CUANTIFICACIN DE POTASIO (K+) DE FORMA INDIRECTA EN BEBIDA ENERGETICA POWERADE POR ELECTROFORESIS CAPILARValencia Bedoya Viviana Julieth; cod 0825841 Escobar Ortiz Diana Carolina; cod 0738815 Universidad del Valle, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Departamento de Qumica. Santiago de Cali, Mayo 2011

RESUMEN En la experimentacin por electroforesis capilar se cuantifico indirectamente potasio en una muestra de bebida energtica Powerade sabor naranja, se prepararon cinco estndares con concentraciones de 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 y 10,0 ppm los cuales se filtraron en papel de 0,45 micras y se pasaron a sus respectivos viales para proceder con el anlisis; una vez en el equipo de electroforesis se realizaron lavados con NaOH 0,1M por 10 minutos y posteriormente se lavo con un buffer de cido actico a pH 4,87, en la calibracin se midi a una longitud de onda de 206 nm apareciendo el pico del potasio en 1,02 1,04 minutos, posteriormente se midi la concentracin la muestra por quintuplicado tomando el promedio para hallar la concentracin de 107,95 ppm en comparacin con el valor real de la muestra de 100,0 ppm obteniendo un error del 7,9%, y un RSD % de 52,7%. Palabras claves: electroforesis capilar, diferencia de potencial, flujo electrosmtico, buffer, capa difusa.

DISCUSIN En la experimentacin realizada se someti estndares de concentracin de de 2,0 10,0 ppm de K+ y una muestra de Powerade (bebida energtica) a el anlisis de electroforesis capilar para la cuantificacin de dicho ion. La electroforesis capilar es una tcnica de separacin de iones o sustancias neutras, basada en la diferencia de velocidad de migracin de las especies, en el seno de una solucin amortiguadora a travs de la cual se aplica una diferencia de potencial generando un campo elctrico constante.1 Esta tcnica fue desarrollada por Arne Tiselius (Estocolmo, 10 de agosto de 1902 - Uppsala, 29 de octubre de 1971; fue un bioqumico sueco galardonado con el Premio Nobel de Qumica en el ao 1948).2 La electroforesis requiere una instrumentacin simple como se observa en la figura 1.

Figura 1. Representacin esquemtica de un equipo de electroforesis capilar.

Esta tcnica se ha aplicado a un conjunto de problemas de separaciones analticas dificultosas: aniones y cationes inorgnicos, aminocidos, catecolaminas, frmacos, vitaminas, carbohidratos, pptidos, protenas, cidos nucleicos , nucletidos, polinucletidos entre otras. Una ventaja especial de este mtodo instrumental es su capacidad de separar macromolculas de inters en la industria biotecnolgica y en la investigacin biolgica y bioqumica. As que si el objetivo es la secuenciacin del ADN, es necesario distinguir entre

polinucletidos de cadena larga que tienen pesos moleculares que varan aproximadamente entre 200 y 500 y difieren solo en un nico nucletido, y es precisamente este mtodo el que tiene la suficiente poder de resolucin para manejar este problema.1 Una separacin electrofortica se lleva a cabo inyectando una pequea parte de la muestra en una disolucin buffer que est alojada en un tubo estrecho o en un medio soporte poroso y plano, como por ejemplo, papel o un gel semislido. Seguidamente, se aplica un elevado potencial de corriente continua, a travs del tampn, mediante dos electrodos situados en los extremos del tampn. El potencial impulsa a los iones de la muestra a migrar hacia uno u otro de los electrodos. La velocidad de migracin de una especie dada depende de su carga y tambin de su tamao. Las separaciones en consecuencia, se basan en las diferencias en la relacin carga-tamao entre los diferentes analitos presentes en la muestra. Cuanto mayor es esta relacin, mas rpido migra un ion en el seno del campo elctrico. Lo anteriormente mencionado con relacin al funcionamiento del mtodo cuantitativo se esquematiza en la figura 1. La relacin de la velocidad de migracin se da gracias a la siguiente ecuacin (Ec. 1) en donde la movilidad electrofortica e es multiplicada por la intensidad del

campo E, siendo as que la movilidad electrofortica en proporcional a la carga elctrica del analito e inversa a los factores de retardo por razonamiento. ?????? = ?????? ?????? Ecuacion 1. Velocidad de migracion de un ion. 3 El campo elctrico se determina por el potencial aplicado y la longitud sobre la que se aplica, tal como se muestra en la ecuacin 2 mostrando as la necesidad de potenciales elevados si se desea tener migraciones y separaciones rpidas, sin embargo los efectos que pueden tener factores como la altura del plato de electroforesis y el flujo electrosmtico afectan la resolucin, factor que resulta ser ms importante que los de velocidad. ?????? = ?????? ?????? ??????

Ecuacion 2. Relacion entre campo elctrico y longitud de capilar.4 As en comparacin con la cromatografa, el numero de platos y por tanto la resolucin no se incremental con la longitud de la columnas.5 ahora bien, considerando lo anterior y que el voltaje que se debe aplicar para generar el movimiento de los componentes de una mezcla que depende de su relacin entre la carga y tamao de cada uno de ellos, es directamente proporcional a la longitud del capilar que se utilice, as que habr

una longitud a la cual el voltaje es el optimo para dar lugar a una resolucin de las seales de los componentes de una muestra es la mejor, por lo anterior aumentar la longitud del capilar indirectamente incrementa la resolucin en la medida porque debe incrementarse el voltaje, pero si ya a ciertas condicione se tienen las condiciones optimas, usar un capilar de mayor longitud, simplemente incrementara el tiempo de medida. En la electroforesis de zona (separacin de iones debido a la movilidad diferente generando zonas inicas, donde la incorporacin de sustancias neutras que actan como separadores permite la separacin en zonas), la cual es la aplicada al caso experimental, la composicin del tampn es constante en toda la zona de separacin. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes inicos de la mezcla migren cada uno segn su propia movilidad y se separen en zonas que pueden estar completamente resultas o parcialmente solapadas. Como se muestra en la figura 2.

Figura 2. Tipos de electroforesis. En la mayora de las separaciones electroforticas de iones pequeos, se ha observado que lo ms favorable para lograr tiempos de anlisis breves es hacer que los analitos se muevan en el mismo sentido que el flujo electrosmtico, como se muestra en la figura 3.6 As en las separaciones de cationes en capilares cuyas paredes no han sido tratadas, tanto el flujo electrosmtico como los cationes se desplazan hacia el ctodo.

A)

B)

C)

Desde hace un tiempo atrs el mtodo ms comnmente utilizado para el anlisis de aniones pequeos, ha sido la cromatografa de intercambio inico, para los cationes, las tcnicas favoritas han sido la espectroscopia de absorcin atmica y la espectroscopia de emisin de plasma de acoplamiento inductivo. E la actualidad, sin embargo, los mtodos de electroforesis capilar han empezado a competir con los mtodos tradicionales. Han sido varias las razones admitidas que conllevan a la adopcin de los mtodos electroforticos siendo las principales: equipos ms econmicos. Menores requerimientos de muestra, mayor rapidez y mejor resolucin. El costo inicial del equipo y los gastos de mantenimiento para la electroforesis son, en general, significativamente ms bajos que para los instrumentos de cromatografa inica y de espectroscopia atmica. Los tamaos de muestra para la electroforesis son del orden de nano litros, mientras que normalmente se necesitan tamaos de muestra muchos mayores de micro litros para otros tipos de anlisis de iones pequeos. Por ello los mtodos electroforticos son ms sensibles. Las separaciones se realizan empleando mecanismos tradicionales en un mbito capilar, adems ofrece ms facilidad y velocidad que la cromatografa liquida de alta eficiencia.

Figura 3. A) supeficie de silica fundida cargada negativamente (Si-O). B) acumulacion de cationes hidratados cerca de la superficie. C) flujo de cargas hacia el catodo luego de la aplicacin de un campo elctrico. Por otro lado, para las separaciones de aniones, el flujo se invierte normalmente debido a l tratamiento de las paredes del capilar con una sal de alquilamonio, como el bromuro de cetil trimetilamonio. Los iones amonio cargados positivamente llegan a si a quedar enlazados a la superficie, cargada negativamente de la slice y crean una doble capa de disolucin cargada negativamente que es atrada hacia el nodo, invirtiendo el flujo electrosmtico.

Mientras elimina el problema de los solventes de la HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayora con muy baja concentracin inica, incorporan los principios de la automatizacin. Las separaciones se obtienen en pocos minutos, obtenindose simultneamente resultados cuantitativos, en oposicin a los procedimientos tradicionales que utilizan horas o das. Los cambios en el pH, en esta tcnica afectan la naturaleza de alguno de los componentes a separar o analizar como lo son las protenas y pptidos al igual que el comportamiento del flujo electrosmtico, pues a pH prximos a 3 la superficie interna del capilar se encuentra cargado negativamente por los grupos silanol. Los iones positivos del buffer son atrados y fijados sobre la capa negativa generando una doble capa elctrica. La magnitud de la electrosmsis se incrementa en funcin del pH y en condiciones alcalinas la velocidad del anterior efecto es usualmente mayor que la velocidad de migracin de los iones de la muestra. Esta propiedad puede ser una ventaja para analizar muestras de especies aninicas o catinicas. En algunos casos experimentales, como la separacin de pptidos o protenas, los grupos hidrfobico poseen determinados sitios

de fijacin, lo que produce variaciones locales en la migracin de la fuerza electrosmtica y por consiguiente alteran la reproducibilidad del los resultados, estos problemas pueden minimizarse trabajando a pH bajo, donde las superficies silanol no se encuentran ionizadas. En los casos en que se trabaja a pH elevado, se emplean aditivos que reducen la absorcin de los analitos. Entre los buffer ms usados estn el fosfato a pH de 2.5 y pH 7 y el borato a pH 9 , siendo la concentracin de 10-50100 nM. El impacto del pH sobre el analito puede producir sustancialmente complejos zwitteriones especialmente en pptidos y protenas, tales como TRISMES-CAPS-Tricine-Bicine reduciendo el calentamiento por efecto joule gracias a su baja conductividad, adems la adicin de sales modifica drsticamente el flujo electrosmtico, por la ruptura de la doble capa inica de las paredes del capilar, pues la carga de estos compuestos es dependiente del pH en forma directa. Una regla de uso frecuente es que hay que seleccionar al pH, entre dos unidades de pH por arriba o por debajo del pKa del analito sometido a la ionizacin completa; a valor de pH altamente alcalino, puede ser muy rpida y se pueden obtener separaciones 6,7 incompletas. Lo anterior se puede visualizar como lo reporta la literatura para el caso de la separacin de 5 tipos de frmacos en el que el incremento del pH modifica de tal

forma su estructura inica no diferencial que impide la separacin ptima de la

mezcla (figura 4).

Figura 4. Efecto del incremento del pH en la separacin electrectroforetica de una mezcla de frmacos.8 Teniendo en cuenta lo discutido a cerca del instrumento y ciertas variables que pueden influir significativamente en las mediciones, es preciso resaltar que aunque considerando que el Na+ por ser ms pequeo se espera que eluya mas rpidamente en relacin con el K+, experimentalmente se dio lo contrario, es posible que debido a las repulsiones generadas en el primer ion impliquen un ligero incremento de tamao, o adicionalmente otras interacciones de los iones en relacin con los componentes del buffer haya generado este comportamiento. En relacin con el mtodo de cuantificacin, se dice que se llevo a cabo de forma indirecta pues se incorpora un cromforo inico al tampn de la electroforesis, lo que hace que el detector reciba una seal constante debida a la presencia de esta sustancia. El analito desplaza a algunos de estos iones, como en la cromatografa de intercambio inico, de tal manera que la seal detectada desciende cuando la banda del analito atraviesa el detector el analito se cuantifica por el descenso en el valor de la absorbancia. As en el caso estudiado, el sistema buffer lo componen el cido actico que estable un equilibrio con su base conjugada y el cromforo es el imidazol (figura 5), por cuanto el primero se encarga de acondicionar el capilar para que se d el flujo

electrosmtico. De igual forma al considerar el carcter bsico del imidazol (pKa =7,1), cabe resaltar que de cierta forma influir en el equilibrio establecido entre el acido actico y el acetato, hacia la formacin de cationes H+, que son indispensables para la generacin de un optimo flujo en la direccin correcta para llevar a cabo la separacin deseada. Esto entonces se ver reflejado en el pH de la solucin (pH = 5).

Figura 5. Estructura qumica del imidazol en funcin de su carcter bsico.9 Segn los datos obtenidos con relacin a la exactitud y precisin (tabla 5) en la determinacin de K+ en la bebida energtica a partir de la curva de calibracin mostrada en el grafico 1 de las medidas llevadas a cabo para la bebida energtica, el incremento en la cantidad de ion cuantificado puede deberse a la presencia del mismo en el agua usada para preparar las soluciones tal como se comprob, pues fue preciso hacer un blanco con esta para obtener valores congruentes a lo esperado, ya que el blanco posea una concentracin de K+ de 1,97, y de igual forma debido a que los tiempos de lavado antes de cada medicin se redujeron en relacin a lo planteado en la qua es posible que

residuos de los iones en estudio hayan contribuido al error obtenido de 7,9% y un %RSD de 52,7% lo cual indica que existe una desviacin en los valores tomados ya que cuando se posee un %RSD menor o igual al 26% la solucin se puede clasificar como homognea, sin embargo esto resulta imposible para la experimentacin por ende no hubo una homognea distribucin de los iones en las muestras tomadas. Por lo tanto, en relacin a la precisin es posible que se haya perdido reproducibilidad no solo debido a las condiciones especificas de cada grupo al preparar la muestra, y de igual forma de los estndares, pero tambin es preciso tener en cuenta que como se discuti las interacciones de los iones en anlisis con las otras especies en solucin, al no ser uniforme ha de influir en la reproducibilidad del mtodo.Calibracion de estandares a concentraciones de 2,0 -10,0 de K+7 6 5

y = 0,606x - 0,121 R = 0,963

Area de pico

4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12

Concentracion K+ (ppm)

Grafico 1. Curva de calibracin para estndares de concentraciones 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 y 10,0 ppm de K+.

La mayora de bebidas deportivas comerciales tienen el equilibrio correcto de electrolitos, carbohidratos, vitaminas, minerales y lquidos. Sin la combinacin correcta de ingredientes en las cantidades adecuadas, una bebida deportiva podra obstaculizar en lugar de mejorar el rendimiento. Malestar estomacal o la tasa de mala absorcin de la bebida podra ocurrir en el equilibrio correcto de los ingredientes. 10 CONCLUSIONES

La electroforesis capilar aplicada a la separacin de iones tales como el K+, se puede lograr con una buena resolucin, teniendo como en todos los casos establecido parmetros como el pH del buffer, la longitud y consecuentemente la intensidad del voltaje aplicado, en las condiciones optimas para lograr un flujo electrosmtico mximo, al igual que movilidades inicas diferenciables que permiten la resolucin adecuada de las seales obtenidas que permiten finalmente la cuantificacin. El mtodo utilizado, si bien resulta fcil y rpido en cuanto a la preparacin de la muestra y dems condiciones, no lo fue en relacin al tiempo requerido a la toma de medidas debido a que entre cada medicin era necesario un lavado para adecuar

el capilar y evitar al mximo posibles obstrucciones y por tanto interferencias apreciables, pero debido a que permite la automatizacin, para analizar una gran cantidad de iones, es un mtodo altamente ventajoso, pues no requiere grandes cantidades de muestra y los desechos generados son mnimos. En comparacin con la cromatografa, el numero de platos y por tanto la resolucin no se incremental con la longitud de la columnas. Es ideal en electroforesis capilar que en la mayora de las separaciones electroforticas de iones pequeos lograr tiempos de anlisis breves es hacer que los analitos se muevan en el mismo sentido que el flujo electrosmtico. El equipo de electroforesis capilar resulta ser un poco ms econmico en cuanto a su consto inicial y mantenimiento en comparacin a instrumentos de cromatografa inica y de espectroscopia atmica. En mtodos electroforticos las separaciones se obtienen en pocos minutos, obtenindose simultneamente resultados cuantitativos. Los cambios en el pH, en esta tcnica afectan la naturaleza de alguno de los componentes a

separar o analizar como lo son las protenas y pptidos al igual que el comportamiento del flujo electrosmtico, pues a pH prximos a 3 la superficie interna del capilar se encuentra cargado negativamente por los grupos silanol. BIBLIOGRAFA 1. SOKOOG; HOLLER; NIEMAN, Principios de Anlisis ta instrumental, 5 edicin; 844 pp. 2. http://es.wikipedia.org/wiki/Arne _Wilhelm_Kaurin_Tiselius Revisado el 10 mayo 2011. 3. SOKOOG; HOLLER; NIEMAN, Principios de Anlisis ta instrumental, 5 edicin; 845 pp. 4. SOKOOG; HOLLER; NIEMAN, Principios de Anlisis ta instrumental, 5 edicin; 846 pp. 5. http://books.google.com/books?i d=7FOyZbb7q8UC&pg=PA869&lp g=PA869&dq=efecto+de+la+longi tud+del+capilar+en+electroforesis +capilar&source=bl&ots=_OklNXy Jgk&sig=aYax4DwJ1yUK1jzAlhivFb fhQqg&hl=es&ei=GIvMTfzyD9Gjtg eX9LGaBQ&sa=X&oi=book_result &ct=result&resnum=1&ved=0CBU Q6AEwADgK#v=onepage&q=efect o%20de%20la%20longitud%20del %20capilar%20en%20electrofores

is%20capilar&f=false. 12 mayo 2011.

Revisado

6. http://redalyc.uaemex.mx/pdf/57 6/57611797003.pdf. Revisado 12 mayo 2011. 7. http://docs.google.com/viewer?a =v&q=cache:WvTtlZQPJbEJ:www. aefa.es/index.php%3Foption%3D com_docman%26task%3Ddoc_do wnload%26gid%3D103+efecto+de l+pH+en+electroforesis+capilar&h l=es&pid=bl&srcid=ADGEESjxAxVZhHnbgFowdSQ52kc906r2Lz3 cbTOlcGW8SSPUMuv2NofBInd3at MzW16MArKcr7Osw_6pFXwIyycd aP8B50wy62x69UP8UATCqo55vl WyobOYSwoumHkZhXVSPb0lDr&sig=AHIEtbTjUo9Tehn4aE wPF7uqGhVnDwTBmg. Revisado mayo 12 2011. 8. http://books.google.com/books?i d=Q1nbZ47NXFkC&pg=PA236&lp g=PA236&dq=efecto+del+pH+en+ electroforesis+capilar&source=bl &ots=FrJlQIBgSV&sig=RCgDb5aSA cerjQsfaP6rf6eNLB8&hl=es&ei=yX 7MTYlKYjBtgfIgJG8BQ&sa=X&oi=book_r esult&ct=result&resnum=3&ved= 0CCAQ6AEwAjgK#v=onepage&q= efecto%20del%20pH%20en%20el ectroforesis%20capilar&f=false. Revisado mayo 12 2011. 9. http://docs.google.com/viewer?a =v&q=cache:jH04lTx3mbwJ:https: //portal.uah.es/portal/page/porta l/GP_EPD/PG-MA-ASIG/PG-ASIG-

66046/TAB42351/Tema%25206.p pt+pka+del+imidazol&hl=es&pid= bl&srcid=ADGEESjZJdxQ4SMcaSm uFFijArjhjvXXgtK1jewRICatGPQT7 mGJI13_p_Itwn7ITzB66JILluk3Qg oDgJ1c0wjvHImpz90u2rHDPUSLK Fwzg6y3fMAmGEHdlftnZTI1VFzQ 2Q3UfjwY&sig=AHIEtbTglO3Wyi0 ANEXOS CLCULOS

KcBWqWwkBncdAwAx-CA. Revisado 12 mayo 2011. 10. http://blog.guatemalahosting.net /1350/los-beneficios-deelectrolitos-en-las-bebidasdeportivas. Revisado 12 mayo 2011.

Tabla 1. Datos de concentracin y rea obtenida en el anlisis electrofortico de los estndares de K+.Concentracin (ppm) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 rea 1,444 2,131 2,946 4,961 6,089

Tabla 2. Regresin lineal de datos obtenidos.X Concentracin (ppm) Y rea X-X (X-X)2 Y-Y (Y-Y)2 (X-X)(Y-Y) 2,0 1,444 -4 16 -2,0702 4,28572804 8,2808 4,0 2,131 -2 4 -1,3832 1,91324224 2,7664 6,0 2,946 0 0 -0,5682 0,32285124 0 8,0 4,961 2 4 1,4468 2,09323024 2,8936 10,0 6,089 4 16 2,5748 6,62959504 10,2992 6,0 3,5142 40 15,2446468 24,24 x Y SXX SYY SXY

Ecuacin de la recta: Y= 0,6060 x 0,1218 R2 = 0,9636

Tabla 3. Datos del rea obtenida por quintuplicado para la muestra de bebida energitca Powerade.rea 3,0261 3,9481 4,0796 3,2206 Promedio = 3,5686

Contenido de K+ en el blanco: []= 1,97 rea = 1,0736 Entonces: 3,5686 1,0736 =2,4950 Contenido en la muestra: ?????? = 0,6060?????? 0,1218 2,4950 = 0,6060?????? 0,1218 ?????? = 2,4950 + 0,1218 0,6060 25 ???????????? 1 ????????????

?????? = 4,3182

?????? = 107,95 ?????????????????? Valor real de K+ 24 mg por cada 24 ml ?????????????????????????????? ???????????? ?????? + = % error %?????????????????????????????? = 107,95 100,0 100 = 7,9% 100,0 24 ???????????? 1000 ???????????? = 100,0 ?????????????????? ?????? + 240 ???????????? 1 ??????

Tabla 4. Desviaciones de intercepto, pendiente y muestra.R2 0,9636 pendiente (a) 0,6060 intercepto (b) -0,1218 Sa 0,068020022 Sb 0,45119378 SR 0,430196389 R 0,981621216 SX 3,16227766 SY 1,952219685 Sxo -3,877138563

Tabla 5. Datos de exactitud y precisin en cuanto al anlisis de electroforesis.Yo (rea de la muestra) 3,5686 Xo (concentracin muestra) (ppm) 107,95 concentracin real (ppm) 100,0 % error 7,9 intervalo de confianza (ppm) 107,95 (5,5) RSD % 52,7

Intervalo de confianza?????????????????? = 3,8771 ???????????? = ???????????? ?????? ?????????????????? ?????? 3,8771 5

???????????? = 107,95 3,18

???????????? = 107,95 5,5 ?????????????????? Coeficiente de variacin relativa:

% ?????????????????? =

3,1623 100 = 52,7% 6,00