cultura e crescimento microbiano aula4 30_11_2015
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MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
ENGENHARIA AMBIENTAL
Prof.ª Mestranda Graziele Ruas 2 Sem 2015
CULTURA E CRESCIMENTO MICROBIANO NUTRIÇÃO
Crescimento Microbiano
• Objetivos da Aula:
• Identificar as fases da curva de crescimento dos microrganismos e o que caracteriza o início e o fim de cada fase;
• Conhecer os tipos de associações e os fatores internos e externos que influenciam na velocidade de crescimento dos microrganismos;
• Conhecer os métodos de quantificação dos microrganismos.
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Crescimento Microbiano
• O CRESCIMENTO CELULAR é definido como aumento coordenado de todos os constituintes celulares. Consequência => Multiplicação Celular;
• O CRESCIMENTO MICROBIANO é normalmente associado ao crescimento de uma população de células de um dado microrganismo, ou seja, com aumento do número de células da população
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Crescimento Microbiano
• Tempo de Geração é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique;
– O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos ou até dias, os microrganismos de interesse ambiental ou tecnológico têm tempo de geração que varia de 1 a 3 horas;
– Depende dos fatores genéticos, ambientais e nutricionais.
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Crescimento Microbiano
• O Crescimento Microbiano pode ocorrer em meio líquido com células em suspensão ou associados a superfícies (biofilmes, flocos, e outros).
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Crescimento Microbiano
• O crescimento individual
termina com a divisão da
célula, gerando duas células –
filhas, independentes e
autônomas.
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Crescimento Microbiano
• Etapas do Crescimento Populacional
– INÍCIO;
– FASE LAG (latência);
– FASE EXPONENCIAL (log);
– FASE ESTACIONÁRIA;
– FASE DE DECLÍNIO.
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Crescimento Microbiano
• Sistema fechado de cultivo => curva de crescimento. (Ex: reatores em batelada).
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Crescimento Microbiano
• Sistema fechado de cultivo => curva de crescimento.
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Crescimento Microbiano
• Sistema fechado de cultivo => curva de crescimento.
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Crescimento Microbiano –Fase LAG ou Adaptativa (I)
• Fase em que não há multiplicação celular;
• Ocorre a síntese de enzimas;
• As células apresentam-se em tamanho aumentado;
• Há síntese e consumo de grânulos de reserva.
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Crescimento Microbiano –Fase LAG ou Adaptativa (I)
• É um período de adaptação ao novo meio, ocorre a síntese de enzimas;
• ↑Tamanho das células;
• ↑ da atividade Metabólica;
• Transcrição do DNA (sem replicação);
• Síntese de DNA.
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Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (II)
• Crescimento logarítmico (Exponencial);
• Fim da síntese de enzimas;
• Célula voltam ao tamanho normal;
• Absorvendo os nutrientes do meio;
• Sintetizando constituintes celulares;
• As células são sensíveis às mudanças ambientais e compostos antimicrobianos;
• Há predominância de células jovens.
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Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (III)
• Equação do Crescimento
• N = N0.2n
• Onde N é o nº de microrganismos ao fim de n divisões e N0 é o nº inicial de microrganismos;
• A velocidade exponencial de crescimento é expressa pelo número de divisões no tempo:
• R=n/t-t0;
• Tempo de Geração:
• G = 1/R.
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Crescimento Microbiano –Fase LOG ou Exponencial (III)
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Fase Log ou Exponencial (III)
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Crescimento Microbiano –Fase Estacionária (III)
• O número de bactérias que surge é o mesmo que morre;
• Acúmulo de metabólicos tóxicos (Ácidos Orgânicos);
• Exaustão de Nutrientes;
• Alteração nas condições físicas do meio;
• As células apresentam tamanho
• Menor que nas fases anteriores;
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Crescimento Microbiano –Fase Estacionária (III)
• Nessa fase há um favorecimento à adesão e agregação entre as células;
• A membrana plasmática torna-se menos permeável;
• A célula tem maior resistência ao choque térmico, pressão osmótica e estresse oxidativo;
• Há redução da síntese proteica;
• Há síntese de proteínas específicas.
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Crescimento Microbiano –Fase de Declínio (IV)
• As células perdem a capacidade de se dividir;
• Número de células mortas > células novas;
• Ocorre o processo de esporulação (Esporos Bacterianos);
• Há impossibilidade de produção de energia e elevado produção de enzimas autolíticas.
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Crescimento Descontínuo e Crescimento Contínuo
• Crescimento Descontínuo: são as quatro fases citadas (Lag, Log, Estacionária e Declínio);
• Crescimento Contínuo: compreende as duas fases lag e exponencial, estabilizando e mantendo a fase exponencial com o suprimento contínuo de nutrientes e remoção contínua e na mesma proporção de células do meio.
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Medidas de Crescimento Microbiano
• Vários métodos na contagem do número total de células ou mensuração da massa celular – adaptáveis para diferentes organismos ou situações;
• Avaliação Direta – contagem de células, filtração e técnica do número mais provável;
• Avaliação Indireta – Turbidez, Atividade Metabólica e Peso seco.
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Medidas do Crescimento Microbiano
• Métodos que determinam o número de células;
– Diretos;
– Indiretos.
• Métodos que determinam a massa das células.
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Métodos que Determinam o Número de Células
•Método Diretos;
•Métodos Indiretos.
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Métodos que Determinam o Número de Células – Método Direto
• Métodos Diretos 1. Enumeração ao microscópio
(com uso de lâminas especiais); (Câmara de Petroff-Hausser e de Neubauer);
2. Enumeração por câmara eletrônica (através de condutividade elétrica).
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Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto
• Métodos diretos
1. Método de contagem de células viáveis ou unidades formadoras de colônias (UFC).
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Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto
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Diluição Decimal para Plaqueamento
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Útil para analisar grandes volumes de água
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Métodos que Determinam o Número de Células – Método direto MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL
• É uma técnica estatística: quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições necessárias para reduzir a densidade até um ponto em que nenhuma bactéria esteja presente nos tubos de diluição seriada;
• Esse método também é utilizada para identificar microrganismos (como bactérias que fermentam lactose produzindo ácido = coliformes);
• Oferece uma estimativa de 95% de probabilidade de a população bacteriana estar em uma faixa determinada.
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Métodos que Determinam o Número de Células – Método Indireto
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Métodos que Determinam a Massa das Células
MÉTODOS INDIRETOS
1. Massa seca: a massa celular é separada por centrifugação, ou filtração, seca e pesada;
2. Dosagem de proteína celular: as células são centrifugadas e o conteúdo proteico dosado;
3. Dosagem de ATP (Identifica células viáveis) – reação de luminscência.
MÉTODOS INDIRETOS
3. Turbidimetria;
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Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano
Limitações de Crescimento pelos Fatores Ambientais
Lei dos Mínimos de Leibig
• O crescimento da população é limitado pelo elemento cuja concentração é inferior a um valor mínimo – o crescimento da biomassa é determinado pelo nutriente em menor concentração;
Lei de Tolerancia de Shleford
• Faixa de tolerância de sobrevivência e crescimento com seus limites superior e inferior – o organismos só cresce em determinada faixa de fatores ambientais;
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Fatores que controlam o Desenvolvimento Microbiano
• FATORES AMBIENTAIS
• Os fatores ambientais influenciam a absorção de nutrientes e portanto no próprio metabolismo celular;
• Os principais fatores são: pH, pressão osmótica, Temperatura, Oxigênio e Luz.
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Fatores que controlam o
Desenvolvimento Microbiano - pH • A maioria dos microrganismos crescem
melhor em pH próximo a neutralidade (6,5 a 7,5);
• Os microrganismos apresentam valores de pH, mínimo, ótimo e máximo para multiplicação;
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Fatores que controlam o
Desenvolvimento Microbiano - pH Bactérias: pH entre 5 e 9;
Classificação das bactérias em relação ao pH: • Neutrófilas: espécies que crescem em faixas de
pH entre 5,4 a 8,5 (EX: Maioria das bactérias patogênicas);
• Acidófilas: espécies que crescem em faixas de pH extremamente baixas, entre 0,1 a 5,4. Ex: Bactérias do estomago – Helicobacter pylory.
• Alcalinófilas: crescem em faixas de pH entre 8,5 e 11,5.
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Fatores que controlam o
Desenvolvimento Microbiano - pH
• Tolerância ao pH
• Maior tolerância a valores baixos de pH: Bolores > Leveduras > Bactérias;
• Microrganismos patogênicos apresentam uma faixa de pH mais estreita;
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Fatores que controlam o
Desenvolvimento Microbiano - pH Efeito dos Ácidos nos Microrganismos
• Maior gasto de energia para manter o pH intracelular;
• Desnaturação de proteínas (DNA);
• Alteração das atividades das enzimas, vitais para as células;
• Menor velocidade de crescimento.
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Fatores que controlam o
Desenvolvimento Microbiano - pH pH do Alimentos
• Alimentos pH > 4,5 => mais sujeitos ao crescimento bacteriano;
• pH entre 4,0 e 4,5 => predominância do crescimento de bolores e leveduras, poucas bactérias;
• pH < 4,0 => crescimento de bolores e leveduras.
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Fatores que controlam o Desenvolvimento
Microbiano – Pressão Osmótica • As bactérias tem mecanismos que as
permitem manter a pressão osmótica elevada.
• Sempre que houver uma diferença de concentração de soluto entre os meios externos e internos (intracelular), as moléculas de água tenderão a igualar as concentrações, fluindo do lado menos concentrado para o mais concentrado.
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Fatores que controlam o Desenvolvimento
Microbiano – Pressão Osmótica • As bactérias geralmente vivem meios
hipotônicos, mas possuem recursos que permitem a manutenção de alta osmolaridade interna;
• Por outro lado a parede celular rígida permite que o citoplasma possa apresentar alta concentração de solutos sem lise celular.
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Fatores que controlam o Desenvolvimento
Microbiano – Pressão Osmótica
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Fatores que controlam o Desenvolvimento
Microbiano – Temperatura • Quando a temperatura
aumenta, os processos químicos e enzimáticos ficam mais rápidos;
• ↑ Temperatura => ↑Taxa de crescimento;
• Pode ocorrer desnaturação proteica.
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Fatores que controlam o Desenvolvimento
Microbiano – Temperatura • Classes Térmicas do Microrganismos
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Fatores que controlam o Desenvolvimento
Microbiano – Temperatura Psicrotrófico:
• Pseudomonas, Alcalígenes, Flavobacterium, Micrococcus; Mesófilos:
• A maioria das espécies ; Maior parte dos patógenos; Termófilos:
• Algumas espécies de Bacillus e Clostridium.
Bolores: • Faixa ampla de temperatura; Crescem em temperatura de
refrigeração; Leveduras:
• Crescem na temperatura de psicrotróficos e mesófilos.
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Fatores que controlam o
Desenvolvimento Microbiano – Luz
• A luz é um fator essencial para bactérias fotossintetizantes;
• Pode inibir o crescimento de alguns microrganismos.
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Fatores que controlam o Desenvolvimento
Microbiano – Oxigênio • O oxigênio exerce um papel decisivo no crescimento
bacteriano, já que os microrganismos reagem diferentes a sua presença.
As bactérias podem ser divididas em: • Aeróbias estritas: Necessitam de O2; • Microaerófilas: Necessitam de O2 em baixa
concentração; • Facultativas: Desenvolvem-se tanto na presença,
quanto na ausência de O2; • Anaeróbias Tolerantes: não utilizam O2; • Anaeróbias Estritas: Oxigênio é letal.
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Fatores que controlam o Desenvolvimento
Microbiano – Oxigênio
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Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato)
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Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato)
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Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato)
• Baixas concentrações de nutrientes determinam baixa velocidade de tomada de nutrientes.
• Quando as concentrações dos nutrientes estão baixas a velocidade de assimilação é que determina a velocidade específica de crescimento;
• Já quando as concentrações dos nutrientes são altas, a constante de velocidade específica independe de tais concentrações. Segundo Barbosa et al. (1999) “a velocidade máxima provavelmente é resultante da saturação dos transportadores de membrana pelos nutrientes”.
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Efeito da Concentração de Nutrientes (ou Substrato)
Macronutrientes
• Necessários em grandes quantidades;
• Tem papel na estrutura celular e metabolismo;
Micronutrientes:
• Necessários em Pequenas quantidades;
• Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas.
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Componentes Celulares
Fonte de Carbono
• Compostos Orgânicos (heterotróficos) – carboidratos, lipídeos, proteínas;
• Dióxido de Carbono (autotróficos) – a fonte de energia é a luz ou compostos inorgânicos.
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Componentes Celulares - Macronutrientes
Fonte de Nitrogênio
• É o elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, ~12%. – constitui proteínas, ácidos nucléicos, etc).
• O N está presente em moléculas orgânicas (Aminoácidos, peptídeos) e em moléculas
inorgânicas (NH3, NO3-, N2)
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Componentes Celulares - Macronutrientes
Hidrogênio
• Presente em compostos orgânicos e inorgânicos (água, sais e gases);
• Funções:
• Manutenção do pH;
• Formação de ligações de H entre moléculas;
• Fonte de energia nas reações de oxirredução na respiração.
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Componentes Celulares
Outros Macronutrientes: • P –Síntese de ácidos nucléicos, ATP; • ƒ S –Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas; • ƒ K–Atividade de enzimas; • ƒ Mg–Estabilidade dos ribossomos; • ƒ Ca–Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de
endósporos; • ƒ Na–Requerido em maior quantidade por microrganismos
marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15% de sal;
• ƒ Fe–Papel chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
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Componentes Celulares
Micronutrientes
• São necessárias quantidade muito pequenas na composição do meio de cultura : Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B.
• Função estrutural em várias enzimas;
• Nem sempre sua adição é necessária;
• Meio de Sintéticos com alto grau de pureza podem não ter esses elementos.
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Meios de Cultura
• Meios de cultura são soluções de nutrientes que promovam o crescimento dos microrganismos;
• Existem diferentes meios de cultura para os diferentes microrganismos e finalidades;
• Para se ter sucesso no cultivo de microrganismos é necessários: conhecer suas necessidades nutricionais => fornecer os nutrientes na proporção adequada.
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Meio de Cultura
• Pode ser: • Quimicamente Definidos (vendidos com os
componentes pré misturados) – pode-se usar o Agar como agente solidificante (polissacarídeo complexo de algas marinhas;) ou
• Complexos – tem maior variabilidade de acordo com o lote.
• Meios gerais (vários organismos crescem); ou • Específicos (identificação de espécies).
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Meio de Cultura
Observação:
• Os micro-organismos introduzidos em um meio de cultura para iniciar o crescimento são chamados de inóculo. Os microorganismos que crescem e se multiplicam dentro ou sobre um meio de cultura são denominados cultura.
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Meios de Cultura – Como de ser?
• Nutrientes na proporção adequada;
• Água;
• pH adequado;
• O Meio deve ser estéril – inicialmente não deve conter microrganismos vivos, assim a cultura será somente do organismos inoculado;
• Incubada em temperatura apropriada.
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Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais
• No saneamento é interessante detectar a presença de microrganismos específicos associados a doenças e para esse fim são usados meios seletivos e diferenciais;
• Os meios seletivos impedem o crescimento de bactérias indesejadas e favorecem as de interesse.
• Exemplo: o ágar sulfeto bismuto isola a bactéria da tifoide, gram negativa (Salmonella typhi), pois inibe as bactérias gram positivas e a maiorias das bactérias gram negativas intestinais.
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Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais
• Os meios diferenciais facilitam a identificação de colônias em relação as outras colônias;
• Alguns meios de cultura tem reações identificáveis com meios diferenciais em tubos ou placas. (Identificação de colônias de Streptococis pyogenes – lisam as hemácias, meio Agar sangue (contêm hemácias)).
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Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais
• Meio Diferencial
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Meios de Cultura Seletivos e Diferenciais
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Bibliografia
• MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J. Microbiologia de Brock.São Paulo: Prentice Hall, 2004.
• PELCZAR, M.J., CHAN, E.C.S., KRIEG, N.R. Microbiologia. São Paulo: Makron Books, 1996. volumes 1 e 2.
• TORTORA, G.J., FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2000.
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Perguntas
1. Quais são as etapas do crescimento microbiano? Explique cada uma delas.
2. O que são macro e micronutrientes? Porque é importante conhecer as necessidades nutricionais dos microrganismos?
3. Para que serve os meios de cultura?
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