César Pérez RcrizDepartmento de Bioiogíu Vegetal

Universidad Politécnica de Madrid

La conservación de semillas es, hoy por hoy, el método más utili-zado en los bancos de germoplasma. Es el más conocido y satisfacemuchos de los requerimientos de conservación. Sin embargo, es difí-cil o imposible de aplicar para un número importante de plantas. Lasplantas propagadas vegetativamente, con un elevado grado de hete-rocigosis o que no producen semillas, deben ser conservadas alma-cenando algún propágulo vegetativo. Esto implica, habitualmente, unciclo anual costoso y colecciones de campo o el almacenamiento depropágulos por cortos periodos de tiempo. En ambos casos, el mate-rial es amenazado- por plagas y enfermedades, adversidades climáti-cas o problemas de tipo político y/o económico. Algunos de estos cul-tivos, como Dioscorea spp., Ipomoea batatas, Solanum tuberosum,Musa spp., etc., son de gran importancia para muchos países. Otroimportante’grupo de plantas incluye aquellas que pueden ser propa-gadas por semilla pero que se desea recurrir a la propagación vege-tativa para incrementar los stocks de determinados genotipos, o por-que no producen semillas hasta una cierta edad. Otro problema deconservación es el de las plantas que tienen semillas recalcitrantes,es decir, semillas que pierden viabilidad cuando se desecan por deba-jo de un determinado contenido de humedad, generalmente bastantealto. Entre las plantas cuyas semillas presentan este tipo de compor-tamiento se encuentran algunas importantes por el uso de su made-ra, sus frutos u otras aplicaciones comerciales, como Juglans spp.,Quercus spp., Elaeis guineensis, Hevea brasiliensis, etc.

En estos casos la conservación in vitro es la alternativa más inte-resante. Es un sistema más económico, sencillo y seguro que las

100 CÉSAR PÉREZ RUIZ

colecciones de campo, facilita la propagación a gran escala y el inter-cambio de material vegetal entre distintos países evitando proble-mas de cuarentena. Por otra parte, las nuevas biotecnologías, estánproduciendo distintos materiales vegetales, como protoplastos, célu-las aisladas, callos, etc., a veces con nuevas e interesantes caracte-rísticas genéticas, que sólo pueden ser conservados in vifro (Withers,1980,1985a, 2985b, 1989; Nitzsche, 1983; Dodds, 1991).

La expresión “cultivo in vitro de plantas” se utiliza para denomi-nar de forma genérica a un conjunto muy diverso de técnicas que,desde hace más de 50 años, vienen siendo una eficaz herramienta enel estudio de numerosos aspectos de la biología de las plantas y en la .,.resolución de importantes problemas prácticos, tanto agronómicoscomo forestales. Lo que tienen en común estas técnicas es que, almenos en algún momento de su desarrollo, se recurre al cultivo dematerial vegetal en condiciones asépticas, dentro de un recipientemás o menos hermético -generalmente de vidrio, de ahí su denomi-nación-, en un medio nutritivo sintético y bajo condiciones ambien-tales (iluminación y temperatura) controladas.

Los cultivos pueden iniciarse con cualquier parte de la planta:yemas, raíces, hojas, distintos tejidos, células aisladas, protoplastos(células sin pared), semillas, embriones, etc. La elección de uno uotro explanto dependerá de los objetivos perseguidos y de la dispo-nibilidad y capacidad de respuesta del material vegetal.

Cualquier técnica de cultivo in vi¿ro tiene como fin primario dirigirel crecimiento y desarrollo del explanto manipulando para ello suentorno. Dicho control se ejerce, básicamente, mediante la adición almedio de cultivo de sustancias reguladoras del crecimiento, variandola concentración de determinados nutrientes o a través de las condi-ciones de iluminación y temperatura en las que se realizan los cultivos.

Tales métodos han permitido el establecimiento de sistemasmodelo, de gran valor, para el estudio de procesos bioquímicos,genéticos, fisiológicos, anatómicos, etc., además de tener numerosasaplicaciones prácticas más o menos inmediatas. De este modo, lastécnicas de micropropagación o propagación in vitre permiten la mul-

BANCOS DE CULTIVOS IN KTRO. 101

tiplicación clonal rápida de plantas de interés, con tasas de multipli-cación elevadísimas y precisando de muy poco espacio. Tambiénmediante técnicas in vih-o se pueden cultivar meristemos aisladospara obtener material vegetal libre de virus, protoplastos para obte-ner híbridos somáticos y plantas transgénicas, células aisladas omasas de tejido desdiferenciado (callo) para la obtención y selecciónde plantas resistentes a condiciones .adversas o distintos tipos deexplantos para producir compuestos de interés industrial.Igualmente, se utilizan métodos de cultivo in vi&o para la obtenciónde plantas haploides, para el rescate de embriones híbridos y para laconservación eficaz de germoplasma a largo plazo.

En sentido amplio, los factores que influyen en el éxito del culti-vo son tres: el material vegetal, la composición del medio de cultivoy las condiciones de incubación.

El material vegetal es, quizá, el factor más importante. Cada espe-cie o variedad se comporta de manera distinta. Igualmente, tienengran influencia la edad de la planta y sus condiciones previas en elcampo, la época de recogida y tipo de explanto, la posición que ésteocupa en la planta y una larga lista de aspectos, propios del materialvegetal, que difícilmente se pueden controlar en su totalidad.Naturalmente, el material cultivado in vitro ha de estar libre de micro-organismos que puedan interferir durante el proceso.

El medio de cultivo desempeña varias funciones. Al mismo tiem-po que sirve de soporte físico al explanto, le proporciona los nutrien-tes necesarios para su supervivencia. Además, tal como se indicóanteriormente, los componentes del medio pueden utilizarse paradirigir el crecimiento y el desarrollo del material vegetal. Todos losmedios de cultivo tienen distintas sales para garantizar el aporte deelementos minerales, una fuente de carbono, algunas vitaminas y, enla mayoría de los casos, reguladores de crecimiento. El medio de cul-tivo puede ser líquido o, lo que es mucho más frecuente, solidificadocon agar u otro tipo de agente gelificante.

En cuanto a las condiciones ambientales de incubación, no suelenvariar mucho de un cultivo a otro. Aunque su importancia es equipa-

102 CÉSAR PÉREZ RUIZ

rable a la de los demás factores del cultivo y a pesar de que cada plan-ta, explanto y período de cultivo puede tener sus requerimientos espe-tíficos, se suele recurrir a calidades e intensidades de luz, fotoperiodosy termoperiodos, más o menos estandarizados, que proporcionan dis-tintos tipos de cámaras climáticas. Las razones que s.e pueden aducirson de tipo económico y para reducir en lo posible el elevado númerode variables que conllevan los ensayos de cultivo in vih-o.

Cada uno de los factores citados (material vegetal, medio de cul-tivo y condiciones de incubación) deberá establecerse, pues, en fun-ción de los otros dos y, naturalmente, de los objetivos perseguidos.Combinando adecuadamente estos tres factores se conseguirá quetengan lugar en el material vegetal alguno de los siguientes procesosmorfogenéticos:

* Desarrollo de los meristemos ya existentes en el explanto.* Organogénesis, es decir, formación de yemas y/o raíces adven-

ticias.* Embriogénesis asexual, o sea, formación de embriones (en este

caso embrioides) a partir de células que no son producto defusión gamética.

?? Desdiferenciación de tejidos y proliferación de una masa decallo.

Mediante la inducción de una o varias de estas vías morfogenéti-cas se pueden conseguir las numerosas aplicaciones prácticas que seindicaron anteriormente.

En términos sencillos, la metodología a seguir para conservar invitvo cualquier material vegetal puede dividirse en las siguientes etapas:

n Obtención del explanto0 Introducción en cultivo in vitro* Almacenamiento/Conservación* Recuperación de un cultivo viable* Regeneración de plantasPara el almacenamiento/conservación in vitro de material vege-

tal existen tres aproximaciones distintas que forman una secuencia

BANCOS DE CULTIVOS IN VITRO. 103

lógica y están indicados en orden creciente de idoneidad para con-servación genética a largo plazo:

. Sin limitar el crecimiento del material vegetal

. Limitando el crecimiento

. Suprimiendo totalmente el crecimiento mediante temperatu-ras ultrabajas (Crioconservación).

El mantenimiento de los cultivos sin limitación del crecimientopuede conseguirse con cierta facilidad. Se trataría de cultivar el mate-rial vegetal haciendo uso de los métodos estándar de cultivo in vitre,en unas condiciones más o menos similares a las de un’programa demicropropagación.

En condiciones de crecimiento continuo, el intervalo entre repi-cados puede’ser desde unos días a varios meses, dependiendo deltipo de cultivo y de las especies. En cualquier caso, mantener un grannúme,ro de cultivos en crecimiento continuo, que no se necesitan deforma inmediata, resulta antieconómico en tiempo y en recursos.

Tienen, por tanto, estos métodos el inconveniente de ser un siste-ma caro y, además, los subcultivos repetidos exponen a los especíme-nes a un riesgo creciente de pérdida por accidente o contaminación.Hay que añadir un problema, nada desdeñable cuando el objetivo esconservar genotipos, el elevado riesgo de que se produzca variaciónsomaclonal. La elección del explanto y la metodología de cultivo tienenun efecto crucial en la proporción de variación generada. En general,debe procurarse utilizar explantos con meristemos caulinares (yemas,meristemos aislados, embriones) que permitan la obtención de tallosmediante desarroflo directo, en medios de cultivo sin reguladores decrecimiento o’con concentraciones bajas de los mismos.

Los problemas de inestabilidad y las demandas prácticas de sub-cultivos pueden ser paliadas reduciendo la tasa de crecimiento delmaterial vegetal.

Repasando la literatura existente sobre el tema, se puede cons-tatar que la limitación del crecimiento del material cultivado in vitrose ha intentado mediante sistemas muy variados:

104 CÉSAR PÉREZ RUIZ

. Reduciendo la temperatura y/o iluminación.

. Induciendo estrés osmótico.

. Modificando el ambiente gaseoso en los recipientes de cultivo.

. Desecando los especímenes a conservar.

. Alterando el medio nutritivo mediante la reducción u omi-sión de componentes esenciales para el crecimiento normalde los explantos.

. Incorporando al medio de cultivo compuestos retardantesdel crecimiento.

La reducción de la temperatura a la que se mantienen los cultivoses el método utilizado más frecuentemente (Figura l), con o sin modi-ficaciones del medio de cultivo. La temperatura adecuada depende dela especie e incluso de la variedad. Así,’ mientras algunas especies delgénero Prunus se pueden conservar con éxito a -3 “C, temperaturasinferiores a 15 “C causan en Musa spp. el deterioro rápido y muerte delos explantos. En general, se acepta que las especies de clima templa-do-frío pueden conservarse entre 0 y 6 “C mientras que las de climatropical-subtropical deben mantenerse entre 15 O y 20 “C.

Entre las sustancias que se han propuesto con el fin de disminuir elpotencial osmótico del medio de cultivo está el manito1 (Figura 2).Añadido al medio en concentraciones de hasta 0,2 M no causa proble-mas de toxicidad y su efecto se manifiesta por un menor crecimiento delos cultivos yun incremento de su longevidad. También se han utilizadocon el mismo fin otros productos como prolina, glicerol y sacarosa.

Otro posible camino esla modificación de la atmósfera a la queestá expuesto el cultivo, generalmente reduciendo la presión parcialde oxígeno. Este sistema sólo se ha ensayado con éxito en Daucuscarota, Nicotiana tabacum y Chrysanthemum moriflorum.

La desecación de los especímenes como medio de conservaciónse utiliza de forma rutinaria con embriones somáticos de Daucus caro-ta y Brassica spp.

Los medios de cultivo han sido modificados en ocasiones dismi-nuyendo la concentración u omitiendo alguno de sus componentes

BANCOS DE CULTIVOS IN WTRO. 105

Figura 1.- Ekplantos de Lavatera oblongifolia conservados a 5 “C durante 1 año.

Figura 2.- Callo de Brassica napus conservado en un medio de cultivo MSsuplementado con manito1 0,2 M.

1 0 6 CÉSAR PÉREZ RUIZ

(Figura 3). Así por ejemplo, se han alcanzado elevados porcentajes desupervivencia en períodos largos de mantenimiento de suspensionescelulares de Vinca reduciendo las concentraciones de nitrógeno ycarbono en el medio y de explantos de Copea arabicareduciendo a lamitad las sales del medio MS (Murashige & Skoog, 1962) y suprimien-do la sacarosa.

Las sustancias más utilizadas como retardantes del crecimientoson: cloruro de 2-cloretil trimetilamonio o cicocel (CCC), ácido n-dimetilsuccinámico (ALAR) y especialmente el ácido abscísico(ARA). En ningún caso de’los estudiados la adición de estos com-puestos al medio ha proporcionado mejores resultados que la reduc-ción de la temperatura.

Si bien se está avanzando en todas estas técnicas, desde unpunto de vista práctico, la utilización de bajas temperaturas y lamanipulación de los componentes del medio de cultivo son los úni-cos métodos que pueden ser considerados por su eficacia y simplici-d a d .

Figura 3.- Conservación in vitre de Coronopus navasii en medios de cultivocon concentraciones de sacarosa reducidas.

BANCOS DE CULTIVOS IN VITRO. 107

Si se desean evitar por completo los subcultivos y eliminar losriesgos de alteraciones genéticas y/o fisiológicas durante el almace-namiento de los especímenes, es necesario utilizar un método queimplique la supresión de todo proceso metabólico. La única opciónseria es la crioconservación, es decir, el mantenimiento del materialvegetal a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 “C) o temperatu-ras próximas. Esta técnica se trata con detalle en otro capítulo.

Las plantas almacenadas en bancos in vitre de germoplasmadeben estar bien caracterizadas. Este es un aspecto.muy importanteen la gestión de cualquier colección ex situ de germoplasma de caraa la identificación del material, el estudio de la diversidad genética enun pool de genes dado, de la integridad genética de las colecciones yde cara a localizar en las colecciones genotipos particulares para suutilización.

Tal como se señaló anteriormente, las técnicas de cultivo in vitrejuegan un importante papel en la conservación de los recursos fito-genéticos. Sin embargo, la conveniencia de estas técnicas ha sido dis-cutida ampliamente, sobre todo en lo que respecta a la posible varia-bilidad originada a través del proceso, denominada variación soma-clonal (Withers, 1980; Henshaw & O’Hara, 1983; Scowcroft, 1984).

La producción de plantas a través del cultivo de tejidos deberíaoriginar, teóricamente, clones fenotípica y genéticamente idénticos almaterial original de partida. Sin embargo, se ha detectado en muchoscasos una gran proporción de plantas regeneradas que presentanvariaciones con relación al tipo parental. De estas variaciones hayalgunas que persisten en ausencia del estímulo que las originó y setransmiten a la descendencia (son heredables), es decir son debidasa mutaciones. Este fenómeno fue denominado variación somaclonalpor Larkin & Scowcroft (1981).

La variación somaclonal resulta ubicua, ocurriendo tanto enplantas de propagación asexual como sexual, alógamas y autógamasy en todos los niveles de ploidía. Se ha descrito su aparición en unnúmero elevado de especies, incluyendo importantes especies agrí-colas (Bajaj, 1990; Karp, 1995).

108 CÉSAR PÉREZ RUIZ

Para definir la naturaleza y las características de la variación esesencial un análisis genético preciso y la comprobación de que lasalteraciones observadas corresponden, de hecho, a mutaciones y noa cambios epigenéticos que luego no se expresan en la descendenciade las plantas regeneradas.

Con respecto a la variación genética, esta puede tener un origennuclear o citoplásmico (condrioma y/o plastoma) y engloba distintostipos de cambios (Freitas, 1998):

l.- Los que afectan al número y/o estructura de los cromosomas.2.- Las alteraciones génicas en sentido estricto que incluyen

tanto las que inciden sobre los caracteres cualitativos, controladospor uno 0 pocos loci (alteraciones monogénicas) como las que pro-ducen variación en los caracteres cuantitativos que presentan unatransmisión de tipo poligénico (alteraciones poligénicas).

3.- Un tercer grupo de alteraciones, sin cabida en los grupos ante-riores, es el que incluye las alteraciones debidas al nivel de metila-ción. Dichas variaciones aunque, directamente, no suponen cambiosen la secuencia y por tanto, en sentido estricto, no pueden ser consi-deradas mutaciones, sí que parecen heredarse, al menos durantealgunas generaciones, aún cuando las segregaciones difieran enmuchos casos de las mendelianas.

4.- Igualmente, los fenómenos de transposición parecen jugar unpapel importante en la variación pudiendo dar lugar a diversos mutantes.

Actualmente, hay recogidos en la literatura diversos ejemplos decada uno de los cuatro casos mencionados (Karp, 1991, 1994, 1995).

Características importantes de la variación somaclonal son(Freitas, 1998): una elevada frecuencia de mutación, la elevada fre-cuencia relativa de mutaciones dominantes o codominantes, la pre-sencia de más de una mutación por planta, la identificación de mutan-tes homocigóticos y la elevada tasa de mutación de determinados locique parecen más propensos a la variación.

El carácter incontrolable e impredecible de la variación soma-clonal constituye el principal obstáculo a su aplicación ya que, por un

BANCOS DE CULTIVOS IN VITRO. 109

lado limita su utilización como herramienta en la mejora de plantas y,por otro, puede resultar inevitable cuando el mantenimiento de losgenotipos constituye el objetivo primordial del cultivo. Una forma desuperar este problema sería a través de un mejor conocimiento delos factores internos y externos que parecen afectar a la naturaleza yfrecuencia de la inestabilidad genética. Durante los últimos años, sehan hecho progresos importantes en la identificación de dichos fac-tores aunque, todavía, se desconozca de forma exacta cómo actúan einteraccionan.

De forma general, los principales factores que intervienen en elproceso serían (Freitas, 1998):

l.- El genotipo. Distintos experimentos han puesto en evidenciaque genomas diferentes responden de forma diferente al estrés quesupone el cultivo in vitre. Así, hay especies que presentan una fre-cuencia de mutación baja cuando son sometidas a cultivo de tejidosy otras presentan una tasa elevada de mutación. Estas diferenciaspueden, incluso, manifestarse en distintas variedades de una mismaespecie. Tanto la frecuencia como el espectro de las variacionesobservadas en las plantas regeneradas parecen estar influenciadaspor la ploidía del material de partida (Karp, 1991).

2.- Vía de regeneración y tipo de explanto. La elección del siste-ma de regeneración puede ser un factor muy importante en la varia-ción somaclonal (Saito & Suzuki, 1999). Muchos estudios, en su mayo-ría citológicos, indican la existencia de una frecuencia elevada devariabilidad en plantas regeneradas a partir de protoplastos, frente avalores menores para plantas regeneradas directamente a partir deotros explantos (Yamagishi & al., 1996). La frecuencia de variaciónaumentaría con el grado de desdiferenciación y desorganización delos tejidos por los que pasa el cultivo. Según este razonamiento, elcultivo de meristemos sería el más estable al que seguirían, por esteorden, la regeneración a partir de yemas axilares, la embriogénesissomática, la organogénesis directa, la regeneración a partir de callos,de suspensiones celulares y, finalmente, de protoplastos. Esta reglatiene, sin embargo, numerosas excepciones.

110 CÉSAR PÉREZ RULZ

4

3.- Duración del cultivo. La frecuencia de mutaciones producidaspor el cultivo in uitro, parece aumentar con la duración de los culti-vos, como lo demuestran varios estudios (Miiller & al., 1990; Nehra &al., 1992). Sin embargo, existen trabajos que apoyan que la mayoría delos cambios podrían tener lugar en las etapas iniciales del cultivo,cuando las células están sometidas a un estrés más intenso(Yamagishi & al., 1996).

4.- Composición del medio de cultivo. En la composición delmedio de cultivo resulta particularmente importante el tipo y con-centración de los reguladores de crecimiento empleados. Bogani &al. (1995, 1996) utilizando la técnica de PCR-RAPDs para el análisis dela variabilidad genética en cultivos a largo plazo de tomate, realiza-dos en medios con distintas concentraciones de auxinas y citoquini-nas, observaron que la composición del medio afectaba a la tasa devariabilidad.

La comprensión de las causas y orígenes de la variación soma-clonal es un paso crucial para conseguir un óptimo aprovechamientodel cultivo in vih-o ya sea desde el aspecto positivo de la variaciónsomaclonal, como fuente de nuevos caracteres utilizables, o desde elpunto de vista negativo, si lo que se pretende es conservar y mante-ner un genotipo determinado a través del cultivo. En cualquier caso,resulta muy importante poder conocer los factores que afectan a laaparición de la variación somaclonal, así como los mecanismos porlos cuales se produce. Así, es imprescindible profundizar en el estu-dio de las condiciones de cultivo in d-o que puedan suponer unmayor grado de estrés.

La detección y estudio de la variación somaclonal se ha aborda-do con diferentes técnicas (Cassells & al., 1997; Kumbar & al., 1999): através de la identificación de alteraciones morfológicas, medianteanálisis cariotípico de los cromosomas en metafase, mediante análi-sis electroforético de proteínas totales e isoenzimas y mediante mar-cadores genéticos de ADN (Hasmi & al., 1997; Jayasankar, 1998; AlZahim & al., 1999) obteniéndose en cada caso información a distintosniveles. A pesar de las distintas técnicas disponibles, una de las difi-

BANCOS DE CULTIVOS IN WRO. 111

cultades importantes encontrada a la hora de estudiar la variaciónsomaclonal ha sido la elección de la metodología a utilizar, ya que sibien en principio cualquiera de ellas es válida para tener una prime-ra aproximación al estudio, la correcta adecuación de la técnica esco-gida puede depender de la causa concreta que en ese momento estéproduciendo la variación .

Un estudio reciente de la FAO (1994), señala que hay 37.600 accesio-nes conservadas in vitre en el mundo. El almacenamiento mediante limi-tación del crecimiento se utiliza de forma rutinaria para la conservaciónde un considerable número de especies en bancos regionales e interna-cionales como el International Network of the Improvement of Bananaand Plantain (más de LO00 genotipos de Musa), Centro Internacional deAgricultura Tropical-Colombia (Manihot), Centro Internacional de laPapa (patata, batata y otros tubérculos), International Institute ofTropical AgricuItureNigeria (Dioscorea, Manihot). Utilizando métodos dereducción del crecimiento in vitro, el International Institute of TropicalAgriculture @TA) mantiene colecciones de germoplasma de más de1500 accesiones de batata, ñame y coco.

4

Las empresas hortícolas utilizan también el cultivo in vitro paramantener híbridos propagados asexualmente que no pueden alma-cenarse en forma de semillas. Los cultivares de Chrysanthemum sonhabitualmente almacenados in vitro e indexados para asegurarse deque están libres de virus. También se almacenan in vitro los geraniosy las petunias (Chu, 1986).

Además, las técnicas de conservación mediante limitación invii-ro del crecimiento se utilizan de forma rutinaria para almacenaraccesiones de Allium, Coffea, Fragaria spp., Fyrus spp., Rubus spp.,Saccharum spp., y Vitis spp.

BIBLIOGRAFÍA

Al Zahim, MA.; Ford-Lloyd, B.V; Newbury, H.J. (1999). Detection ofsomaclonal variation in garlic (Allium sativum L.) using RAPDand cytological analysis. Plant Ce11 Reports 18: 473477.

112 CÉSAR PÉREZ RUIZ

&zjQj, X13S. (1990). Somaclonal variation- Origin, Induction, Cryopreser-. . . . : vation, and Implications in Plant Breeding. En: Bajaj, Y.P.S. (ed.)

Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. ll, SomaclonalVariation in Crop Improvement 1. Springer Verlag.

Bogani, P; Simoni, A.; Bettini, P; Mugnai, M.; Pellegrini, M.G.; Buiatti, M.(1995). Genome flux in tomato auto- and auxo-trophic ce11 clo-nes cultured in different auxin/cytokinin equilibrium. I DNAmultiplicity and methylation levels. Genome 38: 902-912.

Bogani, P; Simoni, A.; &io, P; Scialpi, A.; Buiatti, ik? (1996). Genome fluxin tomato ce11 clones cultured in different physiological equi-librium. II A RAPD analysis of variability. Genome 39: 846-853.

Cassells, A.C.; Sen, Eir (1996). In vitro Production of Late Blight(Phytophtora infestans) Resistant Potato Plants. En: Bajaj, Y.P.S.(ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 36,Somaclonal Variation in Crop Improvement 1. Springer Verlag.

Chu, 1X&‘. (1986) The application of tissue culture to plant improve-ment and propagation in the ornamental horticultureindustry. En: Zimmerman, R.H. & al. (eds) Tissue Culture as aPlant Production System for Horticultura1 Crops. MartinusNijhoff Publishers.

Dodds, J.H. (1991). In vitro Methods for Conservation of Plant GeneticResources. Chapman and Hall.

FAO (1994). Survey of Existing Data on ex situ Collections of PlantGenetic Resources for Food and Agriculture. Food andAgriculture Organisation of the United Nations.

Freitas, M.E. (1998). Estudio ,de la variabilidad producida en cultivos invitro de Secale cereale L. y Sinapidendron spp. Tesis Doctoral.Universidad Complutense de Madrid.

Hashmi, G.; Huettel, R.; Meyev, R.; Krusberg, L.; Hammerschlag, F: (1997).RAPD analysis of somaclonal variants derived from embryocallus cultures of peach. Plant Ce11 Reports 16: 624627.

Henshaw, G.G.; O’Hara, J.FT (1983). In vitro approaches to the conser-vation and utilisation of global plant genetic resources. En:Mantel, S.H.; Smith, H. (eds.) Plant Biotechnology. CambridgeUniversity Press.

BANCOS DE CULTIVOS IN wl-k0. 113

Jayasankar, S.; Litz, R.E.; Schnell, R. J.; Hernandez, A.C. (1998).Embryogenic mango cultures selected for resistance toColletotrichum gloeosporioides culture filtrate show variationin random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Invitre cellular & Developmental Biology - Plant 34: 112-116.

Karp, A. (1991). On the current understanding of somaclonal variation.Oxford surveys of Plant Molecular and Ce11 Biology 7: l-58.

Karp, A. (1994) Origins, causes and uses of variation in plant tissueculture. En: Vasil, I.K.; Thorpe T. (eds) Plant Cell and TissueCulture. Kluwer Academic Publishers.

Karp, A. (1995). Somaclonal variation as a tool for crep improvement.Euphytica 85: 295-302.

Kumbar, MB.; Barker, R. E.; Reed, B.M. (1999). Morphological and mole-cular analysis of genetic stability in micropropagated Fragaria xananassa CV. pocahontas. In vitre Cellular & DevelopmentalBiology - Plant 35: 254258.

Larkin R1J.; Scowcrofi WR. (1981). Somaclonal Variation : A novel sour-ce of variability from cell cultures for plant improvement. Theor.Appl. Genet. 60: 197-214.

4

Miller, E.; Brown, l7.H.; Hartke, S.; L&z, H. (1990). DNA variation in tis-sue-culture-derived rice plants. Theor. Appl. Genet. 80: 673-679.

Murashige,Y; Skoog, E (1962). A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco cultures. Physiología Plantarum 15: 473-497.

Nehra, N.S.; Kartha, K.; Stusnoff; C.; Giles, K. (1992). The influente ofplant growth regulator concentrations and callus age on soma-clonal variation in callus culture regenerants of strawberry. PlantCell Tiss. Org. Cult. 29: 257-268.

Nitzsche, II! (1983). Germplasm preservation. En: Evans, D.A.; Sharp,W.R.; Ammirato, P.V.; Yamada, Y. (eds.) Handbook of Plant CellCulture Vo1 1. Macmillan Publish.

Saito, A. & Suzuk, n/l. (1999). Efficient shoot-regeneration from calli ofapple rootstock [Malus x prunifolia var. ringo Asami Mo84A] andcultivar [Malus x domestica CV. Fuji]. Journal of Plant Physiology155: 620-624.

114 CÉSAR PÉREZ RUIZ

ScowcroFr, BQ?. (1984) Genetic Variability in Tissue Culture: Impact onGermplasm Conservation and Utilization. IBPGR.

Withers, L.A. (1980). Tissue Culture Storage for Genetic Conservation,IBPGR.

Withers, L.A. (1985). In vitre approaches to the conservation of plantgenetic resources. En: Withers, L.A.; Alderson, P.G. (eds.)Plant Tissue Culture and its Agricultura1 Applications.Butterworths.

Withers, L.A. (1985). Long-term storage of in vitre cultures. En: Schafer-Menuhr, A. (ed.) In vitre Techniques, Propagation and LongTerm Storage. Martinus Nijhoff & Dr. Junk Publish.

Withers, L.A. (1989). In vitre Conservation and Germplasm Utilisation.En: Brown, A.H.D.; Frankel, O.H.; Marshall, D.R.; Williams, J.T.(eds.) The Use of Plant Genetic Resources. CambridgeUniversity Press.

Yamagishi, M; Otani, M; Shimada, T. (1996). A comparison of soma-clonal variation in rice plants derived and not derived fromprotoplasts. Plant Breeding 115: 289-294.