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CULTIVO DEMICROORGANISMOS
UNIVERSIDADPOLITÉCNICA DE
HUATUSCO
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Cultivos
Cultivos
un cultivo es un método para lamultiplicación demicroorganismos tales comobacterias y hongos en el que seprepara un medio óptimo parafavorecer el proceso deseado. Uncultivo es empleado como unmétodo fundamental para elestudio de microorganismos.
La microbiología en esencia
Aislamiento demicroorganismos
Cultivo
Los microorganismos son ubicuos, por lo quela preparación de un cultivo puro implica nosólo el aislamiento de un determinadomicroorganismo a partir de una poblaciónmicrobiana natural mixta, sino también elmantenimiento del individuo aislado(descendencia) en un ambiente artificial enel que se impide el acceso de otrosmicroorganismos.
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles lascondiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para quepuedan multiplicarse de forma controlada.
Los medios de cultivo son las soluciones de nutrientes utilizadaspara cultivar microorganismos en el laboratorio.
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo consiste en un gel o unasolución que cuenta con los nutrientes necesariospara permitir (bajo condiciones favorables de pH ytemperatura) el crecimiento de microorganismos.
Generalmente se presentan desecados en forma depolvo fino o granular antes de ser preparados, alprepararse podemos encontrarlos en estado sólido,semisólido y líquido.
Los nutrientes contenidos en un medio de cultivo sonlas sustancias que requieren los microorganismospara la síntesis de sus materiales celulares y paraefectuar sus actividades metabólicas (de interés o no).
Los microorganismos necesitan diferentes tipos denutrientes y no todos se necesitan en la mismacantidad.
MEDIOS DE CULTIVO
Macronutrientes Micronutrientes(elementos traza) Factores de
crecimiento
En un nivel elemental, los requerimientosnutricionales de bacterias como E. coli son reveladospor la composición elemental de la célula, queconsiste en C, H, O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, *Mn, ytrazas de Zn, Co, Cu, y Mo.
Los elementos se encuentran en forma de agua,iones inorgánicos, pequeñas moléculas, ymacromoléculas que sirven tanto al rol estructuralcomo funcional en las células.
MACRONUTRIENTES
Elemento
Fuente Función
C Componentes orgánicos o CO2Principal constituyente de
material celular
O H2O, componentes orgánicos, CO2, yO2
constituyente de materialcelular y agua celular; O2 esaceptor de electrones en la
respiración aeróbica
N NH3, NO3, componentes orgánicos,N2
Constituyente de aminoácidos,nucleótidos de ácidos nucleicos,
H H2O, componentes orgánicos, H2
Principal constituyente decomponentes orgánicos y agua
celular
P Fosfatos inorgánicos (PO4)Constituyente de ácidosnucleicos,, fosfolípidos
S SO4, H2S, So, componentes de azufreorgánico
Constituyente de cisteína,metionina, varias coenzimas
K y Mg Sales de potasio y magnesioCatión inorgánico celular
principal y cofactor para ciertasenzimas
Ca Sales de calcioCatión inorgánico celular,
cofactor para ciertas enzimas yun componente de endosporos
Fe Sales de hierro Componente de citocromos yciertas proteínas del hierro
Los elementos en trazas son iones metálicos requeridospor ciertas células en cantidades tan pequeñas que esdifícil detectarlos y no es necesario agregarlos al medio decultivo como nutrientes.
Los elementos en trazas son requeridos en cantidades tanpequeñas que están presentes como “contaminantes” delagua u otros componentes del medio.
Como iones metálicos, los elementos en trazashabitualmente actúan como cofactores para reaccionesenzimáticas esenciales en la célula.
Un elemento en traza de un organismo puede ser unelemento requerido por otro y viceversa, pero los cationeshabituales calificados como elementos en trazas en lanutrición bacteriana son Mn, Co, Zn, Cu, y Mo.
MICRONUTRIENTES
Los factores de crecimiento son compuestos orgánicosque, como los micronutrientes , se necesitan en muypequeñas cantidades y sólo en el caso de algunascélulas.
FACTORES DE CRECIMIENTO
Aminoácidos
Constituyentes deproteínas
Purinas yPirimidinas
Constituyentesde ácidosnucleicos
Vitaminas
Compuestosorgánicos queforman parte degrupos prostéticoso centros activosde enzimas
CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN ELLABORATORIO
Una vez que un medio de cultivo ha sido preparado yse ha esterilizado para eliminar todos losmicroorganismos, puede ser inoculado con losmicroorganismos de nuestro interés.
El cultivo es incubado en condiciones que favorezcanal crecimiento microbiano.
pH Temperatura Oxígeno *Luz
CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN ELLABORATORIO
Para crecer en la naturaleza o en ellaboratorio, un microorganismo debetener un rango permisivo decondiciones físicas como concentraciónde O2, temperatura, y pH.
A veces las bacterias son referidasindividualmente o en grupos basadosen sus patrones de crecimiento bajovarias condiciones químicas(nutricionales) o físicas. Por ejemplo,los fotótrofos son organismos queutilizan la luz como fuente de energía;los anaerobios son organismos quecrecen sin oxígeno; los termofílicos sonorganismos que crecen a altastemperaturas.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN ELLABORATORIO La inoculación de un medio de cultivo procede, casi siempre, de
un cultivo puro. Se desarrolla a partir de una célula única y que pertenece a la
misma especie y cepa.
Los organismos no deseados, llamados contaminantes, son muyubicuos, por lo que se han diseñado técnicas microbiológicas paraevitarlos
Las técnicas de cultivo en medio sólido inmovilizanlas células permitiéndolas crecer y formar masasaisladas visibles llamadas colonias.
Las colonias bacterianas pueden ser de forma ytamaño variable dependiendo del organismo, de lascondiciones del cultivo, suministro de nutrientes, etc.
Algunas bacterias producen pigmentos que coloreanlas colonias.
Las placas que contengan mas de un tipo de coloniaindican cultivo contaminado.
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS SÓLIDOS)
(a) esterilizar un asa de siembra por flameado (b) introducirla en la suspensión bacteriana pararecoger una muestra, (c) sembrar haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en unaplaca Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer unsegundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y unacuarta vez, hasta que los grupos de células se diluyan y se separen células aisladas. Para estarseguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada ysembrar por estrías una segunda placa.
METODO DE SIEMBRA EN ESTRÍA
METODO DE VERTIDO EN PLACA
(a) hacer diluciones seriadas de la suspensión bacteriana hasta obtener unamuestra con sólo unos pocos cientos de bacterias, (b) verter la muestra en un tubocon agar a sobrefusión, mezclar y verter el contenido en una placa Petri. (c)Después de la incubación, se desarrollan colonias en el agar (más pequeñas) y ensu superficie (más grandes).
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS SÓLIDOS)
Antibióticos
Las bacterias varían su sensibilidad a la penicilina
A concentraciones elevadas la penicilina es tóxica para los procariotas
Purificación de protozoos, hongos, etc., contaminados con procariotas
Procariotas son insensibles a antibióticos poliénicos
Nistatina para la purificación de cultivos bacterianoscontaminados con células eucarióticas
SUSTANCIAS SELECTIVAMENTE INHIBITORIAS
MEDIOS INCLINADOS
Es empleado pararesembrar cepas aisladas,ya sea para suidentificación posterior opara base de cultivo.
Siempre debe hacerse cercael mechero, y flameando laentrada del tubo.
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS SÓLIDOS)
SIEMBRA EN MEDIOS INCLINADOS
Se pueden usas para identificar cada tipo de bacteria, a través decaracterísticas bioquímicas sembrándolas en medios de cultivoespeciales.
Así el medio de cultivo contiene determinados azúcares especialesque sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios seañaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de losnutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos.Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generangases que pueden ser detectados cuando el cultivo se realiza en untubo cerrado.
Cultivo de microorganismos en el laboratorio(MEDIOS SÓLIDOS)
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS SÓLIDOS)
TUBO INCLINADO VS SIEMBRA EN PLACA
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS SÓLIDOS)
CULTIVO POR PICADURA En este método el material para
la investigación es colocado en unalambre recto e introducido almedio.
Debe cuidarse que el trayecto seamismo el de entrada que el desalida
Puede ser empleado paraconservar cultivos patrón.
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS SÓLIDOS)
Si el microorganismo crece en un mediolíquido, en la mayoría de los casos lascélulas que se producen en cada divisióncontinúan su vida independientementeformándose una suspensión de célulaslibres.
Se pueden diferenciar cuatro fases en laevolución de los parámetros que miden elcrecimiento microbiano:
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS LÍQUIDOS)
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS LÍQUIDOS)
1.- Fase lag o de adaptación microorganismos adaptan sumetabolismo a las nuevas condiciones ambientales para iniciarla fase de crecimiento exponencial.
2.- Fase exponencial o logarítmica: la velocidad decrecimiento es máxima y el tiempo de generación es mínimo.Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máximalos nutrientes del medio.
3.- Fase estacionaria: no se incrementa el número debacterias. Se produce una acumulación y liberación demetabolitos secundarios. Entran en esta fase porque se agotaalgún nutriente o porque los productos de desecho durante lafase exponencial hacen al medio inhóspito
4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número decélulas viables del cultivo.
Cultivo de microorganismos en ellaboratorio (MEDIOS LÍQUIDOS)