cuantificacion de proteinas farmacia
TRANSCRIPT
Procedimiento de estudio de proteínas
Cromatografía
• Cromatografía en capa fina
• Cromatografía en columna
• Cromatografía de intercambio iónico
• Cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel
• Cromatografía de afinidad
Electroforesis
Tema 6
Cuantificación de proteínas
• Selección de fuente
• Fraccionamiento de células
• Centrifugación
• Electroforesis en acetato de celulosa
• Electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE)
1º) Aislamiento de las proteínas
Procedimiento estudio de proteínas
3º) Determinación de la
estructura primaria
Selección de la fuente
Disgregación del tejido
Ruptura celular
Cromatografía
Electroforesis2º) Purificación
3º) Determinación de sus
niveles de expresión
3º) Determinación de su
actividad
Tejido
Disgregación del tejido: (Colagenasa, quelantes del Ca++....... )
Separación de las células
Cultivos celularesCultivos primarios
Líneas celulares
Selección de la fuente
Químicos Mecánicos
Lisis osmótica Homogenización
Detergentes Sonicación
Disolventes orgánicos Congelación
(acetona, etanol, TCA)
Fraccionamiento de las células
• Homogenado se somete a altas velocidades de giro
• Separación por tamaño y densidad
• Las moléculas mayores se depositan antes
Estabilización de las proteínas:
• pH
• Degradación proteolitica
• Temperatura
Separación componentes celulares por CENTRIFUGACIÓN
Fraccionamiento celular por CENTRIFUGACIÓN
Homogenado
c. enteras, núcleos
y citoesqueleto
mitocondrias,
lisosomas
y peroxisomas
microsomas y
pequeñas vesículas
ribosomas, virus y
grandes macromoléculas
1000g x 10 min
20.000g x 20 min
150.000g x 3h
80.000g x 1h
Separación en función del tamaño
Aumento de la velocidad de
centrifugación
Se basa en la diferente:
Solubilidad
Tamaño
Carga eléctrica
Densidad
Afinidad por otras moléculas
Separación y purificación de proteínas
CROMATOGRAFÍA
ELECTROFORESIS
Cromatografía sobre papel
(Cromatografía de reparto)
CromatografíaPapel (capa fina): Aminoácidos y Azúcares
Columna: Aminoácidos y Proteínas
Cromatografía
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Las diferentes proteínas se retrasan según sus interacciones con la matriz, de
acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o unión a grupos químicos
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Cromatografía
Muestra
aplicada
El solvente se aplica
contínuamente a la
boca de la columna
Matriz
sólida
Tapón
poroso
Tubo de
ensayo
tiempo
Moléculas fraccionadas
eluídas y recogidas
TRES CLASES DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
A) Intercambio iónico:en base a la carga
B) Filtración en gel:
en base al tamaño
C) de Afinidad:en base a interacción
Flujo de solvente
Partícula
cargada
positivamente
Molécula
cargada
negativamente
unida
Molécula
cargada
positivamente
libre
Flujo de solvente Flujo de solvente
Partícula con
sustrato unido
covalentemente
Molécula de
enzima unida
Otras proteínas
pasan de largo
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Cromatografía
Partículas
porosas
Molécula
pequeña
retrasada
Molécula grande
no retrasada
Cromatografía de intercambio iónico
Las proteínas se separan según
su carga a un pH determinado
(Ej: intercambio catiónico)
Proteínas cargadas
positivamente se unen
a la matriz cargada
negativamente
Proteínas cargadas
negativamente pasan
sin unirse
Cromatografía de filtración en gel o exclusión molecular
Las proteínas se separan según su tamaño
Matriz de polímeros
de carbohidratos
Moléculas pequeñas
entran entre los
espacios acuosos
dentro de la matriz
Moléculas grandes no
entran dentro de los
espacios de la matriz
Cromatografía de afinidad
Las proteínas se separan en función de la especificidad de unión a un ligando
Moléculas que unen
glucosa se unen a
residuos de glucosa
(G) de la matriz
Adición de glucosa
(G)
Moléculas se liberan
tras la adición de
glucosa
Enzima - Sustrato
Antígeno - Anticuerpo
Hormona - Receptor
Electroforesis en acetato de celulosa
Albúmina 45-55% total
Globulinas: a1 5-8%
a2 8-13%
b 11-17%
g 15-25 %
Proteínas plasmáticas
Proteínas teñidas con
Azul de Comassie
tras SDS-PAGEDeterminación de las
masas moleculares
Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE)