culture in vitro des plantes
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Les techniques de culture in vitro cherchent à contrôler les facteurs de l’environnement (température, lumière, composition du milieu…) du fragment de plante mis en culture afin de l’orienter vers un programme d’évolution déterminé.TRANSCRIPT
Elaboré par : DELLAA Ahmed
Les biotechnologies végétales reposent principalement sur les
cultures in vitro.
Les applications sont nombreuses aujourd’hui tant dans le domaine de
l’horticulture que dans celui de la recherche (notamment en amélioration
des plantes), ou encore pour conserver la diversité variétale
(Conservatoires) ou sauvegarder des espèces menacées.
Les techniques de culture in vitro
cherchent à contrôler les facteurs de
l’environnement (température,
lumière, composition du milieu…) du
fragment de plante mis en culture
afin de l’orienter vers un programme
d’évolution déterminé.
Dès 1902, Haberland, un biologiste allemand, observe les potentialités
naturelles de la multiplication végétative (bouturage). Suite à ces travaux, il
énonce le premier grand principe qui ouvrira la voie de la micropropagation
des végétaux. Il s’agit du principe de la totipotence cellulaire.
En 1934, WHITE réussit la
culture de racines de tomate
sur un milieu contenant de l'
eau, des sels minéraux ,un
extrait de levure et du sucre
et une hormone végétale, la
seule connue à l’époque :
l’auxine.
En 1939, Gautheret obtient à partir
de tissu carotte, un amas de
cellules dédifférenciées : un cal.
On peut cultiver ce cal
indéfiniment dans le temps. Avec
lui démarre vraiment la
culture in vitro ("dans du verre").
Il s’agit un ensemble de méthodes faisant intervenir d'une part l'asepsie
(stérilisation du matériel, désinfection des explants) :
Autoclave: sert a la stérilisation desMilieux de culture et du matériel.
Hotte a flux laminaire : travail en condition aseptiques.
d'autre part des conditions de culture parfaitement contrôlées (milieux de
culture définis pour chaque type de plante, température, lumière,
humidité,...).
Ces méthodes s'appliquent des organes ou des fragments d’organes :
les explants.
- graine immature,
- embryon,
- ovule,
- pollen,
- bourgeon terminal,
- bourgeon axillaire,
- morceau de tige,
- morceau de feuille,
- de pétale de fleur,
- etc....
L'explant doit trouver dans le milieu de culture tout ce dont il a besoin
pour survivre, se multiplier et éventuellement régénérer un nouvel
individu, en fait, tout ce que la plante mère peut fournir :
par les racines : les éléments minéraux, l’eau ;
par les feuilles et grâce à la photosynthèse : des sucres, des
vitamines et des acides aminés ;
les hormones, pour orienter la formation des organes.
A- LES ÉLÉMENTS MINÉRAUX :
Macroéléments (g.l-1) Microéléments (mg.l-1)
(N), (Ca), (K),
(S), (Mg), (P)
(Fe), (Cu), (Zn),
(Mn), (Mo), (B)
(Cl), (Co), (Ni),
interviennent en grande
quantité 6 éléments présents
à des concentrations élevée
ne sont nécessaires à la
plante qu'en faibles
concentrations, leur rôle est
essentiel.
B) LES ELEMENTS ORGANIQUES :
sucres vitamines acides aminés
Dès lors, on ajoute
des sucres, le plus
souvent du
saccharose, aux
milieux de culture
pour fournir à l'explant
une source de
carbone.
L'emploi de diverses
vitamines favorise
fréquemment le
développement des
cultures in vitro
Il a parfois été observé
que l'apport d'acides
aminés favorisait la
prolifération.
C) LES REGULATEURS DE CROISSANCE.
Appelés généralement , ils induisent les
phénomènes de croissance et de néoformation des organes.
On trouve ces substances de croissance naturellement dans toutes
les plantes.
hormones végétales
Les hormones utilisées sont principalement : les auxines*, les
cytokinines*, car ces hormones sont capables d’orienter les
explants vers la formation de nouveaux organes.
* En effet, en 1934, on découvre l’auxine (AIA) :il faut 100 kg de maïs immature pour obtenir 500 mg d’AIA. Cette substance naturelle est principalement synthétisée dans les parties apicales et agit sur l’élongation des cellules donc sur la croissance des plantes.
* Les cytokinines ont été découvertes par le biais de la culture in vitro en 1956. Ce groupe de substances de croissance végétales est responsable des divisions cellulaires. Les cytokinines sont principalement synthétisées dans les parties racinaires jeunes.
Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture.
Notion de balance hormonale
Cytokinines bourgeons
Auxine formation de racines
[ ] égales division cellules indifférenciées
En 1962, Murashige et Skoog étudient la multiplication végétative
du tabac et mettent au point le premier milieu de base pour la culture in
vitro. Ce milieu contient des sels minéraux, des sucres, des vitamines B,
des auxines et des cytokinines.
Ce milieu rend possible la culture et la prolifération de méristèmes
de tiges jusqu’alors réfractaires à la multiplication végétative in vitro.
La mise en œuvre
Multiplication in vitro
Acclimatation
4 étapes de culture
Enracinement
SAUVEGARDE DES ESPECES EN DANGER.
EXEMPLE : LES PLANTES CARNIVORES.
MULTIPLICATION D’ESPECES DIFFICILES A OBTENIR
PAR DES METHODES TRADITIONNELLES.
Enfin, les cultures in vitro permettent de mettre plus
rapidement sur le marché les plants certifiés, les
nouvelles créations, ou encore d'assainir des collections.
Obtention de clones sélectionnés pour leur vigueur, leur caractères
intéressants (Chrysanthème, Fraisier, Bananier), leur rareté (Orchidées)
Assainissement des végétaux (plantes sans virus)
Production rapide et en masse, à n'importe quel moment de l'année
Raccourcissement des cycles de développement
Diminution des coûts de production (peu de personnel) et des dépenses
énergétiques ( réduction des surfaces de culture et éclairement réduit)
Facilité de stockage et conservation (au froid) de millions de plantes sur de
très petites surfaces, à l'état sain et à l'abri des contaminations
Production de substances biochimiques intéressantes pour
l'industrie
Meristème
Apex caulinaire
Nœud
Culture de méristème
EnracinementPlantules
Tige feuillée
Morphogenèse indirecte
Callogenèse
cal
Suspensions cellulaires
Caulogenèse indirecte
Embryogenèse somatique indirecte
Morphogenèse directe
Caulogenèse directe
Embryogenèse somatique directe
Semences artificielles
D’après Lindsey et Jones 1989
Explants divers (racines, tige, feuilles…)
Les embryons obtenus après la fécondation peuvent être prélevés, mis en
culture in vitro et donner un nouvel individu. Le sauvetage d'embryons
consiste à prélever un embryon précocement, pour le cultiver in vitro, soit
pour accélérer les cycles végétatifs, soit parce qu'il ne pourrait pas se
développer dans les tissus maternels, par exemple lorsqu'il résulte d'un
croisement interspécifique.
Le processus d'haplodiploïdisation comprend l'obtention de plantes
haploïdes à partir des organes porteurs des cellules
reproductrices, appelés gamétophyte mâle ou femelle, et le retour vers
la phase diploïde.
La propriété la plus importante des protoplastes
est leur capacité à fusionner entre eux lorsqu'ils
sont placés dans un milieu approprié. Cette
technique permet de surmonter les barrières
liées à la reproduction sexuée et de créer de
nouvelles combinaisons entre noyau et
cytoplasme.
Du fait de l'absence
de la paroi
pectocellulosique,
l'introduction directe
de l'ADN dans les
cellules est facilitée.
Le transfert d'un gène précis.
Elle permet de transférer le seul gène désiré et non de
transférer plusieurs gènes comme lors de la
reproduction sexuée.
Une source de gènes étendue.
On peut franchir la barrière des
espèces, des genres et des
règnes. Ainsi, il est possible
d'introduire des caractères qu'il
ne serait pas possible
d'introduire par sélection classique.
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène d'intérêt
La première étape est
l'identification d'un caractère
que l'on veut introduire dans
la plante, comme par exemple
des caractères de qualité
nutritionnelle, la résistance à
certains insectes, à certaines
maladies, à des
herbicides, etc. Le gène
d'intérêt peut provenir de tout
organisme
vivant, plante, animal ou
bactérie puisque le code
génétique est universel.
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène d'intérêt
Il doit ensuite être isolé de
l'organisme donneur. Il est
intégré dans une construction
génétique associant souvent
un gène marqueur. Ce gène
marqueur permet de
sélectionner les cellules qui
ont intégré le gène d'intérêt.
La construction est ensuite
multipliée (clonée) afin de
disposer d'une quantité
suffisante d'ADN pour son
introduction dans les cellules
végétales que l'on veut
transformer.
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Transférer le gène
La transformation biologique
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Transférer le gène
La transformation biologique.
La transformation génétique est
réalisée en mélangeant une
culture d'une souche
d'Agrobacterium transformée,
mise en suspension en milieu
liquide, avec des explants de la
plante, on parle de coculture.
C'est au cours de cette étape
que la construction génétique
introduite dans la bactérie est
transférée dans le génome de la
plante.
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Transférer le gène
La transformation biologique.
La coculture est lavée pour
éliminer les agrobactéries. Il faut
ensuite sélectionner les cellules
qui sont effectivement
transformées.
Pour cela, on apporte dans la
culture des explants un agent
sélectif approprié : herbicide,
antibiotique ... Seules les
cellules végétales transformées,
c'est-à-dire celles possédant et
exprimant le gène marqueur de
sélection, soit de résistance à un
herbicide, soit de résistance à
un antibiotique, pourront se
développer.
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Transférer le gène
Le transfert direct.
Des méthodes dites de transfert direct utilisent des moyens physiques ou chimiques pour permettre la pénétration d'ADN, généralement sous forme de plasmides dans une cellule végétale. Les plus utilisées sont la biolistique et le transfert sur protoplastes.
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Régénérer et évaluer les plantes transformées
Après sélection des cellules
transformées, il faut régénérer les
nouvelles plantes transgéniques.
Les cellules transformées se
développent d'abord en
cals, larges amas de cellules
indifférenciées. Après quelques
semaines, on observe le
développement de pousses. Elles
sont alors placées dans un
nouveau milieu de culture
permettant le développement des
racines. Quand les racines sont
suffisamment développées, les
plantules sont repiquées en pot et
acclimatées en serre.
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Régénérer et évaluer les plantes transformées
Les cellules transformées est une
étape difficile à maîtriser. Aussi,
le génotype, le type de tissus et
les conditions de culture sont
choisis en fonction de leur
aptitude à la régénération.
Les plantes régénérées sont
ensuite analysées pour confirmer
l'insertion de la construction
génétique dans leur génomea
régénération in vitro des.
Etape 1 Etape 2 Etape 3 Etape 4
Incorporer dans une variété commerciale
Les plantes transformées
obtenues sont soumises à
des croisements contrôlés
pour étudier les modalités
de transmission du nouveau
caractère à la descendance.
