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Cuantificación mediantela técnica de PCR en tiempo real
Usos y aplicaciones
Paula Fernández
Instituto de Biotecnología. CICVyA. INTA-Castelar
PCR Standard vs. PCR Tiempo Real
Análisis de punto final
Detección del producto por Electroforesis en gel
Análisis de la cinética de la reacción
Detección del producto en cada ciclo de la reacción
VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TÉCNICAS
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
DESVENTAJA:PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o productos amplificados previamente)
Geles de agarosa….
* Baja precisión* Baja sensibilidad* Baja resolución* No automatizado* Discriminación sólo por tamaño* Resultados cualitativos
mRNA
cDNA (simple cadena)
cDNA (doble cadena)
PCR
RT-PCR
Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
• PCR
OBJETIVO:
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
• La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador concapacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz deluz de una longitud de onda determinada y de detectar lafluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.
PCR en tiempo real
Real Time PCR
Step One Applied Biosystems
• FluoróforoqueseintercalaenelsurcomenordeladoblecadenadeADN
Desventaja:seuneaCUALQUIERADNdedoblecadena(dímerosdeprimersyproductosinespecíficos).
Observación del proceso de amplificación
Se adquieren los datos cuando la amplificación estátodavía en la fase exponencial. Esto estádeterminado por la identificación del número deciclo al cual la intensidad de emisión del fluoróforoaumenta con respecto al ruido de fondo (background)Este número de ciclo se llama ciclo umbral(Ct: threshold cycle). El Ct está determinado en la faseexponencial de la reacción y es más confiable que lasmediciones a punto final convencionales. El Ct esinversamente proporcional al número de copias deltarget templado: a mayor concentración de templado,menor Ct medido.
Concepto de eficiencia
Xn = X0(1 + E)n
Xn = producto de PCR luego del ciclo nX0 = número inicial de copiasE = eficiencia de amplificaciónn = número de copias
Xn
X0
Número de ciclos
Ecuación de la PCR
Las ecuaciones de PCR
• Idealmente, cada ADN “target” en la muestra original se duplica de ciclo en ciclo
• Esto equivale a una eficiencia de transcripción E=2 o de (E-1)x100=100%
• La eficiencia no siempre alcanza el máximo teórico.
La eficiencia de la reacción puede ser calculada por la siguiente ecuación: E=10(-1/slope). La eficiencia de la PCR debería ser de aprox.
90-100% (pendiente ideal = 3.32)
Diversos factores afectan la eficiencia como puede ser: el largo del amplicón, la estructura secundaria y el diseño de primers (entre
otros).
Eficiencia
Efecto de la eficiencia de amplificación
ResultadosUna diferencia de 0.1 en la eficiencia de amplificación resultó en u
número final de copias significativamente menor.
Xn = X0(1+E)nCaso 1: E = 0.9 Caso 2: E = 0.8
Xn = 100 (1+0.9)30 Xn = 100 (1+0.8)30
Xn = 2.3 x 1010 Xn = 4.6 x 109
Las cinco diluciones alcanzan el plateau en el mismo punto aunque cada curva muestra un recorrido diferente. Esto refuerza el hecho de que si las mediciones fueran tomadas a lo largo del plateau los datos no representarían la cantidad inicial del target.
log view
• En la práctica uno no observa los amplicones sino una medida indirecta de su abundancia.
• Lo que se mide es la fluorescencia de la muestra amplificada
• Se supone que la fluorescencia es proporcional al número de amplicones
¿Cómo sería una curva teórica de fluorescencia en función del número de ciclos?
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20Ciclos
0.0
1.1
2.2
3.3
4.4
5.5
6.6
7.7
8.8
9.9
11.0
Fluo
resc
enci
a
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40Ciclo
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
Fluo
resc
enci
a
¿Cómo es una curva de fluorescencia real en función del número de ciclos?
• La mayoría de las curvas de fluorescencia presentan valores erráticos para los ciclos iniciales de la reacción cuyo origen es diverso.
• La curva de fluorescencia no crece indefinidamente.
La cantidad de reactivos limita la reacción.
Como interpretar Rn?
0 10 20 30 40
Cycle number
Rn
CT
Threshold Rn
Sample
No TemplateControl
Rn
Rn
* Rn+ es el valor Rn de una reacción que contiene todos los componentes (muestra de interés, GOI, blanco); Rn- es el valor
Rn detectado in NTC(valor de base)
* Delta Rn es la diferencia entre Rn+ and Rn-. Es además un indicador de la magnitud de señal generada por la PCR
* El gráfico de Delta Rn versus el número de ciclos y muestra las curvas de amplificación para estimar los valores de Ct
Rn
NTC: no template controlGOI: gene of interest
ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de losprimers a secuencias parcialmente complementarias presentes enel DNA o cDNAs de la muestra• Dímeros: los primers pueden hibridarse entre ellos creandoproductos pequeños
PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECÍFICOS (artefactos): que puedenincrementar el valor de fluorescencia obtenida durante lareacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green.
CURVA DE DENATURALIZACIÓN
Muestra el perfil de denaturalización de los productosamplificados.
Si un producto presenta un perfil de denaturalizacióndiferente (valores de Tm diferentes), significa que es otroproducto (no específico) de amplificación, pueden serdímeros.
CURVA DE DENATURALIZACIÓN DE DILUCIONES
(se observan dímeros, de menor temperatura de fusión)
dímeros
DISEÑO EN PLACA
• Relative expression
gen objetivo
referencia
( ( ) ( ))gen objetivo( ( ) ( ))gen referencia
gen
media Cq control media Cq muestra
media Cq control media Cq muestra
ER
E
Pfaffl M.W. Horgan G.W., Dempfle L. (2002) Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical
analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 9 e36
• Simple y rápida (semi-automatizada).• No hay manipulación post-PCR.• Eliminación de contaminación por amplicones.• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.• Muy sensible.• Detección de productos inespecíficos con la opción
“curva de desnaturalización” (Melt-Curve).• Detección de más de un producto específico en una
misma reacción.• Extraordinariamente específico.
Ventajas del PCR en tiempo real
Desventajas del PCR en tiempo real
• Laborioso y dificultoso de poner a punto
• Determinación de genes presuntos constitutivos
• Alta sensibilidad
Determinación del ciclo umbral (Cq) y eficiencias de la reacción de PCR cuantitativa (LinReg PCR)
• Usualmente son genes abundantes y expresados a un nivel celular/tisular constante
• Los más usados son en general los menos confiables
•Usar una combinación de varios genes
Normalización con genes de referencia
40
Valor M: índice de estabilidad de control interno(nivel de expresión de dos genes constitutivos debe ser idéntica)
Media aritmética de los desvíos de los dos genes constitutivos (j y k)
Limitantes:Dependencia de genes analizados
Evalúa media aritmética de los desvíos estándard de a pares de genesSupuesto de estabilidad de todos los genes
CL1: Control leaf 1CL2: Control leaf 2FE1: Flower excision 1FE2: Flower excision2D: Dehydrated1
Búsqueda de genes de referencia
Modelo estadístico
Fernandez y col. 2011
Búsqueda de genes de referencia
Uso de geNorm
Functional Genomics Strategies applied to the study of senescence in sunflower
Leaf sampling at different development stages
Control
Water stress
Bioinformatics data analysis and integration
Biomarkers (genes, transcripts & metabolites) of senescence process in
Physiological approach
• Chlorophyll• Sugars• Nitrogen• Leaf area
Metabolomicapproach
• GC-TOF-MS
Transcriptomic approach
• 4 x 44 Agilent Sunflower Microarray
Moschen 2009
•Imposibilidad de usar un solo gen constitutivo para todas lasespecies (Coker y Davies 2003)
•Tubulina es el más estable en hoja, raíz y flor (más conveniente paraanálisis dentro de clonotecas en tomate) y en Populus pero el menosestable en Arabidopsis.
•DNA-J-like protein más estable en su expresión media (∆Ct) entretodas las clonotecas (tomate).
•Alta abundancia de 18S o 28S RNA frente a mRNA (Kim y col. 2003) (refutado por Solanas y col. 2001).
Normalización de PCR cuantitativa ybúsqueda de genes de referencia
Sunflower Unigene Resource (SUR v.1.0)
Functional annotation and KEGG mapping(Blast2GO software: www.blast2go.org)
38,485 GO terms resulted in 49.6% of total sequences with GO annotation
133,682 EST Genbank (release May 2009)Helianthus annuus L.
VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/UniVec.html)
Trimseq EMBOSS(http://emboss.sourceforge.net/)
28,089 singletons and 12,924 contigs = 41,013 unigenes
(CAP3 software: http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)
Sunflower microarray • 42,386 probes• 74 specific control probes
(10x: 740 controls, previous cDNA chip)
• 1,417 Agilent controls
Fernández y col 2012
Resultados preliminares microarreglo
Hoja 10 CONTROL
T-1 T-3T-2
Hoja 10 stress hídrico
T-1 T-3T-2
Campo
Sólo Control :6280 probes
Sólo Estres: 3781 probes
Invernáculo
Sólo Control :1945 probes
Sólo Estres: 587 probes
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F401
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H110
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T289
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
EF432
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F550
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H124
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F543
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H354
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H125
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H123
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F549
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F443
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H387
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H302
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T221
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F231
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T234
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H385
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F175
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H111
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F209
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H136
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H304
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H209
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F230
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F137
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
EF502
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T340
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H322
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T253
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
EF624
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F216
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
H411
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F210
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F171
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T107
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T111
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
F192
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T322
C1
C2 F1 F2 F3 S1 S2 S3
T187
Validación por qPCR de genes diferencialmente expresados
Perfil de expresión para cada uno de los 80 genes candidatos
Estudios de expresión de genes candidatos frente a estreses abióticos
Validación de genes por PCR cuantitativa (PCR en tiempo real)
• De los 15 genes que fueron seleccionados para su validación se evaluaron 12,confirmándose la expresión diferencial de 10 de ellos (Método 2 -∆∆Ct Livak ySchmittgen, 2001).
EST EF502
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Ciclo
∆R
nFHSHCH
(BU671910) (BU671806) EST T124
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Ciclo
? ∆R
n
FHSHCH
• Permiten medir la producción de productos de PCR mediante un sistema de sondas marcadas mediante dos fluorocromos.
• Su utilidad radica en que poseen un fluoróforo en su extremo 3' y una molécula en el 5' que bloquea su emisión de fluorescencia (denominada en inglés «quencher»); esta sonda marcada hibrida específicamente en la parte central del producto de PCR a obtener.
• Cuando la polimerasa se topa con la sonda la hidroliza mediante su actividad exonucleasa 5'-3', lo cual provoca la separación del quencher del fluorocromo y, por tanto, se emite fluorescencia.
Métodos de detección por hidrólisis de ADN(Sondas TaqMan)