CAPITULO 16“CULTIVO DE EMBRIONES”

Biotecnología vegetal

Alumnos:

Domínguez Dehesa Elizabeth

Domínguez Jerónimo Leticia

González Martínez Ana Iza

Hernández Alvarez Nallely

Lic. En Biología 8° semestre

Introducción

El cultivo de embriones consiste en el aislamiento y crecimiento, in vitro, en condiciones estériles, de un embrión inmaduro, con el fin de obtener una planta viable.

En principio existen dos tipos de cultivo de embriones:

1. Cultivo de embriones inmaduros, que se originan en semillas no acabadas de madurar. Se utiliza para impedir el aborto embrionario (muerte prematura del embrión), y con el fin de obtener una planta viable; este tipo de cultivo es difícil, en parte porque se necesita una ardua disección, y también porque se necesita un medio nutritivo complejo. Las posibilidades de éxito de este tipo de cultivo, dependen mucho del estado de desarrollo del embrión en el momento de ser aislado.

2. Cultivo de embriones maduros, que se encuentran a su vez en semillas maduras. Este tipo de cultivo es fácil, y se utiliza, por ejemplo, para eliminar la inhibición (absoluta) de germinación de las semillas. Suele ser suficiente en estos casos el uso de un medio nutritivo simple, como agar, azúcar y minerales.

Técnicas

El cultivo de embriones no se encuentran generalmente problemas de desinfección. Las semillas maduras se encuentran desinfectadas en su exterior, a partir de ellas se obtienen los embriones abriendo la cubierta seminal. Si las semillas están todavía inmaduras, el fruto aún cerrado permanece estéril, y al abrirlo se obtienen los óvulos sin infectar. A continuación se dan algunos ejemplos de diferentes procedimientos de aislamiento:

1. Aislamiento de embriones de cereza.

Primero se retiran los huesos de los frutos. Se seleccionan las mejores semillas, descartando las que floten en un baño de agua. Se esterilizan las semillas seleccionadas. A continuación se rompe el endocarpio leñoso, quedando a la vista el embrión. Se retiran los embriones con la ayuda de unas pinzas con punta, y se siembran sobre un medio sólido.

2. En el caso de la cebada se retira el fruto de la espiga, se desinfecta, se aclara con agua estéril y se coloca sobre una caja de Petri estéril, con la raquilla hacia abajo y la lemma hacia arriba. Después de retirar la lemma, pared del fruto y cubierta seminal, el embrión queda libre. Se separa con un escalpelo y se siembra sobre el medio.

3. En el caso de la azucena, 40-60 días después de la fertilización se esteriliza el fruto cerrado (con alcohol de 96% y posteriormente flameado), se sacan entonces las semillas y se colocan en agua estéril para impedir su deshidratación. Se retira la cubierta seminal raspando con un escalpelo, haciéndose así visible el endospermo. El embrión puede entonces aislarse a través de unos cortes longitudinales, o es obligado a salir del edospermo a través de un agujero lateral. El embrión se siembra tan pronto como queda en libertad.

Sin embargo, no se puede decir que el cultivo de embriones sea un proceso fácil. En 1969, Lange aisló 1888 embriones de cebada, obteniendo solamente 201 plantas viables. Las razones de este bajo porcentaje de viabilidad pueden ser:

1. Pérdidas debidas a infección (15%)

2. Embriones demasiado pequeños en el momento del aislamiento (elevando la concentración de azúcar se estimula el crecimiento de los embriones pequeños).

3. Interrupción del desarrollo embrionario.

4. Daños en los embriones (especialmente en el caso de semillas duras).

5. Las condiciones artificiales (medios nutritivos).

Factores que afectan al éxito del cultivo de embriones

A continuación se indican los factores de los que depende el desarrollo de una planta viable, a partir de un embrión:

1. Genotipo

En algunas especies vegetales los embriones son difíciles de cultivar, mientras que en otras resulta fácil. Se pueden encontrar incluso diferencias, entre los cultivares de una misma especie.

2. Estado de desarrollo del embrión en el momento del aislamiento

Generalmente los embriones muy pequeños, indiferenciados, es virtualmente imposible desarrollarlos in vitro. Cuanto más desarrollado esté un embrión in vivo, más fácil resulta su cultivo in vitro. A veces es posible, con la ayuda de técnicas especiales, cultivar embriones pequeños; por ejemplo, incubando, en estrecho contacto con el embrión un fragmento de endospermo de una semilla madura, o una porción de tejido hipocotilar, transplante del embrión inmaduro, al endospermo de una semilla normal, de la misma especie.

3. Las condiciones de crecimiento de la planta madre

Generalmente las plantas madre son cultivadas en invernadero, aunque a veces se utiliza material que se ha cultivado en el campo, por ejemplo cebada, estas plantas se cortan y transfieren a soluciones aireadas, en un fitotrón. La mejora del desarrollo de la planta madre, en condiciones controladas, generalmente produce un mejor desarrollo del endospermo y, por consiguiente, mejor crecimiento de los embriones aislados. El crecimiento del embrión puede también ser estimulado, si se desarrollan mas los cotiledones, lo cual depende también del crecimiento de la planta madre.

4. Composición del medio nutritivo

Los embriones inmaduros tienen unas necesidades mucho mas criticas, en cuanto a la composición del medio nutritivo, que los embriones maduros. Sin embargo, tanto los embriones maduros como los inmaduros necesitan macro, microelementos y azúcar.

5. Oxígeno

Se trata de un factor importante, siendo en algunas ocasiones, las necesidades de oxigeno de los cultivos de embriones, superiores a las concentraciones que normalmente se encuentran en el aire.

6. Luz

A veces los embriones aislados necesitan ser cultivados en la oscuridad, durante 7-14 días, pudiendo luego ser transferidos a la luz, para permitir la formación de clorofila.

7. TemperaturaDepende de la especie vegetal que se usa. Normalmente se utiliza una temperatura relativamente alta (22-28°C) para el crecimiento; aunque algunas especies como la azucena, necesitan una temperatura mas baja (17°C). Un tratamiento de frio (4°C) puede ser necesario para romper la dormición. En el caso de la azucena, se ha encontrado que las plantas obtenidas necesitan pasar entre 4 y 6 semanas a una temperatura de 5-9°C, para obtener un buen crecimiento. Las plantas de melocotón crecen en forma de rosera a no ser que reciban un tratamiento de frio.

Aplicaciones prácticas

Las aplicaciones practicas mas importantes del cultivo de embriones se indican a continuación:

1. Eliminar la inhibición (absoluta) de germinación de las semillas

En algunas especies es imposible lograr la geminación in vivo, siendo imprescindible en estos casos el cultivo de embriones, por ejemplo en: Colocasia esculenta, Musa balbisiana y Pinus armandii.

2. Germinación de semillas de parásitos obligados, que resulta imposible in vivo sin la presencia del huésped, pero que puede conseguirse con el cultivo de embriones.

3. Acortar el ciclo de mejora

Existen muchas especies que presentan dormición seminal, la cual frecuentemente se localiza en la cubierta de la semilla y/o en el endospermo. Aislando los embriones se puede producir una germinación inmediata. A veces la germinación se ve retrasada, sino impedida del todo, por la impermeabilidad de la cubierta al agua y al oxigeno. En estos casos el cultivo de embriones puede acelerar la germinación. Hay que tener en cuenta que el cultivo de embriones puede producir un acortamiento mayor aún del de mejora.

4. Producción de haploides

En el cruce Hordeum vulgare X H. bulbosum se produce la fertilización, pero después los cromosomas de H. bulbosum son eliminados, produciéndose como resultado un embrion haploide de H. vulgare, el cual solo es viable por cultivo de embriones. Si se duplican los cromosomas al final se produce un homocigoto de H. vulgare.

5. Prevención del aborto embrionario en frutales de hueso precoces

El transporte de agua y nutrientes, al embrión todavía inmaduro, en cruces como frutales de hueso precoces, que cortado a veces demasiado temprano, produciéndose el aborto del embrión. En la práctica esto quiere decir que no son posibles los cruces. La única solución es utilizar el cultivo de embriones, para evitar el aborto in vivo.

6. Prevención del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad

En el caso de cruces interespecíficos, intergenéricos, y en el caso de cruces por ejemplo, entre diploides y tetraploides, el endospermo puede no desarrollarse o hacerlo muy probablemente. El resultado es el aborto embrionario in vivo, que puede ser evitado exclusivamente por el cultivo d embriones. El cultivo de embriones se utiliza frecuentemente en cruces interespecíficos: Phaseolus, azucena, lino, algodón, tomate, arroz y cebada. Ejemplos de cultivo de embriones con cruces intergenéricos son: Hordeum X Secale y Triticum X Secale. El cultivo de embriones se emplea también en los cruces entre diploides y tetraploides: en cebada y centeno.

7. Propagación vegetativa.

Los embriones se utilizan como un material inicial, para la propagación vegetativa, por ejemplo en las Gramíneas y Coníferas. Los embriones responden muy bien, debido a que se trata de un material juvenil; en las Gramíneas la organogénesis se produce con relativa facilidad a partir de tejido calloso juvenil. En las Coníferas el clonado partiendo de callos inmaduros producidos a partir de embriones, así como la formación de vástagos axilares, resulta también fácil.