3. BIOTEHNOLOGIA ANTIBIOTICELOR

3.1. Consideraii generale Antibioticele formeaz o grup important de medicamente cu toxicitate selectiv, inhibnd, n concentraii foarte mici, unele procese metabolice din celula microbian sau producnd adevrate ruperi, ale acesteia, fr a fi nocive pentru celulele gazd. Se cunosc antibiotice produse de microorganisme i plante superioare, dar importan terapeutic au cptat numai unele din antibioticele produse de microorganisme. Dup descoperirea microbilor de ctre Pasteur, s-a observat c organismele inferioare se apr de alte microorganisme prin utilizarea intensiv a substanelor nutritive, prin modificarea pH-ului, a tensiunii superficiale etc., sau elabornd anumite substane chimice nocive. Acest fenomen este numit antibioz, iar substanele rezultate din metabolismul organismelor antagoniste poart numele de antibiotice. Primul care a sugerat, n 1885, ideea c prin antagonism se produc substane chimice cu aciune inhibant asupra microorganismelor, a fost savantul romn Victor Babe. El a remarcat i faptul c aceste substane pot fi folosite n terapeutic pentru distrugerea agenilor patogeni, purttori ai bolilor infecioase. Introducerea n practica medical a antibioticelor cu un spectru larg de aciune i cu poten nentlnit constituie cea de a doua etap extrem de important, dup introducerea sulfamidelor (1935), n dezvoltarea chimioterapiei. De la descoperirea n 1928 de ctre Fleming a penicilinei, primul antibiotic utilizat n terapeutic, cercetrile n acest domeniu au luat o extindere considerabil, izolndu-se pn astzi aproape 2500 substane active, din care 60 au cptat aplicare practic. Antibioticele se aplic n medicina uman i veterinar ca mijloace antiinfecioase, bacteriene, n combaterea bolilor virale i canceroase, precum i n unele afeciuni de natur neinfecioas. n afar de aceasta, antibioticele i-au gsit utilizarea n zootehnie, agricultur i pomicultur. Producia mondial de antibiotice a nceput n 1943 cu fabricarea pe cale biochimic a penicilinei i a continuat s se extind, ajungnd astzi la peste 12 000 t anual. n ara noastr fabricarea industrial a antibioticelor a nceput n anul 1955, iar n prezent se fabric o gam destul de larg de antibiotice a cror producie se cifreaz la aproximativ 100 t anual. Astzi, n cadrul industriei chimice, industria antibioticelor de biosintez reprezint o ramur productiv deosebit de important, iar dezvoltarea, modernizarea, automatizarea i optimizarea tehnologiilor de fabricaie asigur integral nevoile interne de antibiotice i ofer pentru export aproape o treime din producia realizat. La ridicarea productivitii tehnologiilor de biosintez din ara noastr un aport substanial au adus i specialitii de la ntreprinderea de antibiotice Iai, a

46

cror contribuii originale sunt concretizate n peste 35 de invenii, dintre care o parte au fost brevetate i n strintate. 3.2. Definiia i sursele de antibiotice Prima definiie a antibioticelor a fost dat n 1944 de Waksam, dup care, orice substan chimic produs de microorganisme i care distruge sau inhib nmulirea bacteriilor i a altor organisme, este denumit antibiotic. Aceast definiie a fost considerabil modificat, deoarece cloramfenicolul izolat mai nti (1947) din Streptomyces Venezuelae se obine acum prin sintez, iar penicilinele noi se obin prin semisintez. Astzi, prin antibiotic se nelege un compus chimic elaborat de un microorganism sau obinut prin sintez care, n doze foarte mici, inhib dezvoltarea microorganismelor patogene. Din numrul total de antibiotice naturale i substane asemntoare descrise pn n prezent, 98% sunt produse de plante i microorganisme i numai 2% sunt produse de tulpini animale ca protozoare, molute, insecte sau forme superioare ale organismelor animale. Dintre antibioticele adevrate 68% sunt produse de microorganisme aparinnd actinomicetaceelor, 12% de schizomicete i 20% de diferite specii de eumicete. n clasa schizomicetelor 85% din antibiotice sunt produse de actinomicetale i 15% de eurobacteriale. Din clasa ascomicetelor familia aspergilaceelor este cea mai important, ea producnd 78% din cantitatea total de antibiotice provenite din fungi. Cercetrile asupra antibioticelor din fungi, au ocupat un loc important ntre anii 1945 - 1950 i aceasta ca rezultat al valorii terapeutice ridicate a penicilinei, iar dup 1950 s-au intensificat cercetrile asupra antibioticelor produse de actinomicete. n ultimul timp numrul antibioticelor a crescut i este de ateptat o cretere i mai mare n viitorul apropiat,datorit extinderii cercetrilor asupra ascomicetelor, bazidiomicetelor i adelomicetelor, insuficient studiate pn n prezent. 3.3. Clasificarea antibioticelor Numrul foarte mare de antibiotice cunoscute pn n prezent a pus problema clasificrii acestor produse. S-au propus mai multe criterii de clasificare funcie de originea microorganismului productor, structura chimic a antibioticelor i aciunea antibacterian. Cu toate c fiecare metod folosit la clasificare este susceptibil la anumite critici, clasificarea antibioticelor se va face funcie de originea microorganismelor productoare, structura chimic a antibioticelor, biogeneza i aciunea lor farmacologic. a) Dup originea microorganismului productor, antibioticele se clasific n urmtoarele grupe: - antibiotice produse de bacterii: gramicidina, gramidina S, bacitracina, polimixinele etc.; - antibiotice produse de actinomicete: streptomicina, cloromicetina, tetraciclina, neomicina, kanamicina, nistatina, actinomicina etc.; - antibiotice produse din fungi: penicilina, grizeofulvina.

47

Clasificarea n funcie de originea microorganismului productor nu este concludent, deoarece este cunoscut faptul c acelai microorganism poate produce mai multe antibiotice diferite ca structur i proprieti fiziologice. b) Dup constituia chimic, antibioticele se clasific n urmtoarele grupe: - antibiotice cu structur alifatic: alicina; - antibiotice cu structur aromatic: acidul gladiolic, cloramfenicolul (cloromicetina); - antibiotice cu structur chinonic: fumigatina, ftiocolul; - antibiotice cu cicluri de furan i piran: acidul penicilic; - antibiotice heterociclice cu azot n molecul: acidul aspergilic, acidul hidroaspergilic; - antibiotice heterociclice cu azot i sulf n molecul: penicilinele; - antibiotice cu structur polipeptidic: gramicidina; - antibiotice cu structur complex: macrolidele; - antibiotice cu structur nedeterminat: viomicina. Clasificarea dup structura chimic ofer posibilitatea formrii unor grupe, care elucideaz legtura dintre constituia chimic i proprietile antibacteriene. c) Dup biogenez, antibioticele se clasific n urmtoarele grupe: - antibiotice derivate din aminoacizi sau din uniti asemntoare: oxamicina, azaserina, cloramfenicolul, penicilinele, bacitracinele, actinomicinele; - antibiotice derivate parial sau total din acetat: grizeofulvina, tetraciclinele, grupul macrolidelor, antibiotice polienice; - antibiotice derivate din glucide simple: streptomicina, kanamicina, neomicina; - antibiotice diverse: novobiocina, vancomicina. Clasificarea dup genez permite explicarea mai uoar a mecanismului biochimic de formare a antibioticelor. d) Dup aciunea farmacologic, antibioticele se clasific n urmtoarele grupe: - antibiotice cu aciune antibacterian; - antibiotice cu aciune antituberculoas; - antibiotice cu aciune antivirotic; - antibiotice cu aciune anticanceroas; - antibiotice cu aciune antifungic; - antibiotice cu aciune antiprotozoarian. Prin urmare, antibioticele nu exercit aceeai aciune antimicrobian asupra tuturor germenilor patogeni; ele au spectru antibacterian caracteristic, determinat de rezistena specific a microorganismelor patogene. 3.4. Metode de determinare a activitii antibioticelor nainte de a prezenta metodele generale de determinare a activitii antibioticelor, trebuie subliniat faptul c exprimarea coninutului n antibiotic se face n uniti gravimetrice sau uniti internaionale de activitate. Aceste sisteme de uniti sunt folosite att n tehnologia de fabricaie ct i n terapeutic.

48

Unitatea internaional de activitate, stabilit dup descoperirea penicilinei sodice, reprezint cantitatea minim de antibiotic pur, necesar pentru a nhiba o cultur de 18 ore de stafilococ auriu n 50 ml bulion. Pentru cteva antibiotice, mai uzuale, corespondena dintre unitile internaionale de activitate i concentraia gravimetric, precum i activitile standard i cele ale produselor comerciale sunt prezentate n tabelul 3.1. Tabelul 3.1. Corespondena dintre unitile gravimetrice i cele internaionale ale ctorva antibiotice Nr. crt . 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Denumire a antibiotic ului Penicilin G Penicilin V Streptomic in Dihidrostre ptomicin Tetraciclin Clortebraci clin Oxitetracicl in Eritromicin Polimixin Greutatea corespunzt oare pentru IUL, mg 5,98 10-4 5,90 10-4 12,80 10-4 13,16 10-4 10,0 10-4 11,0 10-4 11,1 10-4 10,53 10-4 1,27 10-4 Activitatea standard Ui/mg 1670 1965 780 760 980 990 990 950 7874

n practic, producia de antibiotice se exprim n uniti gravimetrice (kg sau t), iar n fazele tehnologice randamentele se exprim n uniti internaionale (UI). Activitatea antibioticelor poate fi determinat cantitativ prin urmtoarele grupe de metode: a) metode microbiologice; b) metode chimice; c) metode fizico-chimice. Metodele microbiologice au avut importan prioritar n prima perioad a dezvoltrii industriei de biosintez. Cauza principal a acestei prioriti se explic prin faptul c la nceput numeroase antibiotice nu au putut fi obinute dect sub form de produse brute, iar analiza microbiologic era singura n msur s furnizeze date asupra eficienei terapeutice. Odat cu dezvoltarea industriei de antibiotice i cu creterea puritii preparatelor antibiotice, au nceput s fie aplicate, tot mai mult, metodele chi-

49

mice i fizico-chimice de analiz. Datorit simplitii i rapiditii lor, aceste metode sunt preferate metodelor microbiologice n controlul operativ al procesului de fabricaie. Metodele microbiologice sunt laborioase, dureaz mult, iar precizia lor este inferioar metodelor fizico-chimice (eroarea n cazul tetraciclinelor este de peste 10%). De asemenea, metodele microbiologice nu pot identifica un anumit antibiotic dintr-un amestec. Cu toate acestea, metodele microbiologice sunt de nenlocuit n caracterizarea activitii antimicrobiene a unor antibiotice n care se gsesc produi secundari (inactivi biologic), foarte apropiai din punct de vedere structural. Metodele chimice i fizico-chimice sunt recomandate n prezent ca metode oficiale de identificare i dozare a antibioticelor. Pentru identificarea antibioticelor se folosesc reacii specifice, metode cromatografice i metode spectroscopice n U.V. i I.R., iar pentru dozarea activitii se folosesc metode titrimetrice n U.V. i I.R., electrochimice, cromatografice, polarimetrice i colorimetrice. Descrierea acestor metode depete tematica lucrrii, ea fiind prezentat detaliat, pentru fiecare antibiotic, n publicaiile de specialitate. 3.5. Biotehnologia fabricrii antibioticelor n acest paragraf se vor prezenta numai problemele tehnologice comune tuturor proceselor de obinere a antibioticelor, iar n capitolele urmtoare se vor prezenta aspectele specifice fiecrei tehnologii printre care: mecanismul de biosintez, parametrii fermentaiei, influena diferiilor factori asupra procesului de biosintez i separarea produselor biosintetizate. Tehnologiile de obinere a produselor de biosintez au comun procesele de pregtire i sterilizare a mediului, sterilizarea aerului, fermentaia i filtrarea biomasei. Mediile de cultur se prepar, conform reetelor de fabricaie, n instalaii special destinate acestui scop sau direct n fermentator. Dac cantitatea de mediu este mic, ca n cazul mediului nutritiv din fermentatorul de inoculare, atunci prepararea i sterilizarea lui pot fi realizate direct n fermentator. Sterilizarea fermentatorului, a rcitorului, a liniei de inoculare i transvazarea biomasei, precum i sterilizarea filtrelor de aer se face cu abur la 5 ata, timp de 1 or, la 125 - 130C. Sterilizarea lichidului antispumant din vasul 4 (fig. 3.1) se face prin nclzire cu abur, care circul prin serpentina interioar, timp de 3 - 4 ore. Umplutura filtrelor (vat de sticl) trebuie schimbat lunar, pentru a avea garania unei sterilizri perfecte a aerului tehnologic. De asemenea, umplutura filtrelor se schimb ori de cte ori apar infecii repetate. Dup schimbarea ncrcturii, filtrele se sterilizeaz cu abur direct la 1,5 - 2 at, timp de 1 - 2 ore, apoi se sufl aer steril pn la ndeprtarea total a umiditii. n instalaia de fermentaie astfel sterilizat, se introduce inoculul dup care este pus n funciune sistemul de agitare i aerare. Fermentaia se realizeaz n trei stadii (inoculator, intermediar, regim), iar transvazarea biomasei dintr-un fermentator n altul se face printr-un sistem steril.

50

Fig. 3.1. Schem de principiu a instalaiei de fermentaie: 1 - inoculator; 2 - filtru de aer; 3 - fermentator intermediar; 4 - vas cu lichid antispumant; 5 - fermentator de regim; 6 - pomp Pentru marea majoritate a tehnologiilor de biosintez temperatura, aeraia, agitarea i pH-ul au valori foarte apropiate. Astfel, temperatura optim a proceselor de biosintez este de 26 - 28C i se menine prin rcire n manta i serpentin. Deoarece procesele de fermentaie sunt exoterme, problema grea care apare n proiectarea i construcia fermentatoarelor este asigurarea unui regim uniform de rcire n toat biomasa. Aeraia este un alt parametru comun tuturor tehnologiilor de biosintez aerob i care influeneaz hotrtor asupra randamentelor n faza de fermentaie. Asigurarea unui regim optim de aeraie pe toat durata procesului se realizeaz prin folosirea unui debit de aer de un litru pentru un litru mediu pe minut. Acest coeficient de aerare este aproximativ acelai att n fermentatoarele de mare capacitate, ct i n cele de inoculare i este nsoit de un intens regim de agitare la un pH cuprins ntre 6 i 6,5 pentru faza de cretere a masei celulare i ntre 6,8 - 7,5 pentru faza de biosintez a principiilor active. O problem important n dirijarea procesului de biosintez este reglarea spumrii. Administrarea unei cantiti mari de aer n lichidul de cultur, prezena n mediu a unor substane tensioactive, a particulelor coloidale i a suspensiilor, mresc rezistena bulelor de aer i prin aceasta favorizeaz producerea spumrii. Adeseori procesul de formare a spumei este att de intens nct stnjenete desfurarea normal a fermentaiei, favoriznd apariia infeciilor n lichidele de cultur. Pentru distrugerea spumei se folosesc substane chimice i dispozitive mecanice. Dintre substanele chimice se remarc efectul antispumant deosebit al uleiului vegetal, al grsimii de caalot, al uleiului de silicon i al polimerului oxipropilenic. n fermentaie se folosete curent uleiul vegetal care ofer rezultate acceptabile.

51

Intensificarea procesului de distrugere a spumei se poate realiza prin utilizarea unor separatoare mecanice de spum cu talere rotative (fig. 3.2).

Figura 3.2. Separator mecanic de spum tip CHEMAP 1 tu ieire aer; 2 presetup; 3 dispozitiv de fixare; 4 garnitur de etanare; 5 presetup; 6 canale de separare centrifugal a aerului din spum (canale de spargere a spumei); 7 intrarea spumei n separator; 8 talere rotative de spargere a spumei; 9 orificii de ieire a aerului; 10 axul separatorulu; 11 fermentator; 12 rotor cu diferenial; 13 motor electric. Acest dispozitiv const dintr-o serie de talere conice de absorbie a spumei, montate pe un rotor tubular acionat mecanic. Efectul de distrugere a spumei este mrit de prezena unor icane radiale n talere. Gazele sunt evacuate prin axul rotorului, iar soluia apoas returnat n zona de fermentaie. Numrul mare de parametri i limitele de variaie foarte restrnse impun automatizarea complet a controlului i reglrii lor. Pentru realizarea procesului de fermentaie discontinuu au fost propuse diferite tipuri constructive de fermentatoare, printre care fermentatorul cilindric vertical cu agitator turbin, serpentine de rcire i barbotor de aer (figura 3.3.), utilizat curent n tehnologiile de biosintez.

52

Figura 3.3. Schema fermentatorului discontinuu 1 fermentator; 2 manta de rcire; 3 serpentine de rcire; 4 barbator; 5 agitator turbin; 6, 9 tu de admisie a agentului de rcire; 7, 8 tu de ieire a agentului de rcire; 10 tu de admisie a aerului Pentru fermentaiile n flux continuu se experimenteaz n faz de laborator sistemul de fermentatoare tubulare cu agitare prezentat n figura 3.4.

Figura 3.4. Schema fermentaiei continue pe dou fermentatoare tubulare cu agitare legate n serie: 1 sterilizator; 2 rcitor; 3, 4 fermentator tubular cu agitare; 5, 6 separator parial de mas celular; 7 sistem de pompe pentru recircularea sterila masei celulare Fermentatorul tubular cu agitator orizontal (figura 3.5.) este considerat cel mai convenabil pentru procesele aerobe, deoarece ofer o eficacitate deosebit a aeraiei. n procesul de fermentaie discontinu se recomand ca nainte de transvazare din inoculator n intermediar i de aici n regim, biomasa s se

53

menin cteva ore la parametrii procesului din faza urmtoare, pentru a evita unele stagnri n procesul de cretere sau biosintez.

Figura 3.5. Schema fementatorului tubular cu agitare: A rotorul agitatorului; B fermentatorul tubular; C spaiu tubular pentru rcire; D dispozitiv de etanare i ghidare a axului agitatorului; E axul agitatorului; 1 tu intrare mediu; 2 tu intrare aer; 3 - tu intrare lichid antispumant; 4 tu ieire mediu fermentat; 6 - tu de recirculare a mediului fermentat; 7 - tu pentru aparate de msur (T, pH etc.). Schema simplificat a unui proces de fermentaie este exemplificat prin fluxul tehnologic de fabricaie a penicilinei, G reprezentat n figura 3.6.

54

Figura 3.6. Schema instalaiei de biosintez i separare a penicilinei G sare de potasiu: 1 vas depozitare extract de plumb; 2 pomp cu roi dinate; 3 vas depozit extract de porumb; 4 cad pentru cntrire; 5 vas pregtire mediu pentru inoculator; 6 vas soluie NaOH; 7 vas de msur NaOH; 8 vas de pregtire a mediului pentru intermediar; 9 vas pentru zahr; 10 vas pregtire mediu pentru regim; 11 pomp centrifug; 12a coloan de sterilizare a mediului pentru fermentatorul de regim; 12b coloan de sterilizare a mediului pentru fermentator intermediar; 13, 13a - menintor; 14, 14a rcitor; 15 inoculator; 16a, 16b, 16c filtru pentru aer; 17 fermentator intermediar; 18 fermentator de regim; 19 vas cu lichid antispumant; 20 pomp centrifug; 21 filtru tambur cu vid; 22 vas pentru lichid filtrant; 23 pomp centrifug; 24 rcitor tubular; 25 vas colector soluie nativ; 26 pomp; 27 vas colector soluie nativ; 28 vas reintor de picturi; 29 vas tampon de vid; 30 pomp de vid; 31 pomp; 32 vas msur H2SO4; 33 vas acetat de butil; 34 vas msur cetazol; 35a, 35b, 35c extractor Podbielniak; 36 vas neutralizare ape; 37 vas acetat de butil; 38 vas de soluie fosfat-carbonat; 39 vas cu soluie de fosfat-monopotasic; 40 vas de msur H2SO4; 41 vas acetat de butil; 42 vas acetat de butil concentrat; 43 vas ngheare decolorare; 44 filtru; 45 vas colector concentrat; 46 druk filtru; 47 filtu Seitz; 48 vas de precipitare; 49 vas soluie alcoolic de acetat de potasiu; 50 filtru nuce; 51 vas culegere soluie mum; 52 vas msur butanol; 53 vas msur cloroform; 54 vas de splare penicilin; 55 filtru nuce; 56 vas culegere butanol; 57 vas culegere cloroform; 58 usctor cu pat fluidizat.

55

3.6. Biotehnologia de obinere a penicilinelor G i V Penicilinele constituie un grup de antibiotice, obinute prin biosintez sau semisintez, caracterizate printr-un larg spectru bacteriostatic i bactericid n faza de multiplicare logaritmic a germenilor patogeni. Aciunea penicilinelor este complex; ele mpiedic ncorporarea unor factori n membrana bacterian, ducnd la multiple tulburri de nutriie i metabolism bacterian. Deoarece majoritatea penicilinelor, mai ales cele naturale, sunt inactivate de penicilinaz i acilaz, se impune gsirea unor peniciline cu rezisten i aciune ridicat. Penicilinele ideale" ar trebui s posede un larg spectru antibacterian, stabilitate n mediu acid, rezisten la penicilinaz, stabilitate n soluie, absorbie rapid i s nu produc hipersensibilitate la administrare. Cu toate c nu se cunosc, deocamdat, peniciline care s satisfac toate exigenele, ele dein totui supremaia n practica medical, datorit att proprietilor terapeutice nsoite de toxicitate redus, ct i apariiei penicilinelor de semisintez, despre care se poate spune c au deschis epoca de aur a penicilinelor. 3.6.1. Peniciline de biosintez Penicilinele de biosintez sunt substane chimice produse de diferite specii de microorganisme, din clasa Penicillium i Aspergillus printre care: P. crysogenum, P. notatum, P. crustosum, A. niger, A. giganteus, A. flavus etc. Aceste substane sunt neomogene din punct de vedere chimic, fiind formate din cteva peniciline care au comun sistemul biciclic tiazolidin- -lactamic i care difer ntre ele prin structura catenei laterale i activitate anti-bacterian. Penicilinele sunt acizi monobazici puternici (pK = 2,72,76) cu urmtoarea structur general: S 1 CH3 2C R CO NH CH CH 5 6 CH3 O C7

N

4

3

CH

COOH

Denumirea tipurilor de peniciline separate din lichidul de cultur, activitate antibacterian i structura catenei laterale sunt prezentate n tabelul 3.2. Tabelul 3.2. Denumirea, structura i activitatea penicilinelor naturale Nr. crt . 1. 2. Denumirea penicilinei Penicilina F Penicilina dihidro F (Acid Structura radicalului CH3-CH2-CH = CHCH2 CH3-CH2-CH-CH2CH2 Denumirea radicalului 2-pentenil n-amil Activitatea UI/mg sare Na 1500 1670

56

3. 4. 5. 6. 7.

gigantic) Penicilina G Penicilina X Penicilina K Penicilina V Penicilina O

C6H5 - CH2 HO-C6H4 -CH2 CH3-(CH2)5-CH2C6H5-O-CH2CH2 = CH-CH2-SCH2-

benzil p-hidroxibenzil n - heptil fenoximetil alilmercaptometil

1667 900 2 300 1630 -

n terapeutic se folosesc numai penicilinele G i V sub form de sruri de sodiu, potasiu, calciu, trietilamin i novocain (procain-peniciline). Fenoximetilpenicilina (penicilina V) se utilizeaz i sub form de acid liber. 3.6.2. Proprietile fizice ale penicilinelor G i V Benzilpenicilina (penicilina G) este o substan alb, cristalin care se topete la 80C i se descompune la 87oC, solubil n ap i solveni organici. Avnd 3 atomi de carbon asimetrici (3,5,6) benzilpenicilina este optic activ cu [ ] D 23 = + 241. Principalele proprieti fizice ale srurilor benzilpenicilinei sunt prezentate n tabelul 3.3. Tabelul 3.3. Proprietile fizice ale srurilor benzilpenicilinei Metalul sau amina din sare Sodiu Potasiu Trietilamin Novocain N. etilpiperidin Temperatur a de topire, C 215 (cu desc.) 214-217 (cu desc.) 145 147 (cu desc.) 129 130 (cu desc.) 167 168 (cu desc.)

[] D+301 + 285 + 214 + 173 + 238

Condiiile determinrii Temperatura, Solven Concentraii, C t % 24,8 22 21,5 25 25 ap ap tampon fosfat 1% aceton 50% ap 2,0 0,784 0,22 0,1

Dintre srurile prezentate cele mai importante sunt srurile de sodiu i potasiu caracterizate printr-o bun solubilitate n ap, metanol i etanol; mai greu solubile n izo-propanol, butanol normal i teriar, cetone, dioxan i piridin. Solubilitatea srii de sodiu i potasiu n solveni organici crete foarte mult atunci cnd solventul conine mici cantiti de ap. Dependena dintre solubilitatea srii de sodiu sau potasiu i cantitatea de ap din solvent este utilizat n recristalizare; sarea solvit n solvent cu 10% ap este recristalizat

57

prin adugare de solvent anhidru. Solubilitatea srii de sodiu n solveni coninnd diferite cantiti de ap este redat n tabelul 3.4. Tabelul 3.4. Solubilitatea benzilpeniciline sodice n amestec ap solvent Solvent Aceton Aceton Aceton Aceton Metiletilceton Dioxan Alcool n butilic Coninutul de Temperatura, ap n o C solvent % 0 0 0,5 0 1,0 0 2,0 0 0 0 0 14 0 0 Solubilitatea, mg la 100 ml solvent 6,0 15,6 31,0 100,0 2,4 15.0 81,0

Este interesant de remarcat c ntre +25 i -78C solubilitatea n aceton a srurilor benzilpenicilinei cu sodiu, potasiu i amoniu crete o dat cu scderea temperaturii. Fenoximetilpenicilina (penicilina V), spre deosebire de benzilpenicilina, fiind stabil n mediu acid se poate obine fie sub form de acid, fie sub form de sare. Sub form acid, fenoximetilpenicilina este o substan incolor, crista20 lizat n diverse forme, avnd p.t. 118 - 120oC i [ ] D = + 193. Principalele proprieti fizice ale srurilor fenoximetilpenicilinei sunt prezentate n tabelul 3.5.

Tabelul 3.5. Principalele proprieti fizice ale srurilor fenoximetilpenicilinei Metalul sau amina din sare Sodiu Potasiu Amoniu Novocain Temperatura de topire (cu desc.), C 220 228 256 260 115 125 70 - 72

[ ] D

20

+ 222 + 223 + 236 + 140

Condiiile determinrii Temperatura, Solven Concentraii, C t % 20 ap 1 20 ap 1 20 ap 1 20 ap 1

3.6.3. Structura penicilinelor Din studiile ntreprinse cu metode chimice i fizico-chimice, ndeosebi cu ajutorul razelor X, s-a demonstrat c penicilinele au comun un sistem biciclic tiazolidin- -lactamic, care rezult prin nlnuirea biogenetic a 2 aminoacizi i anume l-cistein i d valin. Structura molecular a penicilinelor este:

58

1 - Cistein

S6

d - Valin2C

R

C O

NH H

C C7

C N4

5

1

CH3 CH3 COOH

H

3

C H

O

Ciclu lactamic Grupa catenei laterale

Ciclu tiazolidinic

Nucleu de penicilin (acid 6 - amino - penicilanic)

Structura bicliclic tiazolidin- -lactamic este mai sensibil dect structura - lactamic simpl la aciunea agenilor nucleofili, electrofili i oxidani. Toate penicilinele sunt extrem de sensibile la atacul nucleofil al ionilor de hidroxil, amine, etc. (schema 1). Produsul iniial rezultat prin hidroliza penicilinelor este acidul penicilic (I) biologic inactiv. Acesta este stabil n soluii neutre numai sub form de sruri sau esteri; la acidulare pierde uor o molecul de CO2 trecnd n acidul peniloic (II) corespunztor, iar n anumite condiii de reacie acidul penicicloic poate trece i n acid penamaldic (III). Penicilina reacioneaz nucleofil cu hidroxilamin, alchil amine, alcooli, hidrai de carbon, glicooli, formnd acizi hidroxamici (IV), alchilamide (V) i esteri (VI). De asemenea, ionii metalici i -lactamazele catalizeaz reacia de hidroliz a penicilinelor la acizi peniciloici. Produii finali de degradare hidroxilic a penicilinelor sunt: peniloaldehidele (VII), CO2 i penicilamina (VIII).

59

S R C NH O O CH CH C NH OH I S R C NH CH2 CH O NH II C(CH3)2 C(CH3)2 CH COOHOH

S R C NH O ONH

CH CH C N

C(CH3)2 CH COOH

- CO2

SH- OH

2

OH

R C NH O O

C C

CH NH OH

C(CH3)2 CH COOH III

CH COOH

R C NH O

S CH2+

CH

O

R CO

NH HON

CH CH C O IV NH

C(CH3)2 CH COOH

VIICO2+

CH3 C CH3

CH COOH VIII

SH NH2

S R C NH CH CH OCu2+

C(CH3)2 CH COOH I

C O

S R C NH CH CH O O C N C(CH3)2 CH COOH

b et

a

H 2O z ma cta -l a

NH OH S

R'OHR' -N

R C NH CH CH OH

C(CH3)2 CH COOH

C OR'' O

NH VI

2

S R C NH CH CH O HSchema I Penicilinele sunt sensibile i la atacul electrofil att la azotul -lactamic ct i la atomul de sulf (schema 2). n mediu puternic acid penicilinele

C(CH3)2 CH COONH3+R'

C NR' O V

NH

60

izomerizeaz la acid penilic (IX) printr-un mecanism implicnd structura de tranziie oxazolonic (X), iar n mediu slab acid, prin aceeai structur de tranziie, se transform n acid penicilinic (XI) care izomerizeaz rapid n acid peniciloic sau penilic. Ionii metalici atac atomul de sulf al ciclului tiazolidinic, transformnd acidul penilic n penicilamin.S R C NH CH CH O C O COOH CH N R C CH NH+

C CH

CH3 CH3

N

COOH S HC CH C O NH C CH

H+

S C

N CH3 R C H O

CH3OH- ' R C CH3

S NH CH CH C O NH OH I C CH

CH3 CH3

CH3 CH COOHHgCl2

IX

COOH X SH CH3

O

COOH

CH3 CH3

H+N R C O C C CH

HO-

C

CH COOH

C

SH NH2 VIII

CH3 NH CH COOH O XI

Schema 2Faptul c penicilamina se formeaz la hidroliza oricrui tip de penicilin demonstreaz c aceasta reprezint un element structural comun tuturor penicilinelor. Al doilea component al degradrii avansate a penicilinelor este peniloaldehida care cuprinde catena lateral i este specific tipului de penicilin supus hidrolizei. Multe din proprietile fizice, chimice i biologice sunt influenate de structura catenei laterale. Dac n catena lateral a penicilinelor se introduce o grupare electronatrgtoare se constat o cretere a stabilitii n mediu acid. S-au obinut corelaii liniare ntre stabilitatea n mediu acid a penicilinelor i aciditatea catenei laterale. Astfel, prin nlocuirea unui hidrogen din poziia a benzil-penicilinei sau a unui hidrogen din ciclul benzenic al meticilinei i fenil-penicilinei cu o grupare aminic sau cu un halogen, crete foarte mult stabilitatea n mediu acid. Confirmarea structurii penicilinelor s-a fcut i prin sinteza acestora. Greutatea mare care apare n sinteza penicilinelor este nchiderea ciclului lactamic. O serie de ncercri se bazeaz pe condensarea D-penicilaminei cu 4alcoximetilen-5-oxazolon, dar randamentul reaciei nu depete 0,1%. O sintez mai practic a fost realizat de Sheenan i colab. n cazul penicilinei V i a altor peniciline. Sinteza se bazeaz pe o metod nou, foarte simpl, de obinere a legturii amidice prin tratarea celor dou componente care conin grupele funcionale (carboxil i amino), cu N, N'-dicilo-hexil-carbodiimid.

61

Folosind diciclohexil-carbodiimida la ciclizarea acidului fenoximetilpeniciloic (XV) s-a obinut, prin nchiderea inelului -lactamic fenoximetilpenicilina (XVI). Acidul fenoximetilpeniciloic a fost obinut din esterul terbutilic al acidului ftalimido-monoaldehidic (XII) i clorhidratul penicilaminei:SH C6H4 CO CO N CH2 COORHCOOR

NaOR

C6H4

CO CO XII N CH CH O + H2N S1) H2N

C

CH3

COOR

CH3 CH COOH VIII C CH CH3 CH3 COOH

C6H4

CO CO N CH CH

S C

CH3

NH2

COOR NH XIIIC6H5OCH2COClHCl

CH3 CH COOH

2)

H2N

CH

CH

HCl

COOR NH S

C 6H5

O

CH2

CO

HN

CH

CH NH XV

C

CH3C6H11N C N

HOOC

CH3 CH COOH

C6H11

Penicilin

XVI

Prin separarea sterioizomerilor derivatului acidului peniciloic (XV) nainte de ciclizare s-a ajuns la penicilin V cu randament de 10 - 12%. La acelai rezultat s-a ajuns i prin ciclizarea acidului peniciloic obinut prin hidroliza penicilinei V naturale. n cursul studiilor privind desinteza i sinteza penicilinelor s-a stabilit c inelul -lactamic este foarte important pentru activitate antibacterian, iar nlocuirea lui cu un ciclu de 5 termeni duce la scderea pronunat a activitii biologice. Restul acil, din catena lateral, poate avea diverse structuri fr a influena sensibil activitatea produsului. Identificarea i dozarea penicilinelor se poate face prin cromatografiere, analize spectrale n U.V., I.R. i RMN, analize titrimetrice i analize colorimetrice. Penicilina G, ca i alte peniciline monoaromatice, prezint n spectrele U.V. o absorbie slab n ap la 264; 257,5; 252 i 257 nm. Aceste benzi sunt benzi tipice pentru absorbia grupei benzilice. Prezena unor produi de degradare acid a penicilinelor este indicat de apariia unui maxim la 320 nm, a crui intensitate este proporional cu gradul de descompunere. Datorit ciclului -lactamic condensat, penicilinele prezint n spectrul I.R. o band de absorbie intens la 5,62 , atribuit vibraiei grupei C=O. Aceast band dispare dac ciclul -lactamic este scindat prin hidroliza enzimatic sau chimic i apare o band nou la 5,75 caracteristic absorbiei peniciloil esterului sau amidei. Restul benzilor de absorbie caracterizeaz celelalte grupri din peniciline: COOH (5,69 ), vibraia de alungire a legturii NH (3 - 3,5 ), amid I (6 - 6,1 ) i amid II (6,5 - 6,7 ).

62

O alt tehnic util pentru caracterizarea medicamentelor -lactamice este spectroscopia RMN. n mod normal spectrele RMN ale srurilor solubile de penicilin pot fi determinate n D2O. Penicilinele prezint, de obicei, un semnal pentru 2 protoni la - 4,42 ppm ai atomilor de hidrogen -lactamici, un semnal net monoprotonic la - 5,71 ppm pentru protonul apropiat gruprii carboxil i semnale nete de 2 sau 3 protoni la = 8,38 ppm i = 8,47 ppm pentru gruparea dimetilic. Pentru dozarea cantitativ a penicilinelor se poate utiliza cu succes metoda iodometric sau colorimetric descrise detaliat n literatur. 3.6.4. Cinetica inactivrii penicilinelor Instabilitatea penicilinei n soluie apoas a fost pus n eviden nc din perioada descoperirii sale. Studiile referitoare la inactivarea penicilinelor naturale n medii apoase au demonstrat c aceast reacie este ireversibil de ordinul nti. Brodersen, studiind procesul de inactivare a penicilinei G n mediu acid, arat c viteza de inactivare depinde de temperatur i de concentraia ionilor de hidrogen. Formele moleculare i ionizate ale penicilinei interacioneaz cu ionii de hidrogen cu viteze diferite. La un pH cuprins ntre 1 i 10 i o trie ionic de 0,5 la 30C viteza de degradare a penicilinei decurge dup o cinetic de ordin pseudo nti, iar degradarea minim se petrece la un pH de 6,5. Studiul cinetic al degradrii penicilinelor naturale la pH cuprins ntre 1 i 14 i o trie ionic de 0,5 la 35oC a scos n eviden faptul c timpul de njumtire a penicilinei potasice la pH de 1,5 i 35oC este de o or, n timp ce pentru penicilina G acid liber este de 4 min, iar energia de activare este 17,6 kcal/mol. Viteza mare de degradare a penicilinei G acid liber este determinat de instabilitatea ciclului lactamic n solui apoase acidulate. Rezultatele cercetrilor privind timpul de njumtire a penicilinei potasice n funcie de temparatur i pH sunt prezentate n tabelul 3.6. Tabelul 3.6. Timpul de njumtire (n h) a benzilpenicilinei potasice n funcie de temperatur i pH pH 2,0 3,0 4,0 5,0 5,5 6,0 6,5 0 4,25 24 197 2000 Temperatura, oC 10 24 1,30 0,31 7,6 1,70 52 12 341 92 336 281 37 62 103 94 pH 7,0 7,5 8,0 9,0 10,0 11,0 0 Temperatura, oC 10 24 37 218 84 178 60 125 27,6 31,2 9,3 1,7 -

Plecnd de la faptul c extracia penicilinelor se face numai n mediu acid, Kodratieva i Bruns au determinat viteza de inactivare a benzilpenicilinei i fenoximetilpenicilinei n funcie de temperatur, la un pH cuprins ntre 2 i 3, rezultatele obinute sunt redate n tabelele 3.7. i 3.8.

63

Tabelul 3.7. Constantele de vitez la incativarea penicilinei G pH = 2,0 C k 103 15,0 11,78 20,00 20,4 30,00 52,5o

pH = 2,5 C k 103 15,0 5,76 24,1 14,7 35,1 40,1o

pH = 3,0 C k 103 24 6,01 35,1 20,8o

Tabelul 3.8. Constantele de vitez la incativarea penicilinei V pH = 2,0 C k 103 35,0 3,26 45,0 8,32 55,0 18,8o

pH = 2,5 C k 103 35,1 1,92 45,0 4,58 55,0 10,54o

pH = 3,0 C k 103 35,6 1,05 45,2 2,70 55,5 7,01o

Rozenberg, studiind viteza de incativare a penicilinei G i V n mediu bazic (pH cuprins ntre 9 i 10), arat c viteza de incativare a penicilinei V este n medie de 2,2 ori mai mare dect viteza de inactivare a penicilinei G. n toate cazurile viteza de degradare a penicilinei a fost determiant prin dozarea iodometric i microbiologic. Pentru a evita erorile de metod este necesar s se aleag un tampon pe baz de acid acetic, acetat, citrat bazic, acid boric, fosfat primar sau glicocol, care nu au aproape nici un efect catalitic. 3.6.5. Mecanismul biosintezei penicilinelor Dei mecanismul biosintezei penicilinelor nu este pe deplin elucidat, totui innd seama de faptul c n molecula lor se gsesc 3 componente de baz: d-valin, l-cistein i un acid substituit, precum i identificarea n miceliul de Penicillium crysogenum a unei tripeptide ( -amino-adipil-cisteinil-valin), se pot concepe etapele care intervin n biosintez. Prima etap const n formarea, din glucoz, a l-cisteinei i d-valinei, iar din acestea a -amino-adipil-cisteinil-valinei, conform schemei I. Pentru elucidarea mecanismului celei de-a doua etape, n care se formeaz sistemul biciclic al penicilinelor, sunt propuse dou ipoteze: 1) plecnd de la o tripeptid (schema II); 2) plecnd de la l-cistein i l-valin (schema III). Dup schema II, sinteza nucleului de baz al penicilinei, acidul 6-aminopenicilanic ar rezulta din acidul -amino-adipic, l-cistein i l-valin trecnd prin faza tripeptidei -amino-adipil-cisteinil-valin. n ultima etap se formeaz penicilina G (prin schimb de grupe acil) sau acid 6-aminopenicilanic prin pierderea grupei acil.

64

Aceast ipotez nu este, deocamdat, confirmat deoarece toate ncercrile de a schimba n tripeptid acidul amino-adipic cu acidul fenilacetic, necesar formrii penicilinei G, au euat. Penicilinele s-ar putea forma i direct din l-cistein i l-valin printr-o serie de faze intermediare, despre care nu se tie dac se formeaz n stare liber, aa cum sunt redate n schema III. n esen, se disting n aceast schem urmtoarele faze n formarea penicilinei: condensarea aminoacizilor, dehidrogenerarea peptidei, hidrogenarea i ciclizarea intermediarului la acid 6amino-penicilanic i introducerea catenei laterale. Formarea acidului 6-amino-penicilanic n lipsa precursorului, precum i obinerea diferitelor peniciline n funcie de precursorul folosit, demonstreaz c procesul de biosintez poate decurge i dup aceast schem.

65

Glucoz: Piruvat: Succinat:

C6H12O6 CH3 CO COOR COOR Acetolactat: CH3 CO C CH3 OH Dihidroxi(CH3)2 C CH izovalerianat: OH OH COOR

CH2 COOR CH2 COOR

Glioxilat: Glicin: Serin:

O NH2

CH COOR CH2 COOR

HO CH2 CH2

CH(NH2) COOH

l-cistein: SH HOCO CH NH2 Acid alfa-amino adipic (Ad)

alfa-hidroxi- (CH3)2 CH CH COOR valerianat: OH CH(NH2) COOH L-valin: (CH3)2 CH CH NH2 COOR

(CH2)3 COOH

CH2 SH Ad NH CH COOH

CH2 SH Ad NH CH CO

CH(CH3)2 NH CH COOH

gama-amino-adipil-cisteinil-valin

Schema I

66

CH2 SH Ad NH CH CO

CH(CH3)2 NH CH COOH CH S

Ad CO NH CH SH CH Ad CO NH CH C O SH CH Ad CO NH CH C O CH Ad CO NH CH Ce bd im acil h Sc pe S gru

CH(CH3)2 CO N CH COOH H CH(CH3)2 N CH COOH

C(CH3)2 N C COOH S C N

CH3

CH3 CH COOH

O C(CH3)2 CH COOH

Pie rde re aci l

S CH N CO

C(CH3)2 CH COOH

CH C6H5 CH2CO NH CH

N

H2N

CH

COPenicilina G

Acid 6-amino-penicilanic

Schema II

67

SH H2N CH CH2 COOH1-cistein

CH(CH3)2 + H2N CH COOHl-valin

SH H2N CH CH CO N SH H2N CH CH CO N C(CH3)2 CH COOH S H2N CH CH CO N C(CH3)2 CH COOHAcid 6-amino-penicilinic (6-AP)

CH(CH3)2 CH COOH

C6 H 5 C6H5 CH2 CO NH

CH2 COOH S C(CH3)2 CH COOH

CH CH CO NPenicilina G

Schema III 3.6.6. Tehnologia obinerii penicilinelor de biosintez Penicilinele de biosintez se obin printr-o tehnologie comun care cuprinde urmtoarele faze: 1) pregtirea mediilor de cultur i sterilizarea lor; 2) fermentaia biochimic; 3) filtrarea soluiilor native; 4) separarea i purificarea penicilinelor. 3.6.6.1. Pregtirea mediilor Aceast faz const n dizolvarea n ap a componenilor mediului conform reetei pentru fiecare faz a procesului de fermentaie. Compoziia calitativ a mediilor de cultur pe faze este prezentat n tabelul 6.9, iar compoziia cantitativ se ncadreaz n limitele valorilor din tabel.

68

Valorile exacte pentru compoziia mediilor de cultur depinde de natura suei productoare i constituie secretul de fabricaie al fiecrei uzine productoare de peniciline. Tabelul 6.9. Compoziia mediului de cultur pe faze de fermentaie Componenii mediului de cultur Extract de porumb Lactoz Glucoz Fin de soia CaCO3 KH2PO4 NH4NO3 Na2SO4 ZnSO4 MnSO4 Fenilacetamid Tiosulfat de sodiu Ap pn la 100 % Inoculator Intermediar Regim 2 0,5-0,6 3-3,5 0,7-0,8 0,1 2-3 3-3,5 1,2 0,7 0,2-0,3 0,12 0,06 0,2 0,016 2,52,8 6-7 2-3 0,3 1,21,3 0,50,6 0,3 0,06 0,002 0,002 0,4 0,8

Pregtirea i sterilizarea mediilor de cultur pentru inoculator i intermediar se poate realiza direct n fermentatoarele respective, sau n aparate destinate acestui scop. Pregtirea mediului de cultur pentru fermentatorul de regim are loc ntr-un aparat prevzut cu agitator, conduct pentru abur viu necesar nclzirii i serpentin de rcire. n acest aparat se introduce apa conform reetei, se nclzete la 60 - 70C, se adaug extractul de porumb i se fierbe timp de 0,5 1 h. Dup aceasta, soluia se rcete la 50-60C i se adaug restul componenilor mediului n urmtoarea ordine: CaCO3, NH4NO3, Na2SO4, MgSO4, MnSO4, KH2PO4, ZnSO4, lactoz, glucoz. Mediul, astfel preparat, este sterilizat n instalaia de sterilizare cu coloan i menintor, prin nclzire cu abur direct la 124 - 126C i meninere la aceast temperatur timp de 10 - 12 min. n continuare, mediul este rcit la 60 - 65C i trimis cu aceast temperatur n fermentatorul de regim, unde se rcete n continuare pn la 27C. 3.6.6.2. Fermentaia penicilinelor Fermentaia este faza fundamental a procesului de biosintez i se realizeaz n trei trepte - inoculator, intermediar, regim - care corespund anumitor stadii de dezvoltare a microorganismelor. Astfel, n inoculator se

69

petrece procesul de aclimatizare a microorganismelor productoare de antibiotic la noile condiii de dezvoltare, n intermediar ncepe creterea exponenial a numrului de microorganisme, iar n regim se desvrete procesul de cretere a microorganismelor i de elaborare a penicilinelor. Aceast etapizare reprezint o imagine general i puin idealizat a procesului de biosintez, deoarece chiar n intermediar ncepe procesul de elaborare a penicilinelor ca rezultat al distribuiei vrstelor microorganismului. Acumularea unor cantiti mari de mas celular face ca volumele fermentatoarelor, n care se realizeaz cele trei etape, s creasc n raport zecimal. Eficacitatea procesului de biosintez este determinat de conformaia genetic a tulpinii productoare. Tulpina utilizat curent n fabricarea penicilinelor este P. crysogenum Q 176 a crei poten a fost ridicat foarte mult prin procese de mutaie. O tulpin bun se caracterizeaz prin capacitate mare de nmulire, utilizare rapid a azotului i a precursorului, lipsa pigmenilor n biomas i miceliu fibros. Procesul de fermentaie a penicilinelor cuprinde trei faze metabolice distincte: faza de cretere, faza de producere i faza autolitic. Faza de cretere se caracterizeaz prin acumulare de mas micelian i utilizarea intensiv a componentelor mediului de cultur. Glucoza este asimilat foarte rapid att pentru formarea materialului celular, ct i pentru furnizarea energiei necesare. Cerinele de oxigen sunt maxime n aceast perioad, iar activitatea respiratorie, caracterizat prin degajare de CO2, este ridicat. Faza de producere a penicilinelor se caracterizeaz prin ncetinirea creterii miceliului - fie datorit epuizrii constituienilor uor asimilabili, fie altor condiii existente - scderea consumului de oxigen, meninerea pH-ului, la 6,8 7,5 i acumularea de penicilin. n aceast faz lactoza este folosit lent de ctre miceliu i furnizeaz energia necesar proceselor de biosintez sau pentru formarea constituienilor celulari. Faza autolitic corespunde stadiului n care microorganismul se epuizeaz ca urmare a activitii metabolice prelungite, iar sursele de carbon din mediu sunt consumate. Coninutul n azot al miceliului descrete considerabil i ncepe procesul de autoliz al acestuia cu eliberarea de amoniac i creterea pH-ului peste 8. Producerea penicilinelor nceteaz i apare un proces de hidroliz alcalin a penicilinelor formate. n practica industrial nu este permis prelungirea fermentaiei pn la apariia autolizei. Cantitatea de peniciline formate ntr-o fermentaie biochimic normal este rezultatul mbinrii raionale a urmtorilor factori: conformaia genetic a tulpinii care decide capacitatea de producere a penicilinelor; folosirea unor constituieni adecvai n mediu i un echilibru corect n proporiile acestora; meninerea pH-ului optim n mediul de fermentaie; dozarea corect a raportului ntre hidraii de carbon; adugarea de precursori care vor decide natura catenei laterale i tipul de penicilin produs; asigurarea necesitilor de substane minerale; meninerea temperaturii optime.

70

Din datele existente n literatur se poate conchide c pH-ul afecteaz vitezele reaciilor enzimatice, permeabilitatea membranelor celulare i gradul de ionizare a srurilor. Pentru faza de cretere a masei celulare pH-ul optim este de 4,5 - 5,0, iar pentru faza de producere a penicilinelor este de 7,0 - 7,5. Prin urmare procesul va trebui condus n cele dou etape n regim diferit. Nu se recomand depirea pH-ului de 7,5, deoarece ncepe procesul de autoliz nsoit de degradarea penicilinelor formate. Dac fermentaia penicilinei se realizeaz prin proces continuu, atunci, realizarea regimului optim de pH pentru faza de cretere a microorganismelor i pentru fazade elaborare a produsului este uor de realizat. Pentru procese discontinui pH-ul este cuprins ntre 6,4 - 7,0. Brown i Peterson, studiind faza de producere a penicilinei de ctre microorganism, demonstreaz c meninerea pH-ului la valoarea 7 n ultima parte a ciclului de fermentaie asigur valori ridicate pentru vitezele de respiraie i elaborare de peniciline. Regimul optim de temperatur este de 25 1C, iar necesarul de aer, deoarece procesul este aerob, este de 1 - 1,5 l aer/l mediu min, la o turaie a agitatorului elicoidal de 110 - 140 rot./min. Compoziia mediului de cultur are un rol hotrtor n procesul de biosintez deoarece, n dezvoltarea sa, microorganismele au nevoie de surse de hidrai de carbon, azot, substane minerale i precursori. Sursele de hidrai de carbon sunt necesare pentru dezvoltarea microorganismelor i pentru producerea antibioticului. Este necesar s se menioneze c biosinteza unei molecule aa de complexe, ca penicilina, necesit un flux de energie din exterior, procesul fiind endoterm. Prin urmare, biosinteza penicilinelor se poate realiza numai dac se desfoar simultan cu procese de oxidare ale hidrailor de carbon care constituie sursa principal de energie. Oxidarea lent a lactozei elibereaz o energie ce depete cu 66 kJ/l mediu de cultur energia necesar sistemului; din aceast cauz procesul de biosintez n ansamblu este exoterm. Viteza de utilizare a hidrailor de carbon se nscrie n urmtoarea schem: glucoz > acid lactic > lactoz, care confirm faptul c n faza de cretere a microorganismelor se consum glucoza, iar n faza de producere a penicilinelor se consum lactoza. Introducerea fructozei sau lactozei n locul glucozei are ca efect imediat scderea brusc a vitezei de cretere a masei celulare. Sursele de azot sunt necesare pentru formarea grupelor aminice i obinerea acizilor aminici. Se utilizeaz azot mineral din sruri de amoniu i azot organic furnizat de aminoacizii i peptidele din extractul de porumb. Prezena substanelor minerale este vital n procesul de cretere deoarece ele afecteaz direct permeabilitatea membranei celulare i echilibrul ionic, activeaz sistemele enzimatice sau intr n sisteme enzimatice. Astfel, KH2PO4 ofer K3- pentru activarea unor sisteme enzimatice i PO+ pentru fosforilare. Jarvis i Johnson au determinat experimental, pentru tulpina P. crysogenum Q 174, necesarul de substane minerale pentru fazele de cretere a masei celulare i elaborarea de peniciline. Tabelul 3.10. Necesarul de substane la producerea penicilinelor

71

Element Potasiu Magneziu Fosfor Fier Sulf

Valori exprimate n mg/l mediu Creterea Producerea ciupercii penicilinei 40 40 8 8 80 200 0,2 7 70 100

Dirijarea procesului de biosintez spre o anumit penicilin se face cu ajutorul unor substane care sunt nglobate n catena lateral a penicilinelor i poart numele de precursori. Pentru penicilina G se utilizeaz ca prescursor fenilacetamida, iar pentru penicilina V acidul fenoxiacetic. Precursorii se adaug n poriuni, deoarece n concentraii mai mari de 0,1 - 0,2% sunt toxici pentru microorganisme. Dinamica procesului de fermentaie este redat n figura 3.7. Procesul de fermentaie a penicilinelor fiind aseptic, sterilizarea aparaturii i a mediului se face cu abur viu la 124 - 125C, iar meninerea sterilitii n timpul procesului este asigurat de suprapresiunea creat prin barbotarea aerului steril necesar biosintezei.

Figura 3.7. Dinamica procesului de fermentaie a penicilinelor Procesul de fermentaie se realizeaz n fermentatoare cilindrice verticale construite din oel inoxidabil, echipate cu agitator elice sau turbin, serpentin pentru rcire, conduct pentru aerare, dispozitive sparge-val, teac termocuplu, filtru individual de aer i rezervor cu antispumant. Fundurile fermentatoarelor sunt sudate pentru a asigura un grad sporit de securitate

72

mpotriva infeciilor, iar tuurile au garnitur metalic pe toat suprafaa flanelor de legtur. Parametrii principali ai procesului de fermentaie sunt prezentai grupat n tabelul 3.11. Tabelul 3.11. Parametri procesului de fermentaie biochimic a penicilinei Etapa de fermentai e Inoculator Intermediar Regim tc 26 1 26 1 26 1 Agitarea, rot/min 270 170 120 Debit aer, l/l mediu min 1,0 1 -1,2 0,6-1 Presiunea , ata 1,2-1,3 1,2-1,3 1,2-1,3 Durata procesului, h 30 - 40 20 - 40 90 - 120

Controlul procesului de fermentaie se realizeaz prin determinarea sterilitii mediului, a gradului de dezvoltare morfologic a ciupercii, a pH-ului mediului, a activitii lichidului de cultur i a consumului de zahr. Probele se iau la interval de 4 - 6 ore, iar procesul se consider terminat atunci cnd coninutul de zahr al biomasei ajunge la 0,2 - 0,6%, iar concentraia soluiei rmne aproape constant ntre dou determinri. Concentraia penicilinelor n soluia nativ la terminarea procesului de fermentaie este cuprins ntre 1 i 1,8%. Valoarea exact depinde de potena suei folosite i condiiile de realizare a procesului de fermentaie.

3.6.6.3. Filtrarea soluiilor native Lichidul de cultur obinut la fermentaie se separ de miceliu pe filtru tambur cu vid. Soluia rezultat se trece printr-un rcitor tubular unde se rcete pn la 3 5oC i se depoziteaz n rezervorul de ateptare, unde este trimis la extracie. Rcirea este absolut necesar pentru a reduce viteza reaciilor de degradare a penicilinelor. n unele tehnologii de fabricaie soluia rcit se trateaz cu cetazol 10% pentru coagularea albuminelor, se filtreaz i se trimite la extracie. 3.6.6.4. Separarea i purificarea penicilinelor Datorit diluiilor foarte mari, separarea penicilinelor se poate face, rentabil, numai prin extracii repetate cu solveni, conform schemei din figura 3.8.

73

Pentru separarea penicilinei prin extracie lichid-lichid au fost studiai muli solveni organici, determinndu-se valorile coeficienilor de repartiie ntre ap i solvent, funcie de temperatur i pH (tabelele 3.12 i 3.13). Dintre solvenii studiai pentru extracia penicilinelor cel mai economic este acetatul de butil.Solutie apoas de KH2PO4 Solutie H2SO4 Solvent

Solutie H2SO4 Solvent Solutie nativ Solvent cu penicilin

Cristalizare

Solutie apoas epuizat

Solvent epuizat

Solutie apoas epuizat

Figura 3.8. Schema de principiu a procesului de extractie a penicilinelor

Tabelul 3.12. Coeficienii de repartiie a penicilinei la 0C funcie de pH Solvent Metiletilcetona Dimetilciclohexan Metilciclohexan Ciclohexan Furfuriacetat Metilizobutil ceton Dimetilftalat Acetat de amil Dietiloxalat Coef. repartiie pH = pH = 0 4,0 180 19 160 15 80 7 62 4 44 4 33 30 20 20 3 2,7 1,8 1,8

Tabelul 3.13. Coeficienii de repartiie a penicilinei G la 0 i pH 2,5

74

Solvent Acetat de izobutil Acetat de butil Acetat de amil Cloroform Eter etilic Dicloretan Diizopropil eter Toluen Tetraclorur de carbon

Coef. repartiie determinat Prin microbiologie titrare 63 67 30 35 27 39 24 37 14 14 7,8 8,6 0,12 0,11 0,1 0,06 0,03 0,015

Echilibrul de faz la extracia penicilinelor i stabilirea condiiilor optime de extracie a constituit obiectul multor cercetri. Rowley i colaboratorii, studiind procesul de extracie a penicilinelor cu acetat de butil, au observat c: 1) n solvent organic trec numai moleculele de penicilin acid nedisociate; 2) ntre moleculele de penicilin nu au loc asociaii n condiiile de extracie; 3) n solvent organic penicilinele nu disociaz n ioni. n aceste condiii se poate afirma c echilibrul de faz la extracia penicilinelor cu un anume solvent depinde numai de temperatur i pH. Repartiia penicilinelor ntre faza apoas i solvent este descris prin coeficienii de repartiie Ko i K:

Ko =K=

Cs Ca'

(3.1) (3.2)

Cs Ca

unde: Ko - coeficientul de repartiie al penicilinei nedisociate; K - coeficientul efectiv (total) de repartiie; Cs - concentraia penicilinei n solvent; C'a - concentraia penicilinei nedisociate n faza apoas; Ca - concentraia total a penicilinei n faza apoas. Din ecuaia bilanului de materiale i a legii aciunii maselor rezult: Ca = C'a + Ca(3.3)Kd = Ca C H + Ca'

(3.4)

75

unde: CH+ este concentraia ionilor de hidrogen Ca- - concentraia penicilinei disociate; Kd - constanta de disociere a penicilinei. Prin combinarea ecuaiilor (6.1 - 6.4) se obine: 1 K = Ko K (3.5) 1+ d CH + Ecuaia (3.5) descrie influena pH-ului asupra coeficientului de repartiie n procesul de extracie a penicilinelor cu solveni organici. Valoarea coeficientului de repartiie pentru sistemul acetat de butilbenzilpenicilin-ap, determinat experimental la temperatura de 0C i pH= 2,5 este K = 30, iar constanta de disociere a penicilinei acid este Ka = 10 -2,75. Introducnd n ecuaia (3.5) valoarea lui K = 30, Ka = 10 -2,75 i CH+ = 10 -2,5 se obine pentru coeficientul de repartiie a penicilinei nedisociate valoarea Ko = 47. La pH < 6 coeficientul de repartiie a penicilinei nedisociate este constant (Ko = 47), iar dependena dintre coeficientul total de repartiie i pH este descris prin ecuaia: 47 K = (3.6) 1 + 10 pH 2, 75 La pH > 6, Ko nu mai este constant, iar dependena dintre K i pH este dat de relaia: 1 K = 0 ,35 pH 0, 66 (3.7) 10 Prin combinarea ecuaiei (6.6) cu (6.7) se obine ecuaia de calcul a coeficientului de repartiie a penicilinei nedisociate la pH > 6. 1 + 10 pH 2, 75 K o = 0,35 pH 0, 66 (3.8) 10 Ecuaiile (3.5 - 3.7) permit calculul coeficientului de repartiie a penicilinei ntre faza apoas i acetat de butil, funcie de condiiile n care se realizeaz procesul de extracie. Pentru acelai scop se pot utiliza i diagrame care dau variaia coeficientului total de repartiie funcie de pH pentru pH < 4,4 (figura 3.9) i pH > 4,4 (figura 3.10).

Figura 3.9. Influena pH-ului asupra coeficientului de repartiie (K) a penicilinei ntre acetat de butil i ap

76

Figura 3.10. Influena pH-ului asupra coeficientului de repartiie a penicilinei ntre ap i acetat de butil Lucrrile experimentale, confirmnd calculele teoretice, demonstreaz c la un pH = 4,4 coeficientul de repartiie K are valoarea 1 i ca urmare separarea penicilinei este practic imposibil. Dup cum s-a artat mai sus (figura 3.8) separarea penicilinei din soluia nativ necesit concentrarea soluiei prin trecere repetat din faza apoas n solvent (extracie) i din solvent n faza apoas (reextracie). Caracterizarea cantitativ a procesului de extracie i reextracie se face funcie de valorile coeficienilor de transfer de mas:

V kL = F

Ca i '

Ca ' f

dCa'

'

C a C ae'

- pentru extracie

(3.9)

V kL = F '

Ca f '

0

dCa - pentru reextracie ' C ae C a

(3.10)

unde: V este volumul extractorului; F - suprafaa de contact; Cae - concentraia de echilibru a benzilpenicilinei nedisociate; i i f - condiii iniiale i finale. n funcie de Ca (concencentraia soluiei native), Ko i K se calculeaz valorile concentraiilor Ca i Cs, dup care prin integrarea relaiilor (3.9) i (3.10) se determin coeficienii de transfer de mas pentru extracie (kL = 25,3 cm/h la pH = 2 - 2,5) i reextracie (k'L = 0,022 cm/h la pH = 4,4 i 8,8). Din comparaia valorilor coeficienilor de extracie kL i k'L rezult c viteza procesului este de 1000 ori mai mare la extracie fa de reextracie. Pentru a mri viteza procesului de reextracie (treapta a doua din figura 3.8) se transform penicilina acid n sare de sodiu sau potasiu, prin tratare cu fosfat sau acetat de sodiu (K), iar sub form de sare penicilina trece total n soluia apoas. Alegerea regimului optim de extracie n contracurent a penicilinei cu acetat de butil se poate face cu ajutorul nomogramei din figura 3.11 care coreleaz cantitatea de penicilin neextras , gradul de concentrare m, pH-ul fazei apoase i numrul teoretic al treptelor de contact N.

77

Figura 3.11. Nomograma pentru calculul extraciei penicilinei: I - E = f (pH, m) pentru extracia penicilinei din soluia apoas n acetat de butil; II - = f (E, N); III - E = f (pH, m) pentru extracia penicilinei din acetat de butil n soluia apoas Pentru sistemul soluie apoas de antibiotic acetat de butil se poate neglija solubilitatea fazelor, iar gradul de concentrare n acest caz este determinat de raportul volumelor fazelor participante la proces:m= V (extracie pH < 4,4) Vs

(3.11)

sau m ' =

Vs (reextracie pH > 4,4) V

unde: V este volumul fazei apoase; V', - volumul de solvent. n partea stng a nomogramei din figura 3.11 este redat dependena dintre factorul de extracie, gradul de concentrare i pH-ul fazei apoase la extracia penicilinei din faza apoas n acetat de butil, iar n partea dreapt a nomogramei este redat dependena acelorai factori, dar la reextracie (trecerea penicilinei din faza organic n faza apoas). n mijlocul diagramei este redat dependena fraciei neextrase funcie de factorul de extracie i numrul treptelor teoretice de contact. Factorul de extracie a fost calculat funcie de pH cu relaia (3.12), iar fracia neextras cu relaia (3.13):E =K 1 (extracie pH < 4,4) m

(3.12)

1 1 (reextracie pU >4,4) K m' E 1 = n +1 E 1 E=

(3.13)

Nomograma permite determinarea rapid a parametrilor procesului de extracie i poate furniza datele necesare optimizrii aparaturii i procesului de extracie a penicilinei cu solveni organici.

78

Mai jos sunt prezentate dou exemple de utilizare a nomogramei din figura 3.11: 1. Extracia penicilinei se realizeaz la pH = 2, cu un raport de volume m = 0,3 pe un extractor cu 1,5 trepte teoretice de contact. Se cere determinarea fraciei neextrase. Pentru aceasta se determin punctul de intersecie dintre ordonata ridicat din pH = 2 cu curba m = 0,3, iar din acest punct se duce o paralel la abscis pn ce intersecteaz curba N = 1,5, funcie de care se determin fracia neextras = 2,3%. 2. Se cere determinarea raportului volumetric m la reextracia penicilinei din acetat de butil pH = 6,5 pe acelai extractor (N = 1,5). Pentru aceasta se determin punctul de intersecie dintre ordonata cu = 2% i curba corespunztoare lui N = 1,5. Din acest punct se duce o paralel la abscis, pn ce ntlnete ordonata cu pH = 6,5. Punctul de intersecie corespunde la m' = 0,12. Deoarece proprietile fizice ale penicilinelor difer, apar mici diferene i n procesul de extracie, din care cauz extracia se va trata separat pentru benzilpenicilin i fenoximetilpenicilin. Penicilina G se separ din soluia nativ, prin extracie cu acetat de butil n trei stadii, dup care se purific prin decolorare i cristalizare. n stadiul I de extracie are loc trecerea penicilinei din soluia nativ n acetat de butil la un pH de 2 - 2,5. Acidularea soluiei native la pH 2,4 - 2,5 se face cu acid sulfuric de 6 10% iar raportul ntre acetatul de butil i soluia nativ este de 1: 3. Acest raport se alege n aa fel, nct n final soluia de acetat de butil s aib o activitate de 20 - 25 000 UI/ml. Extracia se realizeaz n extractoare centrifugale n contracurent, tip Luwesta sau Podbielniak descrise mai sus. n stadiul II de extracie, care se realizeaz n acelai tip de extractor, are loc trecerea penicilinei din acetat de butil n soluie apoas de fosfat disodic i carbonat de sodiu (4%) la pH 7 - 7,2. Raportul dintre soluia apoas i acetat este de 1: 2,5 - 1: 3. n acest stadiu penicilina, sub form de sare de sodiu, trece cantitativ n soluie apoas a crei concentraie final este de 40 - 45 000 UI/ml. n stadiul III de extracie, soluia apoas este tratat cu acid sulfuric de 6 - 10% pn la pH 2 2,5 dup care se amestec cu acetat de butil n raport de 1 : 1,3 - 1 : 1,5. Dup separarea fazelor se obine o soluie de penicilin n acetat de butil cu concentraia de 60 - 80 000 UI/ml care se supune procesului de uscare n vederea cristalizrii penicilinelor. Pentru ndeprtarea apei, soluia de acetat de butil se trece ntr-un vas cu serpentin unde se rcete pn la -10, - 12C, cnd apa nghea formnd cristale fine care se filtreaz pe druck-filtru (figura 3.12). Soluia filtrat se trece peste sulfat de sodiu anhidru pentru desvrirea uscrii dup care, prin tratare cu soluia alcoolic de acetat de potasiu 30%, cristalizeaz penicilina potasic. Penicilina cristalizat se filtreaz i se spal pe filtru cu butanol pentru ndeprtarea acetatului de butil i apoi cu cloroform sau eter pentru

79

ndeprtarea butanolului. Uscarea benzilpenicilinei potasice se face sub un uor vid la 50 - 60C timp de 4 - 5 ore. Penicilina G se separ sub form de sare, deoarece sub aceast form este mult mai stabil dect acidul liber. Dac n faza de fermentaie se adaug ca precursor nu fenilacetamida ci acidul fenoxiacetic, atunci se obine penicilina V. Separarea penicilinei V se realizeaz tot prin extracie cu acetat de butil, dar numai n dou stadii. Aceasta este posibil deoarece solubilitatea penicilinei V n ap este mic.

Figura 3.12. Schema de principiu a instalaiei de separare a penicilinei G din soluia de acetat: 1 - vas de ngheare; 2 - filtru; 3 - vas uscare pe Na2SO4 anhidru; 4 - vas precipitare; 5 - filtru nuce; 6 - usctor Precipitarea penicilinei V, din soluia apoas rezultat de la stadiul II de extracie, se face prin acidulare cu acid clorhidric sau sulfuric diluat. Penicilina V precipitat se filtreaz pe filtru nuce i se usuc n usctor dulap la 35 - 45C sub vid de 100 - 225 mm Hg, timp de 16 - 20 ore. 3.6.7. Peniciline de semisinteze Apariia penicilinelor de semisintez a fost determinat de faptul c benzilpenicilina are o activitate sczut fa de germeni gram-negativi i o foarte slab rezisten n mediu acid i la aciunea penicilinazei. ncercrile de obinere a noi peniciline s-au axat fie pe modificarea catenei laterale, fie pe sinteza chimic direct. Modificarea cantenei laterale, bazat pe utilizarea diverilor precursori n procesul de biosintez, a condus la un numr restrns de peniciline, deoarece microorganismul productor accept ca precursor numai derivaii monosubstituii ai acidului acetic. Pe de alt parte, sinteza chimic direct a prezentat un imens interes teoretic, dar randamentele obinute au fost prea mici pentru a transforma procedeul ntr-un mijloc curent de preparare a penicilinelor modificate. Prima comunicare despre nucleul de penicilin a fost fcut n anul 1950 de ctre Sakaguachi i Murao, care au descoperit n miceliul de Penniccillium crysogenum Q 176 o nou enzim, penicilamidaza, capabil s scindeze catena lateral din molecula penicilinei. Mai trziu, n 1953, Kato a identificat iodometric, la fermentaia penicilinei fr precursor, un metabolit care n

80

prezena acidului fenil-acetic a trecut n penicilin G; acest metabolit a fost denumit de Kato nucleul penicilinei". Etapa culminant a cercetrilor n acest domeniu a constituit-o izolarea, de ctre Batchelor n 1959, a acestui nucleu de penicilin pe care l-a denumit acidul 6-aminopenicilanic. Dup descoperirea i purificarea acidului 6aminopenicilanic (A 6 -AP), a devenit posibil sinteza unui numr mare de peniciline noi, denumite peniciline de semisinteze, avnd catene variate. Aciunea lor antibacterian ct i proprietile lor farmacologice depind de structura acidului care particip la formarea catenei laterale. Penicilinele de semisintez pstreaz, n general, lipsa de toxicitate caracteristic penicilinelor i nltur dezavantajele majore ale acestora n afar de alergie; acest fenomen este atribuit de majoritatea cercettorilor, nsui nucleului penicilinei.

3.6.7.1. Clasificarea penicilinelor de semisintez Penicilinele de semisintez se pot clasifica dup structura chimic a catenei laterale i dup rezistena n mediul acid i la penicilinaz. Dup natura radicalilor legai de carbonul al catenei laterale, penicilinele de semisintez se clasific n urmtoarele grupe: 1) peniciline metil monosubstituite; 2) peniciline metil disubstituite; 3) peniciline metil trisubstituite; 4) peniciline , nesaturate; 5) aril, heterociclil, cicloalchil-peniciline. Dup rezistena chimic i la penicilinaz penicilinele semisintetice se clasific n patru grupe: 1) peniciline rezistente la acizi: feneticilina, propicilina, peniciline cu grupri dialchilsulfonamidice i morfolinosulfonamidice; 2) peniciline rezistente la penicilinaz: meticilina, nafticilina; 3) peniciline stabile la acizi i la penicilinaz: oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, amicilina; 4) derivai cu spectrul larg: ampicilina, carbencilina. Formulele de structur i caracteristicile cele mai importante ale principalelor peniciline semisintetice sunt prezentate n tabelul 6.14. 3.6.7.2. Stabilitatea penicilinelor de semisintez Cunoaterea domeniului de temperatur i pH, n care penicilinele de semisintez prezint o bun stabilitate, este necesar pentru alegerea condiiilor optime de obinere, pstrare i utilizare. A fost studiat influena principalilor factori asupra vitezei de degradare a penicilinelor de semisintez utilizate curent n terapeutic, stabilindu-se c procesul inactivrii decurge, n toate cazurile, dup o cinetic de ordinul I. Din studiul vitezei de degradare a meticilinei, n domeniul de pH 1 - 10, la tria ionic constant de 0,5 i la 25C, s-a stabilit c aceasta este foarte puin

81

stabil n mediu acid, iar viteza de descompunere este de 2 - 3 ori mai mare dect la feniticilin. Tabelul 3.14. Caracteristicile penicilinelor de semisintezS R NH N O CH3 CH3 CH COOH

Denumirea Penicilina G Penicilina V Feneticiclina Propiciclina Lenebencilina MeticilinaC6H5

RC6H5 CH2 CO C6H5 O CH2 CO

Stabilitat e n pH acid + + + + -

Rezisten la penicilinaz + + + +

C6H5 O CH COC6H5 O CH COC 6 H5 O

Activitate asupra germenilor gramnegativi -

CH3

C 2 H5 CH CO

OCH3 CO OCH3 C C CON C CH3

CH

Oxacilina

+

+

-

O ClC6H4 C C CO

Cloxacilina Ampicilina

N C

CH3

+ +

+ -

+

O C6H5 CH CO

NH2

Influena pH-ului asupra vitezei de degradare a meticilinei este redat n figura 3.13.

82

Figura 3.13. Stabilitatea meticilinei funcie de pH Forma curbei este tipic pentru degradarea penicilinelor prin ioni de H+ i OH-, iar curbura din partea acid apare datorit ionizrii meticilinei. Domeniul de pH n care meticilina prezint stabilitate maxim este relativ ngust i se gsete n jurul pH-ului 7. Un studiu complet asupra degradrii oxacilinei n soluie apoas n domeniul de pH 1 - 11 la o trie ionic de 0,5 i la 25C a fost efectuat de Kondratieva i Bruns. Curba care exprim dependena dintre viteza de inactivare i pH-ul soluiei la 25C poate fi mprit n cinci domenii (figura 3.14).

Figura 3.14. Stabilitatea oxacilinei funcie de pH n primul domeniu (pH = 0 - 1,3) oxacilina se gsete sub form nedisociat, iar viteza de inactivare sub aciunea ionilor de hidrogen este proporional cu concentraia iniial a oxacilinei: ' dC dCa ' a = = kCa = kCa ' d d (3.14) iark = k1 C H +

n domeniul III (pH = 3 - 5,5) oxacilina fiind disociat, are loc procesul de inactivare electrofil a anionilor de oxacilin, iar viteza acestui proces este proporional cu concentraia ionilor de hidrogen la puterea n 1:

83

dCa = kC a ' d (3.15) iar

'

k = k2 C n H n domeniul V (pH peste 7,5) are loc procesul de inactivare nucleofil, iar viteza procesului este proporional cu concentraia ionilor de hidroxil: ' dCa = kC a ' d (3.16) iark = k3 COH

Prin urmare, viteza procesului de inactivare a oxacilinei la pH < 1,3, la pH > 7,0 i pH cuprins ntre 3 i 5,5 este descris prin ecuaiile (3.14) - (3.16). Pentru determinarea constantelor k1 k2, k3 se logaritmeaz relaiile de definiie a lor, obinndu-se: log k = log k1 pH log k = log k2 n pH (3.17) log k = log k3 + pKw + pH unde: pKw este produsul ionic al apei. La pH = 0 ecuaiile (3.17) iau forma: log k1 = log k log k2 = log k (6.18) log k3 = log k - pKw Prin extrapolarea curbelor din figura 3.9 se obin valorile numerice ale constantelor catalitice (k1, k2 i k3), iar valoarea lui n pentru domeniul III se determin din panta dreptei n acest interval de pH. n cazul oxacilinei valorile constantelor catalitice sunt: kl = 2,1 10-1, min-1; k2= 1,7 10-1, min-1; k3 = 23,7, min-1 iar n = 0,78. n domeniul II (pH = 1,3 - 3) oxacilina existnd sub form disociat i nedisociat, vitezele de degradare pentru aceste forme sunt diferite i ca urmare pe curb apare o inflexiune. n intervalul de pH 5,5 - 7,5 (domeniul IV) curba prezint un minim, iar procesul de inactivare se realizeaz nucleofil i electrofil, cu viteze comparabile. Domeniul de pH 6 - 7 corespunde stabilitii maxime a oxacilinei. Ecuaia general a vitezei procesului de degradare a oxacilinei ntr-un interval larg de pH se obine prin nsumarea ecuaiilor (3.14) - (3.16): dC a = k1Ca ' CH + + k2 (C n H + ) C a + k3 (COH ) C a d (3.19)

84

Exprimnd concentraia formelor disociate i nedisociate ale oxacilinei n funcie de constanta de disociere Ka i concentraia total de oxacilin Ca se obine: Ca C H + Ca k d C 'a = i C a = k + C kd + CH + d H+ (3.20) Prin combinarea ecuaiilor (3.19) i (3.20) se obine: dC a 1 = Ca d kd + CH + k3 K d K w 2 n k1C H + + k 2 K d C H + + CH +

(

)

(3.21) unde: k = k1CH+ + k2Kd(CnH+) +k3 K d K w CH +

(3.22) Ecuaia (3.22) permite calculul constantei de vitez la inactivarea oxacilinei. Acelai rezultat a fost obinut de Brodersen pentru inactivarea penicilinei G. Pentru fiecare domeniu din figura 3.15, constanta de vitez poate fi calculat foarte uor cu ecuaiile din tabelul 3.15. Tabelul 3.15. Ecuaiile de calcul al constantei de vitez la inactivarea oxiacilinei pH < 1,3 1,3 3,0 3,0 5,5 5,5 7,5 > 7,5 Forma Ionul de catalizator existen PnH H+ PnH, P PnPnPnn

Ecuaia de calcul al lui K

H

+

(k C ) + k K C k=1 H+ 2 d

k = k1C H +

n

H+

K d + CH +

H+ H+, OHOH-

k = k 2C n H +k = k 2C n H + +

(

)

k3 K w CH +

k = k3

Kw CH +

85

Figura 3.15. Diagrama de stabilitate a oxacilinei funcie de temperatur i pH Pentru determinarea rapid a constantei de vitez i a gradului de inactivare, funcie de temperatur i pH, ntr-o perioad de timp determinat, se recomand utilizarea nomogramei din figura 3.10. Dac se urmresc valori foarte exacte ale vitezei de inactivare atunci este necesar utilizarea relaiilor cinetice. Recent au fost publicate rezultatele unor cercetri din care rezult c pHul degradrii minime a ampicilinei la 27C este de 4,4. Hou i Poole au studiat cinetica degradrii ampicilinei n cteva sisteme de tampon cu pH 0,8 - 10, cu trie ionic de 0,5 i la diverse temperaturi. Vitezele de reacii la degradarea ampicilinei se conformeaz cineticii de ordinul nti i sunt afectate simitor de cataliza general acid-baz ndeosebi de ctre ionii de fosfat cu polisarcin. n soluia acid, vitezele aparente cresc odat cu tria ionic i scad cu constanta dielectric a solventului, pH-ului degradrii minime este de 4,85, valoare ce coincide cu punctul izoelectric al ampicilinei n condiiile folosite. Astfel spus, forma de ion amfoter al moleculei de ampicilina este cea mai stabil att la acizi ct i la baze. Inactivarea ampicilinei ntr-o baz este de circa 1400 ori mai rapid dect n acid. Energiile aparente de activare pentru degradarea ampicilinei sunt de 16,4, 18,3 i 9,2 kcal/mol n sisteme tampon cu pH 1,35, 4,93 i respectiv 9,78. 3.6.7.3. Metode de obinere a penicilinelor de semisintez Dintre metodele cunoscute privind obinerea penicilinelor de semisintez, utilizarea practic a cptat metoda acilrii acidului 6-AP cu cloruri acide, cu anhidride mixte i cu acizi carboxilici n prezena diciclohexil-carbodiimidei. A. Acilarea acidului 6-AP cu cloruri acide Acilarea acidului 6-AP cu cloruri acide este cea mai util metod de obinere a penicilinelor de semisintez. Reacia se realizeaz n prezen de NaHCO3 sau trietilamin n mediu apos sau amestec de ap-aceton:P-NH2 + Cl-CORNaHCO3 N(C2H5)2

P-NH-CO-R + NaCl + CO2 + H2O

86

Dac clorura acid nu este stabil n soluie apoas, condensarea se efectueaz n mediu de aceton anhidr, diclormetan, cloroform sau alt solvent anhidru. n locul clorurii acide se pot utiliza fie bromuri acide, fie anhidride ciclice sau aromatice. B. Acilarea acidului 6-AP cu anhidride mixte Metoda de acilare a acidului 6-AP cu anhidride mixte este avantajoas pentru introducerea acizilor carboxilici ale cror cloruri acide sunt greu sau imposibil de obinut. Anhidridele mixte se prepar din acid carboxilic tratat cu cloro-carbonatul de etil sau izobutil n prezena aminelor teriare: R COOH + Cl C OC2H5 O R COO C OC2H5 + H2N P O C. Acilarea acidului 6-AP cu acizi carboxilici Acest procedeu utilizeaz ca agent de condensare N, N' - diciclohexil carbodiimida. Reacia decurge n dou trepte: n prima treapta are loc adiia acidului carboxilic la diciclohexil-carbodiimid, iar n treapta a doua compusul de adiie reacioneaz cu acidul 6-AP formnd penicilina respectiv i diciclohexil-ureea: N C6H11 C + HO CO R N C6H11 NH C6H11 C COR + P NH2 N C6H11 NH C6H11 P NH COR + C O NH C6H11 R COOC OC2H5 + HCl O R CO NH P + CO2 + C2H5OH

Reacia se realizeaz la temperatura camerei, n mediu de tetrahidrofuran, sub o bun agitare. Diciclohexil-ureea format cristalizeaz la diluarea masei de reacie i se separ prin filtrare. D. Obinerea principalelor peniciline de semisintez Utiliznd una din metodele prezentate se obin principalele peniciline de semisintez dup cum urmeaz: - Feneticilina (Broxil, - fenoxietilpenicilina). Se obine prin condensarea acidului 6-AP cu clorura acidului - fenoxipropionic n mediu de aceton i n prezena bicarbonatului de sodiu: P NH2 + Cl CO CH CH3 O C6H5+NaHCO3 -NaCl -CO2 -H2O

P NH

CO

CH CH3

O C6H5

87

Este activ mpotriva stafilococilor penicilinorezisteni dnd rezultate bune n infeciile cilor respiratorii i otit. - Propicilina (Brocilin, Boycilin). Se obine prin condensarea n mediu apos a acidului 6-AP cu anhidrida mixt rezultat din acidul fenoxibutiric i clorocarbonatul de izobutil:C6H5 O CH COOH + Cl CH2 CH3P NH2 + C6H5 O

C O

O

C(CH3)3

C6H5

O

CH COOC OCO CH

OC(CH3)3

CH3 CH2OC(CH3)3-CO2 -(CH3)3-C-OH

CH COOC O

P NH

O C6H5

CH3 CH2

CH2 CH3

- Meticilina (Celbenina, Cinopenil). Rezult prin condensarea clorurii acidului 2,6-dimetoxibenzoic cu acidul 6-AP n mediu de CH2Cl2 n prezen de trietilamin: OCH3 P NH2 + Cl CO OCH32N(C2H5)3

OCH3 P NH CO OCH3

Meticilina este stabil la aciunea penicilinazei fiind utilizat n infecii dermice i ale gtului, precum i n tratamentul pneumoniilor bacteriene. - Oxacilina (Rezistopen, Prostaphlin). Se obine prin condensarea clorurii acidului 5-metil-3-fenil-izoxazolil-4-carboxilic cu sarea de sodiu a acidului 6-AP n prezena bicarbonatului de sodiu:

P NH2 + Cl CO

C

C N O

C6H5

+NaHCO3-NaCl -CO2

P NH

CO

C

C N O

C6H5

CH3 C

CH3 C

Oxacilina este stabil n mediu acid i la penicilinaz, fiind foarte activ mpotriva stafilococilor rezisteni la penicilin. - Ampicilina (Penbritin, Polycillin). Pentru obinerea ampicilinei se pleac de la acidul fenilacetic care se bromureaz, apoi se transform n acidul aminofenil acetic. Acesta se acileaz mai nti cu esterul benzilic al acidului clorcarbonic i apoi cu cloroformiatul de etil, iar anhidrida mixt rezultat se condenseaz cu acidul 6-AP:

88

C6H5 C6H5

CH2 CH NH2

COOH

+Br2-HBr

C6H5

CH Br C6H5

COOH CH NH

+NH3

-NH4Br

C6H5

CH NH2

COOH+P-HN2

COOH

Cl-COOC2H5 Cl-CO-CH2-C6H5

COO C OH2O

COOC2H5 C6H5

O

OCH2

+P-NH2

P

NH

C

CH

C6H5 COOCH2 C6H5

P

NH

CO

CH NH2

C6H5

O NH

Ampicilina acioneaz asupra germenilor penicilino-rezisteni, dar este inactivat de penicilinaz. 3.6.7.4. Tehnologia fabricrii penicilinelor de semisintez Penicilinele de semisintez au o tehnologie de obinere comun care cuprinde urmtoarele etape: obinerea acidului 6-aminopenicilanic; obinerea clorurii acide sau a esterului sare; condensarea acidului 6-AP cu clorura acid sau anhidrida mixt i separarea penicilinei obinute. 1. Obinerea acidului 6-amixopenicilanic Dintre procedeele propuse pentru obinerea acidului 6-AP (biosinteza acidului 6-AP prin cultivarea ciupercii P. crysogenum pe un mediu fr precursor, sinteza chimic i degradarea penicilinelor la acid 6-AP), utilizare practic a cptat procedeul degradrii enzimatice a penicilinelor la acid 6-AP. Pe lng degradarea enzimatic, aplicat n industrie, se studiaz intens hidroliza chimic a penicilinelor n vederea gsirii unui procedeu rapid i economic. Procedeul hidrolizei chimice este aplicat la scar industrial n cteva ri ale lumii pintre care i n ara noastr. a) Hidroliza chimic a penicilinei. Pentru hidroliza catenei laterale a penicilinei se folosesc reactani cu o nalt selectivitate, care s atace gruparea amidic lateral i s nu afecteze ciclul -lactamic. Astfel prin reducerea onitrofenoximetilpenicilinei cu tetrahidrur de bor n prezena catalizatorilor (paladiu) se obine acidul 6-AP i benzoxazin. Acest procedeu are dezavantajul c folosete materie prim scump i greu de obinut:

89

ONO2

CH2

NH ON

S

O

CH3 CH3 COOH

BH4Pd / C

ONHOH

CH2

C NHO

SN

CH3 CH3

O

O

+N

H2 N ON

S

CH3 CH3 COOH

OH Un alt procedeu, brevetat n Olanda, const n obinerea iminoesterilor penicilinei care hidrolizeaz cantitativ n acid 6-AP. Conform acestui procedeu, penicilinele de biosintez (G sau V) se transform n esteri metil-silanici (I) pentru protejarea grupei carboxilice din nucleul penicilinei.SN

R CO

NH O

CH3 + CH3 COOK

CH3

CH3

SN

Cl Si Cl CH3 K OOC CH3

NH CO R O

R CO

NH ON

S

CH3 CH3 COO

CH3 Si CH3

CH3 CH3 OOC I

SN

NH CO R O

R C OH

N* II

*N

C OH

R

R C Cl

N* III

*N

C Cl

R

R C OR

N* IV

*N

C R OR'

90

2

OR' R C O*

+

2

H2 N ON

S

CH3 CH3 COOH

Acidul GAP Prin tratarea esterului cu cloranhidrice (PCl5 sau POCl3) n prezen de catalizatori bazici se obine iminoclorur (III). Timpul optim pentru realizarea acestei reacii este funcie de temperatur, natura i cantitatea de solvent i cloranhidrid. La tratarea iminoclorurii cu alcooli au loc dou procese simultane: formarea iminoesterilor (IV) i hidroliza gruprii esterice formate cu metilsilan, fr a fi afectat ciclul -lactamic. Temperatura i durata reaciei sunt determinate de natura alcoolului folosit. Pentru separarea acidului 6-AP se face hidroliza iminoesterului n mediu slab acid i la temperatur moderat. Acest procedeu ofer randamente foarte bune, fiind aplicate pe scar industrial n unele ri. Cheltuielile de producie la hidroliza chimic sunt mai mici comparativ cu ale procedeului de hidroliz enzimatic i depind n mare msur de preul penicilinei. De asemenea, procedeul hidrolizei chimice conduce la un acid 6-AP pur i cu activitate mare. b) Hidroliza enzimatic a penicilinelor Acest procedeu se bazeaz pe capacitatea unor microorganisme Escherichia coli, Bacterium alcologenes faecalis, Nocardia de a produce enzima Amidaz" capabil s scindeze catena lateral, din peniciline cu eliberarea acidullui 6-AP. Procesul tehnologic de fabricare a acidului 6-AP prin scindare enzimatic a penicilinei cuprinde urmtoarele etape: obinerea masei de Escherichia coli prin fermentaie biochimic i separarea ei de lichidul de cultur; scindarea enzimatic a penicilinei cu E. coli i separarea soluiei de 6AP; concentrarea, cristalizarea i uscarea acidului 6-AP. Prima etap, privind obinerea masei bacteriene, se realizeaz printr-un proces obinuit de fermentaie n trei trepte (inoculator, intermediar, regim) a E. coli pe un mediu steril coninnd extract de porumb, pepton, fenil-acetamid, sruri minerale. Parametrii principali ai procesului de fermentaie sunt redai n tabelul 3.16. Tabelul 3.16. Parametrii de fermentaie a E. Coli Faza de fermentai e Temper atura, C Presiunea , ata Aeraia l aer/l Agitare, mediu rot/min min. Concentr aia masei mg/l Timp, h

pH

91

Inoculator Intermediar Regim

30 1 30 1 30 1

8 8 8

1,8 1,5 1,5

1 1 1 1,2

210 140 110

3,05 3,1 4,1

18 20 18 20 20

Dup atingerea concentraiei n masa celular de 4,1 mg/l, coninutul fermentatorului se trimite la o centrifug unde se separ de lichidul de cultur i se spal cu ap distilat. Biomasa rezultat, cu concentraia de 0,122 gr/l, este trimis n aparatul de scindare unde se nclzete la 35 - 40C. Peste biomasa nclzit, la pH 7,5 se adaug benzilpenicilina potasic n aa fel nct activitatea soluiei s fie de 50 000 UI/ml. n general, 1 kg penicilin este scindat de 1,5 kg E. coli. Procesul de scindare a penicilinei, cu amidaza secretat de E. coli dureaz 4 - 5 ore dup care, masa se rcete la 20C i se separ prin centrifugare soluia cu acid 6-AP de masa micelian, care se utilizeaz la o nou scindare. Soluia obinut conine acid 6-AP i penicilin G nescindat (randamentul scindrii 70 - 75%). Pentru separarea penicilinei nescindate, soluia se aciduleaz la pH 2 - 2,5 i se supune extraciei cu acetat de butil. Stratul apos separat de la extracii, coninnd acidul 6-AP, se neutralizeaz la pH = 1 cu soluie de NaOH, se purific i se concentreaz la vid. Prin acidulare la pH = 3 - 3,5 i rcire la 5C, acidul 6-AP cristalizeaz din soluia concentrat n timp de 10 - 20 ore. n procesul de hidroliz enzimatic se impune gsirea valorilor optime pentru principalii parametri pH i temperatur deoarece pe lng reacii de hidroliz a penicilinei G la acid 6-AP au loc i reacii secundare de degradare a penicilinei i a acidului 6-AP, cu deschiderea ciclului lactamic precum i dezactivarea amidazei. Studiind optimizarea acestui proces enzimatic Ho i Humghrey au demonstrat c randamentul maxim n acid 6-AP se obine la pH = 8 (corespunztor stabilitii maxime pentru acid 6-AP i enzim) i la temperatura de 35 - 40C. Depirea acestei temperaturi accelereaz viteza de inactivare a enzimei i de degradare a ciclului lactamic din penicilin i acid 6-AP. 2. Obinerea clorurilor acide Clorurile acide se obin prin clorurarea acizilor organici corespunztori cu clorur de tionil n exces: RCOOH + SOCl2 > RCOCl + SO2 + HCl Clorurarea se realizeaz n topitur sau n solvent inert (benzen) la temperaturi nu prea ridicate. Dup terminarea reaciei, se distil solventul i clorura de tionil nereacionat, dup care, sub vid, se distil clorura acid. 3. Condensarea acidului 6-AP cu cloruri acide

92

Condensarea acidului 6-AP cu cloruri acide se face n soluie apoas n prezen de NaHCO3, iar dac clorura acid este puin stabil se lucreaz n mediu de solvent (diclormetan sau dicloretan) n prezena trietilaminei, ca agent de legare a acidului clorhidric degajat din reacie. n reactorul de condensare se introduce acidul 6-AP n soluie apoas sau n solvent i agentul de fixare a acidului clorhidric, iar dup rcire la 2 - 3C se adaug clorura acid.

Figura 3.16. Schema de principiu a instalaiei de obinere a penicilinei de semisintez: 1 - aparat scindare; 2 - centrifug; 3 - extractor; 4 - evaporator; 5 - cristalizator; 6 - filtru; 7 - reactor condensare; 8 - aparat concentrare; 9 - cristalizator Adugarea clorurii acide se face n aa fel nct temperatura s nu depeasc 5C (timp de 1 - 1,5 ore), iar perfectarea reaciei se face la 20C , timp de 1 - 1,5 ore. Dup aceasta, masa de reacie rcit la 2 - 5C se aduce la pH = 2 - 2,5 i se extrage cu acetat de butil penicilina format. Din soluia de acetat de butil penicilina se transform n sarea de sodiu cristalizat cu NaHCO 3 sau acetat de sodiu, iar din soluia apoas sarea de sodiu cristalizeaz prin rcire. Prin filtrare, splare cu butanol i recristalizare, se obine penicilina pur, cu randamente cuprinse ntre 60 i 80%.

93