizmu tukov. Priemerné hodnoty BMI sú aj pri LEPR
géne v kategórii miernej nadváhy čo predstavuje možné riziko rôznych zdravotných
problémov spojených s nadváhou. Guízar-Mendoza et al., (2005) v štúdii tiež potvrdili
78
Výsledky a diskusia
zvýšenú hodnotu BMI u jedincov s genotypom GG (27,1 kg.m-2) a potvrdili aj vyššiu
hladinu glukózy (4,8 a 5,0 mmol.l-1) v krvi u obéznych jedincov.
Pri analýze deferencii medzi pohlaviami pre genotyp AG zistená štatistická
preukaznosť v obsahu HDL cholesterolu (0,0046) v prospech mužov a pri triglyceridoch
(0,0305) v prospech žien. Pri GG genotype bol preukazne vyšší obsah HDL
cholesterolu (0,0038), celkového cholesterolu (0,0070) a LDL cholesterolu (0,0057)
u žien. Preukazne vyšší obsah HDL cholesterolu (0,0022) bol zistený pre genotyp AA
u žien.
Tabuľka 30: Priemerné hodnoty biochemických parametrov pre LEPR gén podľa pohlavia
Parametre
GenotypyMuži Ženy
AA(n = 6)
AG(n = 14)
GG(n = 9)
AA(n = 8)
AG(n = 14)
GG(n = 5)
BMI kg.m-2 26,66 25,71 29,03 29,51 28,02 29,07
CHOL mmol.l-1 4,80 5,03 4,84 5,84 5,73 6,86
HDL mmol.l-1 1,34 1,57 1,49 2,03 2,03 2,03
LDL mmol.l-1 2,82 2,73 2,48 3,17 3,17 4,28
TAG mmol.l-1 1,42 1,65 1,96 1,35 1,15 1,20
GLU mmol.l-1 5,79 5,38 5,47 5,32 5,01 6,17
4.2.3 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty
Z biochemických ukazovateľov pre jednotlivé genotypy sme stanovili ich
genotypovú hodnotu a vyjadrili sme účinok aditívnej hodnoty a efekt dominancie.
Genotypové hodnoty sú uvedené v tabuľke 31. Aditívne hodnoty a efekty dominancie
sú uvedené v prílohe.
Pre sledované biochemické parametre bol pozorovaný vplyv genotypu GG pri
ktorom boli zistené významne vyššie hodnoty BMI (+1,2774), zvýšená hladina
cholesterolu v krvi (+0,1266), LDL cholesterolu (+0,1108) TAG (+0,0229) a glukózy
(+0,3133).
V asociačnej štúdii polymorfizmu Gln223Arg pre leptínový receptor Guízar-
Mendoza et al., (2005) potvrdili výrazne vyššiu frekvenciu alely G (0,70) oproti alele A
(0,30). V populácii obéznych aj neobéznych mužov a žien bola vyššia frekvencia
79
Výsledky a diskusia
genotypu GG (Ni et al., 2009). V skupine obéznych a v skupine s normálnou
hmotnosťou bola tiež potvrdená vyššia frekvencia alely G (0,63) nad alelou A (0,38).
Hodnota BMI bola v tejto štúdii tiež zvýšená u jedincov s genotypom GG (27,1 kg.m-2)
a potvrdila sa aj vyššia hladina glukózy (4,8 a 5,0 mmol.l-1) v krvi u obéznych jedincov.
Pre genotyp GG možno konštatovať, že sledované biochemické parametre majú
zhoršujúcu sa tendenciu. U ľudí s týmto genotypom možno predpokladať zdravotné
riziko.
V analyzovanej populácii najlepšie biochemické parametre boli stanovené pre
jedincov s genotypom AG a AA.
Tabuľka 31: Genotypová hodnota biochemických parametrov pre LEPR génLEPR BMI CHOL HDL LDL TAG GLU
AA +0,5225 -0,0369 -0,0183 +0,0055 -0,0884 +0,1147
AG -0,8999 -0,0448 +0,0444 -0,0582 -0,0673 -0,2141
GG +1,2774 +0,1266 -0,0705 +0,1108 +0,0229 +0,3133
4.3 Analýza GHSR génu
Pri analýze polymorfizmu GHSR génu (171T/C) sme vychádzali z práce Wang et
al., (2004). V PCR reakcii boli použité nimi navrhnuté primery. Teplotný a časový
profil bol nasledovný: počiatočná denaturácia 94 oC po dobu 3 minút, denaturácia 94 oC
po dobu 45 sekúnd, annealing 60 oC, 45 sekúnd, polymerizácia 72 oC, 60 sekúnd
a elongácia 72 oC, 5 minút. Reakcia bola optimalizovaná na 30 cyklov v objeme 25 µl.
Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v kapitole „Materiál a metodika“. Veľkosť PCR
produktu bola 593 bp a PCR produkt bol vizualizovaný na 2% agarózovom géle.
Po PCR reakcii sme produkt štiepili reštrikčným enzýmom LweI. V analyzovanej
skupine sme identifikovali všetky tri genotypy: CC, TC aj TT. Pri genotype CC nám
vznikli fragmenty s dĺžkou 567 bp, 26 bp, pri genotype TC vznikli po štiepení tri
fragmenty s dĺžkou 593bp, 567bp a 26bp a posledný z pozorovaných genotypov TT,
nebol štiepený enzýmom, preto vznikol iba jeden fragment s dĺžkou 593 bp (Obrázok
19).
80
Výsledky a diskusia
Obrázok 19: Fotodokumentácia PCR-RFLP (LweI) génu GHSRVýsledky PCR – RFLP analýzy GHSR na 2% agarózovom gélePCR produkt (593bp), DNA ladder 100bp, genotyp CC ( 567bp, 26bp), genotyp TC (593bp, 567bp, 26bp), genotyp TT (593bp)
L100 PCR TT TC CC
Obrázok 20: Schématické zobrazenie štiepnych fragmentov GHSR génu 593bp pomocou reštrikčného enzýmu LweI
L100 – DNA ladder 100bp, PCR – PCR product (593bp), TT – (593 bp), TC – (593 bp, 567 bp, 26 bp), CC – (567 bp, 26 bp)
4.3.1 Genotypová štruktúra podľa génu GHSR
Na základe molekulovo-genetických analýz, sme v nami sledovanej populácii
vyhodnotili nasledovnú genotypovú štruktúru. Identifikovali sme všetky tri genotypy.
S genotypom CC sme identifikovali 19 jedincov, z toho bolo 11 mužov a 8 žien.
Genotyp TT bolo zistený u 20 jedincov a z toho bolo 9 mužov a 11 žien. Najmenej
jedincov bolo s genotypom TC a to 9 mužov a 8 žien.
Pre porovnanie uvádzame, že v štúdii Miyasaka et al. (2006) bola najväčšia
frekvencia genotypu TC (46,8%), genotyp TT (45,4%) a genotyp CC (7,7%) čo
korenšponduje s našimi výsledkami. Výsledky štúdie Wang et al. (2004, 2006) vo
81
Výsledky a diskusia
všetkých pozorovaných skupinách potvrdzujú najvyššiu frekvenciu genotypu TT
(55,5%) potom nasleduje genotyp TC (39,0%) a najnižšiu frekvenciu mal genotyp CC
(5,5%). Frekvencia alely C (0,5344) bola vyššia u mužov a alela T (0,5555; 0,5089)
prevažovala u žien a v celom sledovanom súbore.
Porovnateľné frekvencie uvádzajú aj Vartainen et al., (2004) a to vyššiu
frekvenciu alely T (0,68). Campa et al., (2010) potvrdili tiež vyššiu frekvenciu alely T
(0,70) čo je tendencia aj v nami testovanej skupine žien a v celom sledovanom súbore.
Pri porovnaní medzi očakávanými a pozorovanými frekvenciami genotypov χ2 – testom
boli výsledné diferencie hodnôt štatisticky preukazné (Tabuľka 32).
Tabuľka 32: Genetická štruktúra populácie génu GHSR
GÉN
GHSR
Genotypy (n=56) Alely χ2
d.f. = 2CC TC TT C T
Muži
N= 29
11 9 9 0,5344±0,0643
0,4655±0,0643
4,1074++
8,2844 14,4310 6,2344
Ženy
N=27
8 8 11 0,4444±0,0675
0,5555±0,0675
4,3199++
0,5333 13,3333 8,3333
Spolu
N=56
19 17 20 0,4910±0,0471
0,5089±0,0471
8,6343+++
13,5044 27,9910 14,5044
P<0,05-, P >0,05+, P>0,01++, P>0,001+++
Obrázok 21: Frekvencie genotypov na základe génu GHSR v sledovanej populácii v %
82
20 16 16
1414
20
05
101520253035404550
CC TC TT
muži ženy
Výsledky a diskusia
Efektívnosť pôsobenia alel pre GHSR gén je uvedená v tabuľke 33. Očakávaná
heterozygotnosť populácie bola (0,4998) podobne ako koeficient homozygotnosti
(0,5002). Hodnota polymorfného informačného obsahu lokusu (0,3749) sa blíži k
hraničnej hodnote rovnovážnej populácie, čo je dôsledok takmer vyrovnanej frekvencie
alel. Potvrdzuje to aj hodnota úrovne polymorfnosti lokusu, ktorá vyjadruje počet
efektívnych alel (1,9992). Stupeň realizácie možnej premenlivosti mal hodnotu 50,00%,
čo je ideálny rovnovážny stav. Takáto populácia je vhodná na asociačné štúdie a odhad
priemerného účinku génov.
Tabuľka 33: Efektívnosť pôsobenia alel génu GHSR v sledovanej populáciiAlely He PIC Ca ENA V%
Muži C,T 0,4976 0,3738 0,5024 1,9990 49,98
Ženy C,T 0,4938 0,3719 0,5062 1,9755 49,47
Spolu C,T 0,4998 0,3749 0,5002 1,9992 50,00
4.3.2 Vplyv génu GHSR na variabilitu biochemických parametrov
Pri géne GHSR v celej sledovanej populácii bola zvýšená priemerná hodnota BMI
pre genotypy CC (30,15). Tento genotyp bol v štúdii Miayasaka et al., (2006) spojený
s bulímiou. Ostatné genotypy TC a TT majú však hodnoty BMI v kategórii miernej
nadváhy. Tiež sme zaznamenali zvýšenú priemernú hodnotu celkového cholesterolu
pri genotype CC (5,62) a TT (5,45).
Tabuľka 34: Priemerné hodnoty biochemických parametrov celej populácie pre GHSR gén
ParameterGenotypy
CC (n = 19) TC (n = 17) TT (n = 20)BMI kg.m-2 30,15 26,17 26,86Chol mmol.l-1 5,62 5,19 5,45HDL mmol.l-1 1,77 1,75 1,74LDL mmol.l-1 3,20 2,64 3,14TAG mmol.l-1 1,43 1,73 1,28GLU mmol.l-1 5,74 5,23 5,25
Tak ako v celej populácii tak aj v populácii rozdelenej podľa pohlavia je zvýšená
priemerná hodnota BMI u žien s genotypom CC (31,52). Naopak v štúdii Bienertova-
83
Výsledky a diskusia
Vašku et al., (2009) uvádzajú hodnoty BMI vyššie v skupine mužov. V prípade CC
genotypu bola zvýšená aj priemerná hodnota celkového cholesterolu na (6,04), ale
zvýšené hodnoty boli u žien aj pri genotype TC (5,79) a TT (6,06) a u mužov
s genotypom CC (5,32). U žien boli zvýšené hodnoty aj pri HDL cholesterole
s genotypom TC (2,13) a TT (2,06) čo nie je rizikové. Genotyp TC mal hodnoty
biochemických parametrov v referenčnom intervale.
V T-teste GHSR génu bol vplyv genotypu TC štatisticky preukazný rozdiel
(0,0049) v prospech mužov pri HDL cholesterole. Pri genotype TT bol vysoko
preukazný rozdiel HDL cholesterolu (0,0002), celkového cholesterolu (0,0014) a LDL
cholesterolu (0,0014) v prospech mužov.
Asociáciu alely T s nárastom telesnej hmotnosti a vysokým BMI potvrdili Wang et
al., (2004). Naopak Miyasaka et al., (2006) neuvádzajú vplyv alely T, v polymorfizme
171T/C, na rozvoj bulímie ani s anorexiou a poruchami príjmu potravy. Autori však
uvádzajú až 45,4% jedincov v testovanej skupine malo rizikový genotyp TT.
V rozsiahlej štúdii Gueorguiev et al., (2009) nepotvrdili žiadne významné
asociácie polymorfizmu rs 495225 v géne GHSR s hladinou insulinémie a glykémie.
Tabuľka 35: Priemerné hodnoty biochemických parametrov pre GHSR gén podľa pohlavia
Parametre
GenotypyMuži Ženy
CC(n = 11)
TC(n = 9)
TT(n = 9)
CC(n = 8)
TC(n = 8)
TT(n = 11)
BMI kg.m-2 29,16 25,08 26,08 31,52 27,39 27,50
Chol mmol.l-1 5,32 4,66 4,71 6,04 5,79 6,06
HDL mmol.l-1 1,67 1,42 1,36 1,90 2,13 2,06
LDL mmol.l-1 2,94 2,30 2,71 3,56 3,03 3,50
TAG mmol.l-1 1,58 2,05 1,50 1,23 1,37 1,10
GLU mmol.l-1 5,61 5,38 5,47 5,91 5,07 5,06
4.3.3 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty
84
Výsledky a diskusia
Na základe nameraných biochemických ukazovateľov pre jednotlivé genotypy
bola stanovená ich genotypová hodnota a vyjadrený účinok aditívnej hodnoty a efekt
dominancie. Genotypové hodnoty sú uvedená v tabuľke 36. Aditívne hodnoty a efekty
dominancie sú uvedené v prílohe.
Zo sledovaných biochemických parametrov bol zistený vplyv genotypu CC. Pre
tento genotyp boli zistené významne vyššie hodnoty BMI (+2,8442), zvýšená hladina
cholesterolu v krvi (+0,2598), HDL cholesterolu (+0,0123), LDL cholesterolu
(+0,2902) a glukózy (+0,3766).
Vartainen et al., (2004) vo svojej štúdii tiež potvrdili najvyššiu hodnotu BMI
v genotype CC a najnižšiu v genotype TC, rovnako ako hladina HDL cholesterolu
v krvi bola najvyššia pri genotype CC a najnižšia pri genotype TC.
Z tohto vyplýva u ľudí s genotypom CC riziko vzniku zdravotných komplikácii.
V populácii boli optimálne biochemické parametre stanovené pri jedincoch
s genotypom TC a TT.
Tabuľka 36: Genotypová hodnota biochemických parametrov pre GHSR génGHSR BMI CHOL HDL LDL TAG GLU
CC +2,8442 +0,2598 +0,0123 +0,2902 -0,1104 +0,3766TC -1,1385 -0,1717 -0,0010 -0,2626 +0,1888 -0,1239
TT -0,4510 +0,0895 -0,0096 +0,2366 -0,2615 -0,1113
4.4 Analýza diferencií medzi skupinami
V sledovanej populácii bola vyhodnotená variabilita biochemických
ukazovateľov nutričného stavu: celkový cholesterol, LDL cholesterol, triglyceridy,
glukózu a BMI. Vyhodnotené boli medziskupinové diferencie a korelácie podľa
pohlavia a podskupiny podľa BMI.
85
Výsledky a diskusia
Obrázok 22: Grafické porovnanie pozorovaných skupín a jednotlivých biochemických parametrov
Pri analýze minimálnych a maximálnych nameraných hodnôt boli zistené
výnimočne podlimitné aj nadlimitné hodnoty.
Tabuľka 37: Variabilita biochemických parametrov a BMI populácie (n=56)Parameter SD SE V [%]
BMI kg.m-2 27,77 5,09 0,68 25,99CHOL mmol.l-1 5,43 1,27 0,16 1,61
HDL mmol.l-1 1,75 0,44 0,05 0,20LDL mmol.l-1 3,01 1,01 0,13 1,03
TAG mmol.l-1 1,47 0,67 0,09 0,46
GLU mmol.l-1 5,41 0,83 0,11 0,69
86
0
5
10
15
20
25
30
35
40
CHOL HDL LDL TAG GLU BMI
športovci
normálna váha
ľahká nadváha
obezita
Výsledky a diskusia
Tabuľka 38: Variabilita biochemických parametrov a BMI podľa pohlaviaPohlavie Parameter SD SE V[%]
Muži (29)
BMI kg.m-2 26,94 4,64 0,86 21,58CHOL mmol.l-1 4,92 1,11 0,20 1,23HDL mmol.l-1 1,50 0,42 0,07 0,18LDL mmol.l-1 2,67 0,88 0,16 0,78TAG mmol.l-1 1,70 0,73 0,13 0,54GLU mmol.l-1 5,49 0,67 0,12 0,45
Ženy (27)
BMI kg.m-2 28,66 5,49 1,05 30,15CHOL mmol.l-1 5,97 1,22 0,23 1,49HDL mmol.l-1 2,03 0,27 0,05 0,073LDL mmol.l-1 3,38 1,03 0,19 1,07TAG mmol.l-1 1,22 0,51 0,09 0,26GLU mmol.l-1 5,32 0,98 0,18 0,96
Z našich výsledkov vyplýva že ženy majú oveľa viac nadlimitných hodnôt a to
hlavne pri celkovom cholesterole čo je veľmi veľké riziko vzniku kardiovaskulárnych
ochorení. Zvýšené hodnoty boli aj pri LDL cholesterole, ktorý nazývame aj ako „zlý“.
Ženy mali vysoké hodnoty glukózy a to hlavne tie, ktoré mali zvýšené BMI nad 30 čo
predstavuje riziko vzniku cukrovky, preto sa týmto ľuďom odporúča konzumácia
polysacharidov, zníženie obsahu tukov a zvýšiť podiel vlákniny v strave. Zvýšené
hodnoty triglyceridov boli zase namerané u mužov. Jeden z nich mal zvýšené všetky
hodnoty zisťovanou biochémiou, čo u neho predstavuje vysoké zdravotné riziko.
T-test populácie v porovnaní mužov a žien s jednotlivými parametrami vyšiel
vysoko preukazný rozdiel (<0,0001) v obsahu HDL v prospech žien. Preukazne vyšší
obsah celkového cholesterolu (0,0014), triglyceridov (0,0070) a LDL (0,0083) bol
u žien.
4.4.1 Korelačná analýza
Pre celý sledovaný súbor sa touto analýzou potvrdili nasledovné štatistické
preukaznosti. Medzi hladinou HDL cholesterolu a hladinou celkového cholesterolu je
veľmi vysoká štatistická závislosť, čo nám hovorí o tom, že zvýšením hladiny HDL sa
zvyšuje aj celkový cholesterol. Pri zvýšení hladiny HDL je štatisticky preukazné
(0,0047), že sa zvyšuje aj hladina LDL cholesterolu. Tak isto pri zvýšení HDL
cholesterolu rastie aj hodnota BMI. Pri celkovej hladine cholesterolu a glukózy je
štatistická závislosť (0,0026), z čoho vyplýva, že keď sa zvyšuje hladina cholesterolu
87
Výsledky a diskusia
zvyšuje sa aj hladina glukózy. Silná pozitívna závislosť (<0,0001) je zaznamenaná pri
hodnotení celkového cholesterolu s LDL a s BMI, čo znamená, že s narastajúcou
hladinou celkového cholesterolu narastá aj hladina LDL cholesterolu a zvyšuje sa aj
BMI.
Tiež sa potvrdila štatistická preukaznosť (0,0017) pri parametri glukózy s LDL,
takže s narastajúcou hladinou glukózy rastie aj hladina LDL cholesterolu. Pozitívna
štatistická závislosť (<0,0001) je medzi GLU a BMI. Potvrdili sa aj štatistické
preukaznosť medzi LDL a BMI (0,0005) a aj pri TAG a BMI (0,0043), keď rastie LDL
cholesterol a TAG zvyšuje sa BMI.
Tabuľka 39: Korelácie pre celý súbor (n=56)
SPOLU HDL CHOL TAG GLU LDL BMI
HDL 1,00000 0,63769<0,0001
-0,092110,4995
0,034610,8001
0,372840,0047
0,362150,0061
CHOL 1.00000 0,126510,3529
0,394640,0026
0,91581<0,0001
0,59329<0,0001
TAG 1,00000 0,198610,1423
-0,099080,4675
0,375730,0043
GLU 1,00000 0,409620,0017
0,58639<0,0001
LDL 1,00000 0,452590,0005
BMI 1,00000
V sledovanej skupine žien (27) sme pozorovali štatistickú preukaznosť medzi
nasledovnými parametrami. Celkový cholesterol s triglyceridmi (0,0003) a celkový
cholesterol s glukózou (0,0004). Silná štatistická preukaznosť sa realizovala medzi
celkovým cholesterolom a LDL cholesterolom (<0,0001). Z našich výsledkov tiež
môžeme povedať, že tak ako v celom súbore aj tu platí, že s nárastom hladiny
celkového cholesterolu sa zvyšuje aj BMI. Štatisticky preukazný bol aj vzťah medzi
triglyceridmi a LDL cholesterolom (0,0037). Silná štatistická preukaznosť (<0,0001)
sme zistili medzi triglyceridmi a výškou BMI, a tak isto aj pri glukóze a BMI. Bola
potvrdená pozitívna závislosť medzi hladinou LDL cholesterolu a BMI.
88
Výsledky a diskusia
Tabuľka 40: Korelácie pre ženy (n=27)
ŽENY HDL CHOL TAG GLU LDL BMI
HDL 1,00000 0,266860,1784
-0,008810,9652
0,116470,5629
0,061370,7611
-0,032820,8709
CHOL 1,00000 0,64653
0,00030,635750,0004
0,96436<0,000
1
0,598130,0010
TAG 1,00000 0,370800,0569
0,538780,0037
0,73546<0,0001
GLU 1,00000 0,632420,0004
0,71209<0,0001
LDL 1,00000 0,543600,0034
BMI 1,00000
V skupine mužov sme zistili najmenej štatisticky preukazných hodnôt. Štatistická
preukaznosť (<0,0001) bola stanovená medzi HDL cholesterolom a celkovým
cholesterolom. Tiež bol potvrdený preukazne (0,0004) aj vzťah medzi HDL
cholesterolom a BMI. Podobne, ako aj u žien, sme stanovili kladný (< 0,0001) vzťah
medzi celkovým cholesterolom a LDL cholesterolom v krvi. V skupine mužov aj u žien
rastúca hladina celkového cholesterolu v krvi súvisela so zvyšujúcimi sa hodnoty BMI.
Bolo preukázané, že s rastúcou hladinou cukru v krvi dochádza k nárastu hodnoty BMI.
Tabuľka 41: Korelácie pre mužov (n=29)
MUŽI HDL CHOL TAG GLU LDL BMI
HDL 1,00000 0,73801<0,0001
0,236780,2162
0,14966
0,4384
0,340740,0705
0,609680,0004
CHOL 1,00000 0,10908
0,5732
0,27136
0,1545
0,83337<0,0001
0,565630,0014
TAG 1,000000,0119
60,9509
-0,352810,0605
0,304530,1082
GLU 1,00000
0,243430,2032
0,472390,0097
LDL 1,00000 0,27458
89
Výsledky a diskusia
0,1494
BMI 1,00000
90
Záver
5 Záver
V súlade s vytýčeným cieľami dizertačnej práce sme optimalizovali PCR-RFLP
metódu pre identifikovanie a genotypovanie LEP, LEPR a GHSR génov a HRM
analýzu pre LEP gén. Pre štúdium polymorfizmu vybraných génov sme použili krv
z ktorej sme si vyizolovali DNA.
Na základe molekulovo-genetických analýz sme vyhodnotili genetickú štruktúru
populácie a uskutočnili sme aj asociačné štúdie zamerané na vplyv genotypu
a biochemické parametre.
V prípade LEP génu sme v populácii zaznamenali prevahu heterozygotneho
genotypu AG nad ostatnými genotypmi, najnižšie zastúpenie mal genotyp AA. Z toho
vplýva aj prevaha alely G nad alelou A. Pre mutáciu A/G možno konštatovať, že
sledované biochemické parametre majú zhoršujúcu sa tendenciu u ľudí s genotypom
GG. V analyzovanej populácii biochemické parametre zodpovedajúce referenčnému
rozpätiu boli stanovené u jedincov s genotypom AG. Rozdiel medzi očakávanými
a pozorovanými frekvenciami genotypov sme overili χ2 – testom a zistili sme, že
sledovaná populácia bola v genetickej rovnováhe.
Pri LEPR géne sme tiež zaznamenali prevahu heterozygotneho genotypu AG nad
ostatnými genotypmi. Homozygotny genotyp AA a GG boli v tejto populácii zastúpené
rovnakým počtom, z čoho vyplýva aj rovnaká frekvencia genotypov. Frekvencia
genotypov A a G bola rovnaká. Ženy mali vyššiu frekvenciu genotypu A a muži mali
vyššiu frekvenciu genotypu G. V analyzovanej populácii najlepšie biochemické
parametre boli stanovené pre jedincov s genotypom AG a AA. Na základe výsledkov χ2
– testu, ktorým sme overili rozdiely medzi očakávanými a pozorvanými frekvenciami
genotypov bola populácia v genetickej rovnováhe.
V genetickej štruktúre génu GHSR bolo najviac jedincov s genotypom TT
a najmenej bolo heterozygotneho genotypu TC. Frekvencia alely T bola v prevahe nad
frekvenciou C. V populácii boli optimálne biochemické parametre stanovené pri
jedincoch s genotypom TC a TT. Populácia bola v genetickej rovnováhe, čo sme zistili
91
Záver
overením rozdielov medzi očakávanými a pozorovanými frekvenciami genotypov χ2 –
testom.
Vrámci sledovaných skupín mali skupina športovcov a skupina s normálnou váhou
priemerné hodnoty sledovaných parametrov v rozmädzí referenčného intervalu.
S nárastom BMI sa zvyšovali aj priemerné hodnoty sledovaných biochemických
parametrov. Najrizikovejšia vyšla skupina s BMI nad 30, kde sem mali najviac
nadlimitných hodnôt sledovaných biochemických parametrov.
Korelačnou analýzou sa potvrdilo, že u mužov a v celom súbore medzi hladinou
HDL cholesterolu a celkového cholesterolu je vysoká štatistická preukaznoť a u žien sa
preukaznosť nepotvrdila. Vo vzťahu TAG a HDL cholesterolom sa nepotvrdila
štatistická preukaznosť. U žien medzi hladinou celkového cholesterolu a hladinou TAG
sa potvrdila štatistická preukaznosť. V celom súbore a u žien sa potvrdila preukaznosť
vo vzťahu celkového cholesterolu a glukózy. Medzi hladinou LDL cholesterolu a HDL
cholesterolu bol štatisticky preukazný vzťah iba celom súbore v skupine žien a mužov
sa štatistická preukaznosť nepotvrdila. Silná štatistická preukaznosť sa potvrdila vo
všetkých troch skupinách medzi hladinou LDL cholesterolom a celkových
cholesterolom. V skupine žien sa potvrdila preukaznosť vo vzťahu LDL cholesterolu
a TAG. Štatistická preukaznosť sa potvrdila v skupine žien a celom súbore medzi
hladinami GLU a TAG. Preukaznosť sa potvrdila u mužov a v celom súbore medzi
hladinou HDL cholesterolu a hodnotou BMI.Vo všetkých troch sledovaných skupinách
sa potvrdila preukaznosť medzi hladinou celkohého cholesterolu a hodnotou BMI
a hladinou glukózy a BMI. V skupine žien sa potvrdila silná štatistická preukaznosť
medzi hladinou TAG a BMI. V celom sledovanom súbore a u žien sa potvrdila
preukaznosť mezdi hodnotou BMI a hladinou LDL cholesterolu.
Touto analýzou sa potvrdil vplyv pohlavia na jednotlivé biochemické parametre. A
vybrané gény sú významné z hľadiska metabolizmu tukov a glukózy u ľudí .
92
Návrh na využitie výsledkov
6 Návrh na využitie výsledkov
Výsledky dizertačnej práce poskytujú informáciu o genetickom polymorfizme
sledovanej populácie v rámci LEP, LEPR a GHSR génov. Získané informácie
poukazujú aj na to, že tieto vybrané gény sú kandidátskymi génmi porúch metabolizmu
lipidov a vzniku obezity Na základe získaných výsledkov odporúčame pomocou
optimalizovaných molekulovo-genetických metód:
Rozšíriť sledovanú populáciu a doplniť získané poznatky o vplyve
genotypu vybranných génov na hladiny biochemických markerov
a nutričný stav organizmu. V experimentoch zohľadňovať vplyv pohlavia
a veku pri hodnotení nutričného stavu a tvorbe diétneho režimu ľudí
Využiť získané informácie o polymopfizme génov LEP, LEPR a GHSR pre
hodnotenie nutričného stavu jedincov a zohľadňovať vplyv týchto génov
pri substitučnej liečbe alebo individuálnej diéte
Pre nutrigenomické štúdie analyzovať ďalšie polymorfizmy génov LEP,
LEPR, GHSR, GHRL, MC4R, POMC, TNF α, UCP 1, UCP 2, UCP 3
a realizovať asociačné štúdie s cieľom charakterizovať ich vplyv na
nutričný a zdravotný stav človeka
Pre nutrigenetické štúdie rozšíriť analýzy asociácií nami sledovaných
génov v populácii a rozšíriť sledovanú populáciu, analyzovať cielene
diagnostikované skupiny. Pre asociačné štúdie využiť skupiny ľudí
z uskutočnených experimentov a sledovať aj skupiny s fenotypom
zodpovedajúcim poruche metabolizmu lipidov
93
Zoznam použitej literatúry
Zoznam použitej literatúry
1. ABIZAID, A. – HORVATH, T.L. 2008. Brain circuits regulating energy
homeostasis. In Regulatory Peptides, vol. 149, 2008, no. 1-3, p.3-10. ISSN:
0167-0115.
2. AMILLS, M. – VILLALBA, D. – TOR, M. – MERCADÉ, A. – GALLARDO,
D. -CABRERA, B. – JIMENEZ, N. – NOGUERA, J.L. – SÀNCHEZ, A. –
ESTANY, J. 2008. Plasma leptin levels in pigs with different leptin and leptin
receptor genotypes In: Journal of Animal Breeding and Genetics, vol. 125, 2008,
no. 4, p. 228-233. ISSN: 0931-2668.
3. BANKS, W.A. – TSCHÖP, M. – ROBINSON, S.M. – HEIMAN, M.L. 2002.
Extent and direction of ghrelin transport across the blood-brain barrier is
determined by its unique primary structure. In Journal of Pharmacolgy and
Experimental Therapeutics, vol. 302, 2002, no. 2, p.822-827. ISSN: 1521-0103.
4. BARATTA, M. 2002. Leptin – from a signal of adiposity to a hormonal
mediator in peripheral tissues. In Medical Science Monitor, vol.8, 2002, p. 282-
292. ISSN: 1234-1010.
5. BELL, C.G. – WALLEY, A.J. – FROGUEL, P. 2005. The genetic of human
obesity. In Nature Reviews Genetics, vol. 6, 2005, p.221-234. ISSN: 1471-0064.
6. BEŇO, I. 2008. Náuka o výžive. 2. vyd. Martin : Osveta 2008, s. 66-67. ISBN
80-8063-126-3.
7. BERTHOUD, H.R. 2002. Multiple neural systems controlling food intake and
body weight. In Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 26, 2002, p.393–428.
ISSN:0149-7634
8. BEŽO, M. – RAŽNÁ, K. – BEŽOVÁ, K. 2010. Všeobecná genetika. 3. vyd.
Nitra : SPU. 207 s. ISBN 978-80-552-0477-2.
9. BIENERTOVÁ-VAŠKÚ, J. 2009. Potenciál variability v genech kódujícich
adipokiny v neurobehaviorálním řízení příjmu potravy u české obézni a neobézni
populace : dizertačná práca. Brno: Masarykova univerzita, 2009. 118 s.
10. BIENERTOVÁ-VAŠKÚ, J. – BIENERT, P. – SABLIKOVA, L. –
SLOVACKOVA, L. – FOREJT, M. – PISKACKOVA, Z. – KUCEROVA, L. –
HECZKOVA, K. – BRAZDOVA, Z. – VASKU, A. 2009. Effect of ID ACE
gene polymorphism on dietary composietion and obesity-related anthropometric
94
Zoznam použitej literatúry
parameters in the Czech adult population. In Genes and Nutrition, vol. 4, 2009,
p.207-213. ISSN:1555-8932.
11. BIOWEB.GENEZIS.EU Genetika základné pojmy. [on-line].[cit. 2010-02-23].
Dostupné na internete: <http://www.bioweb.genezis.eu/index.php?cat=7&file=p
ojmy>
12. BJORBAEK, C. – KAHN, B.B. 2004. Leptin signaling in the central nervous
system and the periphery. In Recent Progress in Hormone Research, vol. 59,
2004, p. 305-331. ISSN:0079-9963.
13. BOCHUKOVA, E.G. – HUANG, N. – KEOGH, J. 2010. Large, rare
chromosomal deletions associated with severe early-onset obesity. In Nature,
vol. 463, 2010, p.666-670. ISSN: 0028-0836.
14. BOTSTEIN, D. – WHITE, R.L. – SKOLNIK, M. – DAVIS, R.W. 1980.
Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment lenght
polymorphism. In The American Journal of Human Genetics, vol. 32, 1980, p.
314-331. ISSN:0002-9297.
15. BOUCHARD, C.- DESPRÉS, J.P.- MAURIEGE, P. 1993. Genetic and
nongenetic determinants of regional fat distribution. In: Endokrine Reviews, vol.
14, 1993, no. 1, p. 72-89. ISSN: 0163769X.
16. BOULOUMIE, A. – MARUMO, T. – LAFONTAN, M. – BUSSE, R. 1999.
Leptin induces oxidative stress in human endothelial cells. In The FASEB
Journal, vol. 13, 1999, p. 1231-1238. Online ISSN: 1530-6860.
17. BRAY, G.A.- YORK, D.A. 1997. Leptin and clinical medicine: a new piece in
the puzzle of obesity. In Journal of Clinical Endokrinology and Metabolism,
vol. 82, 1997, no. 9, p. 2771-2776. ISSN: 0021972X.
18. BROCKMANN, G.A. – KRATZSCH, J. – HALEY, C.S. 2000. Single QTL
effects, epistasis and pleiotropy account for two-thirds of the phenotypic F(2)
variance of growth and obesity in DUGixDBA/2 mice. In Genome Research.,
2000, no. 10 p. 1941-1957. Online ISSN: 1549-5469.
19. BRONSKÝ, J.- KOTASKA, K.-PRŮŠA, R. 2004. Ghrelin- structure and
clinical applications In Československá Fyziologie, roč. 53, 2004, č.2, s. 80-85
ISSN: 1210-7875.
20. BRONSKÝ, J.- PRŮŠA, R. 2008. Biochemické markery v regulaci nutričního
stavu. In Klinické Biochemie a Metabolismus, vol. 16, 2008 no. 37, p. 6-13
ISSN: 1210 – 7921.
95
Zoznam použitej literatúry
21. BUCZKOWSKA, O.A. 2005. The role of ghrelin in the regulation of energy
homeostasis. In Endokrynol. Diabetol. Chor. Przemiany, vol. 1, 2005, no. 1,
p.39-42.
22. BURKHARDTOVÁ, D. 2007. Laboratórne hodnoty. Bratislava : NOXI, 2007,
s. 71-72. ISBN 978-80-89179-59-6.
23. CAMPA, D. – PARDINI, B. – NACCARATI, A. – VODICKOVA, L. –
NOVOTNY, J. – STEINKE, V. – RAHNER, N. – HOLINSKI-FEDER, L. –
MORAK, M. – SCHACKERT, H.K. – GÖRGENS, H. – KÖTTING, J. – BETZ,
B. et al. 2010. Polymorphism of genes coding for ghrelin and its receptor in
relation to colorectal cancer risk: a two-step gene-wide case-control study. In
BMC Gastroenterology, vol. 112, 2010, no. 10, p.1-6. ISSN: 1471-230X.
24. CAMPBELL, N. A. – REECE, J.B. 2006. Biologie. Brno : Computer Press,
2006, s. 68 – 71, ISBN: 80-251-1178-4.
25. CAMPFIELD, L. A. – SMITH, F. J. – GUISEZ, Y. – DEVOS, R. – BURN, P.
1995. Recombination mouse OB protein: evidence for a peripheral signal linking
adiposity and central neural networks. In Science, vol. 269, 1995, p. 546–549.
ISSN: 0036-8075.
26. CHAGNON, Y.C. – WILMORE, J.H. – BORECKY, I.B. – GAGNON, J. –
PERUSSE, L. – CHAGNON, M. – COLLIER, G.R., LEON, A.S. – SKINNER,
J.S. – RAO, D.C. – BOUCHARD, C. 2000. Associations between the leptin
receptor gene and adiposity in middle-aged Caucasian males from the Heritage
family study. In Journal of Clinical Endokrinology and Metabolism, vol. 85,
2000, p. 29-34. ISSN: 0021972X.
27. CHANOINE, J.P. – WONG, A.C. 2004. Ghrelin gene expression is maredly
highter in fetal pancreas compared with fetal stomach:effect of maternal fasting.
In Endocrinology, vol. 145, 2004, p. 3813-3820. Online ISSN: 1945-7170.
28. CHEN, C.C. – CHANG, T. – SU, H.Y. 2004. Characterization of porcine leptin
receptor polymorphisms and their association with reproduction and production
traits. In Animal Biotechnology 15, 2004, p. 491-495. ISSN: 1532-2378.
29. CHINN, S. – RONA, R. – GULLIFORD, M.C. HAMMOND, J. 1992. Weight-
for-height in children aged 4-12 years. A new index compared to the nermalised
body mass index. In European Journal of Clinical Investigation, vol. 46, 1992,
p.489-500. ISSN: 1365-2362.
96
Zoznam použitej literatúry
30. CLEMENT, K. – VAISSE, C. – LAHLOU, N. – CABROL, S. – PELLOUX, D.
– CASSUTO, D. – GOURMELEN, M. – DINA, C. – CHAMBAZ, J.-
LACORTE, J.M. – BASDEVANT, A. – BOUGNERES, P. – LEBOUC, Y. –
FROUGEL, P. – GUY-GRAND, B. 1998. A mutation in the human leptin
receptor gene causes obesity and pituary dysfunction. In Nature, vol. 392, 1998,
p. 398-401. ISSN: 0028-0836.
31. COLL, A.P. – FAROOQI, S. – O´RAHILLY, S. 2007. The hormonal control of
food intake. In Cell, vol. 129, 2007, p. 251-262. ISSN: 0092-8674.
32. CONSIDINE, R. V. – CONSIDINE, E. L. – WIILIAMS, C. J. – NYCE, M. .R.
1996. Mutation screening and identifiacation of a sequence Variation in the
human OB gene codin region. In Biochemical and Biophysical Research
Communications, vol. 220, 1996, p. 735–739. ISSN: 0006-291X.
33. COVISA, J.V. 2006. Praktická zdravoveda. 2. vyd. Mladé letá, 2006, s. 355-
363, ISBN 80-10-01114-2.
34. COWLEY, M.A. - GROVE, K.L. 2004. Ghrelin-Satisfying a hunger for the
mechanism. In Endocrinology, vol. 145, 2004, no. 6, p. 2604-2606. ISSN:
0013-7227.
35. CROW, J.F. – KIMURA, M. 1970. An Introductio to Population Genetic
Theory. In New York: Harper and Row, 1970.
36. CUMMINGS, D.E. - SCHWARTZ, M.W. 2003. Genetics and pathophysiology
of human obesity. In Annual Review of Medicine, vol. 54, 2003, p. 453-471.
ISSN: 0066-4219.
37. ČEPICA, S. 2002. Současná genomika hospodářských zvířat. In Sb. XX
Genetické dny. Brno : MZLU, 2002, s.12–18. ISBN 80-7157-607-7.
38. CRABBE, P., - GOEMAERE, S. – ZMIERCZAK, H. – VAN
POTTERLBERGH, I. – DE BACQUER, D. 2006. Are serum leptin and the the
Gln223Arg polymorphism of the leptin receptor determinants of bone
homeostasis in elderly men. In European Journal of Endocrinology, vol. 154,
2006, p. 707- 714. ISSN: 0804-4643.
39. CREMONINI, F. – CAMILLERI, M. – VAZQUEZ ROQUE, M. – MCKINZIE,
S. – BURTON, D. – DAXTER, K. – ZINSMEISTER, A.R. 2006. Obesity does
not increase effects of synthetic ghrelin on human gastric motor functions. In
Gastroenterology , vol. 131, 2006, no. 5, p. 1431-1439. ISSN: 0016-5085.
97
Zoznam použitej literatúry
40. DIBONA, G.F. 2004. The sypathetic nervous system and hypertension: recent
developments. In Hypertension, vol. 43, 2004, p. 147-150. ISSN: 0194911X.
41. DIÉQUEREZ, C. – VYZQUEZ, M.J. – ROMERO, A. – LOPEZ, M. –
NOQUEIRAS, R. 2011. Hypothalamic Control of Lipid Metabolism: focus on
Leptin, Ghrelin and Melanocortins. In Neuroendocrinology, 2011. p.1-11, ISSN:
0028-3835.
42. DUNBAR, J.C. – HU, Y. – LU, H. 1997. Intracerebroventricular leptin increases
lumbar and renal sympathetic nerve activity and blood pressure in normal rats.
In Diabetes, vol. 46, 1997, p. 2040-2043. Print ISSN: 0012-1797; Online ISSN:
1939-327X.
43. DURAN, CH. – APPLEBY, N. – EDWARDS, D. – BATLEY, J. 2009.
Molecular genetic markers: discovery, applications, data storage and
visualisation. In Current bioinformatics, vol. 4, 2009, p. 16-27. ISSN: 1574-
8936.
44. EISENMANN, J.C. – HEELAN, K.A. – WELK, G.J. 2004. Assessing body
composition among 3-to 8-years old children: anthropometry, BIA and BXA. In
Obesity Research, vol. 12, 2004, p. 1633-1640. ISSN: 1930-7381.
45. EL-HASCHIMI, K. – PIERROZ, D.D. – HILEMAN, S.M. – BJORBAEK, C. –
FLIER, J.S. 2000. Two defects contribute to hypothalamic leptin resistance in
mice with diet-induced obesity. In Journal of Clinical Investigation, vol. 105,
2000, p. 1827-1832. ISSN: 00219738.
46. FAROOQI, I.S. – MATARESE, G. – LORD, G.M. – KEOGH, J.M. –
LAWRANCE, E. – AGWU, C. – SANNA, V. – JEBB, S.A. – PERNA, F. –
FONTANA, S. – LECHLER, R.I. – DEPAOLI, A.M. – O´RAHILLY, S. 2002.
Beneficial effects of leptin on obesity, T cell hyporesponsiveness, and
neuroendocrine/metabolic dysfunction of human congenital leptin deficiency. In
Journal of Clinical Investigation, vol. 110, 2002, p.1093-1103. ISSN:
00219738.
47. FAROOQI, S. – O´RAHILLY, S. 2005. Monogenic obesity in humans. In
Annual Review of Medicine, vol. 56, 2005, p.443-458. ISSN: 0066-4219.
48. FAROOQI, S. 2008. Monogenic human obesity. In Frontiers of Hormone
Research, 36, 2008, p.1-11. ISSN: 0301-3073.
98
Zoznam použitej literatúry
49. FAROOQI, S. – O´RAHILLY, S. 2008. Mutations in ligands and receptors of
the leptin-melanocortin pathway that lead to obesity. In Nature Clinical Practice
Endokrinology and Metabolism, vol. 18, 2008, p.569-577. ISSN: 1759-5029.
50. FRIED, S.K. - RICCI, M.R. - RUSSELL, C.D. - LAFERRE, B. 2000.
Regulation of leptin production in humans. In Journal of Nutrition, vol. 130,
2000, p. 3127-3131. ISSN: 0022-3166.
51. FRIEDEWALD, W.T. – LEVY, R.I. – FREDRIKSON, D.S. 1972. Estimation
of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without
use of the preparative ultracentrifuge. In Clin Chem, 18, 1972, p.499-502.
52. GAUNA, C. – MEYLER, F.M. – JANSSEN, J.A. – DELHANTY, P.J. –
ABRIBAT, T. – VAN KOETSVELD, P. – HOFLAND, L.J., BROGLIO, F. –
GHIGO, E. – VAN DER LELY, A.J. 2004. Administration of acylated ghrelin
reduces insulin sensitivity, whereas the combination of acylated plus unacylated
ghrelin strongly improves insulin sensitivity. In Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism, vol. 89, 2004, p. 5035-5042. ISSN: 0021972X.
53. GEFLAND, H. 1989. Taq polymerase. In PCR technology: principles and
application for DNA amplification. New York : Stockton Press, 1989, p. 17-22.
54. GRANKVIST, O. 1992. Improved Detection of HIV-2 DNA in clinical Samples
Using a Nested Primer-Based Polymerase Chain Reaction. In Journal of
Acquired Immune Deficiency Syndromes, vol. 5, 1992, p. 286-293. Online ISSN:
1077-9450.
55. GREEN, M.R. – VAN DER OUDERAA, F. 2003. Nutrigenetics : Where next
for the foods industry? In Pharmacogenomics Journal, vol. 3, 2003, p.191-193.
ISSN: 1470-269X.
56. GREENMAN, Y. – GOLANI, N. – GILAD, S. et al. 2004. Ghrelin secretion is
modulated in a nutrient- and gender-specific manner. In Journal of Clinical
Endocrinology, vol. 60, 2004, p. 382-388. ISSN: 0021-972X
57. GRIFFITHS, A.J.F. – GELBART, W.M. – LEWONTIN, R.C. – MILLER, J.H.
2002. Modern Genetic Analysis. 1. vyd. New York : Freeman, 2002, p.185-264.
ISBN: 0-7167-4382-5.
58. GUEORGUIEV, M. – LECOEUR, C. – MEYRE, D. – BENZINOU, M. –
MEIN, CH.A. – HINNEY, A. – VITIN, V. – WEILL, J. HEUDE, B. –
HEBEBRAUND, J. – GROSSMAN, A.B. – KORBONITS, M. – FROGUEL, P.
99
Zoznam použitej literatúry
2009. Association Studies on Ghrelin and Ghrelin Receptor Gene Polymorphism
with Obesity. In Obesity, vol. 17, 2009, p.745-754. ISSN: 1930-7381.
59. GUIZAR-MENDOZA, J.M. – AMADOR-LICONA, N. – FLORES-
MARTÍNEZ, S.E. – LÓPEZ-CARDONA, M.G. – AHUATZIN-TRÉMARY, R.
– SÁNCHEZ-CORONA, J. 2005. Association analysis of the Gln223Arg
polymorphism in the human letptin receptor gene, and traits related to obesity in
Mexican adolescents. In Journal of Human Hypertension, vol. 19, 2005, p.341-
346. ISSN: 0950-9240.
60. HEATHER D. Obesity factors. 2007 [online]. [cit. 2010-05-10] Dostupné na:
<http://louisville.edu/medschool/familymedicine/images/wtmgmt_4.jpg/view˃.
61. HETHERINGTON, M.M. – CECIL, J.E. 2010. Gene-environment interactions
in obesity. In Forum of Nutrition, vol. 63, 2010, p.195-203. ISSN: 1660-0347.
62. HEO, M. – LEIBEL, R.L. – FONTINE, K.R. – BOYER, B.B. – CHUNG, W.K.
– KOULU, M. – KARVONEN, M.K. – PERSONEN, U. – RISSANEN, A. –
LAAKSO, M. – UUSITUPA, M.I. – CHAGNON, Y. – BOUCHARD, C. –
DONOHOUE, P.A. – BURNS, T.L. – SHULDINER, A.R. – SILVER, K. –
ANDERSEN, R.E. – PEDERSEN, O. – ECHWALD, S. – SORENSEN, T.I. –
BEHN, P. – PERMUTT, M.A. – JACOBS, K.B. – ELSTON, C. – HOFFMAN,
D.J. – GROPP, E. – ALLISON, D.B. 2002. A meta-analytic investigation of
linkage and association of common leptin receptor (LEPR) polymorphisms with
body mass index and waist circumference. In International Journal of
Obesesity, vol. 26, 2002, p.640-646. ISSN: 0307-0565.
63. HIGUCHI, R. 1989. Rapid efficient extraction from cell or blood. In
Amplifications Perkin Elmer Newsletter, vol. 2, 1989, p. 1–3.
64. HINNEY, A. – VOGEL, C.I. – HEBEBRAND, J. 2010. From monogenic to
polygenic obesity: recent advances. In European Child and Adolescent
Psychiatry, vol. 19, 2010, p. 297-310. ISSN: 1435-165X.
65. HOCHBERG, I. – HOCHBERG, Z. 2010. Hypothalamic obesity. In Endocrine
Development, vol. 17, 2010, p.185-196. ISSN: 1662-2979.
66. HOLST, B. – HOLLIDAY, N.D. – BACH, A. – ELLING, C.E. – COX, H.M –
SCHWARTZ, T.W. 2004. Commov structural basis for constitutive activity of
the ghrelin receptor family. In The Journal of Biological Chemistry, vol. 279,
2004, no. 51, p. 53806-53817. ISSN: 0021-9258.
100
Zoznam použitej literatúry
67. HOOPER, L. – THOMPSON, R.L. – HARRISON, R.A. – SUMMERBELL,
C.D. – NESS, A.R. – MOORE, H.J. – WORTHINGTON, H.V. –
DURRINGTON, P.N. – HIGGINS, J.P.T. – CAPPS, N.E. – RIEMERSMA,
R.A. – EBRAHIM, S.J.B. – VEY SMITH, G. 2006. Risks and benefits of omega
3 fats for mortality, cardiovascular disease, and cancer: systematic review. In
British Medical Journal, vol. 332, 2006, p.752-760. ISSN: 0959-8138.
68. HOUSEKNECHT, KL. – PORTOCARRERO, CP. 1998. Leptin and its
receptors:regulators of whole-body energy homeostasis. In: Domestic Animal
Endocrinology, vol. 15, 1998, p. 457-75. ISSN: 0739-7240.
69. HOWARD, B.V. – VAN HORN, L. – HSIA, J. – MANSON, J.E. –
STEFANICK, M.L. – WASSERTHEIL-SMOLLER, S. – KULLER, L.H. –
LACROIX, A.Z. – LANGER, R.D. – LASSER, N.L. – LEWIS, C.E. –
LIMACHER, M.C. – MARGOLIS, K.L. – MYSIW, W.J. – OCKENE, J.K. –
PARKER, L.M. – PERRI, M.G. – PHILLIPS, L. – PRENTICE, R.L. et al. 2006.
Low-fat dietary pattern and risk of cardiovascular disease: the Women´s Health
Initiative Randomized Controlled Dietary Modification Trial. In The Journal of
the American Medical Association (JAMA), vol. 295, 2006, p. 655-666. EISSN:
15383598.
70. HRM – Hight Resolution Melt Assay Design and Analysis 2006. [online]. [cit.
2010-03-25]. Dostupné na:<http://www.gene-quantification.de/hrm-protocol-
cls.pdf˃.
71. HUBAČEK,J.A. – BLOUDÍČKOVÁ, S. – BOHUSLAVOVÁ, R. –
TÁBORSKÝ, P. – POLAKOVIČ, V. et al. 2007. Ghrelin variants influence
development of body mass index and plasma levels of total cholesterol in
dialyzed patients In Clinical Chemistry and Laboratory Medicne, vol. 45, 2007,
no. 9, p. 1121-1123. ISSN: 1434-6621.
72. ICHIHARA, S. – YAMADA, Y. 2008. Genetic factors for human obesity. In
Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 65, 2008, p.1086-1098. ISSN: 1420-
9071.
73. JANSSENS, A.C. – GWINN, M. – BRADLEY, L.A. – OOSTRA, B.A. – VAN
DUIJIN, C.M. – KHOURY, M.J. 2008. A critical appraisal of the scientific basis
of commercial genomic profiles used to assess health risks and personalize
health interventions. In Journal of Human Genetics, vol. 82, 2008, p. 593-599.
ISSN: 1435-232X.
101
Zoznam použitej literatúry
74. JIANG, J.B. – WILK, I. – BORECKI, S. – WILLIAMSON, A.L. – DE
STEFANO, G. – XU, J. – LIU, R.C. – ELLISON, M.P. – MYERS, R.H. 2004.
Common Variants in the 5´ Region of the Leptin Gene Are Associated with
Body Mass Index in Men from National Hear, Lung and Blood Institute Family
Heart Study. In The American Journal of Human Genetics, vol. 14, 2004, p.
220-230. ISSN: 0002-9297.
75. JIANG Z.H. – GIBSON, J.P. 1999. Genetics polymorphisms in the leptin gene
and their association with fatness in four pig breeds In Mammalian Genome,
vol.10, 1999, p. 191-193. e-ISSN: 1432-1777.
76. KALRA, S.P. - DUBE, M.G. - PU, S. - XU, B. – HORVATH, T.L. – KALRA,
P.S. 1999. Interacting appetite-regulating pathways in the hypothalamic
regulation of body weight. In Endocrine Reviews, vol. 20, 1999, p.68–100.
ISSN: 0163-769X.
77. KAPUT, J. – RODRIGGUES, R.L. 2006. Nutritional genomics : Discovering
the path to personalized nutrition. 1. vyd. New Jersey : John Wiley, 2006. 504 p.
ISBN: 978-0-471-68319-3.
78. KATSANIS, S.H. – JAVITT, G. – HUDSON, K. 2008. Public health. A case
study of personalized medicine1. In Science, vol. 320, 2008, p. 53-54. ISSN:
0036-8075.
79. KENNES, Y.M. – MURPHY, B.D. – POTHEIR, F. – PALIN, M.F. 2001.
Charakterization of swine leptin (LEP) polymorphism and their association with
production traits. In Animal Genetics, vol. 32, 2001, p. 215-218. Online ISSN:
1365-2052.
80. KISSENBAH, A.H. – SONNENBERG, G.E. – MYKLEBUST, J. –
GOLDSTEIN, M. – BROMAN, K. – JAMES, R.G. – MARKS, J.A. –
KRAKOWER, G.R. – JACOB, H.J. – WEBER, J. – MARTIN, L. –
BLANGERO, J. – COMUZZIE, A.G. 2000. Quantitative trait loci on
chromosomes 3 and 17 influence phenotypes of the metabolic syndrome. In
Proceedings of the National Academy Science USA, vol. 97, 2000, no. 26, p.
14478-14483. ISSN: 0027-8424.
81. KLOK, M.D. – JAKOBSDOTTIR, S. – DRENT, M.L. 2006. The role of leptin
and ghrelin in the regulation of food intake and body weight in humans:
a review. In Obesity, vol. 8, 2006, p. 21-34. EISSN: 1930-739X.
102
Zoznam použitej literatúry
82. KNOLL, A. 1998. Detekce polymorfismu ve vztahu k mapovaní QTL u prasat :
diserteční práce. Brno : MZLU, 1998. 151 s.
83. KNOLL, A. – URBAN, T. 2002. Aktuální metody používané v molekulárni
genetice zvířat. In Sb. XX. Genetické dny, Brno : MZLU, 2002, s.12–18. ISBN:
80-7157-607-7.
84. KOH, J.M. – KIM, D.J. – HONG, J.S. – PARK, J.Y. – LEE, K.U. – KIM, S.Y. –
KIM, G.S. 2002. Estrogen receptor alpha gene polymorphism PvuII and XbaI
influence association between leptin receptor gene polymorphism (Gln223Arg)
and bone mineral density in young men. In European Journal of
Endocrinology, vol. 147, 2002, p. 777-83. e-ISSN: 1479-683X.
85. KOJIMA, M. – HOSODA, H. – DATE, Y. – NAKAZATO, M. – MATSUO, H.
– KANGAWA, K. 1999. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated
peptide form stomach. In Nature, vol. 402, 1999, p.656-660. ISSN: 0028-0836.
86. KOJIMA, M. – KANGAWA, K. 2008. Structure and function of ghrelin. In
Results and Probllems in Cell Differenciation, vol. 46, 2008, p. 89-115. ISSN:
0080-1844.
87. KOLLÁR, J. 1996. Lipidy a lipoproteíny. Košice : Olympia, 1996, s.17-24.
ISBN 80-967388-7-9.
88. KONSTANTINEDES, S. – SHAFER, K. – KOSCHNICK, S. – LOSKUTOFF,
D.J. 2001. Leptin-dependent platelet aggregation and arterial thrombosis
suggests a mechanism for atherothrombotic disease in obesity. In Journal of
Clinical Investigation, vol. 108, 2001, p. 1533-1540. EISSN: 15588238.
89. KOPECKÁ, K. – KOPECKÝ, P. 2003 Zdravie a klinika chorôb. Martin :
Osveta, 2003, s. 356-357. ISBN: 80-8063-117-4.
90. KOPELMAN, PG. 2000. Obesity as a medical problem. In Nature, vol. 404,
2000, p. 635-643. ISSN: 0028-0836.
91. KORBONITS, M. – GOLDSTONE, A.P. – GUERGUIEV, M. et al. 2004.
Ghrelin a hormone with multiple functions. In Frontiers in neuroendocrinology,
vol. 25, 2004, p. 27-68
92. LALL, S. – TUNG, L.Y. – OHLSOON, C. – JANSSON, J.O. – DICKSON, S.L.
2001. Growth hormone (GH)-in-denendent stimulation of adiposity by GH
secretagogues. In Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.
280, p. 132-138. ISSN: 0006-291X.
103
Zoznam použitej literatúry
93. LAKAR, O. - FUNDAZIOA, E. 2009a. Action of ghrelin hormone increases
appetite and favors accumulation of abdominal fat. [on-line] [cit. 2010-05-15].
Dostupné na: <http://hplusmagazine.com/2009/05/20/action-ghrelin-hormone-
increases-appetite-and-favors-accumulation-abdominal-fat/>.
94. LAKAR, O. – FUNDAZIOA, E. 2009b. Appetite increased by action of ghrelin
hormone leading to accumulation of abdominal fat. [on-line] [cit. 2010-05-21].
Dostupné na: <http://www.medicalnewstoday.com/articles/150962.php>.
95. LEE, Y.S. 2009. The role of leptin-melanocortin system and human weight
regulation: lessons from experiments of nature. In Annals Academy of Medicine
Singapore, vol. 38, 2009, p.34-41. ISSN: 0304-4602.
96. LE ROUX, C.W. – NEARY, N.M – HALSEY, T.J. – SMALL, C.J. –
MARTINEZ-ISLA, A.M. – GHATEI, M.A. – THEDOROU, N.A. – BLOOM,
S.R. 2005. Ghrelin does not stimulate food intake in patients with surgical
procedures involving vagotomy. In The Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism, vol. 90, 2005, no. 8, p.4521-4524. Online ISSN: 1945-7197
97. LEVIN, F. – EDHOLM, T. – SCHMIDT, P.T. – GRYBÄCK, P. –
JACOBSSON, H. – DEGERBLAD, M. – HÖYBYE, C. – HOLST, J.J. –
REHFELD, J.F. – HELLSTRÖM, P.M. – NÄSLUND, E. 2006. Ghrelin
stimulates gastric emptying and hunger in normal-weight humans. In The
Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 91, 2006, no. 9, p.
3296-3302. Online ISSN: 1945-7197.
98. LIEFERS, S.C. – VEERKAMP, R.F. – TE PAS, M.F. – DELAVAUD, C. –
CHILLIARD, Y. – VAN DER LENDE, T. 2004. A missense mutation in the
bovine leptin receptor gene is associated with leptin concentrations during late
pregnancy. In Animal Genetics, vol. 35, 2004, p. 138-41. Online ISSN: 1365-
2052.
99. LITTLE, P.F.R. 2005. Structure and junction of the human genome. In Genome
Research, vol. 15, 2005, p. 1759-1766. ISSN: 1549-5469
100. LŐNNQVIST, F. 1996. The obese (ob) gene and its product leptin-a new
route toward obesity treatment in man? In Q J Medicine, vol. 89, 1996, p. 327-
332. ISSN: 0033-5622.
101. MACKOWSKI, M. – SZYMONIAK, K. – SZYDLOWSKI, M. –
KAMYCZEK, M. – ECKERT, R. – ROZYCKI, M. – SWITOVSKI, M. 2005.
Missense mutation in exon 4 of the porcine LEPR gene encoding extracelular
104
Zoznam použitej literatúry
domain and their association with fatness traits. In Animal Genetics, vol. 36,
2005, p. 135-137. ISSN: 1365-2052.
102. MAGER, U. – KOLEHMAINEN, M. – MELLO, V.D.F. – SCHWAB,
U. – LAAKSONEN, D.E. – RAURAMAA, R.- GYLLING, H. – ATALAY,M. –
PULKKINEN, L. – UUSITUPA, M. 2008. Expression of ghrelin gene in
preripheral blood mononuclear cells and plasma ghrelin concentrations in
patients with metabolic syndrome In European Journal of Endocrinology, vol.
158, 2008, p. 499-510. e-ISSN: 1479-683X.
103. MAKAŁOWSKI, W. 2001. The human genome structure and
organization. In Acta Biochimica Polonica, vol. 48, 2001, no. 3, p. 587-598.
ISSN:0001-527X.
104. MAMMÈS, O. – BETOULLE, D. – AUBERT, R. et al. 1998. Novel
polymorhisms in the 5, region of the LEP gene:association with leptin levels and
response to low-calorie diet on human obesity. In Diabetes, vol. 47, 1998, p.
487–489. Online ISSN: 1939-327X.
105. MAMMES, O. – BETOULLE, D. – AUBERT, R. – HERBETH, B. –
SIEST, G. – FUMERON, F. 2000. Association of the G2548A polymorphism in
the 5´region of the LEP gene with overwieght. In Annals of Human Genetics,
vol. 64, 2000, p. 391–394.
106. MANIATIS, T. 1982. Molecular cloning : a laboratory manual. New
York : Cold Spring Laboratory Press, 1982.
107. MANZELLA, D. – PARILLO, M. – RAZZINO, T. – GNASSO, P. –
BUONANNO, S. – GARGIULO, A. – CAPUTI, M. – PAOLISSO, G. 2002.
Soluble leptin receptor and insulin resistance as determinant of sleep apnea. In
International Journal of Obesity and Related Metabolic Disordes, vol. 26, 2002,
p. 370-5. ISSN: 1476-5497.
108. MARAČEK, I. – STANÍKOVÁ, A. – DANKO, J. 2004. Fyziológia
leptínu a jeho význam v prevencii porúch plodnosti prežúvavcov. In Slovenský
chov, 2004, s. 48. ISSN: 1335-1990.
109. MILLER, S. – DYKES, D. – POLESKY, H. 1988. A simple salting out
procedure for extracting DNA from human nucleated cells. In Nucleid Acid
Research, vol. 9, 1981, no. 4, p.5931-5947. Online ISSN: 1362-4962.
105
Zoznam použitej literatúry
110. MILUCHOVÁ, M. – TRAKOVICKÁ, A. – GÁBOR, M. 2009.
Genetické markéry kvality mlieka a zdravia hovädzieho dobytka. Nitra : SPU.
71s. ISBN 978-80-552-0281-5.
111. MIYASAKA, K. – HOSOYA, H. – SEKIME, A. – OHTA, M. –
AMONO,H. – MATSUSHITA, S. – SUZUKI, K. – HIGUCHI, S. –
FUNAKOSHI, A. 2006. Association of ghrelin receptor gene polymorphism
with bulimia nervosa in Japanese population. In Journal of Neural Transmision,
vol. 113, 2006, p.1279-1285. ISSN: 1435-1463.
112. MONTGOMERY, J. – WITTWER, C.T. – PALAIS, R. – ZHOU, L.
2007. Simultaneous mutation scanning and genotyping by high resolution DNA
melting analysis.In Nature Publishing Group, vol. 2, 2007, p. 59-66. EISSN:
1750-2799.
113. MUCCIOLI, G. – TSCHOP, M. – PAPOTTI, M. – DEGHENGHI, R. –
HEIMAN, M. – GHIGO, E. 2002. Neuroendocrine and peripheral activities of
ghrelin: implications in metabolism and obesity. In European Journal of
Pharmacology, vol. 404, 2002, p. 235-254. ISSN: 0014-2999.
114. MULLIS, K. B. 1990. The unusual origin of the Polymerase Chain
Reaction. In Scientific American, vol.. 262, 1990, no. 4, p. 36-43. ISSN: 0036-
8733.
115. MUNZBERG, H. – FLIER, J.S. – BJORBAEK, C. 2004. Region-specific
leptin resistance within the hypothalamus of diet-induced-obese mice. In
Journal of Endocrinology, vol. 145, 2004, p. 4880-4889. ISSN (electronic):
1479-6805.
116. MURRAY, C.D.R. – MARTIN, N.M. – PATTERSON, M. – TAYLOR,
S.A. – GHATEI, M.A. – KAMM, M.A. – JOHNSTON, C. – BLOOM, S.R. –
EMMANUEL, A.V. 2005. Ghrelin enhances gastric imptying in diabetic
gastroparesis: a double blind, placebo controlled, crossover study. In Gut, vol.
54, 2005, no. 12, p. 1693-1698. ISSN: 1468-3288.
117. MUY-RIVERA, M. – NING, Y. – FREDERIC, I.O. –
VADACHKORIA, S. - LUTHY, D.A. – WILLIAMS, M.A. 2005. Leptin,
soluble leptin receptor and leptin gene polymorphism in relation to preeclampsia
risk. In Physiological Research, vol. 54, 2005, p. 167-74. ISSN 1802-9973.
118. NAKASHIMA, K. – NARAZAKI, M. – TAGA, T. 1997. Leptin receptor
(OB-R) oligmerizes with itself but not with its closely related cytokine signal
106
Zoznam použitej literatúry
transducer gp130. In FEBS Letters, vol. 403, 1997, p. 79-82. ISSN: 0014-5793.
ISSN: 1939-327X.
119. NAKATA, M. – YADA, T. – SOEJIMA, N. – MARUYAMA, I. 1999.
Leptin promotes aggregation of human platelets via the long form of its receptor.
In Diabetes, vol. 48, 1999, p. 426-429. ISSN: 1939-327X.
120. NEI, M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance
from a small number af individuals. In Genetics, vol. 89, 1978, p.132. ISSN:
1943-2631.
121. NEUENSCHWANDER, S. – RETTENBERG, G. – MEIJERINK, E. –
JORG, H. – STRANZINGER, G. 1996. Partial characterization of porcine
obesity gene (OBS) and its localization to chromosome 18 by somatic cell
hybrids. In Animal Genetics, vol. 27, 1996, p. 275-278. ISSN: 1365-2052.
122. NI, K.Y. – SHEK-YI, Y. – TIN, L.L. – HONG, R.L.L. 2009. Genotyping
Candidate Genes Related to Obesity in UCSI University Student Cohort. In
Journal for the advancement of science and Arts, vol. 1, no. 1, 2009, p. 29-42.
ISSN: 1823-903X.
123. PANTEL, J. – LEGENDRE, M. – CABROL, S. – HILAL, L. – HAJAJI,
Y. – MORISSET, S. – NIVOT, S. – VIE-LUTON, M. – GROUSELLE, D. – DE
KERDANET, M – KADIRI, A. – EPELBAUM, J. – LE BOUC, Y. –
AMSELEM, S. 2006. Loss of constructive activity of the growth hormone
secretagogue receptor in familial short stature. In Journal of Clinical
Investigation, vol. 116, no. 3, 2006, p.760-768. EISSN: 15588238.
124. PASQUALINI, J.R. 2005. Enzymes involved in the formation and
transformation of steroid hormones in the fetal and placental compartments. In
Journal of Steroid Biochemisry and Molecular Biology, vol. 97, 2005, p. 401-
415. ISSN: 0960-0760.
125. PATTERSON, M. – VINCENT, R.P. – HUNT, C. et al. 2005.
Postprandial plasma ghrelin is supressed proportional to meal caloric content in
normal-weight but not obese subjects, In The journal od clinical endocrinology
and metabolism, vol. 90, 2005, no. 2, p. 1068-1071. ISSN: 0021972X.
126. PETRUSKA, J. – GOODMAN, M. F. 1988. Comparison between DNA
melting thermodynamics and DNA polymerase fidelity. In Proceedings of the
National Academy Science USA, vol. 85, 1988, p. 6252–6256. ISSN: 0027-8424
107
Zoznam použitej literatúry
127. PODAR, K. – ANDERSON, K.C. 2006. Caveolin-1 as a potentioal new
therapeutic target in multiple myeloma. In Cancer Letters, vol. 233, 2006, p. 10-
15. ISSN: 0304-3835.
128. POSKITT, E.M. 1995. Defining childhood obesity: the relative body
mass index (BMI). In Acta Paediatrica, vol. 84, 1995, p. 961-963. ISSN: 1651-
2227.
129. PRIEUE, X. – TUNG, L.Y.C. – GRIFFIN, J.L. – FAROOQI, S.I. – O
´RAHILLY, S. 2008. Leptin Regulates Peripheral Lipid Metabolism Primaly
through Central Effects on Food Intake. In Endocrinology, vol. 149, 2008, no.
11, p. 5432-5439. ISSN: 1945-7170.
130. QUINTON, N.D. – LEE, A.J. – ROSS, R.J. – EASTELL, R. –
BLAKEMORE, L. 2001. A single nucleotide polymorphism (SNP) in the leptin
receptor is associated with BMI, fat mass and leptin levels in postmenopausal
Caucasian women. In Human Genetics, vol. 108, 2001, p. 233-236. ISSN: 1432-
1203.
131. RAMSAY, T. G. – YAN, X. – MORRISON, C. 1998. The obesity gene
in swine: sequence and expression of porcine leptin. In Journal of Animal
Science, vol. 76, 1998, p. 484–490. ISSN: 0021-8812.
132. RAPLEY, R. – HARBRON, S. 2004. Molecular Analysis and Genome
Discovery. Chichester : Johnr Wiley, 2004. 388 p. ISBN: 9780470020203.
133. RANADIVE, S.A. – VAISSE, C. 2008 Lessons from extreme human
obesity: monogenic disorders. In Endocrinology Metabolism Clinics of North
America, vol. 37, 2008, p.733-751. ISSN: 08898529.
134. REIDY, S.P. – WEBWE, J. – 2000. Leptin: an essential regulator of lipid
metabolism. In Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular
and Integrative Physiology, vol. 125, 2000, p. 285-298. ISSN: 1095-6433.
135. REMESAR, X. – RAFECAS, I. – FERNANDEZ-LOPEZ, J. A. –
ALEMANY, M. 1997. Leptin. In Medicinal Research Rewiews, 17, 1997, p.
225–234. ISSN: 1098-1128.
136. RICHTER, L. – CHEVALLEY, T. – MANEN, D. – BONJOUR, J.P. –
RIZZOLI, R. – FERRARI, S. 2007. Bone Mass in Prepubertal Boys Is
Associated with a Gln223Arg Amino Acid Substitution in the Leptin Receptor.
In The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 92, 2007, no. 11,
p. 4380-4386. ISSN: 0021972X.
108
Zoznam použitej literatúry
137. ROBERT, C. – PALIN, M.F. – COLOMBE, N. – ROBERGE,C. et al.
1998. Backfat thickness in pigs is positively associated with leptin mRNA
levels. In Canadian Journal of Animal Science, vol. 78, 1998, p. 473-482. ISSN:
0008-3984.
138. SAHU, A. 2003. Leptin signaling in the hypothalamus: emphasis on
energy homeostasis and leptin resistence. In Frontiers in Neuroendocrinology,
vol. 24, no. 4, 2003, p. 225-253, ISSN (electronic): 1095-6808. ISSN: 0091-
3022.
139. SAIKI, R. K. – GELFAND, D. H. et al. 1988. Primer directed enzymatic
amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. In Science, vol. 239,
1988, p. 487–491. ISSN: 1095-9203.
140. SAMBROOK, J. – RUSSEL, D.W. 2001. Cold Spring Horbor
Laboratory Press. New York : Cold Spring Harbor, 2001. ISSN: 1559-6095.
141. SAMBROOK, J. – FRITZ, E. F. – MANIATIS, T. 1989. Molecular
cloning: A laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harb. Lab. Press, USA,
1989Shahin, K. A. and R. T. Berg, 1985. Growth patterns of muscle, fat and
bone, and carcass composition of double muscled and normal cattle. In
Canadian Journal of Animal Science, vol. 65, 1989, p. 279-293. ISSN:
00083984.
142. SAS Institute Inc. 1999-2005. SAS Enterprise Guide 3.0.2.446.
143. SCHWARTZ, M.W. – SEELEY, R.J. – CAMPFIELD, L.A. 1996.
Identification of targets of leptin action in rat hypothalamus. In Journal of
Clinical Investigation, vol. 98, 1996, no. 5, p. 1101-1106
144. SEIM, I. – COLLET, CH. – HERINGTON, A.C. – CHOPIN, L.K. 2007.
Revised genomic structure of the human ghrelin gene and identification of novel
exons, alternative splice variants and natural antisense transcripts In BMC
Genomics, vol. 8, 2007, p. 298. ISSN: 1471-2164.
145. SILBERNAGEL, S.- LANG, F. 2001. Atlas patofyziologie člověka.
Praha, 2001, s. 26. ISBN 80-7169-968-3.
146. SILBERNAGEL, S – DESPOPOLOUS, A. 2004. Atlas fyziologie
člověka, Praha 2004, 282 s. ISBN 80-247-0630-X.
147. SILVER, K. – WALSTON, J. – CHUNG, W.K. – YAO, F. – PARIKH,
V.V. – ANDERSEN, R. – CHESKON, L.J. – ELAHI, D. – MULLER, D. –
LEIBEL, R.L.SHULDINER, A.R. 1997. The Gln223Arg and Lys656Asn
109
Zoznam použitej literatúry
polymorphisms in the human leptin receptor do not associate with traits related
to obesity. In Diabetes, vol. 46, 1997, p. 1898-900. ISSN: 1939-327X.
148. SILVER, D.L. – JIANG, X.C. – TALL, A.R. 1999. Increased high
density lipoprotein (HDL), defective hepatic catabolism of ApoA-I and ApoA-
II, and decreased ApoA-I mRNA in ob/ob mice. Possible role of leptin in
stimulation of HDL turnover. In Journal of Biological Chemistry, 274, 1999, p.
4140-4146. ISSN: 1083-351X.
149. SILVER, D.L. – WANG, N. – TALL, A.R. 2000. Defective HDL
particle uptake in ob/ob hepatocytes causes decreased recycling, degradation,
and selective lipid uptake. In Journal of Clinical Investigation, vol. 105, 2000, p.
151-159. EISSN: 15588238.
150. SKIBOLA, S.F. – HOLLY, E.A. – FORREST, M.S. – HUBBARD, A. –
BRACCI, P.M. – SKIBOLA D.R. – HEGEDUS, C. – SMITH, M.T. 2004. Body
mass index, leptin and leptin receptor polymorphism, and non-hodgkin
lymphoma. In Cancer Epidemiolology, Biomarkers and Prevention, vol. 13,
2004, p. 779-86. ISSN: 1538-7755.
151. SNUSTAD, D.P. – SIMMONS, M.J. 2009. Genetika.1. vyd. Brno :
Masarykova univerzita, 2009, s. 423-460. ISBN 978-80-210-4852-2.
152. SOARES, M. A. M. – GUIMARAES, S. E. F. 2001. The role of leptin
and its receptors in fat metabolism. In Second International Virtual Conference
on Pork Quality, November, 05 to December, 06 2001.
153. SNOUSSI, K. – STROSBERG, D.A. – BOUAOUINA, N. – AHMED,
S.B. – HELAL, A.N. – CHOUCHANE, L. 2006. Leptin and leptin receptor
polymorphisms are associated with increased risk and poor prognosis of breast
carcinoma. In BMC Cancer, vol. 38, 2006, no.6. ISSN: 1471-2407
154. SRŠEŇ, Š. – SRŠŇOVÁ, K. 2005. Základy klinickej genetiky a jej
molekulárna podstata. 4. vyd., Martin : Osveta, 2005. ISBN: 80-8063-185-9.
155. STEPIEN-POLESZAK, D. – PIETRUSZKS, A.- KAWECKA, M. 2009.
Effect of Leptin Gene Polymorphism on Fattening and Slaughter Value of Line
990 Gilts. In Acta Veterinaria Brno, vol. 78, 2009, p. 267-272. ISSN: 1801-
7576.
156. STRATIL, A.- PEELMAN, L. – VAN POUCKE, M. – ČEPICA, S.
1997. A HinfI PCR-RFLP at the porcine leptin (LEP) gene. In Animal Genetics,
vol. 28, 1997, p. 371-372. ISSN: 1365-2052.
110
Zoznam použitej literatúry
157. SYVÄNEN, A.C. 2001. Accessing Genetic Variation: Genotyping Single
Nucleotide Polymorphism. In Nature, 2, 2001, p. 30-42. ISSN: 1365-2052.
158. ŠMARDA, J. – DOŠKAŘ, J. – PANTŮČEK, R. – RŮŽIČKOVÁ, V. –
KOPTÍKOVÁ, J. 2005. Metody molekulární biologie. 1. vyd. Masarykova
univerzita v Brne, 2005, s. 54-85. ISBN 80-210-3841-1.
159. TACK, J. – DEPOORTERE, I. – BISSCHOPS, R. – VERBEKE, K. –
JANSSENS, J. – PEETERS, T. 2005. Influence of ghrelin on gastric emptying
and meal-related symptoms in idiopathic gastroparesis. In Alimentary
Pharmacology and Therapeutics, vol. 22, 2005, no. 2009, p. 847-853. ISSN:
1365-2036.
160. TAHARA, M. – AIBA, A. – YAMAZAKI, M. – IKEDA, Y. – GOTO, S.
– MORIYA, H. – OKAWA, A. 2005. The extent of ossification of posterior
longitudinal ligament of the spine associated with nucleotide porophosphatase
gene and leptin receptor gene polymorphisms. In Spine, vol. 30, 2005, p. 877-80.
ISSN: 1528-1159.
161. TAKAHASHI-YASUNO, A. – MASUZAKI, H. – MIYAWAKI, T. –
MATSUOKA, N. – OGAWA, Y. – HAYASHI, T. – HOSODA, K. –
YOSHIMASA, Y. – INOUE, G. – NAKAO, K. 2004. Association of Ob-R gene
polymorphism and insulin resistance in Japanese men. In Metabolism, vol. 53,
2004, p. 650-654.
162. TARTAGLIA, L. A. – DEMBSKI, M. – WENG, X. – DENG, N. –
CULPEPPER, J. – DEVOS, R. et al. 1995. Identification and expression cloning
of a leptin receptor, OB-R. In Cell, vol. 83, 1995, p. 1263-1271.
163. TEMPLETON, A. R. 2006. Population genetics and microevolutionary
theory. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, 716 p.,
ISBN: 978-0-471-40951-9.
164. TINDAL, K. R. – KUNKEL T. A. 1988. A fidelity of DNA synthesis by
the Thermus aqaticus DNA polymerase. In Biochemistry, vol. 27, 1988, p. 6008-
6013.
165. TOLSON, K.P. – GEMELLI, T. – GAUTRON, L. 2010. Postnatal Sim1
deficiency causes hyperphagic obesity and reduces Mc4r and oxytocin
expression. In Journal of Neuroscience, vol. 30, 2010, p. 3803-3812. ISSN:
0270-6474.
111
Zoznam použitej literatúry
166. TRAEBERT, M. – RIEDIGER, T. – WHITEBREAD, S. – SCHARRER,
E. – SCHMID, H.A. 2002. Ghrelin acts on leptin-responsive neurones in the rat
arcuate nucleus. In Journal of Neuroendocrinology, vol. 17, 2002, no. 7, p.580-
586. ISSN: 1365-2826.
167. TRAKOVICKÁ, A. – BEŽOVÁ, K. – ANGELOVIČOVÁ, M. –
KÚBEK, A. – TURJANITSA, I. – KAČÁNIOVÁ, M. – CHLEBO, R. –
MINDEK, A. – ŽIDEK, R. – POKORÁDI, J. – MILUCHOVÁ, M. – GÁBOR,
M. Genetické markéry a kvalita produktov špeciálnych odvetví živočíšnej
výroby. Nitra : SPU, 2005. 178 s. ISBN 80-8069-633-0.
168. TSCHOP, M.- WEYER, C. – TATARANNI, P.A. – DEVANARAYAN,
V. – RAVUSSIN, E. – HEIMAN, M.L. 2001. Circulating ghrelin levels are
decreased in human obesity. In Diabetes, vol. 50, 2001, p. 707-709. ISSN: 1939-
327X.
169. TSCHOP, M. – STATNICK, M.A. – SUTER, T.M. – HEIMAN, M.L.
2002. GH-releasing peptide – 2 increases fat mass in mice lacking NPY:
indication for a crucial mediating role of hypothalamic agouti-related protein. In
Endocrinology, vol. 143, 2002, p. 558-568. ISSN: 1945-7170.
170. TUNG, Y.C. – HEWSON, A.K. – DICKSON, S.L. 2001. Actions of
leptin on growth hormone secretagogue-responsive neurones in the rat
hypothalamic arcuate nucleus recorded in vitro. In Journal of
Neuroendocrinology, vol. 13, 2001, no, 2, p.209-215. ISSN: 1365-2826.
171. UKKOLA, O 2003. Ghrelin and insulin metabolism. In European
Journal of Clinical Investigation, vol. 33, 2003, p.183-185.ISSN: 1365-2362.
172. VALERA MORA, M.E. – SCARFONE, A – VALENZA, V. –
CALVANI, M. – GRECO, A.V. – GASBARRINI, G. – MINGRONE, G. 2005.
Ghrelin does not influence gastric emptying in obese subjects. In Obesity
Research, vol. 13, 2005, no. 4, p.739-744. EISSN: 1930-739X.
173. VAN DER LELY, A.J. – TSCHOP, M. – HEIMAN, M.L. – GHIGO, E.
2004. Biological, physiological, pathophysiological and pharmacological aspects
of ghrelin. In Endocrine Reviews, vol. 25, 2004, p. 426-457. ISSN: 0163769X.
174. VAN HEEK, M. – COMPTON, D.S. – FRANCE, C.F. - TEDESCO,
R.P. – FAWZI, M.P. – GRAZIANO, M.P. – SYBERTZ, E.J. – STRANDER,
C.D. – DAVIS, H.R. Jr. 1997. Diet-induced obese mice develop peripheral, but
112
Zoznam použitej literatúry
not central, resistance to leptin. In Journal of Clinical Investigation, vol. 99,
1997, p. 385-390. EISSN: 15588238.
175.VAN ROSSUM, C.T. – HOEBEE, B. – VAN BAAK, M.A. – MARS, M. –
SARIS, S.W. – SEIDELL, J.C. 2003. Genetic variation in the leptin receptor
gene, leptin, and weight gain in young Dutch adults. In Obesity Research, 2003,
no.11, p. 377-86. EISSN: 1930-739X.
176. VARTAINEN, J. – PŐYKKŐ, S.M. – RÄISÄNEN, T. – KESÄNIEMI,
Y.A. – UKKOLA, O. 2004. Sequencing analysis of the ghrelin receptor (growth
hormone secretagogue receptor type 1a) gene. In European Journal of
Endocrinology, 150, 2004, p.457-463.
177. VAŠKÚ, J. A.B. – VAŠKÚ, A. - DOSTÁLOVÁ, Z. – BIENERT, P.
2006. Association of Leptin Genetic polymorphism-2548 G/A with Gesttional
Diabetes Mellitus In Genes and Nutrition, vol. 1, 2003, no. 2, p. 117- 124. ISSN:
1555-8932.
178.WANG, H.J. – GELLER, F. – DEMPFLE, A. – SCHÄUBLE, N. – FRIEDEL,
S. – LICHTNER, P. – FONTENLA-HORRO, F. – WUDY, S. – HAGEMANN,
S. – GORTNER, L. – HUSE, K. – REMSCHMIDT, H. – BETTECKEN, T. –
MEITINGER, T. – SCHÄFER, H. – HEBEBRAND, J. – HINNEY, A. 2004.
Ghrelin receptor gene: Identification of several sequence variants in extremely
obese children and adolescents, healthy normal-weight and underweight
students, and children with short normal stature. In Journal of Clinical
Endokrinology and Metabolism, vol. 89, 2004, no. 1, p.157-162. ISSN:
0021972X.
179. WANG, T.N. – HUANG, M.C. – CHANG, W.T. – KO, A.M. – TSAI,
E.M. – LIU, C.S. – LEE, C.H. – KO, Y.C. 2006. G-2548A polymorphism of the
leptin gene is correlated with extreme obesity in Taiwanese aborigines. In
Obesity, vol. 14, 2006, p.183-187. EISSN: 1930-739X.
180. WATOWICH, SS. – WU, H. – SOCOLOVSKY, M. et al. 1996.
Cytokine receptor signal transduction and the control of hematopoietic cell
development. In Annual Review of Cell and Developemental Biology, vol. 12,
1996, p. 91-128. ISSN: 15308995.
181. WAUTERS, M. – MERTENS, I. – CHAGNON, M. – RANKONEN, T.
– CONSIDINE, R.V. – CAHGNON, Y.C. – VAN GAAL, L.F. – BOUCHARD,
C. 2001. Polymorphisms in the leptin receptor gene, body composition and fat
113
Zoznam použitej literatúry
distribution in overweight and obese women. In International Journal of Obesity
and Related Metabolic Disordes, vol. 25, 2001, p. 714-20. ISSN: 0307-0565.
182. WHO – Body mass index-BMI. 2011 [online]. [cit. 2010-04-05]
Dostupné na <http://www.euro.who.int/en/what-we-do/health-topics/disease-
prevention/nutrition/a-healthy-lifestyle/body-mass-index-bmi˃.
183. WIEGMAN, C.H. – BANDSMA, R.H. – OUWENS, M. – VAN DER
SLUIJS, F.H. – HAVINGA, R. – BOER, T. – REIJNGOUD, D.J. – ROMIJN,
J.A. – KUIPERS, F. 2003. Hepatic VLDL production in ob/ob mice is not
stimulated by massive de novo lipogenesis but is less sensitive to the suppressive
effects of insulin. In Diabetes, vol. 52, 2003, p.1081-1089. ISSN: 1939-327X.
184. WILDING, J.P.H. 2002. Neuropeptides and appetite control. In Diabetic
Medicine, vol.19, 2002, no. 8, p. 619-627. ISSN: 1464-5491.
185. WILLIAMS, CH.M. – ORDOVAS, J.M. – LAIRON, D. – HESKETH, J.
– LIETZ, G. – GIBNEY, M. – VAN OMMEN,B. 2008. The challenges for
molecular nutrition research 1: linking genotype to healthy nutrition. In Genes
and Nutrition, vol. 3, 2008, p.41-49. ISSN: 1555-8932.
186. WILLER, C.J. – SPELIOTES, E.K. – LOSS, R.J. 2009. Six new loci
associated with body mass index highlight a neuronal influence on body weight
regulation. In Nature Genetics, vol. 41, 2009, p. 25-34. EISSN : 1546-1718.
187. WEBB, J. 2000. New Opportunities for Genetic Change in Pigs. In
Advances in Pork Production, vol. 11, 2000, p. 83–95. ISSN: 1489-1395.
188. WU, X. – COOPER, R.S. – BOERWINKLE, E. – TURNER, S.T. –
HUNT, S. – MYERS, R. – OLSHEN, R.A. – CURB, D. – ZHU, X. – KAN, D. –
LUKE, A. 2003. Combined analysis of genomewide scans for adult height:
results from the NHLBI family blood pressure progream. In European Journal
of Human Genetics, Vol. 11, 2003, no. 3, p.271-274. EISSN: 1476-5438.
189. YAMAGISHI, S.I. – EDELSTEIN, D. – DU, X.L. – KANEDA, Y. –
GUZMAN, M. – BROWNLEE, M. 2001. Leptin induces mitochondrial
superoxide production and monocyte chemoattractant protein-1 expression in
aortic endothelial cells by increasing fatty acid oxidation via protein kinase A. In
Journal of Biological Chemistry, vol. 276, 2001, p. 25096-25100. ISSN: 1083-
351X.
190. YIANNAKOURIS, N. – YANNKOULIA, M. – MELISTAS, L. –
CHAN, J.L. – KLIMAS-ZACAS, D. – MANTZOROS, C.S. 2001. The Q223R
114
Zoznam použitej literatúry
polymorphism of the leptin receptor gtene is significantly associated with
obesity and predicts a small percentage of body weight and body composition
vyraibility. In Journal of Clinical Endokrinology and Metabolism, vol. 86, 2001,
p. 4434-9. ISSN: 1945-7197.
191. YUAN, G. – WANG, J. – HEGELE, R.A. 2006. Heterozygous familial
hypercholesterolemia: an underrecognized cause of early cardiovascular disease.
In Canadian Medical Association Journal, vol. 174, 2006, p. 1124-1129.
EISSN: 14882329.
192. ZADÁK, Z. 2002. Výživa v intenzivní péči. Praha : Grada Publishing,
2002. 487 s. ISBN 80-247-0320-3.
193. ZAZZIET, M. – ROMANO, L. 1992. Low Human Immunodeficiency
Virus Titer and Polymerase Chain Reaction False-negativites. In Journal of
Infection Diseases, vol. 165, 1992, p. 779-780. ISSN: 0036-5548.
194. ZHANG, Y. – PROENCA, R. – MAFFEI, M. et al. 1994. Positional
cloning of the mouse obese gene and its huma homologue. In Nature, vol. 372,
1994, p. 452-432. ISSN : 0028-0836.
195. ZHANG, W. – ZHAO, L. – LIN, T.R. – CHAI, B – FAN, Y. – GANTZ,
I. – MULHOLLAND, M.W. 2004. Inhibition of Adipogenesis by Ghrelin In
Molecular Biology of the Cell, vol. 15, 2004, p. 2484 – 2491. ISSN: 1059-1524.
196. ZORRILLA, E.P. – IWASAKI, S. – MOSS, J.A. – CHANG, J. –
OTSUJI, J. – INOUE, K. – MEIJLER, M.M – JANDA, K.D. 2006. Vaccination
against weight gain. In Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
vol. 103, 2006, no. 35, p.13226-13231. ISSN:0027-8424.
115
Prílohy
Prílohy
116
Prílohy
Obrázok 1: Genotypová hodnota triglyceridov pre LEP gén
Obrázok 2: Genotypová hodnota HDL pre LEP gén
117
Prílohy
Obrázok 3: Genotypová hodnota LDL pre LEP gén
Obrázok 4: Genotypová hodnota celkového cholesterolu pre LEP gén
118
Prílohy
Obrázok 5: Genotypová hodnota glukózy pre LEP gén
Obrázok 6: Genotypová hodnota BMI pre LEP gén
119
Prílohy
Obrázok 7: Genotypová hodnota triglyceridov pre LEPR gén
Obrázok 8: Genotypová hodnota HDL pre LEPR gén
120
Prílohy
Obrázok 9: Genotypová hodnota LDL pre LEPR gén
Obrázok 10: Genotypová hodnota celkového cholesterolu pre LEPR gén
121
Prílohy
Obrázok 11: Genotypová hodnota glukózy pre LEPR gén
Obrázok 12: Genotypová hodnota BMI pre LEPR gén
122
Prílohy
Obrázok 13: Genotypová hodnota triglyceridov pre GHSR gén
Obrázok 14: Genotypová hodnota HDL pre GHSR gén
123
Prílohy
Obrázok 15: Genotypová hodnota LDL pre GHSR gén
Obrázok 16: Genotypová hodnota celkového cholesterolu pre GHSR gén
124
Prílohy
Obrázok 17: Genotypová hodnota glukózy pre GHSR gén
Obrázok 18: Genotypová hodnota BMI pre GHSR gén
125
Prílohy
Obrázok 19: Korelačné závislosti medzi HDL, CHOL, TAG, GLU hodnotené za celý súbor, ženy a mužov
Obrázok 20: Korelačné závislosti medzi HDL, TAG, LDL a BMI hodnotené za celý súbor, ženy a mužov
126
0,63769
0,12651
0,19861
0,26686
0,64653
0,3708
0,73801
0,10908
0,011960
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
HDL : CHOL CHOL : TAG TAG : GLU
spolu ženy muži
-0,09211 -0,09908
0,45259
-0,00881
0,53878 0,5436
0,23678
-0,35281
0,27458
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
spolu ženy mužiHDL : TAG TAG : LDL LDL : BMI
Prílohy
Obrázok 21: Korelačné závislosti medzi HDL, BMI, GLU a LDL hodnotené za celý súbor, ženy a mužov
Obrázok 22: Korelačné závislosti medzi TAG, BMI, CHOL a LDL hodnotené za celý súbor, ženy a mužov
127
0,36215
0,58639
0,40962
-0,03282
0,71209
0,632420,60968
0,47239
0,24343
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
spolu ženy muži
HDL : BMI BMI : GLU GLU : LDL
0,37573
0,59329
0,91581
0,73546
0,59813
0,96436
0,30453
0,56563
0,83337
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
TAG : BMI BMI : CHOL CHOL : LDL
spolu ženy muži
Prílohy
Obrázok 23: Korelačné analýzy medzi CHOL, GLU, HDL a LDL hodnotené za celý súbor, ženy a mužov
128
0,39464
0,03461
0,37284
0,63575
0,11647
0,06137
0,27136
0,14966
0,34074
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
CHOL : GLU GLU : HDL HDL : LDL
spolu ženy muži