CURS MICROBIOLOGIEConf. Univ. Dr. Maria Balasoiu

ISTORICUL MICROBIOLOGIEI. TAXONOMIE BACTERIANĂ. CRITERII DE CLASIFICARE A MICROORGANISMELOR

1. ISTORICUL MICROBIOLOGIEIMicrobiologia studiază microorganismele şi activităţile lor.Microorganismele sunt vieţuitoare care nu se pot vedea cu ochiul liber, ci numai la

microscop.Termenul de microb a fost utilizat pentru prima oară în 1878 de către Sedillot

(chirurg la Academia de Ştiinţe din Paris), în De linfluence des decouvertes de M. Pasteur sur les progres de la chirurgie. Adevărata natură a microbilor a fost descoperită însă doar în a doua jumătate a secolului XX.

Observarea şi descrierea primelor microorganisme au fost făcute de către olandezul Antonie van Leeuwenhoeck (1632-1723) între 1673-1675; cu ajutorul unui microscop de fabricaţie proprie el a observat nişte creaturi minuscule în apa de ploaie, apa din vazele cu flori, urină, fecale pe care le descrie minuţios: forme rotunde (coci), alungite (bastonaş), de virgulă, spiralate.

Nici Leeuwenhoeck şi nici contemporanii săi nu au realizat importanţa extraordinară a descoperirii sale, atenţia savanţilor îndreptându-se nu spre rolul acestor vieţuitoare, ci spre originea lor. Teoria adoptată de ei era teoria generaţiei spontane: animale ca muşte, şoareci, etc. se nasc din materie putrezită şi din noroi.

În 1650 Francesco Redi, plasând carne într-un borcan şi prezervând-o prin tifon de contactul cu muştele demonstra indubitabil că viermii (larvele) nu se nasc spontan din carne, ci din ouăle depuse aici de către muşte, ca atare au părinţi definiţi.

Controversa însă a continuat. Un adept al teoriei generaţiei spontane, Needham, în 1749, constata că microorganismele prezente în bulionul de carne dispăreau după încălzire, dar reapăreau dacă acest bulion era păstrat pentru un timp, chiar într-un recipient acoperit. Concluzia lui Needham a fost următoarea: dacă microorganismele iniţial prezente, virtualii părinţi, au fost omorâţi prin încălzirea bulionului, microorganismele depistate în final nu puteau să apară decât spontan.

Teoria lui Needham a fost combătută de Lazzaro Spallanzani (1729-1799) care a demonstrat eroarea făcută de Needham: măsuri ineficiente pentru a împiedica pătrunderea microorganismelor din aer în bulionul de carne fiert. El a închis ermetic flacoanele cu bulion fiert. După mai multe zile, în flacoanele închise microorganismele nu apăreau, în timp ce ele erau prezente în cele lăsate deschise.

Au urmat apoi o serie de experimente, având ca aspecte comune: distrugerea prin căldură a microorganismelor din bulion (sterilizarea) şi prevenirea accesului în bulionul sterilizat a unor elemente particulare, purtătoare de microorganisme.

Astfel, din anii 1860 teoria generaţiei spontane era complet discreditată.Elaborarea teoriei microbiene a bolilor infecţioase este meritul lui Louis Pasteur

(1822-1895), fondatorul microbiologiei ca ştiinţă.Primele observaţii ale sale apar în timpul experienţelor în care sarea de amoniu a

acidului paratartric, se descompune în acid tartric levogir, iar lichidul care îl conţine se

tulbură. Examinând lichidul la microscop el descoperă prezenţa unei ciuperci, Penicillium glaucum, care metabolizează substratul.

Ulterior L. Pasteur a studiat: procesele de fermentaţie la solicitarea producătorilor de vin şi a descoperit că fermentaţia se datora unor anumiţi microbi; a identificat microorganisme care determinau boala viermilor de mătase şi a demonstrat că acestea se transmit de la un vierme la altul răspândind boala; prin inactivarea sau atenuarea microorganismelor cauzale a preparat vaccinuri pentru prevenirea turbării, antraxului, holerei găinilor; a preparat vaccinul antirabic fără să cunoască natura virală a agentului etiologic; căutând să împiedice fermentaţia care producea mari pagube producătorilor de vinuri, el încălzeşte vinul la 60-70C distrugând microorganismele responsabile - astfel a introdus sterilizarea care-i poartă numele, pasteurizarea, folosită şi azi pe scară largă în industria alimentară.

Împreună cu Joubert şi Chaamberland prezintă la 29 aprilie 1878 celebra lucrare: La théorie des germes et ses applications à la médicine et à la chirurgie, lucrare care a prezentat ideile fundamentale ale teoriei microbiene.

În aceeaşi perioadă, Tyndall descoperea cele două forme de existenţă a unei bacterii: vegetativă (sensibilă la căldură) şi sporulată (rezistentă chiar şi la fierbere îndelungată). El introduce o metodă de sterilizare fracţionată, prin încălzirea discontinuă a produselor, cunoscută sub numele de tyndalizare.

Contemporan cu Pasteur a fost Robert Koch (1843-1910). Prima sa descoperire a fost sporul bacilului cărbunos, în timp ce examina cultura acestui germene pe un preparat nativ între lamă şi lamelă.

El introduce în practica bacteriologică examinarea morfologică a microbilor pe frotiuri fixate şi colorate.

În cultivarea microbilor foloseşte gelatina pentru solidificarea mediilor de cultură şi obţine primele colonii izolate.

Robert Koch a izolat: bacilul antraxului, bacilul tuberculozei (BK) în 1882 şi a demonstrat cauzele acestei boli; vibrionul holeric şi calea de transmitere a bolii.

Teoria germenilor a fost sintetizată şi validată sub forma a trei postulate formulate de Robert Koch în 1882 la şedinţa Societăţii de Ftiziologie din Berlin şi anume:- în corpul tuturor bolnavilor de o anumită boală microorganismul care a determinat boala se găseşte răspândit în raport cu simptomele şi cu leziunile observate;- microorganismul se izolează din corpul bolnavului şi poate fi menţinut în culturi pure pentru studii de laborator;- acest microorganism inoculat la un animal receptiv reproduce o infecţie experimentală asemănătoare cu cea naturală, putând fi reizolat din corpul animalului infectat.

Elevii şi colaboratorii lui Pasteur au continuat studiul agresiunii microbiene asupra organismului animal.

Dezvoltarea microbiologiei a avut un impact deosebit asupra igienei, a epidemiologiei bolilor transmisibile şi chirurgiei prin generalizarea antisepsiei şi asepsiei. Astfel, Semmelweis (1818-1865), şeful clinicii vieneze de obstetrică, reduce mortalitatea lehuzelor de la 18% la 1,27% obligând personalul sanitar şi studenţii care lucrau la disecţia cadavrelor să se spele pe mâini cu clorură de var.

În acelaşi timp, Joseph Lister (1827-1912), chirurg din Edinburgh, introduce în clinica sa asepsia prin pulverizarea acidului carbonic în sălile de operaţie.

Elevul lui Pasteur, Ilia Mecinikov (1845-1916) a descoperit fagocitoza şi rolul inflamaţiei în apărarea antimicrobiană.

Charles Richet a descoperit prima reacţie antigen-anticorp, adică reacţia de antiglutinare, stabilind astfel bazele imunologiei.

Bazele geneticii au fost puse în 1940 prin experimentul lui Oswald Avery, Colin M., Leod şi Maclyn Mc Carty.

Epoca „chimioterapiei antimicrobiene” a fost deschisă de Paul Ehrlich (1854-1915) care a utilizat Salvarsanul (un compus arsenical) pentru terapia sifilisului, descoperirea sulfamidelor de către Domagk (1932) şi descoperirea penicilinei de către Alexander Fleming (1881-1955) în 1928, introdusă în practica medicală în 1941, după purificarea şi stabilizarea ei de către doi chimişti de la Oxford: Florey şi Chain.

MICROBIOLOGIA ROMÂNEASCĂÎntemeietorul microbiologiei româneşti este Victor Babeş (1854-1926), profesor de

bacteriologie şi anatomo-patolog la Bucureşti. 1005 lucrări, printre care primul tratat de bacterologie din lume, scris în 1885 împreună cu Victor Cornil, tratat intitulat „Les bacteries et leur role dans l’etiologie, l’anatomie et l’histologie pathologique des maladies infectieuses”; descoperiri: granulele metacromatice ale bacilului difteriei (corpusculul Babeş-Ernst); 40 specii microbiene; 2 specii protozoare, genul Babesielle; studii asupra turbării, leprei şi pelagrei; a introdus la noi în ţară vaccinul antirabic, seroterapia antirabică şi seroterapia antidifterică; organizează primul institut de cercetare medicală din România „Victor Babeş” şi primul laborator de igienă şi bacteriologie din ţară.

Ion Cantacuzino (1863-1934) a fost profesor la catedra de medicină experimentală din Bucureşti, efectuând studii în domeniul holerei, al imunităţii umorale şi al imunităţii celulare. 1913: aplică în armata română, aflată în plină epidemie de holeră, vaccinul antiholeric cu vaccin omorât; 1906: introduce în ţară vaccinarea antituberculoasă cu BCG; 1910: înfiinţează primele sanatorii de TBC şi primele spitale de boli infecţioase; 1921: Institutul de Seruri şi Vaccinuri „Ion Cantacuzino”.

Constantin Levaditi (1874-1953) a fost profesor la Institutul Pasteur din Paris. A desfăşurat o activitate ştiinţifică deosebită în domeniile: imunologie, virusologie, bacteriologie, parazitologie şi chimioterapie. Împreună cu elevul său Ştefan S. Nicolau pun bazele învăţământului virusologic în ţara noastră, astăzi Institutul de Virusologie „Şt. S. Nicolau”.

Alte personalităţi marcante ale microbiologiei româneşti: Prof. Dr. Nicolae Cajal, Prof. Dr. C. Ionescu Mihăieşi, Prof. Dr. M. Ciucă, Prof. Dr. D. Combiescu, Prof. Dr. Lidia şi I. Mesrobeanu, Prof. Dr. Eugenia M. Duca şi alţii.

2. TAXONOMIETaxonomie (taxinomie), provenind din grecescul „taxis” care înseamnă ordine,

aranjare, este ştiinţa clasificării organismelor.Organismele vii au fost împărţite iniţial în 2 regnuri: vegetal şi animal.

În secolul al XIX-lea s-a observat că microorganismele prezintă nu numai asemănări, dar şi deosebiri faţă de cele 2 regnuri. Sesizând aceste diferenţe Haekel, în 1866, propune unirea microorganismelor cunoscute într-un regn aparte numit PROTISTA, care să cuprindă: algele, protozoarele, fungii şi bacteriile.

În secolul al XX-lea, prin dezvoltarea mijloacelor de cercetare, s-a demonstrat că microorganismele încadrate iniţial în acest regn diferă în mod fundamental unele de celelalte. Astfel, celulele bacteriene au o dezvoltare mult mai simplă, fiind desemnate ca celule de tip PROCARIOT, spre deosebire de alge, protozoare şi fungi, care posedă o structură mai complexă de tip EUCARIOT.

Ca urmare, termenul de PROTISTA s-a restrâns numai pentru organismele unicelulare de tip eucariot, iar bacteriile aparţin unui regn aparte numit PROCARIOTE, din care fac parte: archaebacteriile, eubacteriile şi cyanobacteriile (algele albastre).

EUBACTERIILE sunt:- bacteriile clasice, care au forme variate şi perete celular; - chlamydiile, care sunt bacterii cu parazitism intracelular obligatoriu, cu mecanism unic de multiplicare în lumea bacteriilor;- ricketsiile, care sunt bacterii cu habitat intracelular, dar cu diviziune directă (ca la majoritatea bacteriilor); - mycoplasmele, care sunt bacterii cărora le lipseşte peretele celular.

La acestea se adaugă:

VIRUSURILE, care sunt considerate microorganisme, cu toate că se deosebesc fundamental de acestea. Ele sunt formate dintr-un singur acid nucleic (ADN sau ARN), învelit de o capsulă proteică. Sunt incapabile să-şi determine propriile sinteze în afara aparatului de sinteză al unei celule eucariote (parazitism intracelular).

PRIONII sunt entităţi infecţioase de dimensiuni foarte mici (5 nm) de natură proteică, cauza unor boli ale SNC: boala KURU, Jacob-Creutzteld.

PARAZITII , organisme unicelulare(protozoare) sau pluricelulare(helminti)

FUNGII, organisme unicelulare – specii de Candida.

BACTERIOLOGIE

NOMENCLATURA BACTERIANĂDenumirea ştiinţifică a microbilor se face prin nume LATINIZATE. Se porneşte de

la un substantiv grec sau latin care denumeşte cel mai evident caracter al microorganismelor reunite într-o unitate taxonomică şi primeşte un sufix latin.

CLASIFICARE TAXONOMICĂClasificarea (gr. Kleiss-distribuţie; Classis-apel, grup, adunare, diviziune) este

aşezarea obiectelor, substanţelor, conceptelor, organismelor în grupe ordonate ierarhic în funcţie de asemănări şi înrudiri stabilite prin anume criterii.

Prima clasificare a microbilor apare în opera botanistului Charles Linne în 1767, operă numită „SYSTEMA NATURAE”, în clasa „chaos influsoria”. În prezent bacteriile se clasifică după criteriile stabilite de Comitetul Internaţional de Sistematică a Uniunii Internaţionale a Societăţilor de Microbiologie. Acest comitet editează, la intervale regulate, un manual „BERGEY’S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY”, în care se prezintă ultimele modificări ale taxonanomiei bacteriene.

Microorganismele fac parte din grupul Phyla ce conţine: clase ordine - primesc sufixul „ales” - ex: Spirochetales; Eubacteriales; familii - primesc sufixul „aceae” - ex: Enterobacteriaceae; triburi - primesc sufixul „ceae” - ex: Streptocaccocaceae; genuri - primesc sufixul: „us” (ex: Streptococcus, Staphylococcus); „um” (Clostridium); „a” (Leptospira, Shigella, Salmonella); „as” (Pseudomonas); specii - Gen ( cu majusculă) + determinativ genitiv (cu literă mică). Ex: Staphylococcus aureus, Bordetella pertussis, Haemophilus influensae, Pasteurella pestis etc.

În specii se disting tipuri (serotip - diferă pe baza proprietăţilor antigenice; biotip - diferă pe baza proprietăţilor metabolice; lizotip - diferă pe baza sensibilităţii la bacteriofagii litici), variante şi tulpini (tabelul 1).

Stafilococ aureu

Streptococ β-hemolitic

Bacil tific

Ordin Eubacteriales Eubacteriales EubacterialesFamilie

Micrococcaceae

Lactobacteriaceae(Streptobacteriaceae)

Enterobacteriaceae

Trib - Streptococceae -Gen Staphylococcu

sStreptococcus Salmonella

Specie

Staphylococcusaureus

Streptococcus pyogenes grup A

Salmonella typhi

Tabelul 1: Exemple de încadrare taxonomică a unor bacteriiMORFOLOGIA ŞI STRUCTURA CELULEI BACTERIENE. SPORUL ŞI

SPORULAREA. DIVIZIUNEA CELULEI BACTERIENE

1. MORFOLOGIA BACTERIILORBacteriile sunt organisme unicelulare asexuate (celula somatică fiind şi celula

reproducătoare), procariote (cu nucleu alcătuit dintr-un unic cromozom, fără membrană nucleară, fără nucleoli), haploide (cu unic set de gene), divizibile în celule identice.

Dimensiunea, forma şi aşezarea bacteriilor, criteriu important pentru identificarea lor, este posibilă cu ajutorul microscopului optic, utilizând preparatul nativ şi preparatul fixat şi colorat (frotiu), dar detaliile morfologice şi structurale pot fi puse în evidenţă numai prin microscopie electronică.

1.1. DIMENSIUNI

Dimensiunile bacteriilor se exprimă în micrometri (1m = 10-3 mm), variaţiile fiind în funcţie de specie, formă, mediu şi vârsta culturii. În general, dimensiunea bacteriilor este cuprinsă între 1-10m.

Cele mai mici bacterii sunt reprezentanţii genului Mycoplasma (diametrul 0,3-0,8m), pe când cele mai mari ajung până la o lungime de 10m (bacilul antraxului), 15-20m (spirochetele).

Formele filamentoase, cum sunt actinomicetele, pot atinge o lungime până la 500m.

1.2. FORMĂ

În lumea bacteriilor se întâlnesc diferite forme tipice pentru o anumită specie, cu unele variaţii în funcţie de condiţiile de mediu şi de vârstă. Se disting următoarele forme fundamentale de bacterii: coci, bacili, cocobacili, vibrioni, spirili şi spirochete şi forme filamentoase.

- Cocii sunt bacterii sferice (genul Staphylococcus), ovalare (genul Streptococcus), lanceolate (specia Streptococcus pneumoniae), reniforme (genul Neisseria) cu diametrul de 0,8-1m.

- Bacilii sunt bacterii cu formă alungită de bastonaş cu dimensiuni între 1,5-10m. La bacili este importantă examinarea extremităţilor, aspectul acestora având rol în identificarea lor. Astfel, bacilii pot prezenta capetele rotunjite (familia Enterobacteriaceae), tăiate drept (Bacillus anthracis-bacilul cărbunos), măciucate (Corynebacterium diphteriae-bacilul difteric), în formă de suveică (Fuzobacterium).

- Cocobacilii sunt bacterii uşor alungite, fiind forme intermediare între coci şi bacili (Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae).

- Vibrionii sunt bacterii încurbate în formă de virgulă: vibrionul holeric (Vibrio cholerae), vibrionii saprofiţi (intestin, ape).

- Spirilii şi spirochetele sunt bacterii spiralate, lungi, foarte subţiri. În cazul spirililor corpul bacteriei este rigid (genul Spirillum), pe când la spirochete corpul este flexibil şi mult mai subţire (genurile Borrelia, Treponema şi Leptospira).

- Actinomicetele sunt bacterii foarte asemănătoare fungilor şi formează filamente sau hife lungi şi ramificate care se rup, rezultând forme bacilare (Actinomyces).

1.3. AŞEZARE

Bacteriile sunt organisme unicelulare care se multiplică prin diviziune binară. La unele specii, după diviziune urmează separarea completă a celulelor fiice, rezultând bacterii izolate. La alte specii, după diviziune, celulele fiice rămân legate între ele, determinând diferite tipuri de aşezare a celulelor. Aşezarea bacteriilor (figura 1) permite uneori recunoaşterea genului, sau chiar a speciei, prin examinarea la microscopul optic a preparatelor colorate efectuate din culturi sau direct din produsul patologic recoltat de la pacient.

Cocii se pot aşeza:

în grămezi neregulate: germenii din genul Staphylococcus; în lanţuri la genul Streptococcus; în tetrade (patru indivizi aşezaţi simetric): genul Micrococcus; în baloturi de câte 8 indivizi aşezaţi simetric la genul Sarcina; în diplo, ca două flăcări de lumânare care se unesc prin bazele lor, la specia Streptococcus pneumoniae; în diplo, ca două boabe de cafea care se privesc faţă în faţă prin concavităţile lor, la genul Neisseria: N. gonorrhoeae (gonococ); N. meningitidis (meningococ).

Bacilii se pot aşeza: cel mai ades izolaţi şi în poziţii întâmplătoare unul faţă de celălalt: majoritatea bacililor Gram negativi; grupaţi câte doi (diplobacili): genul Klebsiella; dispuşi în lanţuri (streptobacili): germeni din genul Bacillus (bacilul cărbunos); dispuşi în mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezeşti: Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis; în palisadă, ca scândurile unui gard: Mycobacterium leprae.

Figura 1: Forme fundamentale şi aşezare la bacterii (după Dumitru Buiuc 1992)

2. STRUCTURA CELULEI BACTERIENEUnitatea morfofuncţională a bacteriilor este celula. Bacteriile au, ca tip de celulă,

celula procariotă, care se deosebeşte de celula eucariotă prin structura şi organizarea ei. Diferenţele esenţiale între celula eucariotă şi celula procariotă sunt prezentate în tabelul 1.

Caracter Celula eucariotă Celula procariotă

Dimensiuni - mari (10 - 100m) - mici (1 - 10m)

Organizare- multicelulară, de obicei, cu diferenţieri funcţionale – ţesuturi

- unicelulară (populaţii)

Modalităţi de reproducere

- mitoză sau meioză - diviziune directă (fisiune binară sau sciziparitate)

Nucleu- cromozomi 2n (diploid) sau n (haploid)- nucleol prezent- membrană nucleară prezentă (material ADN concentrat)

- cromozom unic, inelar- moleculă ADN dublu helix- nucleol absent- membrană nucleară absentă (material ADN dispus difuz cu concentrare maximă la centru)

Membrana citoplasmatică

- conţine steroli - nu are în structură steroli (excepţie genul Mycoplasma)

Citoplasmă

- este compartimentată- organite tubulare prezente: reticul endoplasmatic, mitocondrii, aparat reticular intern Golgi, lizozomi

- ribozomii fixaţi pe reticulul endoplasmatic rugos, sunt de 80 S cu subunităţi de 40 S şi 60 S

- este necompartimentată- organite tubulare absente

- ribozomi liberi în citoplasmă, sunt de 70 S cu subunităţi de 30 S şi 50 S

- organite particulare prezente: mezozomi, oxizomi, plasmide

Strat periferic corp celular

- membrana celulară - perete celular

Elemente anexă

- cilii (rar) - cili, fimbrii, capsulă

Forme de rezistenţă

- nu există - spori

Tabel 1: Diferenţe între celula eucariotă şi procariotă (după V. Bîlbîe şi N. Pozsgi 1984)

Bacteriile au o structură foarte complexă, fiind alcătuite din: componente obligatorii şi componente facultative.- Componentele obligatorii sau elementele intrinseci sunt prezente la toate speciile bacteriene şi sunt reprezentate de: nucleu, citoplasmă, membrană citoplasmatică şi perete celular. - Componentele facultative sau elementele anexă sau extrinseci se găsesc doar la unele specii bacteriene şi sunt reprezentate de cili sau flageli, fimbrii şi capsulă.

Deşi mult mai mici şi mai simple decât celulele eucariote, bacteriile sunt asemănătoare cu acestea în ceea ce priveşte mecanismele funcţionale celulare, prezentând o organizare complexă cu o arhitectură externă şi internă distinctă (figura 2).

Figura 2: Schema generală de organizare a celulei bacteriene (după V. Bîlbîe şi N. Pozsgi 1984)

2.1. ELEMENTE ANEXĂ (EXTRINSECI)2.1.1. CILII (FLAGELII) BACTERIENI

Cilii sau flagelii sunt formaţiuni filamentoase ale speciilor microbiene mobile, foarte lungi, subţiri, fragile. Sunt structuri helicoidale, prezenţi mai ales la bacili (familia Enterobacteriaceae) dar şi la unii coci (enterococ).

Sunt formaţiuni implicate în locomoţie, a căror existenţă este controlată genetic. Astfel, la E. Coli s-a stabilit că pentru sinteza cililor cooperează aproximativ 30 de gene, a căror informaţie este necesară biosintezei constituenţilor structurali ai cilului, în asamblarea acestora, precum şi în chemotaxie şi mobilitate.

Dispoziţia şi numărul cililor sunt caracteristice speciei (figura 3). S-au descris bacterii atriche (fără cili), monotriche - cu un cil polar (Vibrio cholerae) sau subpolar (enterococ), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei (Pseudomonas fluorescens), amfitriche - cu cilii situaţi la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) şi peritriche - cu cilii dispuşi pe întreaga suprafaţă a bacteriei (Salmonella, E. coli, Proteus, etc.).

Figura 3 : Tipuri de celule bacteriene în raport cu dispoziţia cililor (după A. Ivanof şi M. Ciupe, 1982)

Din punct de vedere al compoziţiei chimice, cilii conţin o proteină contractilă denumită flagelina, asemănătoare cu miozina din celula musculară animală. În compoziţia flagelinei, a fost descris un aminoacid caracteristic N-metil-lizina, care apare în cursul sintezei flagelului, prin modificarea structurii chimice a lizinei, după încorporarea acesteia în proteina flagelară.

Motilitatea cililor are la bază eliberarea de legături macroergice prin descompunerea ATP ® ADP + radical fosforic (acceptor de radical fosforic este molecula de arginină).

Cilii se evidenţiază la microscopul optic numai pe fond întunecat sau după coloraţii speciale (precedate de tehnici de tratare pentru precipitarea proteinelor flagelare şi mordansare). Structura intimă a cililor bacterieni este furnizată de microscopia electronică. Astfel a fost descrisă existenţa a trei componente morfologic distincte: corpul bazal, cârligul şi filamentul terminal (figura 4).

- Corpul bazal (granulaţia bazală) reprezintă componenta cilului prin care acesta se ataşează la corpul celulei bacteriene. Este o componentă structurală complexă, montată în întregime în peretele celular şi membrana citoplasmatică. Este constituit din patru discuri paralele, dispuse sub forma a două perechi pe o tijă care trece prin centrul lor. La bacteriile Gram negative există două perechi de discuri ce delimitează corpul bazal: o pereche internă (inele M şi S) localizată în membrana citoplasmatică şi o pereche externă situată spre cârlig (inele L şi P) în care discurile sunt mai distanţate. Cele patru discuri au fost denumite M, S, P şi L după presupusa lor ataşare la nivelul membranei citoplasmatice, spaţiului periplasmatic, stratului de peptidoglican şi respectiv stratului lipopolizaharidic. La bacteriile Gram pozitive există o singură pereche de discuri ancorată în membrana citoplasmatică.

La nivelul corpului bazal se află motorul ciliar, a cărui mişcare este transmisă proteinei flagelare, ceea ce face ca cilul să se învârtească în sens orar (rostogolirea bacteriei cu schimbarea direcţiei de mişcare) sau antiorar (deplasarea bacteriei în linie dreaptă).

bacterieatriche

bacteriemonotriche

bacterieamfitriche

bacterielofotriche bacterie

peritriche

Figura 4: Structura cililor (după George A. Wistreich, Max D. Lechtman 1988)- cârligul cilului - un manşon îndoit în unghi drept;- filamentul cilului - liber în afara celulei, cu lungime de 15-25 m.

Cilii sunt organe de locomoţie pentru bacterii. Mobilitatea şi direcţia mişcării cililor este asociată cu proprietatea de chemotaxie, care este o mişcare dirijată înspre sau dinspre o substanţă chimică. Există o chemotaxie pozitivă care se referă la mişcarea spre o concentraţie pozitivă a unei substanţe chimice (zaharuri, aminoacizi) şi aceasta se întâlneşte în mod obişnuit când substanţa chimică reprezintă un avantaj pentru celulă (substanţă nutritivă). Se vorbeşte şi de o chemotaxie negativă, o mişcare prin care bacteria se depărtează de o substanţă chimică (fenolul, acizii, bazele), de obicei când aceasta este dăunătoare, toxică pentru celulă. Stimulii chimici care induc chemotaxia pozitivă sunt numiţi atractanţi, iar cei care induc chemotaxia negativă - repelenţi.

Cilii sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante în identificarea bacteriilor (exemplu Salmonella), stimulând un răspuns imun. În plus, pot îndeplini rolul de receptori pentru virusuri şi în unele cazuri determină aderarea de epitelii (la vibrionul holeric cilul intervine în aderarea de epiteliul intestinal).

În practica de rutină nu se evidenţiază flagelii, ci mobilitatea bacteriilor, fie prin examinarea lor pe un preparat nativ între lamă şi lamelă în care se urmăresc mişcările bacteriilor, fie prin însămânţarea tulpinii pe un mediu semisolid prin înţeparea în profunzime a mediului. Dacă bacteria creşte numai pe traseul de însămânţare este imobilă, dacă difuzează în mediu, ea este mobilă.

2.1.2. FIMBRIILE (PILII)Fimbriile sau pilii sunt prelungiri scurte, rigide şi groase evidenţiate mai ales la

speciile bacteriene Gram negative (speciile familiei Enterobacteriaceae, Neisseria gonorrhoeae) şi mai puţin la bacteriile Gram pozitive (Streptococcus, Corynebacterium). S-a constatat că în cadrul aceleaşi specii pot exista tulpini fimbriate şi tulpini nefimbriate. Sunt elemente mai rezistente decât flagelii, în număr de 100-500/celulă, cu dispoziţie peritrichă, cu evidenţiere numai prin microscopie electronică.

Din punct de vedere chimic sunt polimeri proteici de pileină care rezistă la tripsină, pepsină, acizi, baze. Această natură proteică a pililor le conferă proprietăţi antigenice.

Funcţional, pilii se împart în două categorii:

- pili comuni sau pili de aderenţă (fimbri) a căror sinteză este controlată de gene cromozomiale. Se găsesc în număr de 100-200 pe suprafaţa celulei şi au rol în aderarea de diferite suprafeţe, în special epitelii, de unde şi denumirea de adezine, care iniţiază procesul infecţios. Pilii comuni constituie un factor important de virulenţă (de exemplu la gonococ). În afară de aderenţă, aceşti pili mai au şi proprietăţi antifagocitare.

- pilii “de sex” (sex pilii) sunt formaţiuni puţin mai lungi, flexibile, cu structură şi formă diferită (sferică, formă de cupă, de disc), în număr de 1-4 pe celulă şi întotdeauna codificaţi de formaţiunile genetice extracromozomiale - plasmide. Aceşti pili prezintă o importanţă deosebită în transferul de material genetic între bacterii, formând punţi între celula donatoare şi cea receptoare, în cursul procesului de conjugare. Sunt prezenţi mai ales la bacteriile Gram negative (Enterobacteriaceae, Pseudomonas).

Ambele categorii de pili prezintă antigene specifice piliare şi pot fi receptori pentru bacteriofagi.

2.1.3. CAPSULAUnele microorganisme secretă la suprafaţă un înveliş extracelular ce înconjoară

peretele celular. În funcţie de structură şi de raporturile pe care le stabileşte cu celula bacteriană, se poate vorbi de capsulă propriu-zisă, microcapsulă şi strat mucos (glicocalix).

Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de natură polizaharidică (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella, Haemophilus, Bordetella), formând o reţea strânsă peste peretele celular (Streptococcus pneumoniae) sau având o structură lamelară (Klebsiella). Mai rar, capsula poate fi de natură proteică (bacilul cărbunos).

Rolul cel mai important al capsulei este legat de patogenitatea bacteriei (factor de virulenţă): capsula împiedică fagocitarea bacteriilor care reuşesc, astfel, să scape de sub acţiunea mecanismelor de apărare ale organismului. La speciile capsulate, pierderea capsulei are ca rezultat pierderea virulenţei, fie direct, fie indirect prin efectul chemotactic negativ al substanţelor pe care le conţine (exemplu: Streptococcus pneumoniae, de tip S, capsulat, produce la şoarecele alb de laborator o septicemie mortală, pe când varianta necapsulată nu este patogenă).

Capsula este o structură cu proprietăţi antigenice specifice care permit diferenţierea unor serotipuri în cadrul speciei. Pe baza antigenului capsular se poate face tipizarea bacteriilor (la Str. pneumoniae polizaharidul capsular determină peste 80 de tipuri antigenice, iar la Haemophilus 6 tipuri antigenice). Funcţiile capsulei: protejează bacteriile de diferiţi agenţi antibacterieni din mediu cum sunt: bacteriofagii, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice; protejează bacteriile de acţiunea fagocitelor (factor de virulenţă); reprezintă sediul antigenelor capsulare, importante în identificarea acestor bacterii.

2.2. ELEMENTE INTRINSECI

2.2.1. NUCLEOIDUL (NUCLEUL) BACTERIANMaterialul nuclear bacterian (nucleoidul) are o organizare primitivă în comparaţie

cu nucleul celulelor eucariote, în sensul că nu are membrană nucleară şi nici nucleoli, aceasta fiind principala caracteristică structurală a celulelor procariote.

Din punct de vedere chimic ADN este constituit din baze azotate purinice (adenină-A şi guanină-G), baze azotate pirimidinice (citozină-C şi timină-T), un zahar (dezoxiriboză) şi acid fosforic. O bază azotată purinică sau pirimidinică legată de o moleculă de dezoxiriboză şi de un radical fosforic reprezintă o unitate funcţională numită nucleotid; nucleotidele, la rândul lor, sunt unite între ele prin componentele fosforice formând un lanţ polinucleotidic (catenă). Structura dublu helicoidală a ADN (model propus de Watson şi Crick în 1953) se realizează prin înfăşurarea a două lanţuri polinucleotidice, orientate cu bazele spre interiorul structurii, astfel încât faţă în faţă să se găsească întotdeauna fie adenina şi timina, fie citozina şi guanina. Structura spaţială astfel formată se stabilizează prin două legături de hidrogen între timină şi adenină şi trei legături de hidrogen între citozină şi guanină.

Funcţia nucleului bacterian constă în depozitarea informaţiei genetice necesară autoreplicării precum şi pentru organizarea structurală şi funcţională a celulei bacteriene. Constituie sediul eredităţii cromozomiale şi asigură toate caracterele specifice de specie ale bacteriei respective.

- Autoreplicarea ADN (diviziunea nucleului) precede diviziunea celulară şi este de tip semiconservativ, adică fiecare moleculă de ADN nou formată conţine un lanţ polinucleotidic din molecula de ADN parentală şi un lanţ polinucleotidic nou sintetizat. Nucleul are rol esenţial în multiplicarea bacteriilor. Diviziunea nucleului începe printr-un clivaj longitudinal al cromozomului, catalizat de ADN-polimerază şi urmat apoi de resinteza catenei complementare. În celulă apar două lanţuri bicatenare (identice între ele şi identice cu parentalul) care se separă şi migrează spre polii celulei (împreună cu mezozomii care s-au dedublat concomitent cu nucleul). Apare peretele despărţitor, iar cele două celule se separă. În acest fel se transmit toate caracterele de specie la descendenţi.

- Heteroreplicarea (sinteza proteinelor proprii bacteriei). Nucleul dirijează această sinteză pe baza informaţiei conţinută în ADN. Informaţia genetică este transmisă de la molecula de ADN la ribozomi prin intermediul ARN mesager (ARNm) sau informaţional (prima transcripţie). Sinteza de ARNm (lanţ unic de nucleotide, fiecare nucleotid având în structură riboză, o bază azotată - guanina, citozina, adenină sau uracil- şi o moleculă de acid fosforic) este catalizată de ARN-polimerază pe modelul constituit de unul din lanţurile ADN. Moleculele de ARNm migrează apoi în citoplasmă la sediile de sinteză a proteinelor reprezentate de ribozomi, unde vor servi ca tipar sau matriţă pentru asamblarea acizilor aminaţi în lanţuri polipeptidice (a doua transcripţie). Aminoacizii de structură activaţi enzimatic sunt transportaţi din citoplasmă la ribozomi de molecule de ARN de transport sau solubil (ARNt) specifice fiecărui aminoacid.

În afară de ADN cromozomial, la unele bacterii sunt prezente molecule circulare mici, extracromozomiale de ADN care se numesc plasmide şi care se replică independent de cromozomul bacterian.

2.2.2. CITOPLASMASituată între materialul nuclear şi faţa internă a membranei citoplasmatice,

citoplasma este un sistem coloidal complex alcătuit din aproximativ 80% apă, în care se găseşte o cantitate mare de molecule organice mici (rezultate ale metabolismului bacterian), ioni anorganici, enzime şi acizi ribonucleici (ARN ribozomal, ARN de transport, ARN mesager). În funcţie de specie, în citoplasma bacteriilor se mai pot găsi: plasmide, vacuole şi incluzii. Este necompartimentată fiind lipsită de unele organite celulare prezente la celulele eucariote, cum sunt reticulul endoplasmatic, aparatul Golgi, mitocondriile.

a. RibozomiiPrincipalele elemente ale citoplasmei, sunt structuri sferice, mai mici decât

ribozomii celulelor eucariote, şi reprezintă sediul sintezelor proteice din celulă. Au constanta de sedimentare de 70S (compleţi), ce se menţine stabilă în prezenţa

unei anumite concentraţii de Mg2+ şi K+ din citoplasmă. În absenţa ionilor de Mg2+ are loc disocierea ribozomilor în subunităţi de 50S şi 30S (incompleţi), subunităţi care reprezintă ţintă pentru acţiunea unor antibiotice (streptomicină, eritromicină, cloramfenicol).

Din punct de vedere chimic sunt alcătuiţi din 60% ARN şi 40% proteine. O parte de ribozomi se asociază formând polizomi (mai ales în timpul sintezelor proteice), alţii sunt liberi, iar o a treia categorie se ataşează mezozomilor sau membranei citoplasmatice.

La nivelul ribozomilor sunt sintetizate toate enzimele necesare metabolismului care caracterizează fiziologia bacteriei.

b. MezozomiiSunt structuri membranare care se formează prin invaginarea membranei

citoplasmatice sub formă de buzunar sau în deget de mănuşă, prezente la bacteriile Gram pozitive şi ocazional la cele Gram negative. Ei formează în citoplasmă cavităţi deschise spre spaţiul periplasmic (spaţiul dintre membrana citoplasmatică şi peretele celular) şi sunt în contact direct cu materialul nuclear. Au o organizare mai complexă la bacteriile Gram pozitive şi sunt mai rudimentari la bacteriile Gram negative.Funcţiile mezozomilor participă la replicarea cromozomului bacterian şi diviziunea celulară; sediul unor enzime hidrolitice care îndeplinesc rolul enzimelor lizozomale de la celulele eucariote; sinteza şi secreţia unor exoenzime (penicilinaza sau cefalosporinaza); participă la reacţiile de fosforilare oxidativă şi oxidoreducere (minor).

c. PlasmideleOrganite specifice celulei procariote, reprezintă unităţi genetice

extracromozomiale prezente numai la unii indivizi bacterieni (se pot transfera de la un individ bacterian la altul). Sunt molecule circulare de ADN, mici, capabile să se replice

independent de cromozomul bacterian şi care sunt responsabile de ereditatea extracromozomială (rol în transmiterea unor caractere cum este rezistenţa la antibiotice).

d. Incluziile granulare (depozite de substanţe de rezervă)Descrise la unele specii bacteriene, sunt formaţiuni structurale inerte, temporare,

de diferite dimensiuni, variind în funcţie de specia bacteriană şi condiţiile de mediu. Compoziţia lor chimică este diferită, ele putând fi de:

- glicogen (la specii din familia Enterobacteriaceae); - asemănătoare amidonului (la unii bacili aerobi sporulaţi - genul Clostridium); - lipide (la genul Bacillus); - polimetafosfaţi (sau incluziile de volutină descrise de Babeş şi Ernst la bacilii difterici), etc.

Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolică a celulei bacteriene şi reprezintă un material de rezervă care poate fi folosit ca sursă de energie.

e. VacuoleleVacuolele, alte organite intracitoplasmatice, sunt formaţiuni sferice, care conţin

substanţe lichide sau gazoase, înconjurate de un înveliş lipoproteic unistratificat.

f. OxizomiiReprezintă sediul enzimelor de oxidoreducere. Sunt organite specifice celulei

procariote. În oxizomi se găsesc citocromii, citocromoxidaza, flavin-enzima etc., iar în oxizomi şi materialul solubil se găsesc şi enzimele ciclului Krebs: SDH (se găseşte în cantitate crescută în oxizomi şi în cantitate scăzută în materialul solubil); malic-DH (se găseşte în cantităţi egale, atât în oxizomi, cât şi în materialul solubil); aconitază, izocitric-DH, a-Ketoglutaric-DH (se găsesc în cantităţi scăzute în oxizomi şi în cantităţi crescute în materialul solubil).

2.2.3. MEMBRANA CITOPLASMATICĂ

Apare ca un strat foarte subţire care înconjoară citoplasma şi este foarte aderentă de peretele celular. Este o membrană fină (6,5-7nm), elastică, lipsită de rezistenţă mecanică, reprezentând zona unde se produc fenomenele de permeabilitate osmotică şi selectivă (membrană “semipermeabilă”).

Pe secţiune, membrana apare trilaminată, având drept compoziţie chimică două straturi fosfolipidice dispuse cu părţile hidrofobe faţă în faţă. Printre moleculele fosfolipidice se găsesc molecule proteice (grupări polare, permeaze-translocaze), situate fie la nivelul unuia dintre cele două straturi fosfolipidice, fie le traversează fiind expuse la ambele feţe ale membranei.

Funcţional, membrana îndeplineşte următoarele roluri: este o membrană semipermeabilă, care reglează schimburile ce au loc între celula bacteriană şi mediul extern, atât prin procese active specifice, cât şi prin procese de difuziune pasivă; secretă numeroase enzime hidrolitice ce se eliberează în mediul înconjurător unde scindează macromoleculele în molecule mai mici, ce pot fi transportate în interiorul celulei;

participare la sisteme chemotactice: la nivelul membranei sunt prezenţi receptori asupra cărora acţionează stimulii chimici din mediu cu rol de atracţie (atractanţi) sau de respingere (repelenţi); îndeplineşte funcţia bioenergetică, de eliberare a energiei prin fosforilare oxidativă. În membrană este structurat lanţul respirator şi unele enzime din ciclul Krebs (dehidrogenaze), membrana procariotă preluând funcţia mitocondriilor din celula eucariotă; participă activ la creşterea şi diviziunea celulei bacteriene, la formarea sporului bacterian; reprezintă structura celulară ţintă pentru detergenţi care, utilizaţi ca substanţe dezinfectante alterează structura acesteia, sau pentru unele antibiotice care interferează cu funcţia biosintetică a membranei (polimixinele).

2.2.4. PERETELE CELULAR

Peretele celular este o structură unică pentru bacterii, responsabilă de forma şi rigiditatea celulei (participă minor la osmoză), localizată la exteriorul membranei citoplasmatice şi prezentă la toate bacteriile, cu excepţia reprezentanţilor genului Mycoplasma şi Archaebacteriilor. Peretele este format dintr-un strat bazal, asemănător la toate bacteriile şi un strat al structurilor superficiale, foarte diferenţiat, în funcţie de care bacteriile manifestă caractere tinctoriale diferite: bacterii Gram pozitive, Gram negative şi acido-alcoolorezistente.

Structura stratului bazal

Reţeaua de peptidoglican (mureina) este structura chimică responsabilă de rigiditatea peretelui celular şi care asigură forma şi rezistenţa mecanică a bacteriei. Reţeaua de peptidoglican, prezentă la toate bacteriile, este formată din 3 porţiuni (figura 5):

- “Scheletul de bază” alcătuit din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-glucozamină (N-Ac-Glc) şi acid N-acetil-muramic (N-Ac-Mur);

D-ALA½

N-Ac-Glc ¾ N-Ac-Mur ¾ N-Ac-Glc ¾ N-Ac-Mur½

L-ALA (GLY) 5½

D-GLU½

L-LYS½

D-ALA½

N-Ac-Glc ¾ N-Ac-Mur ¾ N-Ac-Glc ¾ N-Ac-Mur

½ L-ALA (GLY) 5

½D-GLU

½L-LYS

½D-ALA

(GLY) 5

Figura 5: Reţeaua de peptidoglican (după C. Voiculescu, 1996)

- Componenta peptidică formată din punţi tetrapeptidice identice, transversale, între unităţile de N-Ac-Mur a două lanţuri vecine. Structura acestor punţi diferă la bacteriile Gram pozitive de cele Gram negative şi chiar de la specie la specie. În această structură intră D şi L aminoacizi: L-alanina, D-glutamină, L-lizină (sau diaminopimelic la bacteriile Gram negative), D-alanină. Această componentă se sintetizează iniţial ca un pentapeptid, dar într-un peptidoglican complet se găseşte sub formă de tetrapeptid deoarece ultimul aminoacid, D-alanina, este înlăturat când un lanţ peptidic se leagă de un altul vecin;

- Punţi “încrucişate” de pentaglicină (între poziţia 4 şi 3 a două punţi tetrapeptidice vecine) la bacteriile Gram pozitive. La bacteriile Gram negative, tetrapeptidele se leagă între ele printr-o simplă legătură peptidică.

Structura stratului structurilor speciale

Se deosebesc trei tipuri de structuri speciale: Gram pozitiv, Gram negativ şi acido-alcoolorezistent.

a. Bacterii Gram pozitive (caracteristici particulare)Peretele celular al bacteriilor Gram pozitive este relativ mai gros, dar cu o

compoziţie mai simplă. Peptidoglicanul reprezintă 50-90% din greutatea uscată a peretelui celular, are o grosime de 15-30 nm şi conţine până la 200 de lanţuri paralele de mureină, legate tridimensional pentru a forma o reţea groasă. Stratul structurilor speciale este redus şi alcătuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici: acidul ribitoltheicoic şi gliceroltheicoic. Aceştia pot pătrunde până la membrana citoplasmatică (acizii theicoici cu glicerol) legându-se covalent de aceasta - acizii theicoici de membrană sau numai până la perete - acizii theicoici de perete (acizi theicoici cu ribitol). Acizii theicoici intervin în special în creşterea şi diviziunea celulei. Ei reprezintă determinanţi antigenici majori care stau la baza identificării serologice a unor bacterii, fiind substanţe care, pătrunse în organism, induc un răspuns specific din partea sistemului imun al organismului.

De asemenea, la unele specii, se evidenţiază şi prezenţa de polizaharide: polimeri de manoză, arabinoză, galactoză, glucozamină şi polimeri de zaharuri “acide” (acid glucuronic, acid manuronic).

Peretele celular al bacteriilor Gram pozitive este sensibil la acţiunea lizozimului (enzimă hidrolitică prezentă în lacrimi, mucus, salivă) care rupe legăturile dintre acidul N-acetil muramic şi N-acetilglucozamină, autolizinelor bacteriene (enzime muralitice) care intervin în diviziunea celulei bacteriene, penicilinei care inhibă sinteza peptidoglicanului.

b. Bacterii Gram negative (caracteristici particulare)Peretele este mai subţire dar mult mai complex structurat, multistratificat.

Peptidoglicanul are o grosime de 4-5 nm, reprezentând numai 10% din greutatea uscată a bacteriei. Stratul superficial este însă mult mai complex decât la bacteriile Gram pozitive, alcătuit din spaţiul periplasmic, membrană externă şi lipopolizaharidul de perete (LPS).

Principalele diferenţe structurale ale peretelui celular bacterian la bacteriile Gram pozitive şi Gram negative sunt prezentate în figura 6.

Figura 6: Diferenţele structurale ale peretelui celular la bacteriile Gram pozitive şi Gram negative (după Murray, Drew, Kobayashi, Thompson, 1990)

Spaţiul periplasmicEste un compartiment cu funcţie de stocare ce se întinde de la membrana citoplasmatică până la membrana externă. Lărgimea spaţiului periplasmic este variabilă, depinzând de: starea fiziologică a celulei; condiţiile de cultivare. El conţine peptidoglicanul şi un gel care favorizează nutriţia bacteriei prin conţinutul în enzime degradative (fosfataze, nucleaze, proteaze). Tot aici sunt prezente enzimele de inactivare ale unor antibiotice (betalactamaze, cefalosporinaze). Enzimele stocate la nivelul spaţiului periplasmic sunt eliberate prin membrana externă în funcţie de necesităţi şi aceasta este una din explicaţiile marii capacităţi de adaptare la mediu a bacteriilor Gram negative spre deosebire de cele Gram pozitive care, neavând membrană externă, eliberează enzimele imediat ce sunt sintetizate.

Membrana externăEste asemănătoare ca structură cu membrana citoplasmatică fiind formată dintr-un

strat dublu de fosfolipide în care sunt inclavate proteine de o diversitate foarte mare:

unele dintre acestea străbat membrana şi pot ajunge până la peptidoglican, altele sunt ataşate pe faţa internă sau externă a membranei şi proemină în spaţiu sau la suprafaţă, iar altele sunt libere (figurile 7 şi 8).

În membrana externă există proteine majore (porine, non porine) şi proteine minore. Porinele sunt cele care penetrează ambele feţe ale membranei externe şi formează pori sau canalicule, prin care difuzează spre interiorul celulei molecule cu greutate moleculară până la 600 D. Substanţele nutritive ajung din exteriorul celulei până la spaţiul periplasmic, unde se petrec evenimente metabolice de degradare în substanţe ce pot fi transportate prin membrana citoplasmatică în interiorul celulei. A doua categorie de proteine majore, non porinele, sunt fie receptori pentru pili sexuali, fie enzime care reglează sinteza capsulei bacteriene. Proteinele minore funcţionează ca transportori transmembranari specifici pentru moleculele mici (ionii Fe3+, vitamine).

Figura 7: Peretele celular la bacteriile Gram negative (după Murray, Drew, Kobayashi, Thompson 1990)

Lipopolizaharidul de perete (LPS)Deasupra membranei externe a bacililor Gram negativi se află lipopolizaharidul de

perete (LPS) sau endotoxina bacililor Gram negativi. LPS este o toxină termolabilă care se eliberează în mediul înconjurător numai după liza acestor bacterii, fiind foarte reactivă în organismul gazdă.

În structura lipopolizaharidului intră: lipidul A, miezul sau “core” şi unităţi monozaharidice repetitive.

- lipidul A cu o structură particulară, responsabil de toxicitate: produce febră, activează mecanismele apărării antiinfecţioase şi, în exces, produce şocul endotoxic cu evoluţie gravă, chiar fatală;

- miezul sau “core” (polizaharid), numit şi antigen R, comun tuturor bacteriilor Gram negative;

- unităţi monozaharidice repetitive (15-40) care sunt specifice de specie şi tip şi constituie antigenul O al bacteriilor Gram negative (figura 8).

Figura 8: Peretele celular la bacteriile Gram negative (după Murray, Drew, Kobayashi, Thompson, 1990)

c. Bacteriile acido-alcoolo rezistente Dintre aceste bacterii, bacilul tuberculos şi bacilul leprei, reprezentanţi ai genului

Mycobacterium, sunt de interes medical. Aceste bacterii au peretele celular asemănător cu cel al bacteriilor Gram pozitive. Structurile speciale conţin lipide până la 30%, aproape jumătate din acestea fiind reprezentate de acidul micolic şi o ceară ce conferă acestor bacterii caractere tinctoriale deosebite şi rezistenţă crescută la factorii de mediu. Astfel dacă, după o încălzire de scurtă durată ce topeşte cerurile, un colorant pătrunde în celula bacteriană, decolorarea acesteia sub acţiunea acizilor sau alcoolilor nu se mai produce ca la alte bacterii. Acest caracter se numeşte acido-alcoolorezistenţă. Aceste bacterii se colorează foarte slab în coloraţia Gram, evidenţierea lor făcându-se la cald prin tehnica Ziehl-Neelsen.

d. Bacterii cu perete alterat sau formele LSunt bacterii cu stratul bazal viciat sub acţiunea unor factori din mediu ca, de

exemplu, lizozimul, care lizează peptidoglicanul, şi penicilina care împiedică sinteza

acestuia.

e. Bacterii fără perete celular

Există bacterii lipsite în mod natural de perete celular, care nu pot avea o formă

constantă, forma lor fiind variabilă în funcţie de mediul în care se află. Exemplu:

Mycoplasma (cu formă cocoidală, de pară, alungită sau filamentoasă).

Funcţiile peretelui celular: asigură forma, rezistenţa mecanică şi osmotică a bacteriei; participă la diviziunea celulei şi în creşterea acesteia, urmând membrana citoplasmatică în formarea septurilor transversale care separă celula mamă în celule fiice; protoplaştii şi sferoplaştii, lipsite de perete celular, nu se divid; stochează unele enzime în spaţiul periplasmic la bacteriile Gram negative ce vor fi eliberate după necesităţi; prezintă receptori pentru bacteriofagi (virusuri care parazitează bacteriile) prin proteinele de membrană externă, iniţiind infecţia virală a celulei bacteriene; este sediul antigenelor de suprafaţă, fiind deci implicat în răspunsul imun al macroorganismului; este sediul unor factori de patogenitate; are rol în procesul de sporulare; reprezintă ţinta de acţiune pentru unele antibiotice şi detergenţi; prin structura diferită separă cele două categorii de bacterii în coloraţia Gram (Gram pozitive şi Gram negative) sau conferă caracter de acidoalcoolorezistenţă.

3. SPORUL ŞI SPORULAREAUnele bacterii se transformă în spori care apar endocelular şi care pot supravieţui

ani şi zeci de ani în condiţii nefavorabile de dezvoltare. Ei au o rezistenţă crescută la factorii de mediu, la agenţii fizici (căldură, radiaţii), chimici (acizi, dezinfectanţi), chiar şi la coloranţi (evidenţierea se face folosind coloraţii speciale). Există trei genuri de bacterii Gram pozitive sporulate ce prezintă importanţă pentru bacteriologia medicală: Clostridium şi Bacillus (bacili) şi Sporosarcina (coci).

Dintr-o bacterie vegetativă se formează un singur spor, care, în condiţii favorabile de viaţă, va da naştere unei singure celule bacteriene cu toate proprietăţile ei iniţiale.

Forma sporului poate fi rotundă sau ovală. Diametrul sporilor este mai mic la bacilii sporulaţi aerobi nedepăşind diametrul bacteriei (genul Bacillus), pe când la genul anaerob Clostridium, sporul are un diametru mai mare decât bacteria, producând deformarea acesteia. Acest caracter al sporului este important în identificarea bacililor Gram pozitivi anaerobi.

Poziţia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi centrală, ca la Clostridiile gangrenei gazoase, subterminală la bacilul cărbunos (Bacillus anthracis), sau terminală, ca la bacilul tetanic (Clostridium tetani).

În coloraţiile obişnuite sporul apare ca o zonă incoloră în corpul bacterian. El se evidenţiază însă prin coloraţii speciale, la cald, care permeabilizează învelişurile sporale

(coloraţia Moller). Pe preparatele native între lamă şi lamelă efectuate din culturi, sporii apar ca nişte formaţiuni rotunde, refringente.

Ultrastructura şi compoziţia chimică a sporilor asigură acestora o mare rezistenţă la factorii nocivi, ce poate fi explicată atât prin starea de deshidratare (apă 40-50%, faţă de 80-98% la formele vegatative) care anulează schimburile cu mediul extern şi scade sensibilitatea la căldură, cât şi de numeroasele sale învelişuri protectoare.SPORULAREA SAU SPOROGENEZA

Este un proces complex, guvernat de aproximativ 200 de gene din celula bacteriană, gene care sunt activate în condiţii nefavorabile de mediu, altfel aceste gene sunt represate. Sporularea presupune formarea unor structuri noi şi dispariţia altor structuri caracteristice formei vegetative ale bacteriei.

Din punct de vedere morfologic, sporularea începe prin migrarea cromozomului într-o zonă a celulei (de regulă, polară). Urmează invaginarea membranei citoplasmatice cu înglobarea cromozomului (ADN) într-un înveliş dublu (“prespor”). Se sintetizează apoi peptidoglicanul (reţea subţire) pe partea interioară a stratului intern, urmată de sinteza de peptidoglican (reţea groasă) între cele două straturi. Stratul extern se îngroaşe şi el (conţine o proteină “keratin-like”). Continuă cu deshidratare, creşterea concentraţiei de Ca++ şi liza restului formei vegetative.

STRUCTURA SPORULUIEste diferită de la specie la alta dar organizarea generală se aseamănă. De la interior

spre exterior, sporul este format din:

core sau protoplastul sporal, format din materialul nuclear înconjurat de membrana citoplasmatică. Aici este depozitat ADN (genomul complet), unele enzime respiratorii (citocromi, flavoproteine) şi o substanţă care are rol în rezistenţa sporului la căldură - dipicolinatul de calciu (singura evidenţiere în natură);

peretele sporal (cortexul intern), format din peptidoglican şi care este peretele celular primordial;

cortexul sporal (membrana externă), care este stratul cel mai gros al sporului, transparent şi care conţine un peptidoglican cu o structură particulară, mai lax, foarte sensibil la lizozim. Autoliza acestui strat este momentul cheie în transformarea sporului în forma vegetativă;

tunica proteică formată din proteine chitinoase cu numeroase legături disulfitice. Ea este impermeabilă, fiind responsabilă de rezistenţa sporilor la unele dezinfectante;

exosporiumul este prezent numai la unii spori şi conţine lipoproteine şi zaharide.

GERMINAREA SPORULUIÎn condiţii de mediu favorabile (umiditate, Mg++, temperatura 35-40C),

sporul germinează şi va da naştere unei bacterii vegetative identice cu aceea în care s-a format. Germinarea are loc în trei etape: activarea sporului, iniţierea şi dezvoltarea sporului.

- Activarea sporului se produce când acesta întâlneşte condiţii favorabile de viaţă, dar şi un factor mecanic sau chimic care să lezeze învelişul sporal (lizozimul).

- Iniţierea este declanşată de un mediu nutritiv bogat. Pentru unii spori triggerul este L-alanina, iar pentru alţii adenozina, glucoza. Acesta duce la activarea unei enzime autolitice care degradează cortexul sporal. Are loc absorbţia de apă, eliberarea dipicolinatului de calciu şi degradarea unor compuşi sporali.

- Dezvoltarea sporului: protoplastul sporal se transformă în bacterie vegetativă, care trece printr-o perioadă metabolic activă de refacere a constituenţilor celulari normali şi a echipamentului enzimatic complet.

4. DIVIZIUNEA CELULEI BACTERIENEFăcând abstracţie de formele de transfer „sexuat” de material genetic (conjugarea),

regula generală a diviziunii celulei bacteriene este fisiunea binară - diviziune directă - sciziparitate, având drept rezultat apariţia a două celule fiice de dimensiuni egale, cu material genetic identic.

Diviziunea celulei bacteriene cuprinde 2 faze: septarea şi separarea; diviziunea nucleară.

Septarea şi separarea

La microscopul electronic, se poate observa că diviziunea începe cu invaginarea membranei citoplasmatice, în asociere cu mezozomul (adeseori la nivelul acestuia). Astfel se produce un sept transversal complet, mai gros decât peretele celular. - La bacteriile Gram pozitive noul perete se sintetizează în zona ecuatorială a celulei

mamă. Separarea are loc prin formarea unui perete despărţitor de la periferie spre interior,

ca un diafragm care se închide treptat, clivajul celor două celule având loc, cel mai

adesea, după una-două generaţii, formând lanţuri, grămezi.

- La bacteriile Gram negative, sinteza noului perete este mai difuză, în diferite zone ale

vechiului perete celular, cu strangulare treptată a citoplasmei şi separare imediată.

Diviziunea nucleară

Segregarea cromozomului bacterian implică mai multe secvenţe:

ataşarea inelului cromozomial pe mezozom, totdeauna cu o zonă de pe molecula de ADN cromozomial denumită „replicator”;

separarea celor două lanţuri ale moleculei de ADN cromozomial cu răsucirea lor în dublu sens, cu îndepărtarea consecutivă a acestor în spaţiu, unul faţă de celălalt, având mezozomul ca punct de sprijin “pivot”;

diviziunea mezozomului în lungul axului său;

apariţia celor două celule fiice, având fiecare cate un lanţ ADN parental, ancorat de mezozomul propriu;

formarea în fiecare celulă fiică a câte un nou lanţ ADN, complementar (folosind ca matrice lanţul ADN parental).

În felul acesta, fiecare din cele două celule fiice rezultate din diviziune va purta de regulă material genetic identic cu cel cuprins în cromozomul celulei parentale - ½ din ADN-ul celulei parentale - (model de diviziune „semiconservativ”).

METABOLISM BACTERIANDefiniţie: totalitatea reacţiilor biochimice care au loc în celula bacteriană, precum

şi cele determinate de microorganism în mediul înconjurător. Scop final: creşterea şi multiplicarea bacteriei.

Cuprinde:1. Reacţiile catabolice: prin aceste reacţii substratul nutritiv se fragmentează în unităţi componente, cu eliberare de energie;2. Reacţiile metabolice intermediare: prin care energia rezultată din primele reacţii este înmagazinată în compuşi macroergici;3. Reacţii anabolice: reacţii prin care celula bacteriană îşi sintetizează substanţele proprii, cu consum energetic.Observaţie: Toate aceste reacţii sunt catalizate de enzime a căror activitate este controlată

genetic, astfel încât intensitatea lor să fie cât mai eficient adaptată condiţiilor în care

bacteria creşte şi se înmulţeşte.

1. REACŢIILE CATABOLICE (METABOLISM ENERGETIC)Se desfăşoară în 4 faze: descompunerea extracelulară a substanţelor organice,

absorbţia substanţelor, pregătirea subtanţelor pentru oxidare şi oxidarea substanţelor.

1.1. Descompunerea extracelulară a substanţelor organice în unităţi mai mici sub acţiunea unor exoenzime. La bacteriile care au ca habitat omul substanţele din mediul ambiant pot fi: proteine, acizi nucleici, colagen, lipide, mucopolizaharide, pentru descompunerea cărora bacteriile secretă exoenzime hidrolitice, care pot fi în acelaşi timp şi factori de patogenitate.

1.2. Absorbţia substanţelor din mediul extern, care se desfăşoară prin intermediul a 3 mecanisme: pasiv, în funcţie de concentraţia unei substanţe în interiorul şi exteriorul celulei (ex: glicerolul);

activ, prin procesul de fosfarilare a substanţei ce urmează a fi absorbită, cu consum energetic (ex: glucoza, pentru a fi absorbită, trebuie transformată în glucozo-6-fosfat); activ, prin legarea substaţei de proteine transportoare (permeaze), cu consum energetic. Astfel se absorb substanţe pe care celula bacteriană le depozitează în concentraţii foarte mari faţă de concentraţia din mediu. Dacă celula bacteriană este lipsită de o permează, cum este permeaza pentru lactoză, aceasta nu poate fi absorbită nici dacă bacteria, complet lipsită de lactoză, se află într-o soluţie cu conţinut foarte mare de lactoză.

O menţiune specială trebuie făcută pentru fier (Fe), necesar bacteriilor în multiplicare. În ţesuturi Fe nu se găseşte în stare liberă, ci legat de proteine (transferina, siderofilina). Bacteriile au dezvoltat mecanisme ingenioase de absorbţie a Fe prin secreţia sideroforilor, substanţe chelatoare de Fe, care scot Fe din combinaţiile sale, făcându-l absorbabil.

1.3. Pregătirea subtanţelor pentru oxidare se face prin reacţii de decarboxilare, dezaminare, fosforilare.

1.4. Oxidarea substanţelor se face cu eliberare de energie; are loc cu pierdere de electroni (ioni de H2). Substanţa care se va oxida se numeşte donor, iar substanţa care se reduce se numeşte acceptor de H2. În urma oxidării rezultă o substanţă oxidată, o subtanţă redusă şi o anumită cantitate de energie (substanţă energogenetică: glucoza).

În funcţie de acceptorul final de H2 există 3 tipuri de oxidaţie: respiraţia bacteriană este procesul în care acceptorul final de H2 este O2 atmosferic; donorul este o substanţă organică; transferul de electroni este efectuat prin lanţul respirator; fermentaţia bacteriană constă în procese de oxidare parţială a substratului, donorul şi acceptorul final de H2 fiind o substanţă organică; respiraţia anaerobă este procesul în care donorul este o substanţă organică, iar acceptorul final de H2 este O2 prezent într-o sare anorgranică (nitrat sau sulfat) care se va reduce;Observaţie: termenul de respiraţie anaerobă folosit de bacteriologi se referă la fermentaţia în absenţa O2.

1.4.1. RESPIRAŢIA BACTERIANĂ Pentru bacteriile aerobe este legată de sistemul membranar al bacteriilor

(membrana citoplasmică, mezozomi). Cantitatea de energie eliberată este mai mare decât cea eliberată prin fermentaţie, deoarece oxidării de substrat îi urmează oxidaţia de transfer, în care electronii sunt transportaţi pe lanţul respirator până la acceptorul final de hidrogen (oxigenul atmosferic) şi fosforilarea oxidativă. Astfel, la degradarea completă a unei molecule de glucoză bacteriile obţin 38 molecule de ATP.

Lanţul respirator sau lanţul transportorilor de electroni are în componenţă citocromi, flavoproteine, ubichinone. Citocromii reprezintă transportori de electroni, aparţinând unui grup conţinând fier (hem). Atomul central al citocromilor este fierul ce poate trece din stare oxidată (Fe3+) în stare redusă (Fe2+). Conţinutul bacteriilor în citocromi diferă în funcţie de specie şi condiţiile de creştere.

Flavoproteinele reprezintă proteine ce conţin o coenzimă derivată din riboflavină (B2). Exemplu: FAD (flavinadenindinucleotid). Quinonele reprezintă substanţe neproteice cu funcţie de transport a proteinelor în sistemul transportor de electroni. Exemplu: proteine cu fier şi sulf (cu 2, 4, 8 atomi de sulf instabil).

1.4.2. FERMENTAŢIA BACTERIANĂ foloseşte compuşi organici ca donori şi acceptori de electroni. Ea se produce pe următoarele căi metabolice:

Glicoliza Embden-Meyerhof, în care dintr-o moleculă de glucoză rezultă 2 molecule de acid piruvic şi 2 molecule de ATP.

Fermentaţia secundară a acidului piruvic (figura 6), care poate fi:

# lactică:

Exemple: bacilii lactici şi unii streptococi din intestin.

# alcoolică:

Exemple: drojdii.

# acidă mixtă:

Exemple: Escherichia coli şi alte bacterii intestinale.

ACID PIRUVIC ……………….…… ACID LACTIC

NAD → NADH

ACID PIRUVIC …………..…….. ACETALDEHIDĂ

ALCOOL ETILIC

NADHNAD

CO2

ACID OXALACETIC ACETIL-CoA ACID FORMIC

NADH NAD

NADH NAD

ACID PIRUVIC ACID LACTIC

ACID SUCCINIC

NADH NAD

ALCOOL ETILIC

ADP + P ATP

ACID ACETIC H2 + CO2

+

# butilen-glicolică:

Exemple: Enterobacter, Bacillus.

# propionică:

Exemple: Propionibacterium, Veillonella (anaerobi nesporulaţi).# butiric-butanolică:

ACID PIRUVIC ACID ACETOLACTIC

NADH NAD

2,3 - BUTILENGLICOL NAD NADH

ACETONĂ

CO2

ACID OXALACETIC 2 CO2

(legaţi de enzime)

ACID SUCCINIC

NADH NAD

PROPIONIL-CoA

ACID 2-PROPIONIC

2-SUCCINIL-CoA2-METIL-MALONIL-CoA

CoA

ACID PIRUVIC ACID ACETIC

CO2

NADHNAD

NADHNAD

NADHNAD

ACIDUL PIRUVIC ACETIL-CoA

CO2

ACID ACETICACETOACETIL-CoAACETONĂ

ISOPROPANOL CROTONIL-CoA ALCOOL ETILIC

BUTIRIL-CoA

ACID BUTIRIC BUTANOL

CO2

Exemple: Clostridium.

Figura 6: Fermentaţia secundară a acidului piruvic (după V. Bîlbîie, 1984,1985)

Căi alternative de metabolizare a glucozei: şuntul fosfaţilor şi calea Entner-Doudoroff (pentru Pseudomonas).Observaţie: Comparând cele două procese, fermentaţia şi fosforilarea prin transport de electroni, se poate spune că fermentaţia este un proces primitiv de eliberare de energie, întâlnit la bacteriile anaerobe care au apărut primele, în condiţiile în care atmosfera pământului era lipsită de O2. După apariţia O2 s-au dezvoltat procesele fosforilării oxidative.

În glicoliză, dintr-un mol de glucoză se sintetizează 2 moli de ATP, pe când prin respiraţie, prin activitatea coordonată a glicolizei, ATC şi lanţului respirator, se sintetizează 38 moli ATP.

1.4.3. RESPIRAŢIA BACTERIANĂ ANAEROBĂ Foloseşte compuşi anorganici (nitriţi, nitraţi, sulfaţi) în transferul de electroni

prin lanţul respirator (aceştia se reduc), în absenţa O2 molecular. În cazul bacteriilor strict anaerobe, O2 poate fi chiar toxic, datorită formării unui radical liber reactiv, denumit superoxid.

Unele bacterii aerobe, ca bacilul piocianic, în absenţa oxigenului, pot obţine energia necesară prin respiraţie anaerobă (de exemplu, respiraţia nitriţilor), proces numit denitrificare.

2. REACŢII INTERMEDIARE Sunt reacţiile în care energia rezultată în urma oxidării va fi transformată în

energie chimică sub formă de ATP şi tioesteri: Acetyl-CoA. Energia stocată va fi eliberată la nevoie pentru amorsarea unor reacţii catabolice sau pentru sinteza unor molecule cu rol structural sau funcţional.

3. REACŢII ANABOLICESunt reacţii prin care celula bacteriană îşi sintetizează substanţe cu rol structural

(macromolecule) şi funcţional (enzime), din compuşi simpli, rezultaţi în timpul reacţiilor catabolice sau intermediare şi cu consum energetic. La aceasta se adaugă sinteza unor substanţe cu rol de rezervă energetică (incluzii de polizaharide şi lipide).

Posibilitatea reacţiilor de biosinteză diferă de la o specie la alta. Astfel, unele bacterii sunt capabile să sintetizeze toţi aminoacizii, nucleotidele, monozaharidele şi coenzimele, din substanţe simple. Alte bacterii sunt lipsite de unele linii metabolice, fiind dependente de aportul din exterior al substanţelor ce se sintetizeză pe aceste căi. Bacteriile de interes medical se situează între cele două extreme.

Totalitatea proceselor prin care bacteria îşi procură, din mediul înconjurător, substanţele necesare supravieţuirii, creşterii şi înmulţirii reprezintă nutriţia bacteriană.

Cu cât o specie bacteriană are mai multe necesităţi, cu atât ea este mai dependentă de macroorganismul parazitat.

Pentru sinteza elementelor structurale propii şi a unor enzime de adaptare la condiţiile mediului ambiant bacteriile necesită: surse de azot, surse de carbon, O2, fosfor, ioni anorganici, factori de creştere.

După sursa de energie folosită în respiraţie bacteriile pot fi: bacterii fotosintetizante care utilizează ca sursă energetică lumina solară. Pigmenţii fotosintetici din bacterii sunt denumiţi bacterioclorofilă a, b, c, d. Bacteriile mai conţin şi diferiţi pigmenţi carotenoizi care determină colorarea coloniilor. Aceşti carotenoizi absorb energia joasă, care este transferată moleculelor de bacterioclorofilă pentru a fi folosită în fotosinteză. bacterii chimiosintetizante (majoritatea bacteriilor cunoscute) folosesc drept sursă de energie substanţele chimice din mediul de creştere, şi anume substanţe anorganice: amoniac, NO2, H2S.

După sursa de carbon, bacteriile se clasifică în: bacterii de tip autotrof: bacterii capabile să-şi sintetizeze toţi metaboliţii esenţiali, plecând de la compuşi anorganici, sursa de carbon fiind CO2. Ele pot trăi independent de materia organică, în mediul natural sau artificial de nutriţie. Ele sintetizează materie organică din materie anorganică, contribuind esenţial la circuitul substanţelor în natură. Aceste bacterii pot fi: sulfobacterii şi nitrobacterii, care la rândul lor pot fi nitrifiante (nitrobacter) şi denitrifiante (anaerobe). bacterii de tip heterotrof: reprezintă majoritatea speciilor bacteriene (toate bacteriile din patologia umană şi animală). Aceste bacterii necesită pentru biosintezele proprii atât materie organică, cât şi anorganică. Bacteriile heterotrofe pot fi: fotoheterotrofe (bacterii ce folosesc lumina ca sursă de energie şi componente organice ca sursă primară de carbon) şi chimioheterotrofe (bacterii care obţin necesarul de carbon şi energie din metabolismul unui singur compus organic). bacterii mixotrofe: bacterii care folosesc ca sursă de carbon atât substanţe organice, cât şi CO2.

În ceea ce priveşte sursa de azot: azotul reprezintă aproximativ 10% din greutatea uscată a bacteriilor. Majoritetea bacteriilor obţin preferenţial azotul din săruri de amoniu (Escherichia coli, Salmonella). Alternativ, poate fi utilizat azotul organic (aminoacizi sau polipeptide) sau, de către un număr limitat de bacterii, azotul atmosferic ori cel din nitriţi. În toate aceste cazuri însă azotul este iniţial convertit la amoniac. Azotul organic poate fi utilizat şi direct prin reacţii de transaminare.

După sursa de carbon şi de azot pe care bacteriile le pot folosi bacteriile heterotrofe pot fi : bacterii care folosesc carbon din surse organice şi azot molecular atmosferic. Din această categorie fac parte specii aerobe (Azotobacterr) şi anaerobe (Clostridium); bacterii care folosesc carbon organic şi azot din combinaţii anorganice. Carbonul este furnizat de glucide, alcooli, acizi graşi. Azotul rezută din amoniac, sărurile de

amoniu. Exemple: bacteriile saprofite din mediul extern, Escherichia coli nepatogen din intestin. bacterii care folosesc atât azotul cât şi carbonul organic. În această categorie intră:- bacterii saprofite din mediul extern, intestin, de pe suprafaţa mucoaselor;- bacterii mai pretenţioase (frecvent patogene) care necesită factori de creştere, acid nicotinic, substanţe complexe din lichide organice (ascită, sânge). Exemple: Brucella, Haemophilus, Salmonella, Shigella.- bacterii foarte pretenţioase: nu cultivă pe medii artificiale (exemplu: Treponema pallidum) sau prezintă parazitism intracelular strict (Rickettsii, Mycoplasme, Chlamydii).

După necesarul de oxigen bacteriile se clasifică în: bacterii strict aerobe: sunt bacterii care se dezvoltă numai în prezenţa O2

atmosferic, folosind exclusiv respiraţia aerobă (O2 atmosferic este folosit ca acceptor final de H2). Exemple de astfel de bacterii: Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis, etc. bacterii strict anaerobe: bacterii care nu se dezvoltă decât în absenţa O2, prezenţa lui fiind foarte toxică chiar la o presiune de 10-5 atm. Aceste bacterii folosesc ca reacţie energogenetică exclusiv fermentaţia în condiţii anaerobe, deci oxidaţia de substrat. Ele sunt lipsite de superoxiddismutază care transformă radicalul superoxid în H2O2 şi catalază, catalază care descompune apa oxigenată. Exemple: Clostridium, Bacteroides, Fusobacterium. bacterii facultativ anaerobe: bacterii care se dezvoltă atât în prezenţa O2, cât şi în absenţa sa. Ele folosesc respiraţia aerobă, fermentaţia, chiar şi respiraţia anaerobă. Exemple: majoritatea speciilor de interes medical (enterobacteriile). bacterii anaerobe aerotolerante: bacterii care folosesc numai fermentaţia în prezenţa aerului atmosferic, fără participarea O2. Ele tolerează O2 în mediu pentru că, fie au în echipamentul enzimatic superoxiddismutază şi catalază, fie pentru că enzimele există în mediu. Exemplu: germenii din genul Steptococcus. bacterii microaerofile: bacterii care folosesc respiraţia şi fermentaţia, la care se adaugă o concentraţie mai mare de CO2 decât cea din atmosferă. Exemple: genul Neisseria, Brucella, Campylobacter (necesită 6-10% CO2).

CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA BACTERIILOR CULTIVARE

1. DEFINIREA TERMENILOR

Creşterea (în sensul termenului “growth” din limba engleza) reprezintă augmentarea componentelor microorganismului (celulei bacteriene). De exemplu, creşterea trecătoare a volumului celular, prin extinderea incluziilor lipidice, nu reprezintă o “creştere” bacteriană în sensul definiţiei de mai sus.

Multiplicarea este un proces la nivel de populaţie bacteriană consecutiv creşterii, constând din înmulţirea prin diviziune directă, în generaţii succesive, a indivizilor dintr-o populaţie de bacterii.

Cultivarea se referă la toate fenomenele legate de creşterea şi multiplicarea bacteriilor în afara mediului lor natural (extern sau intern), prin asigurarea in vitro a unor condiţii cât mai aproape de cele naturale, adecvate necesităţilor metabolice ale speciei respective.

Creşterea şi înmulţirea bacteriilor este rezultatul nutriţiei şi al metabolismului bacterian.

Viteza de multiplicare a bacteriilor este foarte mare. S-a facut un calcul ipotetic din care rezultă că, dacă la fiecare 20 de secunde are loc o diviziune, dintr-o celulă bacteriană cultivată într-un mediu nelimitat ar lua naştere într-o zi 1x1021 celule, ceea ce ar corespunde unei mase de 4.000 de tone. În realitate, o asemenea rată de înmulţire a bacteriilor nu este posibilă, fiind impiedicată de epuizarea substanţelor nutritive şi a factorilor de creştere, pe de o parte, şi de acumularea metaboliţilor toxici, pe de altă parte.

2. CONDIŢII DE CREŞTERE ŞI MULTIPLICARE LA BACTERIIPrincipalele condiţii de care depind creşterea şi multiplicarea bacteriilor, atât în

mediu natural, cât şi in vitro (cultură), sunt: suportul nutritiv, pH-ul, temperatura, presiunea de oxigen, presiunea ionică, etc.

2.1. SUPORTUL NUTRITIVAcesta este asigurat de: prezenţa donatorilor şi acceptorilor de hidrogen, surse de

carbon, surse de azot, prezenţa substanţelor minerale (sulf, fosfor, activatori enzimatici - magneziu, fier, potasiu, calciu), factori de creştere (aminoacizi, purine şi pirimidine, vitamine din grupul B, ca şi vitaminele A şi D, acizi graşi).

În ceea ce priveşte substanţele minerale necesare creşterii şi multiplicării bacteriilor: fosforul din structura acizilor nucleici, a fosfolipidelor, a acizilor teichoici, a nucleotidelor macroergice (ATP, GTP) sau coenzimele (NADP, flavine) este asimilat ca ion fosfat; sulful din structura unor aminoacizi, a coenzimei A poate fi asimilat din surse variate: compuşi organici, H2S, SO4

2-; K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ sunt activatori enzimatici; Fe2+ face parte din structura citocromilor, a peroxidazelor; Mg2+ împreună cu K+ asigură funcţionalitatea ribozomolor; Ca2+ intră în structura dipicolinatului de calciu din spori. Împreună cu Cl- şi Na+, aceşti ioni sunt asimilaţi ca săruri minerale; micronutrienţii (Zn, Mn, Co, Cu) sunt asiguraţi în formă minerală prin apa de robinet sau impurităţi ale altor ingrediente folosite pentru prepararea mediilor de cultură sau chiar din sticlăria de laborator.

2.2. TEMPERATURATemperatura optimă de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. În

funcţie de această temperatură, bacteriile se împart în psihrofile, care se înmulţesc optim la 200C dar şi sub această temperatură, mezofile, cu temperatura optimă cuprinsă între 20-400C şi termofile, care se înmulţesc optim la peste 450C. Bacteriile mezofile sunt cele

patogene deoarece se înmulţesc la temperatura organismului, fiind denumite şi bacterii “homeoterme”.

Bacterii Temperatura minimă 0C

Temperatura optimă 0C

Temperatura maximă 0C

PŞ

IHROFIL

E

0 15-20 30

Mezofile 2-25 18-45 30-50Termofile 25-45 Peste 55 60-100

Limitele de temperatură în care aceste bacterii pot să crească sunt însă mai mari şi variază de la specie la specie. Astfel, gonococul şi meningococul nu suportă temperaturi mai mari de 1-20C faţă de temperatura optimă, spre deosebire de enterobacterii, care cresc în limite foarte largi.

Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicaţia practică a acestui aspect fiind sterilizarea.

Temperaturile moderat scăzute, ca, de pildă, cea de + 40C din frigidere, nu distrug bacteriile, dar opresc în general înmulţirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din acest motiv, majoritatea produselor biologice sau patologice destinate examenului bacteriologic se păstrează în aceste condiţii. Totuşi, există tulpini microbiene care se înmulţesc şi la temperatura frigiderului ca, de exemplu, tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se înmulţesc la + 50C. Acest aspect trebuie luat în calcul de către medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicaţia etiologică a unui germene într-o infecţie se bazează pe criteriul numeric.

Congelarea. Dacă o suspensie bacteriană este supusă îngheţului la temperaturi nu prea mici faţă de 00C, cristalizarea apei determină formarea unor spaţii ce conţin soluţii concentrate de săruri care nu cristalizează decât la temperaturi mult mai joase (-200C pentru NaCl de exemplu), când soluţiile devin saturate şi pot cristaliza. Aceste concentraţii ridicate de săruri minerale, la care se adaugă cristalele de apă, vor leza structurile bacteriene. Prin îngheţare nu vor fi omorâte toate celulele unei suspensii, dar îngheţul şi dezgheţul repetat scad foarte mult numărul de bacterii viabile.

Conservarea prin congelare. Temperatura congelatoarelor casnice (-100C) nu este destul de scăzută pentru a permite conservarea bacteriilor. Temperatura optimă este cea realizată de CO2 (-780C) sau de azotul lichid (-1800C). Conservarea bacteriilor, a virusurilor prin congelare este favorizată de adaosul de glicerol sau dimethilsulfoxid. Aceşti agenţi chimici induc o solidificare amorfă, vitroasă care înlocuieşte solidificarea prin cristalizare.

2.3. PH-ULBacteriile se pot dezvolta în limite largi de pH, cele patogene pentru om

dezvoltându-se optim la un pH de 7,2-7,4. Există şi excepţii ca, de pildă, bacteriile din genul Brucella care cresc la un pH de 6,0 şi vibrionul holeric la pH de 9,0. Lactobacilii, prezenţi în flora vaginală normală se dezvoltă chiar şi la un pH de 3,9.

Unele bacterii modifică ele însăşi, prin procesele metabolice, pH-ul mediului. Această modificare poate opri înmulţirea sau chiar distruge cultura. Din acest motiv, multe medii au în compozitia lor soluţii tampon care menţin pH-ul în limite convenabile.

Modificarea de către o bacterie a pH-ul unui mediu poate avea valoare deosebită în identificarea unui microb şi poate fi sezizată prin adaugarea în mediu a unui indicator de pH. Foarte multe bacterii se identifică biochimic prin proprietatea lor de a fermenta diferite zaharuri. Această capacitate se evidenţiază tocmai prin însămânţarea unei bacterii pe mai multe medii ce conţin fiecare alt zahar şi un indicator de pH. În cazul fermentării, acidifierea va determina schimbarea culorii mediului.

2.4. UMIDITATEAApa liberă este absolut necesară creşterii şi multiplicării microbilor. Necesarul de

apă variază în funcţie de specie. Astfel, datorită conţinutului sărac în apă a unor alimente cum sunt gemul de fructe, pâinea, unele sorturi de caşcaval, arahidele, etc., multiplicarea bacteriilor este practic imposibilă, în timp ce mucegaiurile se pot dezvolta foarte bine chiar şi în aceste condiţii.

Pentru a aprecia umiditatea, se compară conţinutul în apă a vaporilor deasupra apei curate, care se noteaza cu 1, cu conţinutul în vapori deasupra mediului de cultură. Bacteriile de interes medical au nevoie de o umiditate de 0,98, pe când ciupercile cresc şi la o umiditate de 0,80.

Prin liofilizare (desicare bruscă la - 780C), care este o metodă de conservare a microbilor, se extrage practic întreaga apă liberă din celulele bacteriene, ceea ce are ca urmare creşterea stabilităţii biopolimerilor şi încetarea metabolismului. Bacteriile liofilizate se păstrează ani de zile.2.5. CONCENTRAŢIA DE BIOXID DE CARBON

Cu toate că bacteriile de interes medical nu pot folosi bioxidul de carbon ca sursă de carbon, acesta este absolut necesar reacţiilor de carboxilare în biosinteza unor substanţe proprii celulei bacteriene (purine, aminoacizi, pirimidine etc.).

Necesarul de bioxid de carbon al bacteriilor este diferit. Astfel, unele specii (Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae) sunt dependente de prezenţa lui în concentraţii ridicate până la 10% în atmosfera în care se dezvoltă, pe când altele ca, de exemplu, Staphilococcus aureus se dezvoltă în concentraţia obişnuită de bioxid de carbon din atmosferă (0,003%), dar nu şi într-o atmosferă complet lipsită de bioxid de carbon.

Astăzi, incubarea produselor patologice din care se urmăreşte izolarea bacteriilor se efectuează în termostate de CO2 (6%), deoarece dezvoltarea lor este superioară celei din termostatele obişnuite.

2.6. ULTRASUNETELEUltrasunetele, cu o anumită frecvenţă, sunt bactericide. Bacteriile şi virusurile sunt

distruse de ultrasunete într-un interval de o oră. Ultrasonarea microorganismelor se foloseşte mai puţin pentru sterilizare, cât pentru a obţine diferite componente bacteriene sau virale, cum sunt: enzime, perete celular, acizi nucleici bacterieni, în scopul cercetării acestora.

2.7. PRESIUNEA HIDROSTATICĂ

Bacteriile obişnuite sunt rezistente la presiunea atmosferică. Formele vegetative suferă alterări la 300 de atm şi sunt omorâte la 600 atm, presiune întâlnită în oceane la o adâncime de 6000 m. Cultivarea bacteriilor la presiuni mari induce creşterea lor filamentoasă scăzându-le capacitatea de diviziune.

2.8. PRESIUNEA OSMOTICĂBacteriile se înmulţesc optim pe medii izotonice, rezistenţa lor la variaţiile

presiunii osmotice fiind incomparabil mai mare decât cea a celulelor organismelor superioare. Această rezistenţă se datorează peretelui celular. Bacteriile din genul Mollicutes, lipsite de acţiunea protectoare a peretelui celular, sunt foarte sensibile la variaţii mici ale presiunii osmotice.

Într-un mediu puternic hiperton, bacteriile vor pierde apa din citoplasmă şi vor muri. Acest fenomen se numeşte plasmoliză.

Dacă presiunea osmotică a mediului este foarte scăzută, apa va pătrunde în celulă, care se va umfla devenind turgescentă. Moartea bacteriei se produce prin plasmoptiză.

Creşterea presiunii osmotice a unui mediu prin adaus de NaCl sau zaharuri stă la baza conservării unor alimente.

Există însă bacterii osmofile, dintre care cele halofile sunt capabile să se înmulţească în soluţii hipersaline (bacteriile din genul Staphylococcus şi Enterococcus). Pe baza acestei proprietăţi se prepară unele medii de îmbogăţire şi selective aşa cum este mediul hiperclorurat Chapmann pentru stafilococi. Acesta conţine 7,5g NaCl la 100 ml de mediu, spre deosebire de mediile obişnuite care conţin doar 5g/l. Dintre bacteriile osmofile menţionăm şi pe cele zaharofile, care sunt capabile să se înmulţească pe medii cu un conţinut mare de glucide (6g%). Acest aspect este important pentru unele medicamente, ca de pildă, siropurile care, în ciuda conţinutului ridicat de zaharoză, se pot altera în urma contaminării cu aceste bacterii.

2.9. ELECTRICITATEAElectricitatea sub formă de curenţi galvanici, curenţi de joasă sau înaltă frecvenţă,

nu afectează bacteriile. Dacă însă curentul electric este trecut printr-un mediu lichid, bacteriile pot fi

afectate sub acţiunea unor ioni sau produşi chimici rezultaţi în urma electrolizei.

2.10. RADIAŢIILE2.10.1. Radiaţiile neionizate - razele ultraviolete (UV)

Puterea bactericidă a razelor luminoase devine perceptibilă la o lungime de undă de 330nm, crescând pe măsura scăderii lungimii de undă a luminii UV. Timpul necesar distrugerii microorganismelor depinde de intensitatea luminii, distanţa de sursa de emisie şi mediul în care se găsesc microorganismele.

Mecanismul bactericid al razelor UV constă în inducerea formării în celula bacteriană a unor dimeri de timină care înterferează replicarea ADN. Alterările altor elemente structurale bacteriene sunt neglijabile.

2.10.2. Radiaţiile ionizateMecanismul bactericid al acestor raze constă în formarea în celulă a unor radicali

cu viaţă scurtă şi protoni. Aceşti produşi vor altera bazele azotate şi legăturile dintre ele.

Efectul bactericid al razelor ionizante depinde de cantitatea de energie absorbită, temperatură, presiunea parţială a oxigenului, conţinutul în substanţe organice, prezenţa unor substanţe protectoare (alcoolii alifatici sau substanţe bogate în grupări sulfhidrilice), specia microorganismului şi conţinutul în apă.

Sporii sunt în general mai rezistenţi decât formele vegetative ale bacteriilor, excepţie fiind o bacterie nesporulată, Micrococcus radiodurans, care este cel mai rezistent microorganism la radiaţii. El rezistă la doze de 200 de ori mai mari decât restul bacteriilor datorită faptului că este echipat cu mecanisme deosebit de eficiente de reparare a alterărilor acizilor nucleici.

3. CULTIVAREA BACTERIILORAşa cum arătam mai sus, cultivarea reprezintă oferirea unor condiţii optime de

dezvoltare pentru anumite specii bacteriene în afara mediului extern sau a organismului, adică în medii artificiale de cultură.

Din punct de vedere al posibilităţii cultivării microorganismelor bacteriene, se disting: culturi bacteriene în mediu lichid şi culturi bacteriene în mediu solid.

Cunoaşterea necesităţilor nutritive ale bacteriilor este foarte importantă în bacteriologia medicală, deoarece stă la baza preparării mediilor de cultură destinate izolării diverselor specii bacteriene din produsele biologice sau patologice.

Cultivarea bacteriilor în scop diagnostic pune în esenţă două probleme: alegerea unui mediu de cultură optim, care să permită izolarea tuturor bacteriilor care ar putea fi prezente în produsul de examinat; obţinerea bacteriilor în culturi pure, pentru a putea fi identificate.

3.1. CONDIŢII GENERALE PENTRU CULTIVAREA BACTERIILOR

Un mediu de cultură trebuie să conţină apă, substanţe organice, minerale, oligoelemente şi factori de creştere. Pentru satisfacerea acestor necesităţi se utilizează diferite substraturi biologice nutritive complexe care au în compoziţia lor aceste îngrediente. Astfel:- Peptonele, care se obţin prin hidroliză enzimatică sau acidă a proteinelor de origine animală (de exemplu făina de oase). Ele nu au o compoziţie chimică foarte bine definită, iar prin conţinutul în peptide şi aminoacizi constituie o sursă universală de azot, pentru toate bacteriile cultivabile, fiind folosite practic în prepararea tuturor mediilor de cultură.- Extractul de carne, ce se obţine prin deshidratarea decoctului de carne de vită. Aceasta conţine cantităţi importante de creatinină, xantină, hipoxantină, acid uric, acid adenilic, glicol, uree, glutamină ca sursă de azot, precum şi glicogen, hexozofosfaţi, acid lactic etc., ca sursă de carbon.- Extractul de drojdie, care se obţine prin cultivarea controlată a drojdiilor şi care conţine numeroase vitamine, mai ales cele din grupul B.- Clorura de sodiu, care se adaugă la mediile uzuale într-o concentraţie de 0,9%. Pentru cultivarea bacteriilor halofile concentraţia poate creşte până la 10%.- Mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, manitol) pot îmbogăţi mediile, deoarece constituie surse de carbon uşor accesibile unor bacterii.

3.2. CULTIVAREA MICROBILOR PE MEDII LICHIDE

unui produs pe medii lichide are dezavantajul că nu permite însă obţinerea unei culturi proprii.

Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide diferă. Astfel, bacteriile aparţinând familiei Enterobacteraceae tulbură uniform mediul, altele, ca de pildă bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia), formează pelicule la suprafaţa mediului. Altele formează agregate care se dezvoltă sub formă de grunji ce se depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secretă în mediu pigmenţi difuzabili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps. aeruginosa).

3.2.1. Fazele creşterii şi multiplicării bacteriilor în mediu lichid

Dacă se cultivă o populaţie bacteriană în mediu lichid, se disting următoarele faze: faza de “lag”, faza de creştere exponenţială (logaritmică), faza staţionară şi faza de declin.

a. Faza de “lag”În această fază, care succede imediat însămânţării mediului lichid cu bacterii, are

loc o “adaptare” a germenilor la condiţiile mediului respectiv. Se produc, pe baza metabolismului bacterian normal, enzime şi metaboliţi care ating la un moment dat un prag limită de concentraţie în mediu, când se declanşează multiplicarea.

În cazul trecerii unei populaţii bacteriene de pe un mediu pe alt mediu, deosebit sub raportul compoziţiei sale, îndivizii bacterieni sunt în marea lor majoritate incapabili de a creşte şi de a se multiplica în acest mediu. În acest caz, faza de “lag” reprezintă perioada necesară unor mutante din populaţia bacteriană pentru ca, prin multiplicarea lor, să determine augmentarea numărului de indivizi în întreaga populaţie bacteriană. Sensibilitatea bacteriilor faţă de chimioterapice este crescută. La majoritatea bacteriilor de interes medical, durata ei este în jur de 1/2 oră, iar la formele sporulate 3-4 ore.

b. Faza exponenţială (logaritmică)Odată cu terminarea fazei de “lag”, multiplicarea populaţiei bacteriene se produce

la o rată înaltă şi anume în progresie geometrică: o celulă dă naştere prin diviziune la două celule fiice, care, la rândul lor, se divid determinând apariţia a câte două noi celule bacteriene (creşterea exponenţială a numărului de indivizi pe unitatea de volum a mediului). Această rată de multiplicare poate fi exprimată matematic prin formula:

N = N0kt , unde: N este numărul de celule în cultură la timpul t, N0 este numărul

iniţial de celule în cultură, iar k reprezintă o constantă, semnificând rata la care logaritmul natural al numărului de celule creşte cu timpul.

Pentru a înţelege mai bine procesul măririi numărului de indivizi bacterieni în cursul fazei exponenţiale, trebuie clarificată şi noţiunea de “generaţie”. O generaţie se exprimă prin dublarea numărului de celule (fiind vorba de o diviziune celulară binară). Numărul de generaţii/oră reflectă, de fapt, corelativ, mărirea numărului de celule în general. Deci, numărul de celule în populaţie (N) creşte în raport direct cu generaţiile (g), astfel:

g N0 11 22 43 8

4 165 32

Faza exponenţială continuă până ce se produc trei fenomene: epuizarea rezervelor nutritive din mediu, acumularea produşilor toxici rezultaţi din metabolismul activ al germenilor în cultură şi dezechilibrul de concentraţie ionică (cu scăderea valorii pH-ului).

Pentru bacteriile aerobe, factorul care se epuizează primul în cultura în mediu lichid (vas închis) este oxigenul. Dacă se introduce aer steril continuu (metoda culturilor continue, agitate), populaţia bacteriană poate fi menţinută în faza exponenţială timp indefinit.

Durata acestei perioade este dependentă de aceleaşi condiţii de mediu ca şi faza precedentă dar şi de specie. Astfel E. coli are un timp de generaţie de aproximativ 10 minute, iar Mycobacterium tuberculosis peste 25 ore. Sensibilitatea la antibiotice a microbilor rămâne crescută.

c. Faza staţionarăMultiplicarea bacteriilor în progresie logaritmică nu mai este posibilă, rata de

înmulţire scade treptat până când bacteriile trec în faza staţionară. Numărul bacteriilor rămâne constant, de unde s-ar putea deduce că numărul bacteriilor rămâne constant deoarece ele nici nu se înmulţesc şi nici nu mor. În această fază, celulele nu mai cresc, ci are loc o activitate metabolică endogenă, prin care celula îşi sintetizează rezerve de energie şi produşi intermediari necesari menţinerii în viaţă în noile condiţii. Încetarea multiplicării în faza staţionară se datorează în principal epuizării unui factor nutritiv esenţial din mediu, numit factor limitant şi acumulării unor produşi toxici cum sunt, de pildă, acizii organici care, prin scăderea pH-ului mediului, limitează multiplicarea bacteriilor. În această fază scade sensibilitatea tulpinilor la chimioterapice.

Dată fiind schimbarea condiţiilor de viaţă ale bacteriilor, acestea vor prezenta modificări ale morfologiei şi fiziologiei lor, atât unele faţă de altele, cât şi comparativ cu faza exponenţială. Acum, bacteriile Gram pozitive nu mai reţin cristalul violet şi apar Gram negative pe frotiurile colorate.

În faza staţionară celulele conţin cantităţi mari de polizaharide şi lipide, substanţe pe care nu le găsim în faza de multiplicare exponenţială. La începutul fazei staţionare, unele specii produc anumiţi metaboliţi secundari (antibiotice, colicine, exotoxine) cu distribuţie taxonomică foarte riguraoasă.

Iniţierea sporogenezei la bacteriile sporulate se petrece la sfârşitul fazei exponenţiale sau la începutul fazei staţionare.

Durata fazei staţionare este în general de câteva ore.

d. Faza de declinLa un moment dat, proporţia de celule care mor depăşeşte rata de multiplicare a

celulelor viabile, până când multiplicarea încetează complet.Pentru celula bacteriană, “moartea” înseamnă pierderea capacităţii de a se

reproduce (divide). Cauzele instalării acestei faze sunt: acumularea de cataboliţi, epuizarea rezervelor nutritive, consumul oxigenului (în cazul bacteriilor aerobe).

Numărul de celule care mor la fiecare interval de timp poate fi apreciat indirect prin evaluarea scăderii numărului celulelor supravieţuitoare, după formula:

S = S0-kt, unde: S reprezintă numărul de celule supravieţuitoare la timpul t, S0

reprezintă numărul de celule supravieţuitoare la timpul 0, iar k este o constantă.Deci, ca şi în cazul fazei de declin, se observă o curbă exponenţială, dar, de această

dată, curba arată descreşterea numărului de celule vii, proporţional cu timpul. Faza de declin durează mai multe zile.

3.2.2. Curba de creştere şi înmulţire a bacteriilor în culturi continuiCând se urmăreşte obţinerea unei mase mari microbiene sau a unor produşi

bacterieni pentru cercetare, preparare de vaccinuri, diversele industrii (farmaceutică, alimentară etc), cultivarea bacteriilor se face în sisteme deschise, în care mediul de cultură este permanent înlocuit cu un mediu proaspăt, îndepărtându-se în acelaşi timp masa nou formată de bacterii. Bacteriile vor fi mereu în faza logaritmică, curba de înmulţire având un aspect liniar. În acest fel se obţin culturile continui, pentru realizarea cărora este necesar un chimiostat sau un turbistat.

3.3. CULTIVAREA BACTERIILOR PE MEDII SOLIDEIntroducerea mediilor de cultură solide a însemnat un progres uriaş în tehnicile de

diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distinctă a microbilor, sub forma de colonii izolate. O colonie bacteriană este o micropopulaţie ce rezultă din înmulţirea unui singur microb pe un mediu, vizibilă în general cu ochiul liber.

Cel mai simplu mediu solid este geloza simplă, ce se obţine prin adăugarea la bulion a unei substanţe gelificabile, care de regulă este geloza, un polizaharid obţinut din alga marină agar-agar. La acest mediu simplu se pot adăuga diferite ingrediente (sânge de oaie, ser, ascită, extract de drojdie etc) pentru a putea cultiva bacteriile pretenţioase.

Caracterele culturale sunt foarte importante în identificarea microbilor. Ele se apreciază fie cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, în general, sunt dimensiunea, forma, pigmentul, consistenţa, aderenţa la mediu, activitatea hemolitică şi unele modificări pe care microorganismele le produc în mediul respectiv.

Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate, care se suspendă omogen în ser fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe când coloniile aceleiaşi specii, cu suprafaţă rugoasă, relief şi margini neregulate şi care aglutinează spontan în ser fiziologic - colonii de tip R (rough). În general, cu unele excepţii, coloniile S aparţin tulpinilor virulente, pe când cele R sunt nevirulente.

Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numărătoarea de germeni într-un anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece în multe infecţii criteriul de implicare etiologic este numărul bacteriilor în produsul de examinat (infecţii urinare).

4. ÎNMULŢIREA BACTERIILOR ÎN ORGANISMUrmărind curba de multiplicare a bacteriilor într-un mediu limitat, putem deduce

că după pătrunderea în organism a unui mic număr de microbi, se poate produce o infecţie. Un astfel de exemplu este meningita, în care meningococul se înmulţeşte foarte

rapid punând viaţa pacientului în pericol dacă nu se intervine cu un tratament antiinfecţios.

MicroorganismIn

vitroÎn

vivo

E. coli şi Staphilococcus20-30 minute

4-6 ore

Salmonella typhimurium

30 minute 5-12 ore

Mycobacterium tuberculosis

24 ore câteva zile

Mycobacterium leprae Nu se cultivă

2 săptămâni

Treponema pallidum Nu se cultivă

30 ore

(modificat după Roitt, 1994)

Pe de altă parte, însă, nu toate bacteriile se divid repede. Bacilul tuberculos, de pildă, al cărui timp de generaţie este de 24 ore, se va înmulţi lent şi va produce o infecţie cu evoluţie insidioasă, cronică.

În organism, creşterea şi multiplicarea bacteriilor este diferită de multiplicarea in vitro, fiind stressată de necesităţi nutritive (prin competiţie cu flora normală) şi prin mecanismele de apărare antiinfecţioasă. Condiţiile pe care microorganismele le întâlnesc în organism le selectează pe acelea care cresc în anumite limite de temperatură, osmolaritate şi pH.

Agenţii infecţioşi pe care îi găsim numai în organismele infectate vor supravieţui in vitro numai în condiţiile de temperatură, osmolaritate şi pH apropiate organismului nostru.

Microorganismele care au şi alt habitat decât omul cresc în limite mai largi, necesităţile nutritive ale unui microb reflectând, în general, habitatul lui. Astfel, gonococii, care trăiesc aproape numai în organismul uman, au pretenţii nutritive mai mari necesitând pentru cultivarea in vitro medii speciale, pe când E. coli, Pseudomonas aeruginosa şi alte specii, care supravieţuiesc frecvent în mediul înconjurător, numai medii minimale.

La aspectele menţionate se adaugă habitatul în organism al agenţilor infecţioşi. Astfel, bacteriile cu habitat extracelular sunt expuse acţiunii anticorpilor, complementului, fagocitozei, spre deosebire de bacteriile ce se înmulţesc intracelular şi care sunt protejate de acţiunea acestor factori şi scapă uneori supravegherii imunologice.

Bacteriile dezvoltă mecanisme adaptative care să ocolească barierele ce se opun

înmulţirii lor. Precizăm că şi în condiţiile în care multiplicarea bacteriilor este oprită,

simpla lor prezenţă în organism poate constitui un permanent stimul imunologic cu

urmări benefice sau dimpotrivă, dăunătoare.Multe lichide se folosesc cel mai adesea

pentru înmulţirea unor microbi care se găsesc în număr mic într-un anumit produs. Cel

mai simplu mediu folosit în laboratorul de bacteriologie este bulionul care se prepară din

decoct de carne de vacă, peptonă şi clorură de sodiu. Cultivarea

GENETICA BACTERIANĂ

Ereditatea reprezintă însuşirea generală a tuturor vieţuitoarelor de a transmite caracterele specifice speciei la urmaşi.

Variabilitatea reprezintă modificarea zestrei ereditare a bacteriilor, ceea ce dă naştere

unor tulpini bacteriene noi, care prin virulenţă şi rezistenţa la chimioterapice, se

adaptează mai bine condiţiilor de mediu şi înlocuiesc bacteriile mai puţin adaptabile.

EREDITATEA LA BACTERII

Suportul material al eredităţii

Caracterele unei bacterii sunt determinate genetic. Exprimarea manifestă a acestor caractere constituie fenotipul.

Organizarea materialului genetic la bacterii

Genomul bacterian este alcătuit din repliconi, formaţiuni genetice ce se pot replica independent: - cromozomul bacterian; - elemente genetice extracromozomiale (plasmide; genomul bacteriofagilor); - elemente genetice transpozabile (fragmente de inserţie şi transpozonii-Tn).

1. CROMOZOMUL BACTERIAN

Majoritatea genelor bacteriene se află în cromozomul bacterian haploid, care codifică informaţiile absolut necesare supravieţuirii speciei în condiţii normale.

Cromozomol de Escherichia coli este format din: o moleculă circulară dublu spiralată de ADN ce reprezintă 80% din greutatea lui; o componentă proteică: ARN-polimeraza (reprezintă 10% din greutatea sa); ARNm şi ARNr în curs de sintetizare (10% din greutatea sa).

2. ELEMENTE GENETICE EXTRACROMOZOMIALEAceste elemente genetice sunt reprezentate de bacteriofagi şi plasmide.

2.1. PLASMIDELE Sunt formaţiuni genetice autonome, extracromozomiale, libere în citoplasmă,

reprezentate de molecule circulare de ADN, care se replică independent de cromozom.

Denumirea lor a fost dată în 1952 de către Lederberg. Importanţa lor practică a fost evidenţiată în 1963 de către Watanabe, care a demonstrat posibilitatea transmiterii prin plasmide a rezistenţei la antibiotice a bacteriilor.

Plasmidele pot fi:– conjugative: plasmidele care se pot transfera singure la alte bacterii (ex. plasmida de rezistenţă la antibiotice - plasmidul R); – neconjugative: plasmidele care nu pot părăsi ele singure bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (ex. plasmidul ce codifică secreţia de -lactamază la stafilococul aureu);– episomi: plasmidele care se pot integra (prin recombinare) în cromozomul bacterian, pierzându-şi astfel autonomia de replicare (ex. factorul de sex F - plasmidul F - factor de fertilitate).

Determinanţii genetici de la nivelul plasmidelor sunt: esenţiali (codifică informaţiile legate de replicarea autonomă) şi accesorii (care codifică caractere fenotipice neesenţiale supravieţuirii celulei bacteriene în condiţii naturale). Exemple de determinanţi genetici accesorii: gene de transfer (tra); gene de secreţie a unor toxine; gene de rezistenţă la antibiotice (factor R); gene de rezistenţă la unii ioni şi compuşi organo-metalici; gene pentru secreţia colicinelor (factor col); gene de metabolizare a unor substraturi.

Unele plasmide nu au efect manifest fenotipic. Acestea sunt plasmidele criptice.Plasmide importante pentru practica medicală: plasmidele de virulenţă, plasmidul

care conferă bacteriei rezistenţă la antibiotice (plasmidul R), plasmidul F.

Plasmidele de virulenţă: au determinanţi genetici ce determină sinteza unor factori de virulenţă la bacterii. Exemple: secreţia de enterotoxină (termolabilă şi termostabilă) la Escherichia coli; factori de colonizare la Escherichia coli; hemolizina (stafilococul aureu, streptococul faecalis, Eschirichia coli ); exfoliatina la stafilococul aureu; invazivitatea la Shigella.

Plasmidele de rezistenţă la chimioterapice -R-: sunt molecule circulare de ADN, ce conţin 2 regiuni: genele care codifică rezistenţa la antibiotice - „R”, unice sau multiple, şi genele care conferă plasmidului capacitatea de a se transfera -„FTR”. Rezistenţa de natură plasmidică este întâlnită în proporţie de peste 90% la tulpinile din spital (Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Proteus).

Plasmidul F (plasmidul de sex, factorul de fertilitate) conţine genele de transfer tra. Plasmidul F se poate transmite, prin conjugare, altor celule bacteriene. El se poate integra în cromozomul bacterian putând media transferul de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană donor la receptor.

În funcţie de factorul F bacteriile se împart în:- bacteria F-: lipsite de factor F (celule femele, receptoare de material genetic);- bacteria F+: masculine, au factor F; sunt celule donatoare;- bacteria Hfr. (high frequency of recombination): au factorul F integrat în cromozom; sunt celule masculine;- bacteria Fγ: au factorul F+ ca plasmid autonom, după ce acesta a fost integrat în cromozom şi l-a părăsit rupând un fragment ADN din cromozom; sunt celule donoare masculine.

VARIABILITATEA LA BACTERII

Bacteriile respectă aceleaşi legi ale eredităţii, unitare lumii vii, cu unele particularităţi dictate de organizraea materialului genetic. Astfel, în timpul diviziunii succesive, toţi descendenţii unei bacterii sunt identici între ei şi identici cu celula din care provin.

Variabilitatea la bacterii poate fi explicată prin:

– variaţia fenotipică: reprezintă schimbarea unor însuşiri bacteriene ca adaptare la condiţiile mediului înconjurător, fără să intervină vreo modificare în genomul bacterian;

– variaţia genotipică: rezultă din modificarea genomului.În 1943 s-a dovedit faptul că modificările proprietăţilor unei populaţii bacteriene

sunt rezultatul unor variaţii rare la un număr mic de celule care se selectează şi dau naştere unei populaţii noi.

Variabilitatea la bacterii se realizează prin: mutaţii, transfer de material genetic şi transpoziţie.

1. MUTAŢIA

Mutaţia reprezintă modificarea spontană a genomului bacterian, modificare ce constă în schimbarea secvenţei de nucleotide dintr-o genă. Ele pot fi: punctiforme, inversii, deleţii, inserţii, mutaţii secundare.

1.1. Mutaţiile punctiforme afectează un singur nucleoid în cadrul unei gene şi sunt reversibile. Consecinţe:- înlocuirea unui codon cu altul duce la înlocuirea unui aminoacid cu altul în structura unui polipeptid. Aceste mutaţii sunt numite „mutaţii în sens greşit”;- apariţia unui codon nonsens. Mutaţia nonsens împiedică sinteza în continuare a unui polipeptid, iar dacă ea se produce la începutul genei ce codifică un polipeptid se numeşte mutaţie polară şi acesta nu se va mai sintetiza deloc.

1.2. Inserţia şi deleţia înseamnă adăugarea, respectiv pierderea a 2 până la sute sau chiar mii de nucleotide, procesul fiind ireversibil. Acest tip de mutaţie duce la modificarea importantă a secvenţei de aminoacizi, fiind denumită „mutaţie cu schimbare de proiect”.

1.3. Mutaţii secundare sunt de 2 feluri: mutaţii reverse, care restabilesc o secvenţă nucleotidică ce s-a modificat şi mutaţii supresoare, ce permit exprimarea funcţiei anterioare a unei gene care a suferit o mutaţie, fără restabilirea codonilor iniţiali. Aceasta datorită sintezei unui ARNt care „ştie” să citească un codon nonsens.

Rata de mutaţie reprezintă raportul dintre frecvenţa şi unitatea de timp. Este rară şi variază de le genă la genă între 10-6 şi 10-10.

Consecinţele mutaţiilor duc la apariţia unor indivizi cu caractere noi, cum ar fi: - rezistenţa la chimioterapice;

- structură antigenică modificată; - pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi;- pierderea capacităţii de sinteză a unui metabolit.

Din punct de vedere medical interesează în mod deosebit mutaţia spre chimiorezistenţă, care se poate produce:

- dintr-o dată - „one step” (bacteria devine rezistentă brusc, „peste noapte”, la un antibiotic);

- în mai multe etape - „multi step” (se produc mutaţii multiple, succesive, până ia naştere o mutantă rezistentă la concentraţii crescute de antibiotic).

Mutaţiile naturale sunt rare. Mutaţiile induse sunt determinate de agenţi mutageni: radiaţii X, UV, derivaţi acridinici, agenţi alchilanţi. Aceşti agenţi selectează mutanta pentru ca aceasta să se transforme într-o populaţie bacteriană cu proprietăţi noi, pot duce la „pierderea integrală” a unui plasmid, printr-o modificare ce produce deficienţe ale mecanismului de replicare, astfel încât plasmidele nu vor mai fi „moştenite” de celulele fiice.

2. TRANSFERUL DE MATERIAL GENETIC

Se realizează între 2 celule bacteriene, una denumită donor, cealaltă receptor, prin procese ca: transformarea, transducţia, conjugarea.

2.1. TRANSFORMAREA Reprezintă transferul de material genetic de la o celulă donor la una receptor,

sub formă de ADN pur, eliberat prin liza celulei donor sau prin extracţie chimică.

2.2. TRANSDUCŢIA Reprezintă un transfer de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană la alta,

mediat de bacteriofagi (figura 2).Unii bacteriofagi sunt capabili să transfere orice genă bacteriană (transducţie

generalizată) sau pot transfera numai anumite gene (transducţie specializată).

Figura 2: Transducţia (după Murray, Drew, Kobayashi, 1990)

Transducţia generalizată este mediată de fagi litici, care, după pătrunderea în celula bacteriană, se multiplică şi determină liza celulei gazdă.

În timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmentează. Se poate întâmpla ca unul dintre aceste fragmente, cu o dimensiune apropiată de cea a genomului fagic, să se integreze în capsula bacteriofagului, în locul genomului fagic.

Aceşti bacteriofagi sunt defectivi şi nu se vor mai putea replica, dar pot pătrunde în alte celule bacteriene, injectându-le ADN, ce provine din cel al celulei donoare. ADN se va integra în cromozomul celulei receptoare prin recombinare, rezultând caractere noi ca modificări patogenice bacteriene, rezistenţă la chimioterapice.

Transducţie specializată este mediată de fagii temperaţi.După pătrunderea în celula bacteriană a ADN bacteriofagului temperat, ADN

suferă un proces de circularizare după care se inseră în cromozom prin recombinare sub formă de profag (pe baza homologiei între 10 perechi de baze ale ADN fagic şi bacterian). Profagul devine parte integrantă a cromozomului bacterian, se va replica odată cu acesta, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazdă.

2.3. CONJUGAREA Reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una

receptoare printr-un proces de împerechere, ce se realizează prin contactul direct dintre cele 2 celule. Astfel se pot transmite plasmide şi gene cromozomiale (prin intermediul factorului F+).

ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI, CHIMICI ŞI BIOLOGICI

ASUPRA BACTERIILOR

DEFINIREA TERMENILOR

Pentru înţelegerea mai clară a acţiunii unor agenţi fizici şi chimici asupra bacteriilor, se impune mai întâi definirea unor noţiuni.

Un agent bacteriostatic este acela care are proprietatea de a stopa multiplicarea bacteriilor. Multiplicarea reapare după îndepărtarea agentului respectiv.

Un agent bactericid are proprietatea de a omorî (inactiva definitiv) celula bacteriană, procesul fiind ireversibil: chiar după îndepărtarea agentului, nu se mai produce multiplicarea bacteriană. În acest caz, este vorba de liza celulei bacteriene sau, mai rar, de păstrarea intactă a morfologiei celulare, dar cu oprirea funcţiilor cardinale ale celulei.

Sterilizarea reprezintă acţiunea prin care se obţine suprimarea oricărei flore microbacteriene.

Dezinfectantul este o substanţă (agent) folosită pentru inactivarea microorganismelor de pe unele suprafeţe (mese, podele), dar care, datorită toxicităţii sale marcate, nu poate fi aplicat în ţesuturi umane.

Dezinfecţia este procesul de inactivare a microorganismelor de pe suprafeţe (“obiecte” neanimate).

Antisepsia constă în aplicarea unor substanţe bactericide sau bacteriostatice în scopul de a omorî sau inhiba dezvoltarea florei patogene în plăgi.

Asepsia cuprinde toate măsurile care impiedică contaminarea cu agenţi infecţioşi a unei plăgi.

Conservarea reprezintă prevenirea alterării prin agenţi microbieni ai unor produse degradabile cum sunt alimentele sau medicamentele.

ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI ASUPRA BACTERIILOR

Dintre cei mai imoprtanţi agenţi fizici care pot influenţa viabilitatea şi puterea de multiplicare a bacteriilor, menţionăm: căldura, uscăciunea, (desicarea), presiunea mecanică şi osmotică, radiaţiile, electricitatea etc.

1. CĂLDURATemperaturile ridicate (căldura) prezintă în general (cu excepţia grupului restrâns

al bacteriilor termofile) o acţiune bactericidă. Temperaturile joase sunt mai puţin nocive, cele mai multe specii bacteriene rezistând un timp în stare latentă, fără multiplicare (“hibernare bacteriană”). În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare, bacteriile se împart în: mezofile (370C); criofile sau psihrofile (25-300C sau mai puţin); termofile (55-650C).

Căldura acţionează diferenţiat asupra formelor vegetative şi, respectiv, asupra sporilor bacterieni. Astfel, asupra formelor vegetative, temperatura de 1000C, realizează un efect bactericid complet în 2-3 minute, pe când sporii rezistă chiar 15 minute la temperatura de 1200C. Trebuie precizat faptul că există o corelaţie temperatură-timp, în ceea ce priveşte efectul sterilizant.

Rezistenţa la acţiunea căldurii a diferitelor specii bacteriene este variabilă şi

anume:

a. Forme vegetative (exemplu: Mycobacterium tuberculosis).

Timp Temperatura30 minute 580C20 minute 590C2 minute 650C

b. Spori. În ceea ce priveşte timpul de distrucţie prin căldură, se pot descrie următoarele diferenţe de specie:

SPECIE TIMP DE DISTRUCŢIE (MINUTE)1000C 1050C 1100C 1150C 1200C 1300C

Bacillus anthracis

2-15 5-10

Clostridium tetani

5-90 5-25

Clostridium perfringens

5-45 5-27 10-15 4 1

Clostridium botulinum

300-530

40-120

32-90 10-40 4-20

Clostridium sporogenes

150 45 12

Bacterii din sol

Mai multe ore

420 120 15 6-30 1,5-10

În tabelul de mai jos redăm corelaţia între timpul de distrucţie prin căldură uscată şi temperatură, pentru diferitele specii bacteriene aflate în forma sporulată:

SPECIETIMP DE DISTRUCTIE (MINUTE)

1200

C1300

C1400C 1500C 1600C 1700C 1800C

Bacillus anthracis

180 60-120

9-90 3

Clostridium botulinum

120 60 15-60 25 20-25 10-15 5-10

Clostridium perfringens

50 15-35

5

Clostridium tetani

20-40

5-15 30 12 5 1

Bacterii din sol

180 30-90 15-60 15

Pentru a aprecia eficienţa sterilizării prin căldură, se folosesc următorii parametrii:

- “timp de moarte termică”: reprezintă cel mai scurt interval de timp necesar inactivării unei suspensii bacteriene la o anumită temperatură şi în anumite condiţii.- “timp de reducere decimală” (valoarea “D”): reprezintă intervalul de timp (în minute) necesar reducerii numărului de celule vii cu 90% din valoarea iniţială (cu 9 log 10 ).

1.1. STERILIZAREA PRIN CĂLDURĂ USCATĂCăldura uscată omoară microorganismele prin oxidarea distructivă a

componentelor celulare. Cei mai rezistenţi spori sunt distruşi de căldura uscată la 1600C,

timp de 60 minute. Căldura uscată de 1000C distruge în 60 de minute bacteriile care sunt omorâte prin căldură umedă la 600C în 30 minute. Sporii fungilor sunt distruşi în 60 de minute la 1150C, iar cei bacterieni la temperaturi cuprinse între 120-1600C. În laboratorul de microbiologie se utilizează următoarele tehnici de sterilizare: încălzirea la roşu, flambarea, sterilizarea la pupinel şi sterilizarea cu raze infraroşii.

- Încălzirea la roşu în flacară a obiectelor se aplică anselor bacteriologice în laboratorul de microbiologie.

- Flambarea (trecerea prin flacară pentru câteva secunde) se aplică gâtului baloanelor, eprubetelor după deschidere şi înainte de închiderea lor, pipetelor înainte de utilizare pentru a preveni contaminarea cu germenii din aer. Se mai sterilizează prin flambare instrumente de mică chirurgie, după ce se stropesc cu alcool, dar temperatura produsă nu este suficient de înaltă pentru a asigura o sterilizare optimă.

- Sterilizarea la pupinel. Pupinelul sau cuptorul cu aer cald este o cutie metalică cu pereţi dubli între care se găseşte un strat de azbest care împiedică pierderile de căldură. Mai este prevăzut cu o sursă de căldură care este energia electrică şi un termoregulator. În interior pupinelul este prevăzut cu rafturi pentru obiectele de sterilizat. Temperatura de sterilizare la pupinel este de 1600C timp de 1 oră sau de 1800C timp de ½ de oră. La pupinel se sterilizează întreaga sticlărie de laborator, instrumentarul de stomatologie, seringi fără armătură metalică, pudre, uleiuri etc. Pupinelul nu trebuie să fie supraîncărcat, pentru ca aerul să poată circula nestingherit printre obiectele de sterilizat.

- Sterilizare cu raze infraroşii este folosită pentru sterilizarea seringilor fără armătură metalică la o temperatură de 1800C. Sterilizarea se poate efectua şi la 2000C în vid, aplicându-se instrumentelor chirurgicale.

1.2. STERILIZAREA PRIN CĂLDURĂ UMEDĂCăldura umedă este mai eficientă decât căldura uscată, distrugând bacteriile la o

temperatură mai scăzută şi în timp mai scurt. Formele vegetative ale majorităţii bacteriilor, fungilor şi virusurilor animale sunt omorâte de căldura umedă în 10 minute la temperaturi cuprinse între 500C (Neisseria gonorrhoeae) şi 650C (Staphilococcus aureus). O susceptibilitate deosebită faţă de căldură o prezinta Treponema pallidum, care este distrusă în 10 minute la 430C. Rezistenţă maximă la căldura umedă o are, însă, Bacillus stearothermophylus, a cărui formă vegetativă se poate multiplica la 800C. O parte din virusurile animale au o rezistenţă crescută faţă de căldura umedă, ca, de pildă, virusul poliomielitic care este inactivat la 600C după 30 de minute şi virusul hepatitei B care, dacă se află în ser, rezistă 10 ore la 600C. Mulţi bacteriofagi au o rezistenţă mai mare la căldura umedă decât bacteria gazdă, aceasta fiind distrusă la 600C în 15-30 de minute, iar bacteriofagul la temperaturi cuprinse între 65-800C.

Formele sporulate ale actinomicetelor, ciupercilor şi a fungilor sunt mai rezistente decât formele vegetative, dar nu atât de rezistente ca şi sporii bacterieni.

Rezistenţa sporilor bacterieni variază la diferite specii, dar chiar şi între tulpinile aceleiaşi specii. Astfel, majoritatea sporilor de Cl. tetani sunt distruşi prin fierbere la 1000C în 10 minute, dar s-au semnalat tulpini ai căror spori rezistă la fiebere 1-3 ore,

fiind cei mai rezistenţi patogeni ce pot infecta o plagă. Rezistenţa lor determină standardele minime pentru sterilizarea chirurgicală: 10 minute la 1210C sau 30 de minute la 1150C fără a socoti timpul de încălzire. Unii spori de Cl. botulinum rezistă la fierbere la un pH de 7 până la 8 ore, iar la autoclavare 10-40 minute la 1150C.

Omorârea microorganismelor prin căldură umedă se produce prin coagularea proteinelor structurale şi inactivarea enzimelor, cu participarea apei. Cei mai rezistenţi spori sunt distruşi prin expunere la căldură umedă la 1210C timp de 30 de minute.

- Fierberea este de fapt o metodă de dezinfecţie deoarece ea nu distruge toate formele sporulate. Se efectuează la 1000C timp de ½ de oră şi se aplică siringilor şi instrumentelor de mică chirurgie atunci când nu este posibilă altă metodă. Fierberea se mai foloseşte în epidemii la sterilizarea apei.

- Pasteurizarea a fost introdusă de Pasteur pentru conservarea vinului, fiind utilizată şi acum pentru sterilizarea unor alimente lichide care nu suportă temperaturi prea ridicate (lapte, bere, sucuri de fructe). Metoda constă în încălzirea lichidului: la 620C pentru 30 de minute (pasteurizare joasă), la 710C timp de 15 minute (pasteurizare medie), la 80-850C timp de 3-5 minute (pasteurizare înaltă ) sau introducerea unor vapori filanţi la o temperatură de 130-1500C sub presiune pentru câteva secunde (ultrapasteurizare). Pasteurizarea este o metodă eficientă deoarece bacteriile patogene care se pot dezvolta în lapte (Mycobacteium tuberculosis, Salmonella, Streptococcus şi Brucella) nu sunt bacterii sporulate, numărul lor reducându-se după pasteurizare cu 97-99%. Coxiella burnetii nu este distrusă prin pasteurizare joasă.

- Tyndalizarea constă în încălzirea produsului de sterilizat 3 zile la rând, în baie de apă la 56-1000C câte o oră. Temperatura se alege în funcţie de produsul de sterilizat. Metoda se aplică lichidelor care nu suportă temperaturi ridicate, ca de exemplu: vaccinuri, medii de cultură ce conţin zaharuri în concentraţie mare, proteine, gelatină etc. Formele vegetative sunt distruse în prima zi, iar sporii se transformă în forme vegetative ce vor fi distruse zilele următoare. Reamintim, însă, că sporii bacteriilor termofile nu se distrug prin această metodă.

- Autoclavarea este metoda folosită pentru instrumentarul de chirurgie iar în laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a materialului infecţios. Sterilizarea are loc într-o atmosferă saturată de vapori de apă la 1200C, la o presiune de 1 atm, timp de 30 de minute, în aparate speciale numite autoclave.

2. USCĂCIUNEA (DESICAREA)Sensibilitatea bacteriilor la uscăciune este diferită, în funcţie de specie şi chiar

tulpină. În general, bacteriile sunt rezistente la uscăciune în forma sporulată şi, pentru

unele specii, chiar în formă vegetativă (Mycobacterium tuberculosis persistă în picături

de spută uscată şi la întuneric).

Rezistenţa relativă a bacteriilor la uscăciune, precum şi la temperaturile scăzute, a

stat la baza punerii la punct a uneia dintre cele mai folosite metode pentru conservarea

microorganismelor.

Liofilizarea. Este vorba de uscarea (desicarea) treptată în vid, la temperaturi foarte joase (-400C până la -700C). În stare liofilizată, bacteriile pot fi conservate la temperatura camerei mult timp (ani).

3. PRESIUNEA MECANICĂMajoritatea bacteriilor rezistă la presiuni foarte mari (3.000 atm, formele

vegetative; 12.000-20.000 atm, formele sporulate).

4. PRESIUNEA OSMOTICĂBariera osmotică a celulei bacteriene este membrana citoplasmatică. În mediu

hiperton (cu concentraţie înaltă de ioni şi macromolecule organice) are loc procesul de plasmoliză: apa din celulă iese în mediu, citoplasma se retractă, odată cu membrana citoplasmatică, în timp ce peretele celular, rigid, nu-şi modifică forma. În mediu hipoton (cu concentraţie scăzută de ioni şi molecule organice) se produce fenomenul invers, de plasmoptiză: pătrunderea apei în celula bacteriană, care devine turgescentă, procesul evoluând până la liza celulară (mai ales dacă, în prealabil, peretele celular, rigid şi rezistent, a fost îndepărtat prin lizozim -protoplaşti- sau prin antibiotice inhibitorii ale sintezei acesteia -sferoplaşti).

5. RADIAŢIILERadiaţiile se pot clasifica în: radiaţii ionizante (X, , catodice) şi în radiaţii

ultraviolete.

5.1. RADIAŢIILE IONIZANTE

Categoriile de radiaţii ionizante sunt următoarele:- Radiaţiile X sunt produse de generatoare speciale; au lungimea de undă =0,1nm-40nm.- Radiaţiile sunt produse de izotopi (cobalt 60); au lungimea de undă =0,1nm-10nm.- Radiaţiile catodice sunt produse în dispozitive speciale, numite acceleratori de electroni; sunt compuse dintr-un flux de electroni cu viteză foarte mare (“acceleraţi”); puterea lor de penetrare este de peste 1x106 volţi.

Radiaţiile ionizante au ca mecanisme de acţiune denaturarea proteinelor, acizilor nucleici celulari şi formarea de radicali liberi şi peroxizi. Denaturarea proteinelor şi acizilor nucleici celulari se realizează prin puterea mare de penetrare a acestor radiaţii cu dezintegrarea structurilor primare, secundare şi terţiare ale proteinelor (mai ales la nivelul grupărilor polare), cu “ruperea” lanţurilor acizilor nucleici (ARN monocaternar prezintă şanse de refacere, pe când, ADN bicatenar suferă o degradare definitivă).

Efectul de ionizare se realizează prin formarea de radicali liberi (OH şi H2O) în apa mediului, prin flux fotonic cu energie înaltă cu efect letal şi formarea de peroxizi (R-O-O-R), ce acţionează ca agenţi oxidanţi.

5.2. RADIAŢIILE ULTRAVIOLETERadiaţiile ultraviolete prezintă o lungime de unda =40nm-390nm, iar activitatea

lor bacteriană maximă este de 260nm. Aceste radiaţii se absorb selectiv la nivelul

acizilor nucleici, îndeosebi ADN, determinând formarea dimerilor pirimidinici toxici.

Modificările induse în celulele bacteriene prin razele ultraviolete sunt reversibile, prin

procesele de fotoreactivare şi restaurare la întuneric.

Fotoreactivarea: radiaţiile luminoase pot activa o enzimă celulară care clivează dimerii pirimidinici toxici. Restaurarea la întuneric (“dark repair”) constă în faptul că, la întuneric, are loc acţiunea succesivă a trei enzime (o endonuclează - care desprinde dimerul pirimidinic de pe ADN; o exonuclează - care formează “lacune” de-a lungul moleculei alterate de ADN, prin clivare secvenţială; o ADN-polimerază - care umple lacunele, folosind ca matrice porţiunea omologă din lanţul geamăn de ADN, nealterat. Prin fotoreactivare şi restaurare la întuneric, se selectează indivizi bacterieni rezistenţi la efectul radiaţiilor.

Aplicaţiile radiaţiilor ultraviolete în laboratorul de microbiologie se referă în principal la folosirea lor ca agenţi sterilizanţi. Astfel, radiaţiile ultraviolete se utilizează pentru sterilizarea încăperilor, boxelor, hotelor, sălilor de operaţii, meselor de laborator, etc.

6. ULTRASUNETELEUltrasunetele reprezintă vibraţii cu frecvenţă mai mare decât cea a undelor sonore

(peste 16.000 hertzi). Ele se obţin cu ajutorul cristalelor piezoelectrice. Ultrasunetele au un puternic efect bactericid, producând relativ rapid distrucţia celulei bacteriene. De altfel, una dintre cele mai eficiente metode de dezintegrare a corpilor microbieni - etapa preliminară analizei chimice a bacteriilor în laborator - este ultrasonarea suspensiei bacteriene.

7. ELECTRICITATEACurentul electric, ca atare, exercită acţiuni minore asupra bacteriilor. În schimb, el

poate influenţa compoziţia fizico-chimică a mediului, cu efecte secundare bactericide: creşterea temperaturii peste valorile optime desfăşurării normale a metabolismului bacterian; ionizarea clorului din compuşii cloruraţi; formarea de ozon.

8. FILTRAREASterilizarea anumitor lichide care conţin substanţe alterabile prin căldură, se face

cu ajutorul filtrelor. Lichidele termolabile sunt trecute prin filtre sterilizante, care reţin microorganismele, permiţând trecerea lichidului astfel sterilizat.

Filtrele folosite sunt de mai multe feluri, în funcţie de compoziţie:- filtre Chamberlan din porţelan, numite şi bujii, în formă de lumânare;

- filtre Berkefeld din pământ de infuzorii (Kisselgur), putând fi recondiţionate după folosire;

- filtre Seitz din placă de azbest şi celuloză; după dimensiunea porilor, pot fi: clarifiante (cu pori mari) sau sterilizante (cu pori de dimensiuni foarte reduse) - EKS1, EKS2;

- filtre de metilen celuloza (Millipore, Sartorius), ce prezintă o porozitate de 0,2 microni.

ACŢIUNEA AGENŢILOR CHIMICI ASUPRA BACTERIILORPentru a putea intra în uzul curent, se impune întrunirea următoarelor condiţii

generale pe care trebuie să le îndeplinească un agent chimic dezinfectant:- să aibă o puternică acţiune antimicrobiană (bactericidă), în concentraţii relativ

reduse;- să prezinte un grad înalt de solubilitate în apă;- să nu fie foarte toxic pentru organismul uman, chiar în aplicaţii externe;- să nu se combine cu materii organice de pe tegumente, care să-l inactiveze;- să-şi exercite efectele bactericide cu intensitate apropiată atât la temperatura

camerei, cât şi la cea a corpului uman;- să aibă capacitate mare de penetrare; pe cât posibil, să nu degaje un miros

neplacut; să aibă un cost relativ scăzut.

1. AGENŢI CHIMICI CU ACŢIUNE ANTIBACTERIANĂ1.1. FENOLUL ŞI DERIVAŢII FENOLICI

Fenolul (C6H5OH) sau acidul carbolic este un bun denaturant al proteinelor precum şi un detergent. Acţiunea sa bactericidă presupune liza celulelor bacteriene. El se poate folosi ca dezinfectant în concentraţie de 2,5% la decontaminarea băilor, a podelelor de spital, a ploştilor etc., fiind însă iritant. Este activ faţă de majoritatea bacteriilor, inclusiv faţă de bacilul tuberculozei şi spori. În concentraţie de 1%, se foloseşte pentru conservarea vaccinurilor.

(4-alil-2- methoxifenol). Ultimul este folosit în stomatologie.

1.2. ALCOOLIIDeşi dezinfectanţi cu putere mai slabă decât a fenolilor, alcoolii, prin gruparea

“alkyl” (R-CH2OH) acţionează bactericid, dar numai asupra formelor vegetative. S-a demonstrat, de pildă, ca sporii de bacil cărbunos rezistă timp de 20 de ani în alcool absolut..

1.3. HALOGENII ŞI COMPUŞII HALOGENAŢIHalogenii cei mai utilizaţi ca antiseptice şi dezinfectante sunt clorul şi iodul,

ambele cu acţiune puternic bactericidă şi sporicidă. Mecanismul de acţiune al halogenilor se bazează pe proprietăţile lor oxidante.

Clorul a fost introdus ca dezinfectant de O.W. Holmes la Boston în anul 1835 şi de Semmelweis la Viena în 1847 pentru a preveni transmiterea febrei puerperale prin mâinile medicilor.

- clorul gazos în concentraţie de 2-30/00 este folosit pentru potabilizarea apei, dar concentraţia trebuie să fie mai mare dacă apele au conţinut crescut de substanţe organice, deoarece acestea fixează şi inactivează clorul;

- hipocloritul de sodiu se foloseşte tot pentru dezinfecţia apei, a veselei şi a WC-urilor, la curăţirea suprafeţelor în industria alimentară, în unităţi de alimentaţie publică etc.;

- cloramina este folosită ca dezinfectant pentru veselă, lenjerie, în concentraţie de 2-3% şi ca antiseptic în concentraţie de 1%;

Iodul este un oxidant puternic şi se combină ireversibil cu proteinele bacteriene. Se foloseşte sub formă de:

- soluţie alcoolică 1-2% ca antiseptic cutanat;- tinctura de iod care conţine 4-5% iod şi 2-5% iodură de potasiu se utilizează tot

ca antiseptic cutanat pentru antiseptizarea pielii înainte de intervenţii chirurgicale. Atât soluţia alcoolică cât şi tinctura nu pot fi aplicate direct pe plăgi deoarece au efect distructiv asupra ţesuturilor;

- iodoforii, care conţin iod complexat cu un detergent anionic, au o serie de avantaje: au o penetrabilitate foarte bună a pielii, nu sunt iritanţi, deoarece iodul este eliberat treptat din combinaţie şi nu pătează lenjeria. Un exemplu este betadina, un complex hidrosolubil al iodului cu polivinilpirolidina. Preparatul poate fi folosit pentru antiseptizarea plăgilor superficiale.

Dezavantajul antisepticelor cu iod este alergizarea pe care o produc la unele persoane.

1.4. ACIZII ŞI BAZELEEfectul bactericid al acizilor şi bazelor se datorează denaturării brutale a

proteinelor bacteriene.Acizii. Acţiunea dezinfectantă a unui acid creşte, în general, paralel cu gradul de

disociere electrolitică. Cei mai bactericizi acizi în ordine descrescătoare a activităţii lor sunt: acidul azotic, clorhidric, persulfuric şi permenganic. Acizii organici au o acţiune bactericidă mai slabă. Acizii minerali se folosesc mai rar în dezinfecţie. Astfel, în laboratoare se utilizează amestecul sulfocromic pentru dezinfecţia şi degresarea pipetelor.

Ca antiseptice se folosesc mai frecvent:- acidul boric: 2-3% în soluţii apoase, 10% în unguente şi 0,005-1,6% pentru

colire. Nu se aplică sugarilor (este toxic) şi nu se aplică pe plăgi întinse;- acidul acetil glacial: diluat 28-32% se utilizează în dermatologie şi stomatologie

ca antiseptic, astringent, cauterizant şi antifungic.Bazele, ca si acizii, sunt active în funcţie de gradul de disociere. Bazele cu

proprietăţi puternic bactericide sunt: KOH, NaOH, LiOH, NH4OH. Se pare că acţiunea bazelor se datorează nu numai radicalilor rezultaţi prin disociere, ci şi bazelor nedisociate (cu efect bactericid) care pătrund în celula bacteriană. Dintre baze, Ca(OH)3 este folosit la văruirea încăperilor, iar soluţia caldă de NaOH 5%, ca dezinfectant.

Sensibilitatea la acizi şi baze este diferită de la specie la specie. Astfel, mycobacteriile sunt relativ rezistente la acizi şi baze, NaOH şi H2SO4 fiind folosite pentru lichefierea sputei în scopul izolării bacilului tuberculos.

1.5. SĂRURILE

Dintre săruri, cele ale metalelor grele au efectul bactericid cel mai puternic. Astfel, ionii de Hg şi Ag sunt activi într-o proporţie de 1/1000000. Acţiunea lor bactericidă se datorează combinării lor cu grupări active ale enzimelor pe care le inactivează. Eficienţa lor depinde, însă, mai degrabă de densitatea culturii bacteriene decât de concentraţia lor, deoarece ei sunt absorbiţi repede şi preferenţial de bacterii, atingând în bacterii concentraţii mari în defavoarea concentraţiei de mediu.

- clorura de mercur (sublimatul) 10/00 se foloseşte în laboratoare ca dezinfectant pentru pipete şi lame;

- merthiolatul, care este un compus organic al mercurului, este folosit drept conservant pentru seruri şi vaccinuri în concentraţie de 1/10.000 şi ca dezinfectant în concentraţie de 1/1.000;

- nitratul de argint în concentraţie de 1% se folosea în profilaxia oftalmiei gonococice la nou-născut înainte de introducerea penicilinei în terapie;

- colargolul, protargolul şi argirolul sunt compuşi de argint care se folosesc sub formă de colire şi unguente în concentraţie de 1-1,5%;

- compuşii organici ai arsenului, bismutului, antimoniului au fost utilizaţi în trecut în tratamentul sifilisului şi a unor infecţii produse de unele protozoare;

- sulfatul de cupru este folosit cu succes ca fungicid, dar nu în medicină, ci în agricultură;

- oxidul de zinc se foloseşte ca antiseptic, astringent şi caustic în dermatologie.

1.6. FORMALDEHIDA ŞI GLUTARALDEHIDAFormaldehida înlocuieşte atomii labili de H din grupările NH2 sau –OH, frecvente

în nucleoproteine şi din grupările –COOH şi –SH ale proteinelor. Este la fel de activă faţă de spori ca şi faţă de formele vegetative, probabil pentru că poate pătrunde uşor în celula bacteriană datorită dimensiunilor reduse ale moleculei şi pentru că reactionează în lipsa apei.

Formaldehida este un gaz, forma obişnuită de prezentare fiind o soluţie de 37% numită formalina. În concentraţie de 0,1% a fost utilizat mult timp în prepararea vaccinurilor prin detoxifierea toxinelor.

Se poate utiliza sub formă gazoasă sau lichidă pentru sterilizarea diferitelor suprafeţe. Formaldehida gazoasă este pusă în libertate dintr-un polimer, paraformaldehida şi este folosită la dezinfecţia încăperilor, a mobilierului şi în general a obiectelor care nu pot fi sterilizate prin căldură. Ea nu deteriorează obiectele supuse dezinfecţiei (îmbrăcăminte, obiecte de matal, lemn, piele etc.), dar are o acţiune iritantă asupra conjunctivei şi căilor respiratorii.

Glutaraldehida 2% în soluţie apoasă este mai activă decât formolul şi mai puţin iritantă. Este mai activă în mediu alcalin fiind bactericidă, sporicidă şi virulicidă. Este indicată în sterilizarea unor instrumente medicale ce nu pot fi supuse sterilizarii prin căldură, ca, de pildă, citoscoape, echipament de anestezie, materiale plastice şi termometre.

1.7. DEZINFECTANŢII GAZOŞISuccesul obţinut în prevenirea toxiinfecţiilor alimentare nu a putut fi nici pe departe

reeditat în infecţiile ce se transmit pe cale aeriană. Pulverizarea fenolului în sălile de operaţie introdusă de Lister a fost rapid abandonată. Pulverizarea propilenglicolului sau a

dietilenglicolului în concentraţii mici, netoxice pentru om, reduc mult numărul de bacterii din aer, dar aceşti produşi sunt foarte sensibili la umiditate pe de o parte, iar pe de altă parte nu distrug bacteriile de pe mobilier, suprafeţe ce constituie de fapt una din sursele bacteriilor din aer.- Oxidul de etilen este un gaz foarte solubil în apă, fiind cel mai potrivit dezinfectant gazos pentru suprafeţe uscate. Este însă destul de costisitor şi are o toxicitate reziduală. Se utilizează la sterilizarea materialelor care nu suportă temperaturi ridicate: obiecte din plastic, echipament chirurgical, cărţi, obiecte din piele care au foat contaminate de pacienţi contagioşi. Fiind explosiv, se utilizează în amestec de 90% cu CO2.

1.8. SĂPUNURILE ŞI DETERGENŢII (AGENŢI TENSIOAC-TIVI)Săpunurile au o acţiune moderat bactericidă datorită acizilor graşi nesaturaţi pe

care îi conţin (acizii oleic, linoleic şi linolenic) mai ales asupra florei Gram pozitive. Flora Gram negativă, mai ales cea din grupa coliformilor, este mai sensibilă la săpunuri ce conţin acizi graşi saturaţi. Nu se cunoaşte exact mecanismul bactericid al săpunurilor, ele fiind folosite mai ales pentru îndepărtarea mecanică a microbilor de pe piele, prin spălare. În săpunuri se pot încorpora diferite antiseptice care intensifică acţiunea antibacteriană a acestora.

Detergenţii sunt substanţe tensioactive sintetice. Din punct de vedere chimic, ei se împart în: detergenţi anionici (ce includ alcooli sulfataţi, alkilaril sulfonaţi etc.), detergenţi cationici (care sunt compuşi cuaternari de amoniu, în care cei 4 atomi de hidrogen sunt înlocuiţi prin radicali organici), detergenţi neionici (care sunt poliesteri şi eteri formaţi din condensarea unor acizi graşi, alcooli şi fenoli) şi, în sfârşit, detergenţi amfoteri (care conţin atât grupări anionice cât şi cationice). Dintre detergenţi, importanţi ca antiseptice şi dezinfectante, sunt cei anionici, cationici şi amfoteri.

1.9. ANTOGONIŞTII METABOLICIReprezintă agenţii chimici care interferă cu o reacţie normală între o enzimă

specifică şi substratul respectiv, în procesul metabolic. Antagonistul acţionează prin combinarea cu o parte a enzimei (cu apoenzima-suportul proteic, cu coenzima-partea activă, sau cu activatorul mineral), împiedicând ataşarea enzimei pe substrat. Combinarea antagonistului cu enzima se face datorită marii afinităţi a acesteia faţă de anumite situsuri (regiuni) din molecula proteinei enzimatice. Exemple: oxidul de carbon sau cianurile se combină cu atomul de fier din enzimele porfirinice, blocând rolul acestora în respiraţia celulară bacteriană.

Antagoniştii metabolici pentru bacterii se împart în:- antagonişti ai proceselor energetice: oxid de carbon, cianuri, dinitrofenol;- antagonişti ai biosintezelor: p-fluorofenilalanina, care înlocuieşte competitiv

fenilalanina din lanţul proteic normal, cu apariţia unei proteine modificate, nefuncţionale.

1.10. COLORANŢIIColoranţii trifenilmetanici, cum sunt cristal-violetul, metil-violetul şi verdele

briliant, sunt substanţe puternic bacteriostatice, slab bactericide, active mai ales pe bacteriile Gram pozitive. Violetul de genţiană se poate folosi ca antiseptic în concentraţie de 0,2%.

Coloranţii tiazinici, cum este albastrul de metilen, se folosesc ca antiseptici externi în concentraţii de 0,2-0,5%. Albastrul de metilen poate fi administrat ca antiseptic intern în infecţiile urinare (urodezinfectante).

Dintre coloranţii acridinici, cel mai utilizat este rivanolul (lactat de metacridina) în concentraţii de 1-2%, la antiseptizarea plăgilor chirurgicale şi traumatice.

1.11. ALŢI DEZINFECTANŢIPeroxidul de hidrogen într-o concentraţie de 3% este folosit ca antiseptic, dar nu

este recomandabil, susceptibilitatea bacteriilor fiind diferită.Permanganatul de potasiu (KMnO4) este un antiseptic uretral sau vaginal în

concentraţie de 1/1.000.Acidul peracetic (CH3-CO-O-OH), agent puternic oxidant, este folosit sub forma de vapori pentru sterilizarea camerelor unde cresc animale “germ-free”, pentru care este însă toxic.

ACŢIUNEA AGENŢILOR BIOLOGICI ASUPRA BACTERIILOR.

BACTERIOFAGUL ŞI FENOMENELE DE BACTERIOFAGIE

In anul 1915, Twort a observat caracterul vitros (sticlos) al unor colonii de stafilococ. După 2 ani (1917), d’Herelle a izolat un principiu litic din filtratele de fecale de la bolnavi cu dezinterie bacilară. Cele două descoperiri se datorau existenţei unor virusuri ale bacteriilor, capabile să lizeze celula bacteriană (bacteriofagi).

Din anul 1920, Jules Bordet şi Mihail Ciucă au descris fenomenul de “lizogenie” (infecţia simbiotică a bacteriei cu bacteriofag, fără liza celulară, însoţită de modificări ale bacteriei purtătoare).

1. MORFOLOGIA ŞI COMPOZIŢIA CHIMICĂ A BACTE-RIOFAGULUI1.1. FAGII ADN

O particulă de bacteriofag cu morfologie tipică, cuprinde: capul şi coada (figura 1).- Capul conţine un miez de acid nucleic şi un înveliş proteic. Miezul de acid nucleic este format din ADN cuprinzând circa 50% din greutatea uscată a bacteriofagului. Învelişul proteic (capsida) dă forma poligonală a capului şi este format din subunităţi identice de proteină. De fapt, învelişul formează în spaţiu o prismă hexagonală.- Coada este partea cu care bacteriofagul se ataşează de suprafaţa celulei bacteriene. Coada variază în ceea ce priveşte complexitatea structurală, de la un bacteriofag la altul (bacteriofagul T2 de Escherichia coli prezintă o coadă cu complexitate foarte mare).

În general, coada are trei părţi: miezul lacunar, teaca contractilă şi placa bazală terminală. Placa bazală terminală are formă hexagonală, purtând ataşate “fibrele cozii”.

Figura 1: Morfologia şi stadiile funcţionale ale unui bacteriofag (după Murray, Drew, Kobayashi, 1990)

Coada bacteriofagului se poate găsi în două stadii funcţionale: stadiul relaxat şi stadiul contractat.

- în stadiul relaxat, teaca contractilă acoperă aproape în întregime miezul lacunar, iar fibrele cozii nu sunt vizibile; - în stadiul contractat, teaca terminală contractilă apare scurtată, miezul lacunar este vizibil pe o mai mare întindere, iar placa terminală prezintă fibrele cozii evidente.

Proteinele care formează capsida capului, miezul lacunar al cozii, teaca contractilă şi fibrele cozii sunt distincte.

În afară de forma tipică de morfologie a bacteriofagilor, pot exista şi alte forme, atipice: bacteriofagi fără coadă (unii bacteriofagi ADN) sau bacteriofagi filamentoşi - cu morfologie variată (bacteriofagi “fd” în formă de baghetă, cu ADN al capului şi proteinele de înveliş legate în reţea, însă insuficient precizată ca structură a subunităţilor componente).

1.2. FAGII ARNDescrişi mai curând, fagii ARN (f2, MS2, R17, OB) prezintă morfologie aparte. Unui

asemenea tip de bacteriofag i se descriu: - un miez de ARN monocatenar (cu greutate moleculară de 4x106 daltoni şi având o structură “autocomplementară” complexă, de tip terţiar);

- capsidă formată din circa 180 unităţi (capsomere). Proteinele capsidale sunt de două categorii şi anume:

de inveliş, cu greutate moleculara de 14.000 daltoni (“proteina A” fagică); de maturare, cu greutate moleculară de 40.000 daltoni (ARN- polimeraza- ARN-

dependentă).Fagii ARN intervin în fenomenele de conjugare cromozomială (fixare de fimbriile

bacteriei donatoare F+), ca şi în lizogenizarea unor bacterii intestinale.

2. TIPURI DE RELAŢIE BACTERIOFAG-BACTERIEBacteriofagul este un virus bacterian, a cărui gazdă este deci o bacterie. Ataşarea

bacteriofagului de suprafaţa celulei bacteriene depinde de existenţa pe această suprafaţă a unor receptori.

Din punct de vedere al ataşării, se disting genetic bacterii lizosensibile (care permit ataşarea şi intrarea bacteriofagului) şi bacterii lizoresistente (care nu permit ataşarea şi intrarea bacteriofagului).

Lizorezistenţa naturală (genetică) trebuie deosebită de rezistenţa unei bacterii la “infecţia” cu bacteriofag, datorită purtării de către bacterie, în intrior, a unui fag temperat (fenomen de lizogenie).

Se cunosc două categorii de relaţii bacteriofag-bacterie şi anume: relaţii de tip litic şi relaţii de tip simbiotic.

2.1. RELAŢII BACTERIOFAG-BACTERIE DE TIP LITICÎn acest tip de relaţie, pătrunderea bacteriofagului în celula bacteriană lizosensibilă

se soldează cu moartea celulei (cu unele rare excepţii), precum şi cu eliberarea din celulă a unor particule de bacteriofag neoformate.

“Infecţia” fagică de tip litic implică mai multe etape şi anume: adsorbţia, penetrarea, replicarea intracelulară, maturarea particulelor fagice neoformate, eliberarea particulelor fagice neoformate.

a. AdsorbţiaDatorită prezenţei receptorilor pe suprafaţa celulei bacteriene lizosensibile,

particulele de fag se adsorb pe această suprafaţă şi anume prin ataşarea cozii (fibrelor cozii) pe receptori. Pe suprafaţa unei celule bacteriene, se pot ataşa până la 100 particule fagice.

Ataşarea pe receptori se bazează pe proprietatea de specificitate: receptorii unei celule bacteriene sunt înalt specifici pentru anumiţi bacteriofagi. Specificitatea de receptori fagici se datoreşte naturii chimice a peretelui celular bacterian (dispoziţia reţelei de mucopeptide). De pildă, pentru bacteriofagii de Escherichia coli T3, T4, T7, receptorii se găsesc în stratul lipopolizaharidic din peretele celular, în vreme ce pentru bacteriofagii T2 şi T6, în stratul de lipoproteine din perete.

Există o “competiţie” pe receptori între doi fagi (celula Escherichia coli cu fagB/2 ataşat, nu permite ataşarea suplimentară a fagului T2).

b. PenetrareaOdată ataşat, bacteriofagul “injectează” acidul nucleic al capului în celula

bacteriană, trecând din stadiul relaxat în stadiul contractat al cozii. Faptul că acidul

nucleic al capului intră în celulă, iar proteina de înveliş rămâne în exteriorul celulei, a fost demonstrat prin marcarea acidului nucleic fagic (ADN ) cu izotopul Td3H şi, respectiv, a proteinei de înveliş (capsidei) cu izotopul S35.

De la această regulă, fac excepţie bacteriofagii filamentoşi ”fd”, care pătrund în întregime în celula bacteriană (ADN + proteina).

c. Replicarea intracelularăReplicarea bacteriofagilor ADN

După câteva minute de la pătrunderea acidului nucleic fagic (perioada de “eclipsă”), ADN-ul fagic începe să “comande” prin genele sale, în celula bacteriană gazdă, sinteza unor proteine “precoce” (“early proteins”), din care fac parte enzimele necesare sintezei crescute de ADN de tip fagic. Dintre aceste enzime, cea mai importantă este o nouă ADN-polimerază (fag- dependentă), dar şi altele, ca: nucleosidtrifosfatkinaza, timidil-sintetaza.

Concomitent are loc “paralizarea” ADN celular (oprirea sintezelor celulare codificate de ADN propriu).

În continuare, “copiile” de ADN fagic (rezultate din acţiunea enzimelor “precoce”) determină, folosind aparatul de sinteză al celulei (ribozomi), formarea de neoproteine fagice “tardive” (“late proteins”), care se asamblează în jurul moleculelor de ADN fagic, dând naştere capsidei capului şi celorlalte componente proteice ale particulelor fagice neoformate.

Replicarea bacteriofagilor ARNCând ARN fagic intră în celula bacteriană, acţionează el însuşi ca un mesager la

nivelul ribozomilor, unde se sintetizează mai întâi o ARN-sintetază, care asigură apoi formarea de “copii” de ARN fagic, care, la rândul lor, “codifică” în ribozomi sinteza de proteine pentru formarea capsidei particulelor neoformate. O fază intermediară în replicarea bacteriofagilor ARN este formarea unui ARN dublu catenar, rezultat din lanţul de ARN al particulelor fagice pătrunse în celulă (lanţ ”plus”), legat complementar cu un lanţ, rezultat din acţiunea ARN-sintetazei de tip fagic (lanţ “minus”).

d. Maturarea particulelor fagice neoformatePrin asamblarea dintre moleculele de acid nucleic fagic nou formate în celulele

gazdă şi proteinele fagice “tardive”, de asemenea nou sintetizate, după modelul “codificat” de acidul nucleic fagic, rezultă noile particule de bacteriofag.

e. Eliberarea particulelor fagice neoformateLa un moment dat, particulele fagice care “umplu” spaţiul celular bacterian, produc

“explozia” peretelui celular şi membranei citoplasmatice, cu liza celulară concomitentă şi cu eliberarea în mediul exterior a particulelor fagice neoformate, capabile ca, în prezenţa altor celule bacteriene lizosensibile să reia ciclul de tip litic.

Şi de această dată, excepţia o fac bacteriofagii filamentoşi “fd”, care trec prin membrana citoplasmatică şi perete, fără a determina liza consecutivă a celulei.

2.2. RELAŢII BACTERIOFAG-BACTERIE DE TIP SIMBIOTIC

Fenomenul intrării unui bacteriofag într-o celulă bacteriană, fără a determina liza acesteia şi integrarea materialului genetic fagic în cromozomul bacterian, poartă numele de “lizogenie”.

În acest tip de relaţie bacteriofag-bacterie, după ataşarea şi penetrarea bacteriofagului în celula gazdă, nu se produce replicarea independentă a acidului nucleic fagic, ci acesta se integrează în ADN celular (cromozomul bacterian), replicându-se odată cu replicarea ADN celular (diviziunea celulei). Bacteriofagii capabili de a stabili o relaţie de tip simbiotic cu bacteria purtatoare sunt denumiţi “profagi” sau “bacteriofagi temperaţi”.

Etapele “infecţiei” fagice de tip simbiotic sunt: adsorbţia, penetrarea acidului nucleic fagic, “circularizarea” ADN fagic, cuplarea ADN fagic circular cu ADN bacterian.

Bacteriile care conţin în interior fagi temperaţi se numesc “bacterii lizogene”. Ele sunt rezistente (“imune”) la “infecţia” cu un alt bacteriofag omolog. Acest fenomen se datoreşte eliberării în citoplasma celulei lizogene a unei substanţe “represor”, care inhibă multiplicarea unui fag litic pătruns în celulă.

Substanţa “represor” acţionează şi asupra profagului existent în celula lizogenă, împiedicând desprinderea acestuia din inelul comun ADN fagic-ADN bacterian şi, respectiv, iniţierea sintezelor fagice pentru declanşarea “infecţiei” de tip litic.

Inducţia reprezintă procesul prin care un fag temperat (profag) aflat într-o celulă bacteriană lizogenă, trece în forma sa litică (“virulentă”), adică îşi desprinde acidul nucleic din cromozomul bacterian şi iniţiază sinteze de tip fagic la nivelul aparatului ribozomul celular, cu determinarea lizei celulei şi eliberării de particule fagice “virulente” în mediu, capabile să reia un ciclu de tip litic în alte celule lizosensibile. Fenomenul de inducţie se datoreşte inactivării sau distrugerii substanţei “represor” (figura 2).

Agenţii capabili să producă fenomenul de inducţie (agenţi inductori) pot fi variaţi: temperatura de 440C, iradierea cu ultraviolete, agitaţia mecanică, etc. Agenţii inductori ar acţiona, după unii autori, prin determinarea în celulă a sintezei unei substanţe “inductor”, care inactivează secundar substanţa “represor”. Natura acestei substanţe “inductor” nu este încă cunoscută. Pe de altă parte, apar o serie de proprietăţi noi ale celulei. De exemplu: tulpinile de Corynebacterium diphteriae, prin lizogenizare (purtarea unui fag temperat) devin toxigene (producătoare de toxină difterică). De asemenea, unii streptococi beta hemolitici sunt capabili de a sintetiza toxina eritrogenă numai în cazul când poartă în interior fagi temperaţi specifici.

Figura 2: Lizogenie-Inducţie (după Murray, Drew, Kobayashi, 1990)

Acest fenomen de schimbare a unor proprietăţi ale celulei bacteriene, prin prezenţa profagului, poartă numele de “conversie”. Intrarea fagului temperat în celulă determină exprimarea unor gene celulare preexistente, represate până atunci. “Conversia“ lizogenă diferă de “transducţie”, la care genele care caracterizează noile proprietăţi sunt cuprinse exclusiv în genomul fagului infectant.

3. IMPORTANŢA FENOMENULUI DE BACTERIOFAGIE ÎN MEDICINĂ

Genetica bacteriofagilor. Bacteriofagii prezintă două însuşiri genetice importante şi anume: stabilitatea tipului şi rata joasă de variaţie genetică. Fenomenele genetice legate de bacteriofag sunt: mutaţia fagică, transducţia, recombinarea fagică, restricţia şi modificarea.

Mutaţia fagică. Toate proprietăţile unui bacteriofag sunt controlate de genele din acidul nucleic fagic. Mecanismul de mutaţie genetică se aplică şi la bacteriofag, ca şi la bacterii, celulele animale sau virusuri animale. Deci, cu prilejul replicării fagului în celula bacteriană, pot apărea indivizi prezentând o “greşeală” în molecula de ADN, care conferă particulei neoformate proprietăţi noi.

Transducţia. Este fenomenul introducerii în genomul (cromozomul) bacterian a unor gene cu ajutorul materialului genetic fagic, cu apariţia consecutivă de proprietăţi noi ale celulei bacteriene, codificate de genele fagice introduse în ADN celular.

Recombinarea fagică. Când pe suprafaţa aceleiaşi celule bacteriene, se adsorb simultan doi sau mai mulţi bacteriofagi ADN înrudiţi, dar uşor diferiţi genetic, ambii pot “infecta” celula şi se pot reproduce. În acest caz, unii din indivizii fagici neoformaţi sunt recombinaţi, adică posedă proprietăţi ale ambelor categorii de particule fagice infectante. De exemplu: dacă o celulă de Escherichia coli este supusă contactului cu doi fagi T 2, unul care produce plaje cu dimensiuni mici, precoce, iar altul care produce plaje cu

dimensiuni mari, tardiv, se obţin particule recombinate, care dau plaje cu dimensiuni mari, precoce.

Restricţia şi modificarea. S-a observat că o anumită categorie de bacteriofagi se multiplică la o rată înaltă în anumite tulpini de Escherichia coli şi la o rată joasă în alte tulpini aparţinând aceleiaşi specii bacteriene. Aceasta se explică prin faptul că, în celula bacteriană ar exista două enzime complementare, una modificatoare (care acţionează asupra ADN fagic, făcându-l apt de a funcţiona ca “matrice”), alta restrictivă (care degradează orice formă de ADN din celulă care nu a fost “modificat” de enzima modificatoare). În cazul “infecţiei” cu bacteriofag a celulei bacteriene, o parte din ADN pătruns din exterior nu este modificat, deci este supus degradării, iar o altă parte, modificat fiind, nu mai este degradat şi iniţiază sintezele de tip fagic proprii ciclului litic. Fenomenul de restricţie se întâlneşte mai ales la tulpini bacteriene unde activitatea celor două enzime este astfel coordonată, încât un număr relativ mic de molecule de ADN fagic funcţionează ca “matrice” pentru determinarea apariţiei particulelor fagice neoformate.

BACTERIOCINELEReprezintă substanţe de natură proteică, elaborate de anumite specii bacteriene,

care au efect bactericid (litic) asupra unor tulpini de bacterii de aceeaşi specie sau din specii înrudite cu a tulpinii secretoare. Acţiunea bactericidă depinde de existenţa pe suprafaţa bacteriei a unor receptori specifici. Din acest punct de vedere, se disting: bacterii bacteriocino-sensibile (cu receptori) şi bacterii bacteriocino-rezistente (fără receptori). Efectul bacteriocinelor este letal. De asemenea, trebuie reţinut că elaborarea de bacteriocine de către un individ bacterian echivalează cu liza celulei bacteriene secretoare însăşi.

Bacteriocinele prezintă o greutate moleculară relativ mare (50.000-80.000 daltoni) şi un spectru antibacterian mult mai larg decât al antibioticelor. Acţiunea litică a bacteriocinelor este puternică, fiind suficientă o singură moleculă pentru a produce liza unei celule. Ca şi în cazul bacteriofagilor, celulele bacteriene în funcţie de specie şi tulpină, au o susceptibilitate diferită faţă de bacteriocine, datorită prezenţei de receptori pe suprafaţa peretelui celular bacterian.

Mecanismele intime ale activităţii intracelulare a bacteriocinelor comportă următoarele secvenţe: depolimerizarea ADN nuclear, inhibiţia sintezei de proteine bacteriene (prin impiedicarea citirii de către ribozom a mesajului înscris pe ARN mesager); creşterea permeabilităţii membranei citoplasmatice (cu compromiterea barierei osmotice şi selective a celulei).

Din punct de vedere practic, spectrul de activitate al unei bacteriocine, elaborată de anumite specii sau tulpini bacteriene, poate fi utilizat ca indicator, el fiind caracteristic.

Metoda de testare a spectrului bacteriocinelor se numeşte bacteriocinotipie (caracterizarea unei tulpini bacteriene circulante în populaţia umană, pe baza spectrului litic al bacteriocinelor elaborate). Bacteriocinotipia are, deci, importanţă epidemiologică, alături de lizotipie, pentru caracterizarea unor tulpini de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (implicate în etiologia unor infecţii interioare).

NOŢIUNI DE CHIMIOTERAPIE ANTIBACTERIANĂ

1. INTRODUCEREPărintele chimioterapiei antiinfecţioase este Paul Ehrlich, care, după numeroase

sinteze şi cercetări asupra compuşilor arsenicali, obţine, în anul 1909, salvarsanul

(compusul 606) activ asupra Treponemei pallidum şi altor spirochete.

Ehrlich a fost primul care a formulat principiile chimioterapiei:

Chimioterapicul trebuie să prezinte o “toxicitate selectivă”, adică să aibă efect inhibant net asupra bacteriilor infectante, dar să fie relativ nenociv pentru organismul uman bolnav. Aceasta constituie diferenţa fundamentală între agenţii chimioterapici şi substanţele dezinfectante uzuale, care sunt foarte active faţă de bacterii, dar greu de tolerat de către organismul uman, în concentraţiile lor eficiente (bactericide sau bacteriostatice). Există o înrudire particulară de ordin chimic între germen şi chimioterapic. Aceasta duce la posibilitatea apariţiei dependenţei microorganismului faţă de chimioterapic. Din cea de-a doua caracteristică a chimioterapiei, rezultă necesitatea folosirii combinate (asociate) a mai multor chimioterapice.

În anul 1929, Fleming descoperă penicilina, secretată de mucegaiul Penicillinum

notatum, dar introducerea ei în terapie s-a produs abia după un deceniu, fiind meritul a

doi chimişti de la Oxford, Florey şi Chain.

Studiind acţiunea bactericidă a unor coloranţi, Domagk (1934) descoperă că prontozilul roşu administrat la şoareci, îi protejează de efectul letal al infecţiei experimentale cu streptococi beta hemolitici, în ciuda faptului că in vitro este lipsit de activitate bactericidă.

Trefouel şi Niti (1935) arată că, în organismul şoarecilor, prontozilul se descompune într-un compus cu acţiune bacteriostatică, numit sulfamidă.

2. DEFINIŢIE

Chimioterapicele sunt substanţe capabile să exercite, în doze mici, un efect inhibitor asupra bacteriilor. Acest efect poate fi: letal (bactericid) sau numai de împiedicare a multiplicării microorganismului (bacteriostatic).

În trecut, sub denumirea de chimioterapice, erau desemnate substanţele antimicrobiene obţinute prin sinteză chimică (sulfamide, sulfone, nitrofurani, etc.), iar sub cea de antibiotice, substanţele de origine biologică, secretate de bacterii şi mucegaiuri. Cu timpul însă, unele antibiotice s-au obţinut mai uşor pe cale sintetică decât pe cale biologică (de exemplu: cloramfenicolul), motiv pentru care, termenul de chimioterapic antiinfecţios este utilizat astăzi pentru orice substanţă folosită în tratamentul infecţiilor, indiferent de origine.

Introducerea chimioterapiei antiinfecţioase a dus la o creştere spectaculoasă a ratei de supravieţuire după infecţii. Astfel, în decurs de 50 de ani, a apărut, sub presiune selectivă, fenomenul de rezistenţă. Ca urmare, producerea de chimioterapice

antiinfecţioase, a devenit o industrie care, fiind în permanenţă concurenţă cu apariţia tulpinilor rezistente, caută noi produşi faţă de care microorganismele să fie sensibile.

Introducerea unui nou chimioterapic în practica medicală este evaluată la 200

milioane de dolari şi parcurge mai multe etape care durează aproximativ 10 ani.

3. CLASIFICAREClasificarea chimioterapicelor poate fi efectuată după mai multe criterii şi anume:

structură chimică, origine, scopul folosirii, spectru de activitate, mecanism de acţiune,

după felul în care îsi exercită efectul antibacterian, etc.

3.1. DUPĂ STRUCTURA CHIMICĂÎn tabelul 1, sunt cuprinse categoriile de chimioterapice antibacteriene, cu

reprezentanţii lor mai însemnaţi, ţinând seama de criteriul compoziţiei chimice.

3.2. DUPĂ ORIGINE

Se disting:- Antibiotice produse de microorganisme (Penicilina, Polimixina, Bacitracina).- Produşi de semisinteză, preparaţi în laborator (sinteză) pe baza unui nucleu sintetizat de către un microorganism (Meticilina, din familia penicilinelor).- Produşi de sinteză chimică integrală - chimioterapice sintetice (sulfamidele, Acidul nalidixic, penicilinele sintetice, etc.).

3.3. DUPĂ SCOPUL FOLOSIRII

Din acest punct de vedere, se cunosc chimioterapice: antibacteriene, antifungice, antiparazitare, antivirale.

În cadrul capitolului de faţă, ne vom referi în speţă la chimioterapicele

antibacteriene.

Categorie chimioterapice

Preparate comerciale

Betalactamine Peniciline: Penicilina G (injectabilă) Penicilina depozit-Moldamin (injectabilă) Penicilina V (administrare orală)AmpicilinaOxacilina, CloxacilinaCarbenicilinaCefalosporine: Cefalotin, Cefazolin, Cefamicina

Aminoglicoside Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina, NeomicinaSpectinomicina

Polimixine Polimixina B, Polimixina E (Colistin)Alte antibiotice Cloramfenicol

TetraciclineMacrolide: Eritromicina, Oleandomicina, SpiramicinaLincomicinaClindamicinaAcid fusidicNovobiocinVancomicinaRifampicina (Rifamicina)

Chimioterapice antibacteriene considerate “nonantibiotice”

Sulfamide, Trimetropin (Biseptol)Acid nalidixic (Negram)Nitrofurane (Nitrofurandoid)TiosemicarbazonaIsoniazidaAcidul paraaminosalicilic (PAS)

Tabel 1: Clasificarea antibioticelor după structura chimică

3.4. DUPĂ SPECTRUL DE ACTIVITATE După acest criteriu chimioterapicele pot fi: cu spectru larg şi cu spectru îngust

(sau relativ îngust).

a. Chimioterapicele cu spectru larg (Cloramfenicolul, tetraciclinele, Ampicilina, sulfamidele, cefalosporinele).

Ca efecte adverse, pot determina:

Alergii-anafilaxie, rash cutanat, nefrite, granulocitopenii, anemii hemolitice; Toxicitate: tromboflebite după administrarea intravenoasă, hipoprotrombinemie; Suprainfecţii: cefalosporinele din a doua şi a treia generaţie. Acestea au un spectru de acţiune mai scăzut asupra bacteriilor Gram pozitive (stafilococi, enterococi), fiind astfel posibile suprainfecţii cu aceste microorganisme şi cu fungi.

b. Chimioterapicele cu spectru îngust (sau relativ îngust):- Acţiune predominantă asupra bacteriilor Gram pozitive (majoritatea penicilinelor, Eritromicina, Streptomicina, Clindamicina).

- Acţiune predominantă asupra unor bacterii Gram negative (Cicloserina, Kanamicina, peniciline, sulfamide, Gentamicina, cefalosporine)- Acţiune predominantă asupra bacilului tuberculos: Streptomicina, Hidrazida acidului izonicotinic (HIN), Acidul paraaminosalicilic (PAS).

- Acţiune predominantă asupra spirochetelor: Penicilina, Salicilatul de bismut.

3.5. DUPĂ FELUL ÎN CARE ÎŞI EXERCITĂ EFECTUL ANTI- BACTERIAN

Chimioterapice bacteriostatice: împiedică multiplicarea germenilor bacterieni (Cloramfenicol, sulfamide);Chimioterapice bactericide: au efect letal asupra celulei bacteriene, fie în faza de creştere logaritmică (Penicilina), fie în faza de lag (Streptomicina).

3.6. DUPĂ MECANISMUL DE ACŢIUNE- Agenţi care acţionează asupra structurilor de suprafaţă ale celulei bacteriene (perete celular, membrana citoplasmatică);

- Agenţi care interferă cu sinteza proteinelor celulei bacteriene;- Agenţi care interferă cu sinteza acizilor nucleici în celula bacteriană.

4. METODE DE TESTARE A SENSIBILITĂŢII BACTERIILOR FAŢĂ DE

CHIMIOTERAPICE

În scopul aprecierii sensibilităţii sau rezistenţei bacteriilor la chimioterapice,

se folosesc metode in vitro şi in vivo.

7.1. METODE IN VITRO (ANTIBIOGRAMA)

Există, în principiu, două posibilităţi de testare a activităţii antibacteriene a

chimioterapicelor: antibiograma în diluţii şi antibiograma difuzimetrică.

Antibiograma în diluţii. Prin antibiograma în mediu lichid, în diluţii crescânde

de antibiotic, se poate stabili precis concentraţia minimă inhibitorie (CMI) şi

concentraţia minimă bactericidă (CMB) a antibioticului faţă de o anumită specie

bacteriană. Se foloseşte în cercetare, deoarece este pretenţioasă din punct de vedere

tehnic, presupune un consum mare de materiale şi depăşeşte în general necesităţile

clinice.

Antibiograma difuzimetrică. În examenele bacteriologice de rutină se utilizează

antibiograma difuzimetrică, în mediu solid, după tehnica Kirby-Bauer. Ea constă în

însămânţarea tulpinii de cercetat pe suprafaţa unui mediu solid şi aplicarea unor

microcomprimate de antibiotice pe suprafaţa mediului. După o termostatare de 16 ore

se apreciază sensibilitatea germenului în funcţie de diametrul zonei de inhibiţie care

apare în jurul microcomprimatului de antibiotic. Fiecare firmă producătoare de

microcomprimate livrează, împreună cu acestea, o listă din care rezultă

corespondenţa diametrului zonei de inhibiţie măsurat în mm şi sensibilitatea la

fiecare microcomprimat.

Recent s-a introdus o altă variantă de antibiogramă pe mediu solid, testul E,

care permite stabilirea precisă a CMI. În loc de microcomprimate se aplică pe mediul

de cultură însămânţat fâşii de hârtie de filtru împregnate cu antibiotic în

concentraţie crescândă. Astfel, la un capăt al fâşiei concentraţia este minimă, iar la

celălalt capăt, maximă. După diametrul zonei de inhibiţie corespunzătoare fiecărei

concentraţii, se va putea calcula CMI.

Cunoscând CMI pentru antibioticele la care un germene este sensibil, nivelul

seric maxim care se poate realiza şi capacitatea de difuziune a antibioticului în

focarul infecţios, se va putea alege varianta optimă de tratament.

7.2. METODE IN VIVO

Se bazează pe titrarea activităţii inhibitorii antimicrobiene a unui chimioterapic

în umorile bolnavului căruia i se aplică tratamentul cu acel chimioterapic. Testarea

se face faţă de tulpini standard de bacterii din specia celei incriminate în etiologia

cazului, sau faţă de tulpini standard cunoscute a fi foarte sensibile la acel

chimioterapic (exemplu: tulpina de stafilococ şi tulpina Marbury de Bacillus

subtilis, etc). În paralel, se introduce o scară etalon de chimioterapic (diluţii

succesive de chimioterapic, pornind de la o concentraţie bine determinată), în

vederea comparării cu seria de diluţii test (ser sanghin sau alte umori, în diluţii).

Testarea sensibilităţii la chimioterapice prin antibiogramă se va face la tulpini

izolate, înainte de introducerea în terapia cazului a antibioticelor sau altor

chimioterapice.

PROCESUL INFECŢIOS

PROCESUL INFECŢIOS este definit ca un ansamblu de fenomene fiziopatologice şi clinice, apărute în urma conflictului dintre microorganism (dotat cu multiple şi variate mijloace de agresiune), şi organism (înarmat cu posibilităţi complexe de apărare).

INFECŢIA se poate defini ca totalitatea modificărilor biologice care se declanşează în organismul uman la pătrunderea agentului infecţios, modificări care sunt la baza alterării homeostaziei organismului.

Un caracter important al infecţiei îl constituie specificitatea etiologică (un anumit agent infecţios produce o anumită boală infecţioasă).

Specificitatea etiologică a fost enunţată prin postulatele lui Robert Koch. Astfel, pentru a incrimina un agent microbian drept agent etiologic al unei infecţii, trebuie îndeplinite următoarele condiţii:- izolarea constantă a germenului din leziunea specifică;- obţinerea lui în cultură pură şi întreţinerea lui prin treceri succesive pe medii de cultură;- reproducerea experimentală a bolii, prin inocularea culturii de germen la animalul de laborator;- izolarea aceluiaşi tip de germen din leziunile animalului de laborator.

CARACTERELE GENERALE ALE INFECŢIEI

1. PATOGENIE În orice infecţie au loc următoarele evenimente:- contaminarea (întâlnirea macroorganismului cu agentul infecţios);

- pătrunderea microorganismului;- multiplicarea germenilor în organismul gazdă prin eludarea rezistenţei antiinfecţioase;- apariţia injuriilor morfologice şi funcţionale, datorate atât acţiunii directe a agentului infecţios, cât şi reacţiilor de apărare ale organismului;- deznodământul infecţiei: vindecarea (cu sau fără sechele); exitusul; coexistenţa pe timp îndelungat a celor doi parteneri ai infecţiei (agentul infecţios şi organismul).

1.1. CONTAMINAREAReprezintă întâlnirea organismului cu microbul patogen şi are loc prin depunerea

acestuia pe învelişuri (tegumente şi mucoase care căptuşesc cavităţile natural deschise), sau pătrunderea prin leziuni (soluţii de continuitate între mediul intern al organismului şi mediul extern).

Prima întâlnire a organismului cu microbii se realizează la naştere, când nou-născutul vine în contact cu microorganismele prezente în canalul vaginal şi pe pielea mamei. Până la naştere el a fost protejat de membranele fetale şi placentă, placentă ce permite pătrunderea unui număr foarte redus de microorganisme din circulaţia mamei, cum ar fi, de pildă, unele virusuri (rujeolos, rubeolic, HIV, citomegalic), bacterii (Treponema pallidum), unii paraziţi (Toxoplasma gondii).

După naştere nou-născutul se poate apăra de microorganismele cu care vine în contact datorită anticorpilor pe care îi primeşte de la mamă, pe cale sanguină, la care se adaugă cei din colostrul şi laptele matern. Aceşti anticorpi îi asigură o protecţie relativă faţă de infecţie, până când va începe să-şi dezvolte propriile mecanisme de apărare antiinfecţioasă.

În timpul vieţii extrauterine o parte din microorganismele cu care organismul vine în contact va dispărea, o parte va coloniza tegumentele şi mucoasele şi doar o mică parte vor produce infecţii propriu-zise.

Contaminarea poate fi exogenă şi endogenă.

CONTAMINAREA EXOGENĂ se produce prin contactul organismului cu agentul infecţios din mediul înconjurător. Căile de contaminare pot fi: hidrică, alimentară, respiratorie, contact sexual, muşcături de animal, înţepături de insecte, prin plagă murdărită cu pământ, contaminări iatrogene prin instrumente medicale (seringă, catetere, endoscoape) etc.

CONTAMINAREA ENDOGENA înseamnă contaminarea cu germeni de pe suprafaţa tegumentelor şi mucoaselor. Aceste microorganisme produc infecţii dacă traversează barierele anatomice şi pătrund în ţesuturi (exemplu: E. Coli ce face parte din flora normală a intestinului, pătruns la nivelul căilor urinare, va determina infecţie la acest nivel).

De remarcat, este faptul că nu orice contaminare este urmată de infecţie. Apariţia sau nu a infecţiei este condiţionată de gradul de patogenitate şi numărul bacteriilor contaminante, de starea de rezistenţă a organismului, la rândul ei influenţată de factorii de mediu extern (umezeala excesivă, extremele de temperatură pot favoriza apariţia unor infecţii). Pe de altă parte, agenţii infecţioşi din flora normală a

organismului, care nu produc infecţii la individul sănătos, le vor produce la persoanele cu rezistenţa generală a organismului scăzută (subnutriţie, carenţa de vitamine, oboseală, sarcină), la pacienţii cu anumite boli endocrine (diabet, hipotiroidie, insuficienţă suprarenală etc.), în cursul tratamentelor imunosupresive sau la pacienţii cu deficienţe imune genetice sau dobândite etc.

1.2. PĂTRUNDEREA GERMENILOR ÎN ORGANISM (POARTA DE INTRARE)

Poarta de intrare este locul de colonizare (înmulţire) primară şi pătrundere a microbului în organism. Această poartă poate fi o mucoasă sau tegumentul, intacte sau lezate. Unele specii au poartă de intrare unică şi foarte specifică, altele au porţi de intrare multiple. Aceste diferenţe sunt condiţionate: de sursa şi calea de contaminare, de condiţiile de înmulţire oferite de fiecare mucoasă sau tegument (pH, temperatură, grad de umiditate), ca şi de existenţa unor receptori celulari specifici pe care microbii se fixează în mod selectiv.

Exemple de bacterii cu poartă de intrare unică: bacilul tific, vibrionul holeric, produc infecţia numai dacă ajung în organism pe cale digestivă; speciile Shigella infectează numai prin mucoasa colonului; gonococul şi Treponema pallidum, pentru a produce bolile venerice, pătrund prin mucoasa genitală şi în mod excepţional pe alte căi. Exemple de bacterii care pot pătrunde în organism pe mai multe căi, determinând infecţii cu diferite localizări: Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis.

În funcţie de specie, tulpină şi variantă genetică a bacteriei infectante, microorganismele pătrund în organismul gazdă pe diferite căi:- calea respiratorie: streptococii -hemolitici, stafilococi patogeni, pneumococi, meningococi, Corynebacterium diphteriae, Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae, Pasteurella pestis.- calea digestivă: Salmonella, Shigella, vibrionul holeric, Escherichia coli, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, stafilococi, streptococi.- calea genitală: gonococi, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum.- calea cutanată (soluţii de continuitate de la nivelul pielii): streptococi -hemolitici, stafilococi patogeni, Corynebacterium diphteriae, Bacillus anthracis.- căi urinare: Escherichia coli, Proteus, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, streptococi de grup D (enterococi).

Unele microorganisme pot trece direct prin pielea intactă, datorită unor mişcări de înşurubare, cum este cazul bacteriilor spiralate ale genului Leptospira. Altele pot traversa epiteliul mucoasei respiratorii, digestive, a tractului genito-urinar, conjunctiva. Microorganismele care reuşesc să pătrundă pe aceste căi dispun de mecanisme speciale de aderenţă, ce depăşesc mecanismele rezistenţei naturale (lacrimi, mucus, mişcările cililor vibratili).

Alţi agenţi infecţioşi pătrund direct în sânge sau ţesuturile profunde prin leziuni traumatice, muşcătura unor animale (virusul rabic), înţepătura unor insecte (Yersinia pestis, Plasmodium falciparum) sau acte medicale (injecţii, transfuzii) efectuate fără respectarea normelor de asepsie (HIV, virusul hepatitei B, C, rickettsii, etc.)

1.3. MULTIPLICAREA GERMENILOR

Numărul de microorganisme care pătrund în organism (mărimea inoculului) este prea mic, în mod obişnuit, pentru a iniţia infecţia. Agenţii infecţioşi trebuie să învingă mecanismele de apărare antiinfecţioasă ale gazdei şi să se înmulţească la un nivel corespunzător pentru a produce simptome. Indiferent de gradul ei de patogenitate, este necesară adaptarea bacteriei la noile condiţii oferite la poarta de intrare: când acestea sunt favorabile, bacteria se înmulţeşte şi secretă factori enzimatici de virulenţă şi uneori toxine care vor determina leziunea iniţială. Cu cât bacteria este mai patogenă, cu atât este necesar un număr mai redus pentru a declanşa infecţia (pesta, bruceloza, leptospiroza); în schimb, este necesar un număr mare de bacterii pentru a produce, de exemplu, febra tifoidă, lepra.

Multiplicarea microorganismelor se poate face intracelular sau extracelular. Microorganismele cu habitat extracelular sunt supuse acţiunii complementului (C), lizozimului, anticorpilor, fagocitozei etc., pe când cele cu habitat intracelular sunt protejate de aceşti factori. Eliminarea din organism a microorganismelor cu habitat intracelular se face prin distrugerea celulelor în care se află, ceea ce duce la producerea de leziuni tisulare.

1.4. LOCALIZAREA INFECŢIEIUnele bacterii rămân localizate la poarta de intrare şi se multiplică numai într-o

zonă relativ limitată, fără a invada organismul - bacterii neinvadante. Exemplu: bacteriile toxigene (speciile genului Clostridium, Corynebacterium diphteriae, Salmonalla, Shigella, vibrionul holeric). După multiplicarea la poarta de intrare a microorganismului, este secretată toxina care este vehiculată de sânge în organism, toxină care este responsabilă de apariţia bolii. În cazul bacilului botulinic, acesta îşi secretă toxina numai în condiţii de anaerobioză, la 30C (în conservele alimentare), fără să pătrundă în organism, boala fiind practic o intoxicaţie ce se produce prin consumul alimentelor conservate.

În cazul altor bacterii, infecţia se poate propaga de la poarta de intrare prin contiguitate (din aproape în aproape) şi prin diseminare la distanţă pe cale sanguină sau/şi limfatică, cu fixarea germenilor în anumite zone de elecţie. În acest caz rezultă infecţia sistemică sau generalizată. Bacteriile se numesc bacterii invadante (Salmonella typhi, E. coli patogen, stafilococii patogeni).

Infecţiile bacteriene cu caracter invadant prezintă 3 faze distincte:- faza de invadare a ţesuturilor învecinate porţii de intrare, însoţită sau nu, de reacţia ganglionilor limfatici loco-regionali;- faza de generalizare a infecţiei, pe cale sanguină şi/sau limfatică, cu apariţia bacteriemiei (prezenţa în sânge a bacteriei infectante). Când prezenţa bacteriilor în sânge se soldează cu multiplicări secundare, cu focare de diseminare în ţesuturi, apare septicemia;- faza de cantonare în zonele de elecţie. Exemplu: meningococii (Neisseria meningitidis) pătrund pe cale respiratorie, apoi trec în circulaţie, pentru ca, în final, să se fixeze la nivelul meningelui; pneumococii (Diplococcus pneumoniae) pătrund pe cale respiratorie şi se fixează la nivelul arborelui bronho-alveolar sau la nivelul meningelui; speciile familiei Enterobacteriaceae pătrund pe cale digestivă şi rămân cantonate în intestin, chiar dacă în unele cazuri prezintă şi descărcări bacteriemice.

La cele două categorii de bacterii (neinvadante şi invadante) se adaugă a treia categorie, bacteriile sensibilizante, care prin infecţie sensibilizează organismul. Acesta va răspunde prin reacţii imunopatologice ce îi sunt nocive şi generează leziuni. Exemplu: bacilul tuberculos.

În plus, există posibilitatea ca aceeaşi bacterie să fie în acelaşi timp invazivă, toxigenă şi sensibilizantă. Un astfel de exemplu este Streptococcus pyogenes, dotat cu enzime invazive, cu capacitatea de a secreta eritrotoxina (responsabilă de apariţia scarlatinei) şi de a produce prin mecanism alergic cardita reumatismală, reumatismul poliarticular acut, glomerulonefrita acută difuză.

2. ASPECTELE CLINICE ŞI ETAPELE EVOLUTIVE ALE INFECŢIEI Manifestările clinice ale infecţiei sunt multiple, fiind influenţate de o serie de

variabile, cum sunt: factorii genetici ai gazdei şi ai agenţilor infecţioşi, doza infectantă, calea de pătrundere, factorii de patogenitate ai microbilor, rezistenţa antiinfecţioasă a gazdei, factorii de mediu etc.

Din punct de vedere al manifestărilor clinice, infecţiile bacteriene pot fi: inaparente, latente şi aparente.

- Infecţii inaparente, evoluează asimptomatic (fără semne clinice evidente deşi germenul este prezent în organism), dar prezenţa ei se confirmă prin reacţii serologice sau intradermoreacţii (IDR) pozitive, ceea ce atestă contactul organismului cu acel antigen (bacterie, virus, fung) şi deci instalarea imunităţii. Apărute în mod spontan, infecţiile inaparente realizează “imunizările oculte” în masa populaţiei. Uneori însă, astfel de persoane reprezintă o sursă de infecţie pentru colectivitate ("purtători sănătoşi”).

- Infecţiile latente nu se manifestă clinic, deşi agenţii infecţioşi (bacterii, virusuri sau protozoare), pot persista vii în organism timp îndelungat. Infecţia se poate însă activa şi deveni clinic evidentă datorită unor factori favorizanţi. De exemplu: herpesul este activat de o iritaţie mecanică locală, febră, căldură excesivă, stress, ultraviolete etc. Bruceloza, sifilisul, tuberculoza pot prezenta perioade de latenţă cu recidive posibile, manifestate clinic. Unele infecţii latente virale pot produce transformări celulare până la tumori (virusuri oncogene, v. Herpes tip 2, v. Citomegalic).

- Infecţii aparente clinic care pot fi, după sediul unde evoluează infecţia, localizate sau generalizate.

Infecţiile localizate sunt acele infecţii în care bacteria se înmulţeşte la poarta de intrare şi determină leziuni minime: abcese, furuncule, flegmoane, angine, etc. Depăşiind poarta de intrare, unele bacterii produc infecţia numai dacă ajung în organul de elecţie: bacilul tific şi vibrionul holeric în intestinul subţire, bacilul dizenteric în colon, unde se înmulţesc şi determină simptomele de boală.

În unele cazuri infecţia progresează din aproape în aproape (prin contiguitate) afectând ţesuturile vecine: infecţia rinofaringelui poate invada căile respiratorii superioare (bronhiile) şi apoi chiar pe cele inferioare, alveolele pulmonare (zonă normal sterilă) determinând pneumonii şi bronhopneumonii. De asemenea, infecţia vaginală

netratată, se poate extinde până la uter şi anexe; procesele inflamatorii apendiculare generează peritonite.

Infecţii generalizate. Uneori, în absenţa tratamentului, infecţia se poate generaliza pe cale sanguină sau limfatică, determinând bacteriemii sau septicemii.

BACTERIEMIA este pătrunderea în sânge a unui număr redus de bacterii, într-un interval de timp limitat, fără manifestare clinică importantă, organismul învingând de obicei infecţia. Bacteriemia este fie discontinuă, când bacteriile sunt mobilizate dintr-un focar septic acut (pneumonie), sau subacut (osteomielită), fie fugară, când bacteriile sunt aspirate printr-o ruptură vasculară posttraumatică, chirurgicală, postextracţională (stomatologie). Uneori însă, bacteriemia explică localizarea tardivă a unei infecţii, spre exemplu tuberculoza osoasă consecutiv infecţiei pulmonare.

SEPTICEMIA este revărsarea permanentă sau intermitentă în sânge a unor bacterii dintr-un focar infecţios existent: endocardita bacteriană, abces care comunică cu un vas sanguin, un cateter venos infectat, etc. Septicemia se însoţeşte de febră caracteristică, frison şi o stare generală alterată care necesită tratament de urgenţă. Localizarea secundară a infecţiei netratate sau incorect tratate în diverse organe, constituie septico-pioemia (dată de bacterii pioemice cu înmulţire extracelulară) sau granulia (dată de bacterii facultativ intracelulare). Septicemia este însoţită cel mai adesea de „toxemie”, datorată difuziei concomitente de exoenzime-agresine, toxine (endotoxina bacteriilor Gram negative când se produce o liză masivă a acestora în sânge), produşi de catabolism şi alterare tisulară.

Infecţiile generalizate evoluează în mai multe etape:a. Etapa (perioada) de incubaţie: intervalul parcurs de la pătrunderea germenului

infectant în organism până la apariţia primelor simptome de boală. Durata ei (ore, zile,

săptămâni) depinde atât de microorganism (specie sau tulpină) cât şi de rezistenţa

organismului. În general, cu cât perioada de incubaţie este mai scurtă, bacteria este mai

virulentă şi infecţia mai severă.

În funcţie de durata medie a perioadei de incubaţie există:- boli cu incubaţie scurtă, 1-7 zile: toxiinfecţii alimentare, meningite, difteria, gonoreea;- boli cu incubaţie medie, 8-21 zile: febra tifoidă, tetanos etc.;- boli cu incubaţie lungă, zeci de zile: hepatita B (60-180 zile);- boli cu incubaţie foarte lungă, ani de zile: tuberculoza, lepra, SIDA.

Unele boli au o perioadă fixă de incubaţie: rujeola, rubeola, variola, varicela.

b. Debutul bolii reprezintă momentul apariţiei primelor semne de boală, de regulă

necaracteristice: febră, scăderea apetitului, stare generală alterată, dureri de cap, dureri

musculare, articulare etc. Debutul poate fi brusc sau insidios.

c. Perioada de stare se caracterizează prin apariţia semnelor clinice şi paraclinice specifice bolii (digestive, respiratorii, manifestări cutanate, semne de iritaţie meningeală etc.)

d. Perioada de declin (defervescenţă): în cazul unei evoluţii favorabile semnele majore ale bolii diminuă până la dispariţia totală, brusc, in crisis (ca în pneumonia pneumococică) sau lent, progresiv, in lisis (ca în febra tifoidă).

e. Perioada de convalescenţă este perioada în care se refac leziunile şi se restabilesc funcţiile perturbate. Este o perioadă foarte importantă pentru că acum pot apărea: recăderi, complicaţii, cronicizarea infecţiei.

În cazul unei evoluţii favorabile se produce vindecarea, cu sau fără sechele. De regulă, vindecarea poate fi totală, însă în anumite cazuri, bolnavul poate rămâne purtător de germeni sau poate să prezinte sechele funcţionale sau organice. În cazul unei evoluţii nefavorabile, boala evoluează spre exitus sau cronicizare.În cazul vindecării trebuie făcută distincţia între vindecarea clinică şi cea bacteriologică, care nu se suprapun totdeauna. Vindecarea bacteriologică reprezintă momentul când nu se mai izolează germenul cauzal în produsele bolnavului. Dacă are loc vindecarea clinică, dar nu şi cea bacteriologică (germenul se izolează din produsele fostului bolnav după dispariţia semnelor clinice), apare starea de “purtător” (exemplu: Salmonella, Shigella, E. coli patogen).

3. EFECTELE NOCIVE ALE INFECŢIEI3.1. Alterări organice şi funcţionale determinate de agentul infecţios

Alterările mecanice (obstrucţii) se datorează reacţiei inflamatorii a gazdei ca răspuns la prezenţa microorganismului (exemplu: în difterie obstruarea căilor respiratorii prin falsele membrane).

Distrucţie celulară. Efectul distructiv depinde de celulele implicate, de numărul lor şi de viteza evoluţiei infecţiei. Această distrucţie celulară are loc prin enzimele eliberate de microorganisme (hemolizine, leucocidine), dar în special prin toxinele acestora. Unele toxine acţionează în apropierea porţii de intrare (Shigella) sau acţionează la distanţă de locul unde sunt produse (Corynebacterium diphteriae).

Alterări ale metabolismului celular apar în unele infecţii care evoluează fără leziuni celulare. Sunt cauzate de toxinele eliberate de bacterii: tetanos (toxina determină modificări ale metabolismului celulelor motoare producând paralizii spastice); botulism (toxina botulinică împiedică eliberarea de acetilcolină la nivelul sinapselor colinergice producând paralizia flască); holeră, diareea malignă a nou-născutului (toxinele -vibrionului holeric, E. coli enterotoxigen- determină creşterea nivelului AMP-ului ciclic

în celulele epiteliului intestinal, cu eliminarea unor cantităţi mari de apă în intestin cu apariţia diareei).

3.2. Alterări datorate reacţiilor de apărare antiinfecţioaseSimptomele infecţiilor sunt produse nu numai de microorganismul infectant, ci şi

de reacţiile gazdei.Puroiul este o consecinţă a inflamaţiei şi constă dintr-un amestec de leucocite vii

şi distruse, bacterii, exudat. El rezultă prin migrarea rapidă a leucocitelor (în special granulocite neutrofile) în focarul infecţios, sub acţiunea unor stimuli chemotactici. Prin distrugerea leucocitelor se eliberează hidrolaze din granulaţiile lizozomale care lezează ţesuturile învecinate, cu extinderea zonei afectate.

Abcesul rezultă atunci când puroiul se constituie într-o colecţie. În cazul existenţei unor deficienţe genetice ale funcţiilor leucocitelor, pot apare infecţii purulente recurente, chiar în prezenţa unui tratament corect cu antibiotice.

Febra. O temperatură mai mare de 37C atrage atenţia asupra posibilităţii existenţei unui proces infecţios. Însă, lipsa febrei nu exclude o infecţie, după cum, nici prezenţa febrei nu defineşte o infecţie (febră prin mari distrucţii celulare). Asigură mobilizarea mijloacelor de luptă ale organismului, prin activarea metabolismului şi a circulaţiei sanguine. Mecanismul producerii febrei recunoaşte excitarea centrilor termoreglatori, cu predominenţa termogenezei, prin diferite citokine: interleukină-1(IL-1), factorul de necroză tumorală, alfa interferon. De asemenea, doze mici ale endotoxinelor bacteriilor Gram negative produc febră, în timp ce dozele mari induc şocul endotoxic şi coagulare intravasculară diseminată.

Răspunsul imun, atât umoral cât şi celular, în anumite condiţii şi când depăşeşte anumite limite fiziologice, poate avea un efect nociv asupra organismului. - Răspunsul imun umoral. Înfecţiile induc formarea de anticorpi specifici. Anticorpii se combină cu antigenele infecţioase sau unele produse ale acestora (toxine, enzime). Complexele antigen-anticorp induc un răspuns inflamator, prin intermediul sistemului complementului, în scopul eliminării agentului infecţios sau neutralizării produşilor lor toxici.

La persoanele cu predispoziţie alergică, răspunsul imun umoral nu are întotdeauna un efect protector. În aceste cazuri, se poate produce sensibilizarea organismului faţă de antigenele bacteriene cu apariţia stării de hipersensibilitate mediată umoral (de tip I, II, III). Exemplu: complicaţiile alergice poststreptococice (cardita reumatismală în care apare starea de hipersensibilitate de tip II şi glomerulonefrita acută difuză în care apare starea de hipersensibilitate de tip III). - Răspunsul imun celular este mediat de limfocitele T citotoxice, K (ucigaşe), NK (natural ucigaşe) şi macrofage. Atunci când acesta depăşeşte în intensitate limitele fiziologice este asociat cu inflamaţia cronică. Acest aspect se întâlneşte frecvent în infecţiile cu germeni cu habitat predominent intracelular (tuberculoză, lepră) şi infecţiile virale.

MECANISMELE DE BAZĂ ALE PROCESULUI INFECŢIOS

Procesul infecţios se realizează prin acţiunea combinată, antagonistă, a două categorii de factori: factorii de patogenitate ai bacteriei şi factorii de rezistenţă ai organismului infectat.

1. FACTORII DE PATOGENITATE AI BACTERIEI

Patogenitatea se defineşte prin capacitatea unor bacterii de a produce boală. În cazul bacteriilor, patogenitatea se exprimă prin două proprietăţi ale germenului: virulenţă şi toxinogeneză.

1.1. VIRULENŢA Este capacitatea unei bacterii de a pătrunde, a se adapta, a se multiplica, a invada

şi a determina leziuni specifice în ţesuturile pentru care are tropism (invazie microbiană). Virulenţa este un caracter de tulpină. Exemple: în cadrul speciei Corynebacterium diphteriae există tulpini toxigene virulente şi tulpini netoxigene, deci nepatogene; patogenitatea tulpinilor de pneumococ variază în funcţie de cantitatea materialului capsular.

Virulenţa unei tulpini microbiene se apreciază prin comparaţie cu o tulpină

standard a cărei virulenţă este cunoscută şi se exprimă prin DLM (doza letală minimă)

sau DL50 (doza letală medie). DLM este numărul total de germeni necesari sau

cantitatea de toxină necesară pentru a omorî toate animalele dintr-un lot experimental,

iar DL50 numărul de germeni sau cantitatea de toxină necesară pentru a omorî 50%

dintr-un lot de animale experimentale.

Virulenţa se realizează prin factori corpusculari şi factori enzimatici.

1.1.1. FACTORII DE VIRULENŢĂ CORPUSCULARIAceşti factori sunt legaţi de anumite elemente din structura celulei bacteriene,

elemente care conferă bacteriei protecţie împotriva mijloacelor de apărare ale organismului şi favorizează pătrunderea în ţesuturi.

a. Capsula Are efect antifagocitar (inhibă înglobarea bacteriilor de către fagocite), favorizând

invazia microbului în ţesuturi. Acţionează, de asemenea, şi împotriva anticorpilor locali sau altor substanţe bactericide. Exemple de bacterii capsulate: pneumococul (materialul capsular este de natură polizaharidică), bacilul cărbunos (de natură polipeptidică), unele tulpini de stafilococi şi streptococi, Klebsiella pneumoniae, Clostridium perfringens. Unele bacterii (Klebsiella, bacilul cărbunos), deşi mai virulente când sunt capsulate, posedă şi alţi factori de patogenitate.

b. Compuşi ai peretelui bacterian

Anumite componente situate în straturile superficiale ale bacteriei, imprimă acesteia o virulenţă deosebită, având rol antifagocitar. Exemple: proteina M de la streptococul -hemolitic grup A, factorul parietal de virulenţă de la stafilococul aureu, factorul cord de la bacilul Koch, factorul de ataşare la mucoasa intestinală la E coli patogen şi Shigella, antigenul Vi (de înveliş) la unele tulpini de bacil tific.

c. MobilitateaBacteriile mobile sunt mai virulente decât cele imobile. Mobilitatea deosebită a

treponemelor (spirochete) şi leptospirelor (spirili), care pătrund în organism prin pielea şi mucoasele intacte, este realizată prin mişcările de tirbuşon ale corpului celular. Mobilitatea poate fi realizată şi prin intermediul cililor, fie ca atribut de specie (la Proteus) fie consecutiv activării aderenţei la mucoasa intestinală prin cili (caracter indus de plasmida „de colonizare” la E. coli patogen).

d. Fimbriile

Oligomeri proteici ce apar ca apendici filamentoşi la suprafaţa celulei bacteriene,

fimbriile au rol în ataşarea germenilor pe receptorii de pe suprafaţa celulelor

susceptibile de la poarta de intrare. Structurile principale bacteriene care pot funcţiona

ca adezine sunt:

- pilii comuni (adezine piliale) care permit o aderare crescută de celulele epiteliale.

Exemple: fimbriile P (prezente la tulpinile de Escherichia coli pielonefritogene);

fimbriile S (la tulpinile de E. Coli implicate în meningite); fimbriile K88 şi K89 (la

tulpinile de E. Coli enterotoxigene ce produc diareea malignă a nou-născutului); fimbriile

ce conţin N-metilfenilalanină (la unele bacterii Gram negative, la Pseudomonas,

Neisseria, Bacteroides, Vibrio). În plus, există posibilitatea ca aceeaşi tulpină bacteriană

să conţină mai multe tipuri de adezine ce sunt codificate de anumite zone cromozomiale

sau plasmidice. Această diversitate genetică permite adaptarea tulpinii la condiţiile

diferite oferite de organismul gazdă.

- adezine nepiliale, ca de exemplu, glicocalixul, microcapsula, proteine de membrană

externă la bacteriile Gram negative, ca şi unele substanţe din organism. O astfel de

substanţă care are proprietatea de a adera la suprafeţele mucoase este fibronectina, o

glicoproteină plasmatică ce se găseşte în spaţiul extracelular. Unele bacterii care pătrund

în organism aderă la rândul lor de fibronectină şi, prin intermediul ei, de suprafaţa

celulelor epiteliale. Astfel de microorganisme sunt Streptococcus pyogenes,

Staphilococcus aureus, Treponema pallidum.

1.1.2. FACTORI ENZIMATICI DE VIRULENŢĂ (EXOENZIME)Sunt substanţe elaborate de bacteria infectantă şi eliminate înafara ei, care

determină modificarea ţesuturilor locale, favorizând diseminarea bacteriilor în organism, din aproape în aproape, cu invadarea ţesuturilor dincolo de poarta de intrare.

a. CoagulazaEnzimă secretată de stafilococii patogeni, care, in vitro, coagulează plasma citratată

(test important de patogenitate). În organism ea favorizează formarea în focarul inflamator a unei “pelicule” de fibrină care protejează germenii împotriva fagocitării şi altor factori de apărare nespecifică şi specifică.

b. FibrinolizinaEnzimă activatoare de plasminogen („kinază”), care determină digestia fibrinei din

focarul inflamator, astfel încât bacteriile pot străbate această barieră. Capacitatea de elaborare a fibrinolizinei reprezintă unul din testele de patogenitate pentru unii germeni (exemplu: stafilococi patogeni, streptococi patogeni).

c. HialuronidazaDepolimerizează acidul hialuronic din substanţa fundamentală a ţesutului

conjunctiv şi din cimentul intercelular al epiteliilor, potenţează invazivitatea germenilor. Exemplu: stafilococul aureu, streptococul -hemolitic grup A, Clostridium perfringens.

d. Enzime hidroliticeDin grupul acestor enzime fac parte: colagenazele, lecitinazele, neuraminidazele,

lipazele, proteazele, nucleazele.- Colagenaza, enzimă proteolitică de depolimerizare a colagenului din ţesutul conjunctiv. Exemplu: Clostridium perfringens.- Lecitinaza (“alfa-toxina”) care determină hidroliza lecitinei din membranele celulare. Exemplu: Clostridium perfringens.

- Neuraminidaza, prezentă la multe bacterii şi virusuri, hidrolizează mucoproteinele de pe suprafaţa celulelor, expunându-le atacului.

e. Enzime citoliticeDin categoria enzimelor citolitice fac parte hemolizinele şi leucocidinele, enzime

cu efect hemolitic sau de distrugere a leucocitelor. Au efect antifagocitar, favorizând indirect invazia. Exemplu: streptolizinele streptococului -hemolitic grup A (streptolizina “O” şi streptolizina “S”); hemolizinele intrinseci: -hemolizine responsabile de hemoliza completă; a-hemolizine responsabile de hemoliza incompletă.

Pe lângă bacteriile cu habitat extracelular, bacterii care sunt supuse, cu succes, mecanismelor de apărare antiinfecţioasă a organismului, există şi bacterii cu habitat intracelular: facultativ intracelular (bacilul Koch, Brucella) şi obligatoriu intracelular (Chlamydia trachomatis). Prezenţa lor intracelulară le asigură protecţie împotriva mijloacelor de apărare ale organismului, inclusiv cele imune. Bacteriile cu habitat intracelular sunt cele mai invazive bacterii deoarece, supravieţuirea lor în diverse celule şi mai ales în fagocite, favorizează diseminarea lor în organism. Pătrunse în celulele fagocitare, bacteriile ajung la ganglionii limfatici şi apoi în circulaţia generală, unele dintre ele trecând, la adăpostul fagocitelor, chiar bariera hematoencefalică.

1.2. TOXINOGENEZA

Este definită drept capacitatea unor germeni de a elabora toxine, substanţe solubile cu efect toxic pentru ţesuturile organismului infectat. Ele se împart în exotoxine şi endotoxine.

1.2.1. EXOTOXINELE Sunt substanţe toxice (proteine solubile şi filtrabile), eliberate de bacteria vie în

mediul ambiant al germenului: fie în mediul de cultură fie în organismul infectat. Sunt elaborate în special de bacterii Gram pozitive şi prezintă o acţiune strict

specifică, determinând manifestări clinice caracteristice.

a. Proprietăţi fizico-chimice- sunt holoproteine termolabile (excepţii: toxina botulinică ce este înalt termostabilă, enterotoxina stafilococică);

- se transformă prin învechire şi sub acţiunea formolului (4%0) în vaccinuri eficiente, toxoizii-anatoxine, produşi netoxici, cu imunogenitate păstrată;

- sunt sensibile la radiaţii şi variaţii de pH.

b. Proprietăţi biologice

Toxicitate

Aprecierea gradului de toxicitate se face prin stabilirea valorii DLM (doza letală

minimă). Efectele toxice apar după o perioadă de latenţă, puterea toxică este mare, doza

letală minimă este mică. Se distinge net tropismul selectiv pentru anumite teritorii:

- neurotropism: toxina botulinică, toxina tetanică, toxina difterică;

- miotropism: toxina difterică;

- enterotropism: enterotoxina stafilococului, enterotoxina vibrionului holeric, E. coli patogen, Shigella dysenteriae;

- dermotropism: exotoxina bacilului cărbunos, eritrotoxina;

- tropism pentru mucoasa căilor respiratorii: toxina difterică, toxina secretată de Bordetella pertussis.

Pentru unele specii bacteriene, exotoxinele pot reprezenta unicul factor de patogenitate responsabil de toată simptomatologia bolii (Corynebacterium diphteriae, Clostridium tetani, Clostridium botulinum). Pentru alte bacterii (bacilul cărbunos, stafilococ) exotoxina completează doar ceilalţi factori de patogenitate (numai unii dintre stafilococii patogeni sunt enterotoxici, producând toxiinfecţii alimentare).

Antigenitate

Au specificitate antigenică înaltă, sunt puternic imunogene, sunt neutralizabile prin anticorpi specifici.

1.2.2. ENDOTOXINELESunt produşi toxici prezenţi la bacilii Gram negativi, făcând parte integrantă din

structura lor şi care se pun în libertate numai după moartea (liza) acestor bacterii.

Endotoxina este lipopolizaharidul (LPS) din membrana externă a peretelui

celular al acestor bacterii şi joacă un rol important în patogenia infecţiilor produse de

aceste microorganisme. Exemplu la enterobacterii complexul glucido-lipido-polipeptidic:

Salmonella typhi, E. Coli, Shigella, Y. pestis.

a. Proprietăţi fizico-chimice

- sunt heteroproteine (proteine complexe) formate dintr-un suport de proteine simple plus o grupare prostetică (de obicei de natură lipido-glucidică). Majoritatea endotoxinelor sunt complexe glucido-lipido-polipeptidice;

- sunt solubile, dar nu difuzează în mediul ambiant al germenului (ele se eliberează numai odată cu liza celulei bacteriene);

- sunt termostabile;

- rezistente la tratamentul cu alcool;

- nu se transformă în toxoizi sub acţiunea formolului.

b. Proprietăţi biologice

Toxicitate

Toxicitatea endotoxinelor este mai redusă comparativ cu cea a exotoxinelor. Doza letală minimă este mare. Efectele toxice au loc fără perioadă de latenţă. Au un tropism mai difuz, manifestările toxice sunt variate:- tulburări hemodinamice la nivelul capilarelor şi arteriolelor, până la colaps periferic;

- modificări ale formulei leucocitare (leucopenie);

- efect hiperglicemiant;

- febra, determinată de eliberarea din macrofage (sub acţiunea endotoxinelor) a pirogenilor endogeni (IL-1, TNF) care acţionează pe centrii termoreglării din hipotalamus;

- activarea complementului pe cale alternativă, ceea ce favorizează chemotaxia fagocitelor în focarul infecţios cu liza bacteriilor;

- activarea macrofagelor care vor secreta enzime lizozomale în cantităţi crescute, cu creşterea capacităţii lor fagocitare ;

- activarea limfocitelor B cu accentuarea producerii de anticorpi;

- coagulare diseminată intravasculară, datorită activării sistemului coagulării prin factorul XII Hageman.

În cantităţi mici determină reacţii de alarmă benefice organismului (febră, activarea C pe cale alternativă, activarea macrofagelor, stimularea limfocitelor B), în timp ce în cantităţi mari, determină şocul endotoxic fatal, fie prin acţiunea directă a endotoxinei, fie prin substanţele eliberate de neutrofile în urma lizei lor datorată endotoxinei bacteriene. Şocul endotoxic (clinic: hipotensiune, coagulare intravasculară diseminată) poate apărea şi în cazul administrării unor perfuzii în care endotoxina provine de la bacili Gram negativi omorâţi prin sterilizare (figura 1). C3b2Bb, rezultat în urma clivării fiziologice, se leagă de suprafaţa bacteriilor, fiind protejat astfel de inactivare. La stabilizarea C3b2Bb participă şi o proteină plasmatică, properdina (P);

deci activarea complementului pe calea alternativă este rezultatul stabilizării C3b2Bb (a C3 convertazei) ce poate fi determinată, printre altele, de prezenţa bacteriilor.

2. FACTORII DE REZISTENŢĂ A ORGANISMULUI INFECTAT

Organismul este expus în toate etapele vieţii la diferite infecţii, cea mai mare

receptivitate întâlnindu-se la copii sub 1 an şi bătrâni. La aceste vârste extreme infecţiile

evoluează de obicei mai sever, datorită posibilităţilor mai reduse de apărare ale

organismului. Unele boli endocrine (diabet, hipotiroidie, insuficienţă suprarenală),

subnutriţia, carenţa de vitamine, oboseala, sarcina, etc., scad rezistenţa generală a

organismului, favorizând apariţia diferitelor infecţii.

Organismul gazdă poate contribui la desfăşurarea procesului infecţios prin

mecanisme de rezistenţă nespecifică şi specifică (tabel 2).

- Rezistenţa nespecifică, naturală, înnăscută faţă de agenţii infecţioşi este comună tuturor indivizilor unei specii;

- Rezistenţa specifică, dobîndită (imunitatea antiinfecţioasă) se dezvoltă pe parcursul vieţii, ca urmare a contaminării continue cu diverşi agenţi infecţioşi.

Tipuri de rezistenţă

Exemple

Naturală, înăscută, nespecifică

Dobîndită natural

Dobîndită artificial

- Barierele externe (mecanică, chimică, biologică);- Factori interni umorali (sistemul complementului) şi celulari (inflamaţia, fagocitoza).- Transfer placentar de anticorpi de la mamă la făt (pasivă);- După contactul cu un agent infecţios.- Administrare de antitoxine (pasivă);- Vaccinare (activă).

Tabel 2: Tipuri de rezistenţă (după Moldovan Roxana, 1997)

Mecanismele rezistenţei naturale sunt distincte de cele ale rezistenţei dobîndite, dar, ele nu pot fi separate, deoarece se intrică şi acţionează sinergic.

2.1. REZISTENŢA NESPECIFICĂ (NATURALĂ, ÎNNĂSCUTĂ, DE SPECIE)Reprezintă starea de rezistenţă cu care sunt dotaţi toţi indivizii unei specii faţă de

anumiţi agenţi infecţioşi. Răspunsul de apărare nespecifică este de o intensitate relativ egală, indiferent de natura agentului agresiv bacterian, şi indiferent de numărul de contacte anterioare pe care organismul le-a avut cu agentul respectiv.

Fiecare specie este genetic rezistentă la anumite infecţii, dar şi susceptibilă la altele. Astfel, omul este singura specie care face în mod natural sifilis, scarlatina, gonoreea, animalele fiind rezistente în mod natural. Această rezistenţă antiinfecţioasă se explică prin condiţiile impropri pe care un organism le oferă microorganismului faţă de care este rezistent şi prin lipsa receptorilor celulari specifici pentru agentul infecţios respectiv.

Dar, rezistenţa antiinfecţioasă prezintă variaţii de rasă şi variaţii individuale, chiar în cadrul aceleiaşi specii. Este cunoscut faptul că în timpul unor epidemii, unii indivizi fac forme grave de boală infecţioasă, alţii forme fruste, iar unii chiar infecţii clinic inaparente. Această variaţie individuală a rezistenţei la infecţii este determinată de structura generală a mecanismelor de apărare şi în special de prezenţa diferitelor antigene de histocompatibilitate.

Factorii de apărare nespecifică pot fi împărţiţi în: barierele cutanate şi mucoase, reacţia febrilă, factorii interni umorali şi celulari.

2.1.1. BARIERELE CUTANATE ŞI MUCOASETegumentele şi mucoasele constituie bariere mecanice, chimice şi biologice,

eficiente în prevenirea pătrunderii microbilor în organism (tabelul 3).

Sediu Mecanisme de protecţiePiele - Barieră mecanică

- Secreţia de acizi graşi- Acidul lactic, rezultat al metabolismului local- Uscăciunea relativă a pielii

Cavitatea bucală

- Enzimele (lactoperoxidaza, lizozimul şi anticorpii din salivă- Actiunea de spălare a salivei

Aparat respirator

- Tusea şi strănutul- Mişcarea firelor de păr din vestibulul nazal care captează microbii- Enzimele şi capacitatea surfactantă a mucusului- Mişcările cililor vibratili- Macrofagele alveolare

Tract digestiv - PH-ul gastric (1-2)- Enzimele şi anticorpii din mucus

- Mişcările peristaltice- Flora intestinului gros

Ochi - Lizozimul din lacrimi- Acţiunea de spălare a lacrimilor

Ureche - Acţiunea antimicrobiană a cerumenuluiAparatul genitourinar

- Ph-ul vaginal, flora locală- PH-ul urinii- Acţiunea de spălare a urinii

Tabel 3: Bariere cutaneo-mucoase (după Moldovan Roxana, Coşniţă Monica, 1997)a. Bariere mecanice

Sunt reprezentate de integritatea pielii şi mucoaselor, integritate care este cel mai important obstacol în calea pătrunderii bacteriilor dincolo de poarta de intrare. Această integritate este asigurată de: straturile cornoase ale epidermului, “capcanele anatomice” la nivelul mucoaselor (meatele nazale), înglobarea bacteriilor în masa de mucus cu reţinerea lor, mişcarea cililor epiteliului căilor respiratorii superioare, îndepărtarea mecanică a bacteriilor prin secreţiile naturale de la nivelul mucoaselor (salivă, spută, secreţii nazo-faringiene), peristaltismul intestinal.

b. Bariere chimice- pH scăzut de la suprafaţa tegumentelor (pH=5-6), asigurat de acizii graşi cu moleculă lungă din secreţia glandelor sebacee, are un puternic efect nociv pentru germenii patogeni (streptococii de grup A, bacilii difterici);

- lizozimul, existent în salivă, secreţia lacrimală, secreţia nazo-faringiană, mucusul cervical, lichidul prostatic, este o proteină cu greutate moleculară mică, cu efect de liză a bacteriilor prin desfacerea componentelor glucidice din peretele bacterian;

- acidul clorhidric din sucul gastric (pH=2) are puternic efect bactericid asupra tuturor germenilor ce pătrund odată cu alimentele, asigurând sterilitatea stomacului şi duodenului;

- secreţia biliară cu efect puternic bactericid, ceea ce explică lipsa bacteriilor în duoden şi prima porţiune a jejunului; bila interferează funcţiile vitale ale membranei celulare având şi o acţiune neutralizantă asupra unor toxine bacteriene;

- pH acid al vaginului, rezultat în urma metabolizării glicogenului de către bacilii lactici, reprezintă de asemenea un mijloc eficient de apărare contra microbilor.

c. Bariere biologiceSunt reprezentate de flora comensală de pe tegumente şi mucoase. Coexistenţa în

acelaşi ecosistem a diferitelor specii, tulpini şi variante bacteriene, ca şi asocierea altor

agenţi (fungi, paraziţi, virusuri) este marcată puternic de relaţia de antagonism

bacterian, care asigură o protecţie biologică eficientă, cu precădere în cazul căilor

respiratorii superioare, intestinului, tegumentului, vaginului (Exemplu: speciile de

Lactobacillus din vagin, menţin în mod normal un pH acid, nefavorabil dezvoltării altor

bacterii).

Mecanismele prin care flora normală se opune multiplicării florei patogene sunt:

- competiţia pentru acelaşi receptor celular;- competiţia pentru un substrat nutritiv;- secreţia unor produşi secundari toxici,- stimularea sistemului imun, cu producerea anticorpilor naturali, care vor reacţiona încrucişat cu antigenele florei patogene.Administrarea abuzivă de antibiotice cu spectru larg poate distruge echilibrul dintre speciile florei normale şi unele specii condiţionat patogene sau patogene, cu apariţia diareei prin dezvoltarea necontrolată a unei singure specii. Exemplu: S. aureus, Candida albicans, Clostridium difficile, care fac parte din flora normală şi care se menţin la individul sănătos în anumite limite tocmai datorită antagonismului bacterian.

2.1.2. REACŢIA FEBRILĂ

Ea însoţeşte, de regulă, o infecţie bacteriană. Implică o dereglare a mecanismelor sistemului termoreglator (central şi periferic), cu predominanţa termogenezei. Centrii termoreglatori din hipotalamus vor fi excitaţi de către diferiţi factori pirogeni ca: endotoxinele bacteriilor Gram negative (lipopolizaharidul din peretele celular al acestor germeni acţionează asupra macrofagelor ce vor secreta pirogeni endogeni: interleukină-1 (IL-1), factorul de necroză tumoral (TNF-alfa);

alţi “pirogeni endogeni” secretaţi de macrofage, monocite, granulocite, ca urmare a acţiunii altor bacterii, virusuri, hormoni steroizi, limfocite T, complexe imune circulante (figura 3).

Reacţia febrilă, din punct de vedere al apărării antiinfecţioase nespecifice, asigură

mobilizarea mijloacelor de luptă ale organismului, prin activarea metabolismului şi a

circulaţiei sanguine. O temperatură de 38,5-39C accentuează distrugerea agenţilor

infecţioşi, prin creşterea producţiei de imunoglobuline şi a activării fagocitozei. Însă,

febra prelungită poate fi asociată cu efecte nevaforabile (creşterea activităţii cardiace, la

un pacient cu funcţie cardiovasculară compromisă, poate determina apariţia convulsiilor;

modificările metabolice pot duce la deshidratare şi pierdere de electroliţi; creşterea

susceptibilităţii la efectele unor toxine microbiene).

Figura 3: Reacţia febrilă (după C. Voiculescu, 1996)

2.1.3. FACTORII INTERNI AI APĂRĂRII NESPECIFICEÎn cazul în care bacteriile patogene au învins barierele mucoase sau cutanate,

difuzarea lor este împiedicată în mod normal, de ţesutul conjunctiv intercelular. Uneori

însă, acesta poate fi distrus de unele enzime bacteriene proteolitice: proteinaze,

fibrinolizine, colagenaze, streptochinaze. Factorii interni ai apărării nespecifice sunt

încadraţi în două categorii: factori umorali şi factori celulari.

a. FACTORI UMORALIa.1. Polipeptidele bazice din unele ţesuturi au efect bactericid (pătrund prin peretele bacterian şi alterează funcţiile osmotice a membranei citoplasmatice, ducând în final la moarte celulară). Exemple: polipeptidele bazice cu efect asupra bacilului cărbunos, spermina şi spermidina cu efecte asupra bacilului Koch şi stafilococului aureu.

a.2. Lizozimul este o mucopeptidază care hidrolizează legăturile peptidoglicanului din peretele celular al bacteriilor, acestea devenind sensibile la liza osmotică. Acţionează puternic asupra bacteriilor Gram pozitive. Bacteriile Gram negative nu sunt sensibile la acţiunea lizozimului, deoarece peptidoglicanul este acoperit de membrana externă. Dacă aceste bacterii sunt supuse iniţial acţiunii complementului, acesta va leza membrana externă dezvelind peptidoglicanul, sensibil acum la acţiunea lizozimului.

a.3. Splenocitina din splină care acţionează pe bacilii Gram negativi: Salmonella, E. coli patogen.

a.4. Betalizina, proteină bazică de origine trombocitară, cu efect inhibitor asupra multiplicării florei Gram pozitive, cu efect distructiv la nivelul membranei celulare.

ENDOTOXINEBACTERIENE

BACTERIIVIRUSURISTEROIZICICLy T IMUNE

GRANULOCITEMONOCITEMACROFAGECELULE TUMORALE

FEBRĂ

IL-1 (PIROGEN ENDOGEN)

a.5. Lactoferina este o proteină care leagă fierul şi care este în competiţie cu bacteriile cărora le este esenţial în multiplicare.

a.6. Opsoninele sunt substanţe care aderă de suprafaţa unui microorganism făcându-l accesibil fagocitozei. Există opsonine specifice (anticorpi de tip IgG implicaţi în apărarea antiinfecţioasă dobândită) şi nespecifice (C3b, fibronectina). Exemplu: C3b, produsă în timpul activării complementului, se leagă de glicoprotein-receptorul pentru C3b prezent pe membrana fagocitelor. Fiind legat de fagocit microbul va fi fagocitat eficient.

a.7. Stress-ul infecţios antibacterian ce constă din punerea în activitate a axului hipotalamus – hipofiză anterioară – corticosuprarenală cu eliberare de glucocorticoizi. Însă, în cantitate mare, glucocorticoizii scad mijloacele de apărare ale organismului (figura 4).

Figura 4: Stress-ul antiinfecţios (după C. Voiculescu, 1996)

a.8. Proteina C reactivă îşi trage numele de la faptul că reacţionează, printre altele, cu proteina C a pneumococului. Această proteină se ataşează pe unele bacterii sau fungi şi promovează învelirea acestora cu molecule de complement (C). Învelirea celulelor cu fracţiuni de C produce facilitarea fagocitării celulelor respective. a.9. Fibronectina, glicoproteină care favorizează adeziunea celulelor de suprafeţe, acţionează ca opsonină faţă de bacteriile Gram pozitive. Ea se găseşte la suprafaţa mucoaselor, impiedicând, prin proprietatea de a se lega de flora Gram pozitivă, colonizarea mucoaselor cu floră Gram negativă (de exemplu mucoasa faringiană).

a.10. Sistemul complementului (C, alexina)Complementul este o componentă complexă a serului normal. Este format din

aproximativ 25 de proteine plasmatice („componente”) care se activează succesiv una pe cealaltă într-o ordine dată („activare în cascadă). Aceste componente sunt produse în marea lor majoritate de către ficat. Macrofagele reprezintă al doilea sediu important de sinteză a componentelor complementului. A mai fost demonstrată sinteza limitată a unora

SALUTAR

HIPOTALAMUS

HIPOFIZĂ

ACTH

SUPRARENALĂ

NOCIV

din factorii acestuia în fibroblaste şi celulele intestinale. Se comportă ca proteine de fază acută: rata sintezei lor se accelerează în cursul infecţiilor sau altor injurii.

Cantitatea de complement prezentă în plasmă este relativ constantă. - Creşterea activităţii globale a complementului se poate produce în infecţii sau procese neoplazice. - Scăderea nivelurilor plasmatice ale complementului se datorează fie unui consum exagerat al acestuia (în bolile de complexe imune), fie unei sinteze reduse (cum este cazul insuficienţei hepatice).

ACŢIUNE BIOLOGICĂ

Există 2 căi de activare a complementului, cu punct de plecare diferit, dar, care

converg spre aceiaşi produşi finali:

- calea clasică (comună), a cărei activare presupune prezenţa anticorpilor specifici, deci un contact prealabil cu agentul etiologic respectiv. Activarea pe această cale se produce, de regulă, în prezenţa complexelor antigen-anticorp. Astfel, bacteriile cu care organismul a mai venit în contact, pătrund în organism şi întâlnesc anticorpii corespunzători cu care vor forma complexe antigen-anticorp. câte o moleculă de C1q şi de C1s şi două molecule de C1r formează unitatea de recunoaştere (C1qrs) ce se va lega de complexul antigen-anticorp;

unitatea de recunoaştere va cliva C4 şi C2 în C4a, C4b şi C2a, C2b; o moleculă C1qrs poate secţiona un număr mare de molecule C4 şi C2 înainte de a fi inactivată prin intervenţia unei molecule de reglare, numită inhibitorul lui C1 (C1 INH), care disociază C1qrs;

componentele C4b şi C2a vor forma C4b2a ce reprezintă C3 convertaza căii clasice, care va cliva C3 în C3a şi C3b. C3b este piesa esenţială în reacţiile următoare (figura 5).

- calea alternativă, mai veche din punct de vedere filogenetic, se activează în absenţa anticorpilor specifici, deci face parte din rezistenţa antiinfecţioasă naturală. Activarea pe această cale este declanşată de mai mulţi factori: polizaharide, acizi theicoici, bacterii Gram pozitive sau Gram negative, endotoxine bacteriene, paraziţi (tripanozoma), levuri (Candida albicans), agregatele de imunoglobuline (agregate termic, nu prin complexare cu antigene).

Figura 5: Sistemul complementului

În plasma normală C3 este supus permanent unei activări spontane discrete prin clivarea în C3a şi C3b. C3b se combină cu factorul B (enzimă proteolitică), rezultând C3bB;

după legarea sa de substrat, factorul B este clivat proteolitic în fragmentele Ba şi Bb de o enzimă prezentă în plasmă în stare activă, factorul D; în urma acţiunii factorului D se va obţine Ba iar C3bB va deveni C3b2Bb;

C3b2Bb este C3 convertaza căii alternative. Această convertază, rezultată în mod fiziologic, ar putea cliva cantităţi mari de C3, dacă nu

FORMAREA COMPLEXULUI DE ATAC AL MEMBRANEI

Deci, ambele căi produc enzime specifice („C3 convertaze”) care vor acţiona asupra componentei C3 a sistemului (elementul crucial al cascadei), cu scindarea sa în două fragmente: C3a şi C3b.

- C3a, agent inductor de inflamaţie, are proprietăţi chemotactice şi „anafilatoxice” (degranularea mastocitelor cu eliberarea histaminei şi creşterea permeabilităţii vasculare).

- C3b, care se depune pe bacterii sau pe alte celule ţintă, poate produce eliminarea acestora prin două mecanisme: imunoaderenţa şi liza. O serie de fagocite (granulocitele neutrofile, macrofage) exprimă pe suprafaţă receptori specifici pentru C3b. C3b mijloceşte pe această cale ataşarea celulelor ţintă pe fagocite („imunoaderenţă”) şi

ingurcitarea lor ulterioară. Această învelire cu C a ţintelor, care pregăteşte şi facilitează fagocitoza, a fost denumită „opsonizare”.

În acelaşi timp, C3b, poate media continuarea activării în cascadă a sistemului,

care se va finaliza prin asamblarea unui complex enzimatic (C5, 6, 7, 8, 9) pe suprafaţa

celulei ţintă. Acest complex a fost denumit „complex de atac a membranei” deoarece

provoacă soluţii de continuitate care duc la liza celulei atăcate (bacterie, celulă infestată

de virus sau alte organisme invadatoare).

Etapele principale ale formării complexului de atac al membranei sunt:

ambele C3 convertaze se combină cu C3b formând C5 convertaza (C3b2BbP pentru calea alternativă şi C3b4b2a pentru calea clasică);

C5 convertaza secţionează C5 cu generare de C5a (anafilatoxină) şi fragmente active C5b;

C5b se fixează pe suprafaţa celulei (bacteriei). De remarcat este faptul că moleculele C5b sunt foarte instabile şi sunt inactivate rapid dacă rămân libere în plasmă; în schimb, ele devin stabile dacă reuşesc să se ataşeze unui substrat sau membrană celulară, pe care începe procesul de asamblare a complexului de atac;

de C5b se vor lega în continuare C6, C7, C8 care se găsesc libere în ser şi se asamblează pe molecula C5 numai în momentul activării ei, fără intervenţia vreunei enzime proteolitice. Se formează complexul C5b678, care are capacitate litică redusă. Celulele ţintă pot fi lizate doar atunci când densitatea unor asemenea complexe este foarte mare;

în continuare, mai multe molecule de C9, care polimerizează, se ataşează de complexul C5b678, ducând la creşterea considerabilă a puterii litice. Structura proteinei C9 este asemănătoare cu a perforinelor prezente în granulaţiile celulelor citotoxice;

se formează, astfel, un complex de atac al membranei celulare (C5b6789) cu liza consecutivă a celulei bacteriene.

b. FACTORII CELULARI Sunt reprezentaţi de fagocitoză şi inflamaţie.

b.1. FAGOCITOZA Constituie un proces esenţial, prezent pe toată durata infecţiei. Reprezintă reacţia de

apărare celulară a organismului şi constă dintr-un mecanism de îndepărtare a microorganismelor şi a celulelor lezate, prin înglobarea lor de către anumite celule ale organismului (fagocite) specializate pentru această funcţie.

Aceste celule migrează la locul de pătrundere al bacteriilor în organism, le înglobează şi le distrug în interiorul lor, prin fagolizozomi (enzimatic). Se realizează în

acest fel localizarea infecţiei, care clinic se manifestă prin inflamaţie cu simptomele caracteristice: rubor, tumor, calor, dolor, şi functio laesa. În acest fel o infecţie minoră poate fi învinsă, printr-o bună apărare locală, iar puroiul rezultat din resturile celulelor distruse, conţine bacterii moarte (puroi steril). De cele mai multe ori însă, infecţia progresează, determinând diferite manifestări clinice.

CATEGORII DE CELULE CU PROPRIETĂŢI FAGOCITARE (FAGOCITE)În fagocitoză intervin două categorii principale de celule: microfagele şi

macrofagele. Aceste celule au capacitatea de a migra dirijat spre locul unde sunt particule străine. Migrarea lor în ţesuturi este favorizată de substanţele chemotactice: C5a, C5b şi alţi factori produşi în cursul inflamaţiei. Ele au pe suprafaţa lor receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinei G (IgG) şi receptori pentru fracţiunea C3b a complementului şi pot dezvolta mecanisme puternic microbicide. Se mai numesc şi fagocite profesioniste, pentru a putea fi deosebite de celulele fibroblaste, endoteliale şi reticulare care alcătuiesc fagocitele neprofesioniste; acestea îndeplinesc o activitate fagocitară mai redusă, deoarece sunt lipsite de receptorii prezenţi pe fagocitele profesioniste şi mai ales nu dezvoltă mecanisme bactericide.

MICROFAGE

- Granulocitele neutrofile realizează fagocitarea corpilor bacterieni integri sau fragmentelor de germeni. Capacitatea de fagocitoză este mărită de procesul de opsonizare, opsoninele fiind anticorpi de tip IgG. După înglobare, antigenele străine sunt distruse datorită: enzimelor lizozomale şi lactoferinei (din granulaţiile specifice neutrofile); mieloperoxidazei, elastazei, catepsinei, beta-glucuronidazei (din granulaţiile azurofile). Ele sunt celule “kamikaze” ale apărării antiinfecţioase, deoarece sosesc primele la locul injuriei. După digestia materialului fagocitat, foarte frecvent, leucocitele sunt distruse.

- Polimorfonuclearele eozinofile iau parte la apărarea antiparazitară. Conţin enzime ce

metabolizează histamina şi leucotrienele fiind astfel capabile să joace rol important în

limitarea reacţiilor alergice. Ele conţin şi proteine toxice (proteina majoră bazică) ce

duce la distrugerea celulelor epiteliale din tractul respirator ducând la inflamaţie cronică

în astmul bronşic. Ele fagocitează complexe antigen-anticorp precum şi unele resturi

antigenice ce rezultă din răspunsul imun şi care în alte condiţii ar duce la boli autoimune.

- Polimorfonuclearele bazofile (echivalentul mastocitelor tisulare) au granulaţii mari ce conţin numeroşi mediatori chimici şi precursorii acestora, ca, de exemplu: histamina, prostaglandine, leucotriene, factori activatori ai trombocitelor. Aceşti mediatori sunt

eliberaţi, la nevoie, în cantităţi reduse. Elaborarea lor masivă poate fi dăunătoare cu apariţia reacţiilor alergice de tip I: astm bronşic, urticarie, febră de fân etc.

MACROFAGELE Pot fi mobile, prezente în sânge (monocitele) şi fixe, dar uşor mobilizabile, ce fac

parte din sistemul reticulo-endotelial (sistem fagocitar mononuclear). Exemple: macrofagele din splină şi ganglionii limfatici; celulele Kuppffer din ficat; histiocitele din ţesutul conjunctiv; unele celule ale nevrogliei.

În tabelul 5 sunt prezentate comparativ principalele proprietăţi şi funcţii ale polimorfonuclearelor şi celulelor sistemului reticulo-endotelial.

Polimorfonucleare Sistem fagocitar mononuclearProprietăţi Funcţii Proprietăţi Funcţii

- Au origine medulară

- Sunt celule cu viaţă scurtă

- Au pe suprafaţă receptori pentru C3 şi Fc a IgG

- Au un număr mare de lizozomi

- Mieloperoxidaza prezentă în lizozomi

- Sunt active neutrofilele, apoi eozinofilile

- Sunt foarte mobile

- Sunt primele care se deplasează la locul infecţiei

- Reprezintă prima linie de celule care fagocitează

- Digeră total bacteriile fagocitate

- Eozinofilele înglobează complexe antigen-anticorp

- Origine medulară

- Sunt celule cu viaţă lungă

- Au pe suprafaţă receptori pentru C3 şi Fc a IgG

- Au un număr mic de lizozomi (numărul creşte în macrofagul “activat”)

- Nu au mieloperoxidază

- Cuprinde monocitul sanguin şi macrofagele tisulare. Macrofagele diferă morfologic între ele, dar funcţionează identic

- Fagocitoza

- Funcţie secretorie

- Celule asociate răspunsului imun

Tabel 5: Caractere ale fagocitelor polimorfonucleare şi celulelor sistemului fagocitar mononuclear (după A. Ivanof şi M. Ciupe, 1982)

Macrofagele fagocitează macromolecule inerte, microorganis-mele opsonizate, pe care le distrug în mare parte (tabel 6).

Unele microorganisme (micobacterii, listerii, brucele, toxoplasme) supravieţuiesc

şi se înmulţesc în macrofage. În acest caz, macrofagele protejează microorganismele

respective, servind ca factor de diseminare a infecţiei.

Funcţie Exprimare

1. Fagocitoză

2. Funcţie secretorie

3. Cooperare cu sistemul imun

- Reprezintă a doua linie de celule care

fagocitează ;

- Nu digeră complet microorganismele;- Înglobează resturi celulare şi tisulare, “curăţind” teritoriul lezat.

- Enzime cu acţiune asupra proteinelor prezente în mediul extracelular: colagenaze, elastaze, proteaze lizozomale, activatori ai plasminogenului;- Secreţie de factori antiinfecţioşi: lizozim, fracţiuni ale complementului (C2, C4, probabil C3, C5), interferon;- Factori ce modelează funcţia altor celule: proteina mitogenă asupra limfocitului T şi a timocitului;- Citotoxine asupra celulelor străine şi tumorale;- Reglatori ai activităţii celulare: prostaglandine;- Factori de diferenţiere: factorul de “stimulare al coloniilor”, care stimulează diferenţierea celulei suşă medulare în linia granulocitară.

- Intervine în declanşarea şi reglarea răspunsului imun.

Tabel 6: Funcţiile celulelor sistemului fagocitar mononuclear (după A. Ivanof şi M. Ciupe, 1982)

ETAPELE FAGOCITOZEI

Sunt reprezentate de: chemotaxie, adsorbţia particulelor pe fagocit, ingestia particulelor în fagocit şi digestia intracelulară.

CHEMOTAXIA

Reprezintă mobilizarea unidirecţională, dirijată a polimorfonuclearelor spre locul unde se eliberează factori chemotactici. Aceşti factori pot fi atât de origine bacteriană (formilmetionil-leucil-fenilalanina), cât şi factori ai organismului gazdă, ce apar în cursul inflamaţiei: C5a, kalicreina produsă de ţesuturile lezate, prostaglandine (E2, D2), tromboxan, leucotriene (B4), amine vasoactive, fragmente de colagen, de fibrină (tabel 7). Sub influenţa factorilor chemotactici fagocitele părăsesc capilarele prin diapedeză.

Pentru fiecare dintre factorii chemotactici, fagocitele au receptori specifici. În urma interacţiunii dintre aceşti factori şi receptorii celulari prezenţi pe suprafaţa PMN, se produc modificări ale fagocitului.

Componente bacteriene Componente ale organismului- Proteine bacteriene, îndeosebi N-formil-metionil-peptide;- Unele lipide bacteriene.

- Componente din sistemul complement: C5a, C5,6,7, obţinute prin activare;- Proteine serice: Kallikreina, fragmente de fibrină;- Histamina;- Derivaţi arahidonici;- Produse ale limfocitelor (limfokine);- Unii factori eliberaţi de neutrofile.

Tabel 7: Factori chemotactici (după A. Ivanof şi M. Ciupe, 1982)

ADSORBŢIA (ATAŞAREA) PARTICULELOR PE SUPRAFAŢA FAGOCITELORAtaşarea pe suprafaţa fagocitului poate fi întâmplătoare sau dirijată. Contactul

întâmplător depinde de şansa de coliziune între fagocite şi particule. În cel de-al doilea caz, fagocitele migrează către bacterii sau alte particule datorită chemotaxiei. S-a demonstrat că unele extracte bacteriene sau corpi bacterieni integri atrag leucocitele (chemotaxie pozitivă).

Dar, în mod normal, pentru ca să permită ataşarea fagocitului, suprafaţa celulei bacteriene trebuie modificată, şi această pregătire în vederea fagocitării se numeşte opsonizare. Opsonizarea se poate realiza prin mecanisme specifice, deoarece presupun participarea anticorpilor rezultaţi în urma unui răspuns imunitar. Este vorba de intervenţia IgG, care se leagă de fagocite prin fragmentul Fc, realizând o punte între antigenele de suprafaţă şi receptorul de pe fagocit, sau prin acţiunea combinată a complementului şi a anticorpilor, aşa cum se întâmplă în cazul IgM. IgM nu se pot fixa pe suprafaţa fagocitului, dar intervin formând complexe imune care activează complementul, activare din care rezultă fracţiunea C3b pentru care există receptori pe fagocit (figura 6).

Opsonizarea se poate realiza şi prin mecanisme nespecifice, prin intervenţia proteinei C reactive, a fibronectinei, C3b, alfa 2-glicoproteinei serice.

Figura 6: Etapele fagocitozei

Un factor potenţator al ataşării particulelor este şi aşa numita fagocitoză de suprafaţă, prin care microorganismele sunt captate mai uşor dacă sunt prinse pe suprafeţe rugoase. Aceasta se poate realiza prin plasarea microorganismelor pe suprafeţele dintre leucocite, între leucocite şi suprafeţele tisulare, sau în interstiţiile cheagurilor de fibrină.

Adsorbţia particulelor pe suprafaţa fagocitului este inhibată de anumiţi factori: hiperosmolaritatea mediului, concentraţii crescute de glucoză şi, respectiv, scăzute de fosfaţi în mediu etc.

INGESTIA (ÎNGLOBAREA) PARTICULELOR ÎN FAGOCITDupă ataşare, particulele sunt înglobate într-o vacuolă formată de membrana

citoplasmică prin emitere de pseudopode. Procesul necesită energie, care provine de

obicei din glicoliză. După înglobarea particulei, vezicula fagocitară se deplasează spre

interiorul celulei.

Etapa de ingestie (înglobare) se desfăşoară cu ritmuri şi intensităţi diferite, în

funcţie de intervenţia unor factori potenţatori sau inhibitori. Din prima categorie,

amintim existenţa în membrana fagocitului a unor proteine „contractile” din familia

actino-miozinei, care asigură emiterea de pseudopode şi formarea „pungilor”. Factorii

inhibitori sunt mai puţin bine studiaţi, un rol probabil în acest sens avându-l

prostaglandinele din seria E şi leucotrienele din grupul B.

DIGESTIA

Vacuola formată (fagozom) va fuziona cu lizozomii (grupaţi în jurul vacuolei) rezultând fagolizozomii. Formarea fagolizozomilor este un proces însoţit de dispariţia granulaţiilor intracitoplasmatice (degranulare). Liza granulelor ar avea loc la contactul cu peretele pungii fagocitare şi constă în eliberarea enzimelor lizozomale, care sunt diverse substanţe cu acţiune microbicidă, care vor declanşa digestia. În acelaşi timp, are loc o activare puternică a metabolismului oxidativ al PMN.

Distrugerea microbilor se petrece prin 2 mecanisme: O2-dependente şi O2-independente.

Mecanismele O2-dependente Sunt consecinţa “exploziei respiratorii”, o cale metabolică de respiraţie în stare

dormantă într-o celulă inactivă. Intensificarea bruscă a metabolismului („explozia respiratorie”) duce la formarea unor compuşi de tipul: ionilor de superoxid (O3

-), oxigen atomic (O-), radicali hidroxili, peroxid de hidrogen (H2O2) şi hipoclorit (HOCl). Toţi aceşti produşi au efect puternic bactericid.

Fenomenul digestiei intracelulare a particulelor are o complexitate deosebită. În esenţă, au loc următoarele secvenţe:

- eliberarea enzimelor lizozomale din fagolizozomi în interiorul vacuolei;

- eliberarea în vacuolă şi a altor enzime celulare: mieloperoxidaza, o enzimă foarte activă stocată în PMN, care în mediu acid existent în fagolizozom duce la formarea unor halogeni cu efect puternic microbicid;

- activarea proceselor oxidative şi anume: utilizarea intensă de către celulă a oxigenului molecular, care, sub acţiunea catalitică a NADPH (nicotinadenindinucleotidfosfat redus), se transformă în superoxid; superoxidul este clivat, datorită superoxid-dismutazei, în oxigen molecular şi peroxid de hidrogen;

- peroxidul de hidrogen, în cooperare cu mieloperoxidaza, determină dezagregarea particulelor fagocitate; peroxidul de hidrogen eliberat în fagocit este un agent bactericid puternic, dar combinarea cu mieloperoxidază îi creşte de 50 de ori activitatea.

Mecanismele bactericide independente de O2 Aceste mecanisme care intervin în omorârea microorganismelor, se datorează unor

enzime:

- enzime hidrolitice (catepsina, glicozidaza, arilsulfatază) care digeră peretele celular bacterian;

- defensine: proteine cationice care se leagă de peretele celular şi determină formarea unor canale ce străpung peretele, atât la bacteriile Gram pozitive, cât şi la cele Gram negative;

- lizozimul, prezent în granulaţiile lizozomale, ce atacă peptidoglicanul;

- histone nucleare sau pH-ul acid din fagolizozom, care împiedică viaţa microorganismului fagocitat;

- lactoferina care spoliază mediul de fier necesar bacteriilor pentru multiplicare.

În digestia intracelulară a particulelor mai pot interveni şi mecanisme adiţionale, ca: apariţia în citoplasmă a ionului de clor oxidat, cu puternică acţiune bactericidă; folosirea de către celulă a căii scurtate hexozo-monofosfat, în vederea sintezei ulterioare de superoxid (O2¯), peroxid de hidrogen (H2O2), acidul hipocloros (HOCl).

Omorarea microorganismelor fagocitate este urmată de digerarea completă a acestora prin activitatea unor hidrolaze. În PMN se produce degradarea completă a microorganismului, spre deosebire de macrofage, în care particula fagocitată este degradată parţial, incomplet, antigenele fiind apoi prezentate sistemului imun.

Calea hexozomonofosfaţilor

NADPH Superoxid Mielo

O2 O2¯ H2O2 HOCl

oxidaza dismutaza peroxidază

b.2. INFLAMAŢIA Este un proces natural de apărare antiinfecţioasă, un mecanism important de

rezistenţă naturală, dar care este reglat în evoluţie de procese imune şi de foarte multe ori procesul inflamator este dependent de factori imunitari.

Constă dintr-un ansamblu de procese clinice şi fiziopatologice de apărare celulară nespecifică, declanşat de diferiţi agenţi, cu deosebire infecţioşi, dar şi de iritanţi cum ar fi substanţele chimice, căldura puternică şi leziuni mecanice. Rezultatul acestui proces este acumularea unui mare număr de celule fagocitare la locul inflamaţiei.

Inflamaţia este un mecanism de apărare antiinfecţios rapid, care tinde să

localizeze infecţia şi să prevină diseminarea ei. Manifestările clinice sunt eritemul

(rubor), căldura (calor), edemul (tumor), durerea (dolor) şi impotenţa funcţională a

regiunii respective (functio laesa).

Inflamaţia poate evolua spre: vindecare cu restituţio ad integrum a ţesutului sau vindecare cu sechele. Deznodământul unei reacţii inflamatorii depinde de extinderea procesului inflamator, de microorganismele implicate, precum şi de reactivitatea gazdei.

ETAPELE INFLAMAŢIEI (ASPECTE FIZIOPATOLOGICE)

VASODILATAŢIE CAPILARĂ LOCALĂ

Înroşirea zonei inflamate este rezultatul creşterii cantităţii de sânge la acest nivel. Dilataţia vaselor sanguine locale determină o scădere a circulaţiei sângelui,care este însoţită de o creştere a permeabilităţii capilarelor locale ceea ce cauzează apariţia edemului.

ATRACŢIA LEUCOCITELOR (CHEMOTACTISM)Chemotactismul este reprezentat, în acest caz, de atracţia între leucocite şi spaţiul

interstiţial. Primele celule care ajung în ţesutul agresat sunt PMN, datorită capacităţii mari de migrare, apoi celulele sistemului reticuloendotelial şi limfocitele care au rol principal în iniţierea reacţiilor imunitare.

Toate aceste celule sunt înzestrate cu o mare capacitate de recepţie a stimulilor chemotactici, care sunt reprezentaţi în mare, de factorii chemotactici de natură bacteriană, de factorii produşi în urma activării C, şi nu în ultmul rând, de cei rezultaţi din degranularea mastocitelor. Cei mai importanţi factori care asigură producerea inflamaţiei sunt: aminele vasoactive (de tip histaminic), serotonina, unele enzime proteolitice (enzime lizozomale, kalicreină), unele subfracţiuni de complement (C3a, C5a) denumite „anafilatoxine” (ce determină degranularea mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici), interleukina-1 (IL-1) şi interleukina-8 (IL-8) ce sunt monokine secretate de macrofag. O parte din aceştia sunt preformaţi, aşa cum este histamina, cu efect vasodilatator asupra capilarelor şi cu creşterea permeabilităţii acestora.

Sub acţiunea acestor factori, PMN vor părăsi capilarul prin diapedeză şi se vor îndrepta către focarul inflamator.

În consecinţă se produce o exudare a plasmei cu mediatorii pe care aceasta îi conţine, din capilare spre zona infectată (creşterea fluxului sanguin spre zona inflamată, cu creşterea temperaturii locale).

Sub acţiunea unor mediatori chimici rezultaţi în timpul activării C şi secretaţi de macrofagele stimulate de toxinele bacteriene, se modifică endoteliul capilar care permite adeziunea PMN de acesta.

DIAPEDEZA LEUCOCITARĂEste procesul prin care un fagocit se strecoară printre celulele endoteliului

vascular, trecând în spaţiul interstiţial. Această trecere a celulelor în spaţiul interstiţial se face printr-un mecanism cu mai multe etape: rostogolire, marginaţie-adeziune, traversare prin emiterea de pseudopode (figura 8).

Figura 8: Etapele inflamaţiei

În procesul de trecere a fagocitelor prin celulele endoteliului vascular intervin moleculele de adeziune, ce fac parte din trei familii: selectine, integrine şi superfamilia imunoglobulinelor. Moleculele de adeziune sunt structuri exprimate pe suprafaţa leucocitelor şi a celulelor endoteliale care permit, prin interacţiuni reciproce, ataşarea leucocitelor de endoteliul capilar, cu o forţă crescândă, facilitând, în final, diapedeza. Există două categorii de molecule de adeziune (MA): L-selectine (CD 62L, LAM-1) sunt MA exprimate pe granulocite; E-selectine (CD 62E, ELAM-1), P-selectine (CD 62P), ICAM-1 (CD 54) ce sunt MA exprimate pe endoteliile vaselor mici.

Iniţial, prin L-selectine granulocitele se leagă de membrana celulelor endoteliale, legare slabă, sub acţiunea curentului sanguin granulocitele „rulează” (se rostogolesc) pe suprafaţa endoteliului vascular. Sub acţiunea unor atractanţi (IL-8) se modifică forma celulelor ataşate, ceea ce determină oprirea rulării şi adeziunea fermă la endoteliu. Aceeaşi IL-8 de pe suprafaţa endoteliului distruge L-selectinele, cu modificarea formei celulelor făcându-le apte să traverseze peretele vascular.

PMN vor părăsi capilarul prin diapedeză şi se vor îndrepta către focarul inflamator unde vor distruge microbii prin fagocităză. Formarea puroiului poate fi asociată inflamaţiei. După ce fagocitele au distrus celulele bacteriene, sunt degradate şi mor. În aria afectată se formează o masă de celule distruse, fagocite moarte, ceea ce reprezintă puroiul.

CONCLUZII În esenţă, organismul este apărat faţă de unele infecţii prin zestrea sa ereditară,

care nu permite dezvoltarea anumitor germeni. Germenilor la care este sensibil, organismul se opune pătrunderii lor prin bariere externe anatomice şi chimice la care se adaugă flora normală a organismului (antagonism bacterian). Dacă totuşi germenii au reuşit să străbată aceste bariere şi ajung în zonele interne sterile ale organismului, intervin o serie de factori umorali, dintre care unul este de o importaţă majoră: complementul. Activarea complementului are ca urmare liza celulelor microbiene, dar şi declanşarea răspunsului inflamator infecţios. Cascada de activare a complementului va antrena eliberarea unor mediatori chimici care participă direct în procesul inflamator şi vor

atrage în focarul infecţios un aflux mare de celule fagocitare (PMN, macrofage). Acestea vor distruge microorganismele prin fagocitoză.

Însă, în acelaşi timp, există germeni care dezvoltă strategii ce ocolesc mecanismele rezistenţei naturale şi care pot da infecţii la indivizii neimunizaţi. Astfel de strategii se referă la inhibiţia fagocitozei (secreţia de toxine faţă de fagocite; rezistenţa faţă de lizozim; inhibiţia exploziei respiratorii a fagocitelor) sau la rezistenţa la acţiunea complementului (inactivarea C5a la Pseudomonas aeruginosa; prezenţa la suprafaţa bacteriilor a unor substanţe - acidul sialic - care determină degradarea C3b la E. coli; împiedicarea inserţiei complexului de atac al membranei la Salmonella, E. coli).

Sintetizând datele privind factorii, respectiv mecanismele de apărare nespecifică ale organismului, putem constata că prezenţa factorilor nespecifici umorali sau celulari în diferite umori, sânge, ţesuturi şi organe, constituie un sistem de apărare dinamică şi interdependentă, prin care organismul uman răspunde la atacul microorganismelor. Acest sistem cuprinde sistemul fagocitar (polinucleare şi mononucleare), sistemul kininelor declanşator al proceselor de inflamaţie, sistemul complementului şi sistemul de coagulare şi fibrinoliză.

2.2. REZISTENŢA SPECIFICĂ (IMUNĂ).APĂRAREA SPECIFICĂ-IMUNĂ.

IMUNOPROFILAXIE

Se poate spune că, încă din timpul vieţii fetale şi mai pronunţat după naştere şi

ulterior în tot timpul vieţii, organismul uman se găseşte în permanent conflict cu

focarul infecţios. Faţă de acesta organismul reacţionează prin funcţia de apărare

antiinfecţioasă (nespecifică şi specifică - imună), care are câteva intervenţii

importante: vindecarea dintr-o infecţie manifestă, împiedicarea reinfecţiei cu acelaşi

agent etiologic şi prevenirea primoinfecţiei. Aceste modalităţi de apărare se întâlnesc

în toate infecţiile bacteriene, micotice, parazitare şi virale, în care se găsesc trăsături

comune. Ţinând însă seama de mecanismele specifice prin care aceste categorii de

agenţi infecţioşi declanşează procesul infecţios, apar în consecinţă particularităţi

distincte şi diversificate de apărare.

Apărarea antiinfecţioasă se realizează diferenţiat în raport de:

proprietăţile speciei patogene, poarta de intrare, localizarea în organismul uman, diversitatea factorilor de patogenitate şi a mecanismelor prin care aceştia

acţionează. Trecând peste aceste diferenţe, se poate însă generaliza, că în majoritatea

infecţiilor, apărarea este rezultatul unei acţiuni sinergice şi ordonate a proceselor de imunitate (umorală şi celulară) şi a factorilor de rezistenţă naturală.

Mai mult, există şi posibilitatea ca în aceeaşi infecţie să survină o contribuţie diferenţiată: faţă de o categorie de factori intervin preponderent efectorii imunităţii umorale, pe când faţă de alţi determinanţi de patogenitate efectul imunitar de apărare se instalează prin componenţii imunităţii mediate celular.

Intervenţia fagocitelor, prima „armată” care intră în joc în apărare, are un caracter general, vizând aproape toate bacteriile, ca şi alte microorganisme. Trebuie subliniat că fagocitoza acţionează în tot timpul infecţiei: împiedicarea instalării agenţilor infecţioşi la poarta de intrare (evitarea primoinfecţiei şi reinfecţiei), limitarea multiplicării şi generalizării bacteriilor, constituind în acelaşi timp modalitatea principală de eliminare a microorganismelor din ţesuturile gazdei, ceea ce are ca rezultat vindecarea. Chiar dacă acţionează diferiţi factori imunitari sau chimioterapice, fagocitoza este cea care, în final, asigură sterilizarea organismului de agenţii patogeni. În majoritatea cazurilor funcţia fagocitară este dependentă de efectori ai imunităţii umorale, ai imunităţii celulare şi a altor sisteme biologice.

O contribuţie majoră în apărarea antiinfecţioasă o au procesele imunitare. Se poate aprecia că, în toate infecţiile se dezvoltă paralel o imunitate umorală şi o imunitate celulară, cu variaţii de intensitate de la o infecţie la alta.

Astfel, dacă în infecţiile cu exotoxine ca factor principal de patogenitate contribuţia majoră de apărare este asigurată de imunitatea umorală prin procesul de neutralizare, în alte infecţii, în care microorganismele se multiplică facultativ intracelular, ca şi în infecţiile virale, în micozele viscerale şi în parazitoze, rolul principal îl au procesele de imunitate celulară (exemplu: procesul infecţios al tuberculozei). În majoritatea infecţiilor însă, funcţia de apărare este asigurată prin participarea în proporţii diferite şi cu intensitate variată, a sistemelor efectoare a celor două tipuri de răspuns imun. Funcţia de apărare se realizează în primul rând, prin eliminarea cât mai rapidă a antigenului străin pătruns în ţesuturile organismului, sau neutralizarea efectelor nocive ale acestuia.

APĂRAREA SPECIFICĂ IMUNĂ

Imunitatea (apărarea imună) reprezintă capacitatea de apărare a organismului:

- faţă de agresori externi (virusuri, bacterii, fungi, paraziţi);

- faţă de propriile molecule şi celule degradate sau modificate.

Răspunsul de apărare specifică, ce caracterizează apărarea (rezistenţa) imună-

dobândită, este rapid, precoce, intens şi eficient. Intensitatea răspunsului de apărare

specifică depinde de natura agentului infecţios şi de numărul de contacte anterioare

pe care organismul le-a avut cu agentul respectiv.

1. DINAMICA RĂSPUNSULUI IMUNModul în care organismul răspunde unui stimul antigenic este variat, dinamica şi

amplitudinea răspunsului diferă în funcţie de factorii genetici, starea fiziologică şi vârsta, felul, cantitatea şi modul de administrare a antigenului. Dincolo de aceşti factori există o condiţie care influenţează constant dinamica răspunsului imun şi anume dacă organismul respectiv a mai venit sau nu în contact cu acelaşi antigen. Din acest punct de vedere putem distinge un răspuns imun primar şi un răspuns imun secundar.

1.1. RĂSPUNSUL IMUN PRIMAR Constituie răspunsul organismului la un prim contact cu un antigen, indiferent de

natura agentului. Acest răspuns are amplitudine scăzută şi este redus ca durată şi intensitate.

1.2. RĂSPUNSUL IMUN SECUNDAR Un al doilea contact cu acelaşi antigen determină un răspuns imun secundar, mai

prompt, mai intens şi cu o durată mai mare decât răspunsul primar. Organismul care a venit în contact cu un antigen „ţine minte” aceasta şi ştie să răspundă mai prompt şi mai bine la un nou contact cu acelaşi antigen. Rezultă deci, că antigenele pot induce un fenomen de „memorie imunologică”, care întregeşte caracteristicile fundamentale ale sistemului imun, alături de capacitatea acestuia de a face discriminarea între „self” (propriu organismului) şi „non-self” (străin de economia organismului), ca şi capacitatea de discriminare între antigene diferite.

2. TIPURI DE RĂSPUNS IMUN

Există două tipuri de răspuns imun: umoral şi celular.

2.1. RĂSPUNSUL IMUN UMORAL

Imunitatea umorală intervine prioritar faţă de antigenele unor agenţi infecţioşi

(bacterieni, virali, parazitari) responsabili de infecţii acute, faţă de proteine serice de

altă specie sau alt allotip, faţă de antigenele eritrocitare de heterogrup (reacţiile de

incompatibilitate în sistemul grupelor sanguine ABO sau Rh). Secundar, imunitatea

umorală intervine în reacţia de respingere a grefei, ca şi în boala canceroasă.

Veriga efectorie este reprezentată de proteine specifice, plasmatice sau din

secreţii externe (mucoase, piele), denumite imunoglobuline (Ig) - anticorpi (de clasă:

IgM, IgG, IgA, IgD, IgE) care au capacitatea de a neutraliza antigenul care le-a indus

formarea.

Locul contactului între antigen şi anticorp este la distanţă atât de zona de

pătrundere a agentului (poarta de intrare) cât şi de locul de sinteză al

imunoglobulinelor (Ig).

Testarea răspunsului imun se face prin reacţii antigen-anticorp clasice (de

aglutinare, de precipitare, de seroneutralizare, de fixare a complementului, etc.) şi

moderne (imunofluorescenţă, ELISA, RIA).

2.2. RĂSPUNSUL IMUN CELULAR

Intervenţie prioritară faţă de antigene infecţioase care produc o evoluţie cronică a

bolii, cu tendinţa de cuibărire a germenului în ţesut, marcată de descărcări

periodice în torentul sanguin (tuberculoză, bruceloză, sifilis, lepră), faţă de ţesuturi

străine speciei receptorului (respingerea grefelor), ca şi faţă de celulele tumorale (boli

maligne).

Veriga efectorie este reprezentată de celule specifice - limfocite sensibilizate -

subseturi de limfocite T (limfocitele CD4+Th1 de hipersensibilitate tardivă, limfocite

CD8+ T-citolitice). Aceste celule în contact cu antigenul secretă limfokine (substanţe

solubile secretate de unele celule ale sistemului imun).

Locul contactului între antigen şi anticorp este aproape de poarta de intrare sau în

anumite zone de cantonare preferenţială a antigenului, unde se produce “granulomul”

cu aspect lezional-reactiv (aglomerare de limfocite T şi macrofage).

Testarea răspunsului imun se face prin teste in vivo (intradermoreacţii - IDR - de

tip întârziat) şi teste in vitro (transformarea blastică a limfocitelor T, inhibiţia

migrării macrofagelor, testul de citotoxicitate imună, citometrie în flux).

IMUNOPROFILAXIA INFECŢIILOR

Utilizarea serurilor şi vaccinurilor, alături de chimioterapice, reprezintă o

armă esenţială în profilaxia şi tratamentul unor boli infecţioase.

Profilaxia specifică (imunoprofilaxia) infecţiilor bacteriene poate fi de două

categorii: pasivă (transfer de anticorpi specifici) şi activă (administrare de

vaccinuri).

1. IMUNOPROFILAXIA PASIVĂ (SERURI TERAPEUTICE)

Serurile sunt produse biologice cu un conţinut bogat în anticorpi specifici faţă de

unul sau mai mulţi agenţi patogeni şi se folosesc pentru blocarea procesului infecţios

la subiecţii infectaţi cu agentul patogen respectiv.

Aceste seruri conferă imunitate pasivă (fără participarea sistemului celular

imunocompetent). Imunitatea prin transfer de anticorpi este rapidă (conţine

anticorpi gata formaţi), dar de scurtă durată (10-15 zile pentru serurile heterologe şi

20-30 de zile pentru serurile homologe), timp necesar proteinei străine să se elimine

din organism.

După provenienţă, serurile sunt de două categorii: seruri heterologe şi seruri

omologe.

1.1. ADMINISTRAREA DE ANTICORPI SPECIFICI HETEROLOGI

(SEROPROFILAXIE, SEROTERAPIE)

Serurile heterologe se obţin pe animale (cal, iepure, oaie) hiperimunizate activ cu

diferite vaccinuri şi antitoxine.

Se utilizează în prevenirea unor boli bacteriene care recunosc în mecanismul

patogenic intervenţia prioritară sau exclusivă a exotoxinelor bacteriilor infectante:

tetanos, difterie, gangrenă gazoasă, botulism.

După compoziţie, serurile se clasifică în:

- seruri antibacteriene (ser antimeningococic);- seruri antitoxice (ser antidifteric, antitetanic, antigangrenos, antibotulinic);- seruri mixte: antibacterian + antitoxic (ser anticărbunos).

După scop, serurile se clasifică în seruri administrate profilactic (seroprofilaxie)

şi seruri administrate curativ. De exemplu, la copii contacţi cu un bolnav de difterie

se administrează preventiv ser imun antidifteric. Dar pentru a obţine o imunizare

mai puternică şi durabilă, seroprofilaxia se continuă cu vaccinarea (anatoxină

difterică).

Imunizarea pasivă are caracter de urgenţă în următoarele cazuri:

- protecţia pacienţilor cu a-gamaglobulinemie faţă de infecţiile cu bacterii piogene în condiţii de risc crescut pentru infecţiile respiratorii;

- protecţia persoanelor nevaccinate în condiţii de risc ctrescut pentru tetanos sau pacienţi cu plăgi traumatice, arsuri, avort septic;

- gangrenă gazoasă la pacienţii cu plăgi traumatice;

- terapia unor toxiinfecţii şi intoxicaţii: difterie, tetanos, botulism, muşcătură de şerpi veninoşi.

1.2. ADMINISTRAREA DE GAMAGLOBULINE SPECIFICE HOMOLOGE

Se obţin de la om, fie de la convalescenţi de boli infecţioase (seruri de

convalescent), fie de la persoane imunizate activ, în mod special, şi se numesc seruri

hiperimune. Serurile omologe se folosesc astăzi sub formă de imunoglobuline

(gamaglobuline) specifice, extrase din aceste seruri.

- Imunoglobulinele extrase din amestecuri diferite de plasmă (de la mai mulţi donatori adulţi normali) se numesc imunoglobuline normale sau gamaglobuline normale standard (conţin IgG faţă de microorganismele care infectează majoritatea populaţiei);

- Gamaglobulinele obţinute din seruri de convalescent sau din serul unor voluntari umani hiperimunizaţi cu un anume antigen (prin vaccinare sau administrare de anatoxină) se numesc imunoglobuline umane specifice anti-(ex.: tetanos) sau gamaglobuline umane hiperimune.

Avantajul administrării gamaglobulinelor specifice: număr redus de injecţii; aport

mare de anticorpi care se menţin în organism un timp mai îndelungat (10-14

săptămâni); fără riscul sensibilizării la o eventuală repetare.

Administrarea gamaglobulinelor se face prin injecţii intramusculare şi nu

intravenoase. Introducerea directă în sânge poate determina forme grave de

hipersensibilitate imediată (agregarea trombocitelor, activarea complementului).

2. IMUNOPROFILAXIA ACTIVĂ (VACCINURILE)

Vaccinurile sunt eşantioane de germeni microbieni sau toxine bacteriene,

preparate astfel încât şi-au pierdut capacitatea de a produce boală (patogenitatea), dar

şi-au păstrat capacitatea de a induce răspuns imun (imunogenitatea), deci de a proteja

activ, specific organismul împotriva unei reinfecţii homologe cu germeni patogeni.

Un individ vaccinat, venind în contact cu germenul patogen sau cu toxinele

acestuia, va dezvolta nu un răspuns primar (de mică intensitate, de durată scurtă),

ci un răspuns secundar (intens şi persistent).

2.1. CATEGORII

În funcţie de starea agenţilor patogeni (modul de preparare) şi natura

componentelor antigenice, vaccinurile se pot clasifica în:

· vaccinuri corpusculare preparate din agenţi patogeni vii atenuaţi (microbieni, virali);

· vaccinuri corpusculare preparate din agenţi patogeni omorâţi sau inactivaţi (microbieni, virali);

· vaccinuri preparate din:

- componente microbiene purificate (produse ale metabolismului bacterian);

- fracţiuni sau subunităţi structurale ale microorganismelor (polizaharide capsulare, componente ale peretelui bacterian, subunităţi antigenice virale);

· vaccinuri sintetice;

· vaccinuri clonate sau biosintetice obţinute cu ADN-recombinant.

2.1.1. Vaccinuri corpusculare preparate din agenţi patogeni vii atenuaţi

Majoritatea vaccinurilor vii atenuate sunt vaccinuri virale, cele bacteriene

fiind mai puţine. Aceste vaccinuri complete conţin tulpini bacteriene (sau virale)

selectate pentru nivelul redus şi stabil al virulenţei.

Exemple de vaccinuri vii atenuate sunt prezentate în tabelul 1.

Virusuri Bacterii

Vaccinuri standard Vaccinuri standard

Poliomielitic Mycobacterium

tuberculosis

Rujeolic Salmonella typhi

Rubeolic

oreionului

febrei galbene

hepatitei A

Vaccinuri

experimentale

Vaccinuri experimentale

Gripal Shigella

respirator sinciţial Vibrio cholerae

Rotavirus

Citomegalovirus

Herpesvirus

Varicella

Tabelul 1: Vaccinuri vii atenuate (după Moldovan Roxana, Coşniţă Monica, 1997)

Atenuarea bacteriilor se face prin căldură, mutaganeză chimică (bacil tific),

pasaje timp îndelungat pe medii de cultură (ex.: tulpini de bacil tuberculos bovin

întreţinut timp de 13 ani prin pasaje succesive pe mediu cu cartof glicerinat şi bilă).

Administrarea la persoanele sănătoase produce o infecţie inaparentă, urmată,

după o singură inoculare, de instalarea unei imunităţi mediate umoral (prin anticorpi)

şi/sau celular (limfocite T reactive specifice).

În tabelul 2 sunt prezentate principalele avantajele şi dezavantajele

vaccinurilor preparate din agenţi vii atenuaţi.

Avantaje Dezavantaje- asigură stimularea

concomitentă a imunităţii

mediate celular şi umoral

- reversibilitatea virulenţei

iniţiale după replicarea

îndelungată în organismele

(inclusiv IgA secretor);

- în administrarea orală ®

imunitatea umorală locală

blochează accesul virusului

“sălbatic” la celulele sensibile;

- asigură protecţie de lungă

durată (ani de zile) deoarece

vaccinarea echivalează cu o

infecţie uşoară sau

asimptomatică în cursul căreia

replicarea asigură eliberarea în

organism a unei cantităţi de

determinanţi antigenici cu

structură identică cu cea a

agentului patogen;

- răspunsul imun este divizat

faţă de toate antigenele

microorganismului

- sunt uşor de administrat;

- previn boala naturală.

vaccinate;

- stabilitatea scăzută a

vaccinurilor la temperaturi

ambiante;

- numărul relativ mare de contraindicaţii.

Tabelul 2: Avantajele şi dezavantajele vaccinurilor preparate din agenţi vii atenuaţi (după Moldovan Roxana, Coşniţă Monica, 1997)

2.1.2. Vaccinuri corpusculare preparate din agenţi patogeni omorâţi sau inactivaţi

Sunt suspensii sau produse obţinute din particule bacteriene (sau virale) totale, la

care, prin diverse procedee fizice (căldură, radiaţii UV) sau chimice, s-a neutralizat

infecţiozitatea cu menţinerea proprietăţilor imunogene. Induc un răspuns imun mediat

umoral (anticorpi).

Exemple:

vaccinul antitifoidic (TAB); vaccinul antiholeric; vaccinul antipertussis; vaccinul anti-E. coli (experimental); vaccinul anti-Yersinia pestis.

Principalele avantaje şi dezavantaje ale vaccinurilor preparate din agenţi

infecţioşi omorâţi sunt prezentate în tabelul 3.

Avantaje Dezavantaje

- stabilitatea mare care

nu permite reversia

virulenţei;

- stabilitate antigenică;

- stabilitate la

temperatura uzuală.

- induc imunitate de durată mai

scurtă ® rapeluri numeroase;

- absenţa stimulării proceselor

imunitare locale la nivelul

mucoaselor (IgA secretor) ® riscul

ca la vaccinaţi să se producă o

colonizare a mucoaselor cu

multiplicare locală a agenţilor

imunizanţi urmată de diseminarea

şi transmiterea lor.

Tabelul 3: Avantajele şi dezavantajele vaccinurilor preparate din agenţi

infecţioşi omorâţi (după Moldovan Roxana, Coşniţă Monica, 1997)

2.1.3. Vaccinuri preparate din componente microbiene

a. Anatoxine

Anatoxinele sunt produse microbiene purificate. Se obţin din toxine bacteriene

(tetanică, difterică, clostridiilor gangrenei gazoase, stafilococică) detoxifiate prin

învechirea la căldură cu formol 4%.

Administrarea anatoxinelor este însoţită de apariţia în organismul omului

vaccinat a anticorpilor antitoxici, protectori împotriva infecţiei cu germeni secretori

de exotoxine cu specificitate similară anatoxinei vaccinante.

Cele mai eficiente anatoxine utilizate în vaccinare sunt anatoxina difterică şi

tetanică. Formează, împreună cu Bordetella pertussis inactivat, un trivaccin Di-Te-

Per. O altă anatoxină este cea preparată din neurotoxina secretată de Clostridium

botulinum.

b. Vaccinuri preparate din fracţiuni sau subunităţi structurale ale microorganismelor

Sunt preparate vaccinale constituite din componenţi structurali care sunt

responsabili de răspunsul imun: polizaharide capsulare, componente ale peretelui

bacterian, subunităţi antigenice virale.

Avantajele constau în eliminarea reacţiilor postvaccinale iar dezavantajele în

obţinerea unei imunităţi celulare slabe, cu necesitatea asocierii de adjuvanţi.

2.1.4. Vaccinuri sintetice

Se obţin prin sinteza in vitro a fracţiunilor polipeptidice care reprezintă antigenele

vaccinante ale unor microorganisme. Pentru a deveni antigene complete, fracţiunile

sintetice trebuie cuplate cu un carrier. Aceste vaccinuri sunt încă obiect de studiu

experimental.

2.1.5. Vaccinuri obţinute cu AND-recombinant (vaccinuri clonate sau biosintetice)

Sunt preparate în scopul obţinerii de fracţiuni antigenice imunogene purificate a

căror administrare să excludă reacţiile adverse şi complicaţiile postvaccinale.

Prin tehnica ADN-recombinant, genele care codifică proteinele (antigenele)

componente ale vaccinului sunt selecţionate, izolate şi introduse în genomul unei

celule vector: bacterie (E. coli), levură (Saccharomices cerevisiae) sau celule de

mamifere capabile apoi să le sintetizeze în cantităţi industriale.

În raport cu numărul antigenelor înrudite sau diferite în acelaşi preparat,

vaccinurile pot fi:

- vaccinuri monovalente care provin de la o singură specie bacteriană sau virală

(toate vaccinurile);

- vaccinuri asociate care reprezintă o asociere a vaccinurilor împotriva mai multor

boli, asociere care trebuie să asigure eficacitatea fiecăruia dintre vaccinuri, iar

reacţiile adverse să nu fie mai frecvente şi mai grave decât cele cunoscute pentru

fiecare vaccin în parte. Exemple: vaccinul antidiftero-tetanic (vaccin bivalent),

diftero-tetano-pertussis (vaccin trivalent), antimeningococic (tetravalent).

2.2. INDICAŢII DE VACCINARE

Aceste indicaţii pot fi: generale, selective şi elective.

Vaccinările generale vizează toată populaţia infantilă sau adultă în raport cu un

program de vaccinare stabilit în funcţie de gravitatea şi prevalenţa într-o anumită

ţară a unor infecţii. Astfel, în România, vaccinările anti-tetanică, anti-difterică, anti-

tuberculoasă, anti-pertussis şi anti-poliomielitică sunt obligatorii.

Vaccinările selective vizează grupe de populaţii cu risc crescut la o infecţie (anti-

pneumococică, anti-meningococică, anti-gripală în colectivităţi).

Vaccinările elective vizează pacienţii la care anumite infecţii sunt mai frecvente şi mai

grave decât în populaţia generală (vaccinul anti-pseudomonas la pacienţii arşi,

vaccinul anti-gripal la pacienţi cu afecţiuni respiratorii cronice, la cei cu diabet

zaharat).

2.3. CALEA DE ADMINISTRARE A VACCINURILOR

Calea de administrare este în general parenterală, deci fără producerea de

anticorpi IgA secretori. Se impune, atunci când bariera imună a mucoaselor este

esenţială pentru o protecţie bună, administrarea vaccinurilor atenuate pe cale orală,

pentru a stimula producerea de IgA secretor.

2.4. COMPLICAŢIILE VACCINURILOR

Aceste complicaţii constau din: inducerea bolii infecţioase şi diverse accidente

alergice.

- Boala infecţioasă poate fi indusă prin vaccinuri vii (tulpini bacteriene sau virusuri

atenuate) la persoanele cu deficienţe ale apărării imune.

- Accidentele alergice (reacţii anafilactice) se pot datora impurităţilor antigenice

provenite din substratul pe care se cultivă tulpina vaccinantă.

2.5. CONTRAINDICAŢIILE VACCINURILOR

Pot fi temporare şi definitive. Din categoria celor temporare fac parte:

sarcina, boli febrile acute. Cele definitive se referă la pacienţii cu imunodeficienţe şi

pacienţii hipersensibilizaţi la antigenele vaccinante.

MICROBIOLOGIE ECOLOGICĂ

1. DEFINIREA TERMENILOR

Microbiocenoza reprezintă ansamblul speciilor de microorganisme, dintr-un

anumit ecosistem (nişă ecologică).

Ecosistemul (nişa ecologică) este zona din macroorganism (cavitate naturală, piele etc.) care asigură dezvoltarea unei microbiocenoze.

Microbiota defineşte totalitatea microbiocenozelor din organism, cu interrelaţiile dintre ele.

Flora bacteriană dintr-o nişă bacteriană poate fi clasificată după două criterii: adaptabilitatea la condiţiile nişei ecologice şi potenţialul de a determina boala.

După adaptabilitatea la condiţiile nişei ecologice

Flora rezidentă: microorganisme bine adaptate la condiţiile ecosistemului, constantă şi caracteristică sistemului; Flora flotantă: specii de microorganisme neadaptate, sau puţin adaptate, cu timp de persistenţă variabil în cadrul unui ecosistem.

După potenţialul de a determina boala

Din punct de vedere al patogenităţii, microorganismele nu se pot clasifica rigid, deoarece în anumite condiţii acelaşi microorganism stabileşte relaţii diferite cu gazda umană.

Flora saprafită (“normală” sau “indigenă”): speciile nepatogene care populează în mod normal diferitele ecosisteme ale organismului.

Flora patogenă: este alcătuită din microorganisme patogene, care nu se găsesc în mod normal în ecosistemele organismului. Ele pot determina tulburarea echilibrului ecologic al nişei, cu apariţia unei boli cu manifestări clinice caracteristice, uneori cu penetraţie mare în populaţie (Salmonella Typhi, Yersinia pestis etc.), sau pot determina îmbolnăviri cu consecinţe grave (Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum).

Flora condiţionat patogenă: specii şi tulpini saprofite, din flora indigenă a ecosistemului, care, în anumite condiţii favorizante (scăderea rezistenţei antiinfecţioase a organismului, stress, viroze, tratament imunosupresiv, SIDA, etc.), ca şi în cazul în care colonizează zone anatomice sterile (apariţia de septicemii şi meningite), pot determina boala. Datorită existenţei patogenităţii condiţionate, termenul de floră “normală” tinde să fie înlocuit, cu cel de floră “indigenă”, termen care implică posibilitatea ca din această floră să se selecteze indivizi bacterieni condiţionat patogeni.

Flora accidental patogenă provine din flora comensală a organismului, dar necesită condiţii deosebite de înmulţire, chiar dacă pătrunde în zone anatomice sterile. Astfel, streptococii viridans se găsesc în mod normal în faringe şi ajung în circulaţie după extracţii dentare. La omul sănătos, mecanismele rezistenţei naturale antiinfecţioase înlătură streptococii în câteva ore de la pătrunderea lor în sânge, pe când la cei cu vicii

valvulare, la care există depozite de fibrină pe endocard, streptococii se vor înmulţi producând endocardita lentă malignă. Un alt exemplu, este cel al tulpinilor de Staphilococcus epidermidis, principalul comensal al pielii, care explică eşecurile din chirurgia ortopedică şi cardiacă datorită pătrunderii în circulaţie, în timpul actului operator.

Flora condiţionat patogenă şi cea accidental patogenă alcătuiesc flora oportunistă, care profită în orice împrejurare de vulnerabilitatea gazdei umane.

Ponderea germenilor în etiologia infecţiilor s-a modificat de-a lungul timpului. Până la descoperirea rolului microbilor în producerea acestora, patologia infecţioasă a fost dominată de bacteriile înalt patogene. Introducerea metodelor de antisepsie şi asepsie, a profilaxiei specifice prin vaccinare şi seroterapie a bolilor infecţioase, a scăzut mult incidenţa infecţiilor. După descoperirea antibioticelor problema infecţiilor părea rezolvată, însă la scurt timp după introducerea lor în tratamentul infecţiilor, s-a remarcat apariţia tulpinilor bacteriene rezistente. În consecinţă, etiologia infecţiilor a început să fie, şi mai este şi astăzi, dominată de flora condiţionat patogenă.Cu timpul, microbiologia clinică a fost pusă faţă în faţă cu o nouă problemă, legată de diagnosticul microbiologic al infecţiilor care apar la bolnavii cu SIDA. Înfecţiile, la aceşti bolnavi cu imunitatea compromisă, sunt produse de microorganisme condiţionat patogene, accidental patogene şi uneori chiar şi de microorganisme care până în prezent nu au fost deloc izolate (sau foarte rar) în infecţii.

2. INTERRELAŢII ÎNTRE MICROORGANISMELE DINTR-O NIŞĂ ECOLOGICĂ

Între microorganismele dintr-o nişă ecologică se stabilesc relaţii care pot influenţa gazda umană. Relaţiile ce se stabilesc între microorganisme sunt: neutralism, comensalism, simbioză, sinergism, parazitism, antagonism.

RELAŢII DE INDIFERENŢĂ (NEUTRALISM), în care speciile se tolerează reciproc. În acest tip de relaţie, speciile trebuie să fie îndeajuns de depărtate din punct de vedere taxonomic şi să aibe necesităţi nutritive diferite (să nu intre în competiţie pentru acelaşi substrat nutritiv sau energetic). Acest tip de relaţie influenţează mai puţin gazda umană.

RELAŢII DE COMENSALISM, în care un microorganism are nevoie de un altul, fără ca fenomenul să fie valabil şi invers. De pildă, Haemophilus influenzae are nevoie pentru creştere şi multiplicare de factor V, factor pe care îl secretă Staphylococcus aureus. Aplicaţia practică a acestui raport dintre cele două specii se folosea în trecut pentru izolarea Haemophilus influenzae dintr-un produs patologic în care se bănuia prezenţa lui, prin însămânţarea în striu transversal a unei tulpini de Staphylococcus aureus. Coloniile de Haemophilus se dezvoltă doar în jurul culturii de stafilococ. Acest fenomen se numeşte satelitism. Alt exemplu este constituit din cultivarea împreună a bacteriilor aerobe şi anaerobe. Bacteriile aerobe consumă oxigenul molecular cu scăderea potenţialului de oxidoreducere din mediu, ceea ce permite dezvoltarea populaţiei anaerobe asociate.

SIMBIOZA constă în asocierea a două specii care se favorizează reciproc. Astfel, aciditatea produsă de bacilii lactici favorizează dezvoltarea levurilor, care consumă la rândul lor acidul lactic. Scăderea acidităţii permite dezvoltarea bacililor lactici.

SINERGISMUL este o relaţie între microorganisme, frecvent dăunătoare organismului. Astfel, unele bacterii fuziforme (Fusobacterium) şi spiralate (Treponema vincenti) nu sunt patogene separat, dar atunci când se regăsesc împreună în faringe, sunt cauza unei faringite ulceronecrotice denumită şi angina fuzospiralară a lui Plaut-Vincent. Alt exemplu este prezenţa concomitentă, într-o plagă, a florei aerobe şi anaerobe. Flora aerobă consumă oxigenul creând astfel condiţii optime dezvoltării florei anaerobe.

PARAZITISMUL constă în folosirea unei specii de către o altă specie ca habitat. Există multe forme de parazitism între microorganisme, dar din punct de vedere medical importante sunt virusurile care parazitează bacteriile - bacteriofagii. Prin relaţiile care se stabilesc între bacteriofagi şi celulele parazitate se pot răspândi diverse caractere, dintre care de interes medical, sunt cele legate de patogenitatea şi rezistenţa la antibiotice ale bacteriilor. Exemplu: în relaţiile fag-bacterie de tip simbiotic, când „infecţia” cu un bacteriofag temperat a unei bacterii din aceeaşi nişă ecologică, conferă acesteia proprietăţi noi (tulpinele de Corynebacterium diphteriae devin toxigene prin lizogenizare cu fagi specifici; streptococii betahemolitici lizogeni secretă toxina eritrogenă etc).

ANTAGONISMUL se defineşte prin efectul inhibitor pe care un microorganism îl are asupra dezvoltării şi multiplicării altui microorganism. Este cea frecventă relaţie întâlnită între microorganismele aceleiaşi nişe ecologice. Într-o asemenea interrelaţie, specia care învinge se numeşte antagonistă, iar specia sau speciile stânjenite în dezvoltare se numesc concurente. Se deosebesc trei tipuri de antagonism: antagonism prin diferenţă de vitalitate care se datorează vitezei de multiplicare mai mare a unei specii decât a speciei concurate, diferenţe de echipament enzimatic etc.

antagonism nespecific care este determinat de eliberarea în mediu a unor substanţe toxice, neselective ca, de pildă, acizi, alcooli etc.

antagonism specific ce se datorează elaborării unor substanţe mai puţin toxice asupra organismului, dar nocive pentru alte specii microbiene. Aceste substanţe sunt antibioticele, care constituie baza terapiei antiinfecţioase şi bacteriocinele (substanţe specifice proteice, cu activitate antibacteriană cu spectru îngust, secretate de unele bacterii - E. coli, Pseudomonas aeruginosa, care acţionează asupra indivizilor aceleiaşi specii sau a speciilor înrudite).

Există numeroase exemple de antagonism bacterian: între bacteriile aerobe sporulate (Bacillus anthracis, Bacillus mycoides); între Pseudomonas aeruginosa şi Bacillus anthracis; între speciile nepatogene şi cele patogene (speciile nepatogene, mai adaptabile, inhibă de obicei pe cele patogene). Exemple: streptococii alfa-hemolitici (viridans) inhibă în faringe dezvoltarea Corynebacterium diphteriae; Escherichia coli nepatogen inhibă în intestin speciile patogene de Enterobacteriaceae (E. Coli patogen, Shigella, Salmonella etc.).

Relaţiile de antagonism pot însă să se manifeste uneori în dauna florei saprofite şi în favoarea celei patogene. Astfel, Staphilococcus aureus patogen este antagoist puternic faţă de E. Coli nepatogen. Aşa se explică de ce tratamentul abuziv cu antibiotice cu spectru larg (tetracicline), pe cale orală, neasociat cu administrarea de complex vitaminic B, prin inhibiţia parţială a florei de E. Coli din intestin, favorizează apariţia unei enterite stafilococice foarte grave - disbacterie - (tulburarea echilibrului florei intestinale indigene, cu diminuarea rolului fiziologic antagonist al acestei flore faţă de flora patogenă sau condiţionat patogenă).

Antagonismul bacterian normal poate fi tulburat şi în alte cazuri de tratamentul neraţional cu chimioterapice. De pildă, tratamentul îndelungat cu penicilină duce la dispariţia streptococilor alfa-hemolitici (viridans) din nazofaringe, cu înlocuirea lor de flora Gram negativă.

Există şi forme de antagonism între bacterii şi virusuri, cum este, pe de o parte, între bacterii şi bacteriofagi, iar pe de altă parte, între bacteriile dintr-o nişă ecologică şi virusurile care o populează ocazional sau datorită vaccinării orale (exemplu: relaţiile care se stabilesc în intestin, între enterobacterii: nepatogene, patogene şi enterovirusuri).

3. INTERRELAŢII MICROORGANISM - MACROORGANISM Între organismul uman şi microorganisme se stabilesc relaţii foarte variate, dintre

care unele îi sunt dăunătoare iar altele benefice. Astfel, între macroorganism şi

microorganisme (bacterii, virusuri, fungi, protozoare), se stabilesc relaţii care pot fi de

comensalism, mutualism şi parazitism.

COMENSALISMUL este o asociaţie în care un microorganism foloseşte ca mediu de viaţă un alt organism fără să-l prejudicieze. Omul este gazda unei flore comensale foarte bogate - flora normală, prezentă pe piele, mucoase, tract digestiv, etc. Microorganismele trăiesc şi se nutresc în strânsă relaţie cu gazda, dar nu pe seama ţesuturilor acesteia, ceea ce nu antrenează urmări vizibile pentru macroorganism. Exemplu: bacteriile florei indigene a pielii care se hrănesc cu detritusuri organice de pe suprafaţa tegumentelor.

MUTUALISMUL (TOLERANŢĂ MUTUALĂ) este o relaţie care se stabileşte în beneficiul ambilor parteneri ai asociaţiei. De exemplu, între bacilii lactici şi gazda umană există un beneficiu reciproc: vaginul oferă condiţii de viaţă bacililor lactici, iar aceştia, la rândul lor, acidifică mediul împiedicând dezvoltarea altor microorganisme. Alt exemplu, este constituit din bacteriile florei indigene intestinale, care produc fenomenele fiziologice de fermentaţie şi putrefacţie, ca şi sinteza unor vitamine.

PARAZITISMUL este o relaţie care se stabileşte în mod cert în beneficiul microorganismului şi în detrimentul gazdei umane. Din această categorie fac parte microorganismele patogene.

Însă acestor tipuri de relaţii nu le corespund grupe taxonomice fixe de microorganisme, deoarece relaţiile care se stabilesc depind în egală măsură de gazda umană. Astfel, în anumite condiţii, relaţia de comensalism sau mutualism poate să se transforme într-o relaţie de parazitism cu efecte nefavorabile asupra gazdei.

“OPORTUNISMUL”. Unele microorganisme nu sunt capabile să producă boala la gazdă, în condiţii normale dar, odată cu apariţia unor schimbări în circumstanţele ecologice ale mediului intern sau extern (surmenaj, subnutriţie, tumori comsumptive, infecţii intercurente etc.) determină infecţii grave şi chiar mortale. De exemplu, la nou-născuţi, pot apare infecţii grave cu E. coli (tulpini condiţionat patogene). De asemenea, flora indigenă fusospirilară a cavităţii bucale (Borrelia vincenti, Fusobacterium fusiformis), în anumite condiţii de scădere a rezistenţei organismului, poate provoca stomatite, angine sau faringite ulceromembranoase. Un alt exemplu din această categorie îl oferă fungii (în special levurile, de tipul Candida albicans), care în cazuri de diabet zaharat, tumori ale ţesutului limfoid, leucemii, provoacă infecţii grave, locale sau viscerale, mortale.

Relativ la tipul de relaţie “oportunism”, trebuie avută în vedere posibilitatea exacerbării florei bacteriene indigene, în condiţiile tratamentului intensiv (şi uneori abuziv) cu corticosteroizi, tratament care diminuă rezistenţa nespecifică şi specifică a macroorganismului.

Cel mai pregnant exemplu de infecţie oportunistică îl oferă infecţia cu virus HIV.

4. FLORA NORMALĂ (INDIGENĂ) A ORGANISMULUIÎn timpul vieţii intrauterine, organismul este steril, fiind ferit de microorganisme

atât prin membranele fetale, cât şi prin placentă, care este impermeabilă pentru majoritatea lor, cu excepţia unor virusuri (virusul rubeolic, citomegalic, etc.), bacterii (Treponema pallidum) şi paraziţi (Toxoplasma gondi). Prima întâlnire a organismului uman cu microorganismele mediului înconjurător se produce în momentul naşterii, când fătul vine în contact cu flora vaginală şi cutanată a mamei.

După naştere, organismul este supus unei contaminări continue. Flora normală a organismului este prezentă imediat după naştere şi este constituită din specii comensale. Ea colonizează mucoasele şi tegumentele copilului, fiind supusă anumitor variaţii până când se stabileşte un raport numeric echilibrat între bcterii şi fungi. Se constituie, astfel, o ,,barieră biologică” care, prin concurenţă microbiană se opune la pătrunderea altor specii patogene în organism. Fiecare mucoasă (cavitatea bucală, mucoasa rinofaringiană, intestinală, vaginală) prezintă o floră variată, cu anumite particularităţi.

În general, organismul uman este populat de foarte multe specii bacteriene şi de un număr mai mic de virusuri, fungi şi protozoare.

Flora normală a organismului depinde de o serie de factori, cum sunt: vârsta, regimul alimentar, statusul hormonal, starea de sănătate, condiţiile de igienă colectivă şi personală. Este foarte dificilă definirea exactă a speciilor care alcătuiesc flora normală, deoarece o serie de specii patogene pot fi şi ele prezente temporar pe tegumente şi mucoase, fără să producă îmbolnăviri. De exemplu, pneumococul şi meningococul sunt bacterii patogene, fiind cauza unor infecţii foarte grave. Totuşi ele se găsesc la aproximativ 10% din populaţia sănătoasă.

Zonele organismului populate în mod normal cu microorganisme sunt: pielea, tractul respirator superior (vestibul nazal, faringe), tubul digestiv (cavitatea bucală şi intestinul gros), tractul urinar (partea anterioară a uretrei) şi vaginul.

În afară de aceste zone, microorganisme mai pot apărea în număr mic şi în mod pasager în restul tractului respirator, digestiv şi în uter, fiind rapid îndepărtate de mijloacele de apărare ale organismului. Sângele, lichidul cefalorahidian, lichidele sinoviale, din seroase, ţesuturile profunde sunt sterile. Prezenţa microbilor în aceste zone are întotdeauna o semnificaţie patologică.

4.1. FLORA NORMALĂ A PIELII

Pe tegumente există o floră rezidentă, situată în straturile profunde, de obicei constantă şi una superficială, flotantă.

Pielea este populată de multe specii bacteriene, densitatea acestora fiind mai mare în zonele umede (axila, zona perineală, zonele interdigitale). Specia cel mai des întâlnită, care reprezintă 90% din flora cutanată aerobă este Staphilococcus epidermidis. În regiunile umede se poate întâlni şi S. aureus. În afară de speciile menţionate, pe piele se mai găsesc bacili difteromorfi anaerobi, ca, de pildă, Propionibacterium acnes (în foliculii piloşi, transpiraţie, glandele sebacee) care se înmulţesc mai ales la pubertate, producând acneea juvenilă. La 20% din populaţie se izolează de pe piele Clostridium perfringens. În mod pasager se evidenţiază în patul periunghial şi pe scalp specii de Candida.

O menţiune specială trebuie să facem pentru prezenţa bacteriilor patogene şi condiţionat patogene pe tegumentele şi mucoasele farmacistului. Ele pot constitui o importanţă sursă de contaminare a medicamentelor pe care acesta le prepară sau le mânuieşte.

4.2. FLORA NORMALĂ A CAVITĂŢII BUCALE ŞI A VESTIBULUI NAZAL

Speciile ce colonizează aceste zone sunt, în general, streptococi, stafilococi, bacili difteromorfi, coci Gram negativi şi mai rar ciuperci. Unele din aceste specii sunt condiţionat patogene (Str. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Candida).

Densitatea florei microbiene în cavitatea bucală este foarte mare, mai ales la nivelul suprafeţei dinţilor şi şanţurilor gingivale, care sunt sediul unei bogate flore anaerobe. Dacă igiena cavităţii bucale este deficitară, sub acţiunea unor specii ca Streptococcus mutans, se produc cariile dentare. S-a constatat că numărul de Str. mutans creşte în timpul producerii cariilor şi scade după tratarea acestora.

Flora faringiană este reprezentată de streptococi viridans şi ocazional de streptococi beta-hemolitici (specie patogenă), la care se adaugă difteromorfi, neisserii hemolitice, stafilococi, etc.

Tractul respirator inferior este steril, dar s-a izolat din plămânul persoanelor sănătoase Pneumocistis carinii. Acest parazit nu are semnificaţie patologică la aceste persoane, dar poate da pneumonii grave la persoanele imunocompromise, cum sunt bolnavii de SIDA.

4.3. FLORA NORMALĂ A TUBULUI DIGESTIV

Stomacul conţine doar ocazional floră bacteriană acidotolerantă (unii lactobacili şi streptococi) dată fiind aciditatea gastrică pronunţată. Frecvent se izolează de pe mucoasa gastrică Helicobacter pylori, care ar putea constitui cauza unor gastrite şi a ulcerului duodenal. La persoanele la care se administrează o medicaţie ce schimbă pH-ul gastric, flora normală suferă modificări.

Partea incipientă a intestinului subţire conţine un număr redus de microbi, care creşte vertiginos spre ileon unde se vor găsi streptococi, lactobacili, enterobacterii, specii de Bacteroides, etc.

Intestinul gros este cea mai populată zonă cu microbi a organismului. Aici, peste 90% din floră este anaerobă, reprezentată mai ales de bacili aparţinând genului Bacteroides, însoţită de enterobacterii care sunt facultativ anaerobe, la care se adaugă protozoare nepatogene, ca, de pildă Entamoeba coli. Tratamentul cu antibiotice alterează rapid echilibrul care se stabileşte între aceste specii cu înmulţirea consecutivă a unor specii mai rezistente la antibiotice cum sunt Clostridium difficile, specii din genul Enterococcus şi Pseudomonas care pot produce diaree cu posibilităţi de evoluţie spre colită pseudomembranoasă.

4.4. FLORA NORMALĂ A TRACTULUI UROGENITALUretra anterioară este populată la ambele sexe cu floră asemănătoare celei de pe

piele: S. epidermidis, Enterococcus faecalis, difteromorfi etc.

Flora vaginală variază în funcţie de vârstă. Astfel, până la pubertate flora vaginală

conţine specii prezente pe piele, iar după pubertate până la menopauză, vaginul este

populat cu o varietate foarte mare de bacterii, predominante fiind speciile de

Lactobacillus (bacili Doderlein).

Bacilii Doderlein, indicatori ai ciclurilor endocrine normale, sunt bacili Gram

pozitivi care se dezvoltă numai la pH acid (pH-ul normal al vaginului). La fetiţele nou-

născute, bacilul apare repede în vagin, datorită fermentării glicogenului din mucoasa

vaginală (rămas din circulaţia maternă), cu scăderea concomitentă a pH-ului local. După

consumarea rezervei de glicogen de provenienţă maternă, pH-ul vaginal creşte şi bacilul

Doderlein, nemaigăsind condiţii prielnice, dispare, fiind înlocuit de o floră mixtă

(streptococi de grup D - enterococi, difteromorfi, stafilococi coagulazo-negativi,

Neisserii banale). La pubertate, odată cu apariţia ciclului menstrual, glicogenul reapare

în celulele epiteliului mucoasei vaginale. Se crează din nou condiţii de fermentare a

glicogenului, cu scăderea pH-ului, ceea ce duce la repopularea vaginului cu bacilul

Doderlein, reprezentând, deci, o reflectare fidelă a pH-ului normal vaginal al femei, în tot

cursul vieţii sexuale normale. În perioada climaxului, pH-ul vaginal creşte din nou, ceea

ce provoacă dispariţia bacilului Doderlein.

5. ROLUL FLOREI NORMALE A ORGANISMULUIFlora normală joacă un rol important în menţinerea stării de sănătate, cât şi în

producerea unor infecţii. Astfel:

este un factor important în apărarea antiinfecţioasă naturală, stimulând atât fagocitoza, cât şi unii factori umorali (complement, betalizine);

este, de asemenea, un important factor în apărarea specifică (imună). Flora indigenă acţionează atât la nivelul apărării sistemice (induce sinteza de anticorpi naturali, la un nivel coborât, dar eficient, datorită stimulării antigenice continue), cât şi la nivelul apărării locale (anticorpi IgA secretori la suprafaţa mucoaselor, cu rol de “ecran” împotriva infecţiilor cu germeni patogeni);

flora normală deprimă înmulţirea florei patogene prin mecanisme competitive pentru un anumit substrat nutritiv, pentru aceiaşi receptori celulari şi producerea de bacteriocine.

contribuie la nutriţia şi metabolismul organismului;

- sintetizează (specii de Bacteroides şi E. coli) şi secretă în intestin unele vitamine, cum sunt vitamina K şi vitamine din grupul B;

- intervine în circuitul hepato-entero-hepatic al unor substanţe cum sunt hormonii steroizi şi sărurile biliare. Aceste substanţe sunt excretate în intestin prin bilă sub forma conjugată de glucuronide sau sulfaţi. Ele nu pot fi reabsorbite decât după deconjugare care se petrece sub acţiunea glucuronidazelor şi sulfatazelor secretate de flora bacteriană.

constituie sursa majorităţii infecţiilor oportuniste.

Medicul practician întâlneşte mai frecvent infecţii produse de microorganisme ce fac parte din “flora normală” decât infecţii produse de flora patogenă provenită din mediul extern al organismului. Astfel, speciile de Bacteroides, de pildă, rezidente ale intestinului gros, produc abcese dacă pătrund în zone sterile ale organismului. Staphilococcus epidermidis, cea mai importantă specie a florei normale a pielii, are proprietatea de a se ataşa în mod nespecific de catetere de plastic, producând septicemii. De asemenea, E. coli, prezent în flora intestinală este cel mai frecvent agent etiologic al

infecţiilor urinare. Aceste infecţii cu germeni comensali şi condiţionat patogeni sunt favorizate, după cum am văzut mai sus, de administrarea necontrolată a antibioticelor.

RECOLTAREA ŞI PRELUCRAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

RECOLTAREA PROBELOR PENTRU EXAMENUL MICROBIOLOGIC

Diagnosticul bolilor infecţioase, controlul sterilităţii diverselor produse biologice şi farmaceutice, controlul microbiologic al aerului, apei, alimentelor, obiective de bază ale laboratoarelor de microbiologie, necesită recoltarea de produse adecvate.

Materialele respective sunt eşantioane în care se bănuieşte prezenţa unor microorganisme. Ele pot fi produse normale, cu unele modificări în caz de boală (sânge, fecale, lichid cefalorahidian-LCR), sau produse care apar numai în urma îmbolnăvirii (puroi, spută, lichid peritoneal, lichid articular).

Probele provin de la bolnav, convalescenţi, purtători (personal medical, angajaţi din sectorul alimentar, din farmacii şi industria farmaceutică), cadavre. Se pot analiza, de asemenea, medicamente, probe de aer, apă, sol, alimente şi alte materiale.

1. REGULI GENERALE DE RECOLTARE Pentru fiecare boală infecţioasă se recoltează produsele patologice cele mai reprezentative (cunoscând poarta de intrare, căile de răspândire şi eliminare, etc.). Se utilizează tehnica corectă de prelevare, ţinându-se cont de momentul cel mai potrivit (peroiada bolii, de preferinţă înainte de tratamentul cu antibiotice sau/şi antiseptice) şi se recoltează cantitatea necesară, pentru fiecare produs în parte. Operaţiunea de recoltare trebuie efectuată steril (instrumentar, recipiente curate şi sterilizate fără urme de antiseptice), aplicând cu rigurozitate metodele de asepsie şi antisepsie. Trebuie asigurată menţinerea sterilităţii din momentul recoltării până la identificarea agentului patogen. Produsul se etichetează corespunzător şi este însoţit de un bilet care cuprinde următoarele date: numele şi prenumele, vârsta, domiciliul, data şi locul recoltării, natura produsului, examinările cerute, diagnosticul prezumtiv, specificarea dacă a fost tratat cu chimioterapice, numele persoanei care a recoltat. Materialele trebuie ferite de contaminare sau denaturare în timpul transportului şi manipulării, printr-o ambalare corespunzătoare, în sticle bine închise, cu dop de cauciuc sau plută, protejate de cutii de lemn sau metal. Dacă se expediază la distanţă se menţionează “material infecţios”, uneori prin curier special. Transportul trebuie realizat cât mai rapid, pentru că orice întârziere scade posibilitatea evidenţierii microorganismelor iniţial prezente şi permite înmulţirea celor contaminante. Trebuie respectate şi condiţiile de temperatură: uneori este indicată temperatura corpului uman (meningococ, gonococ), alteori temperaturi scăzute, realizate în recipiente de gheaţă (mai ales virusuri). Pentru transportul la distanţă se utilizează medii lichide conservante sau medii speciale de transport. Însămânţarea se face pe medii adecvate, cât mai repede după recoltare, dacă este posibil chiar la patul bolnavului.

2. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE: BOLNAVI SAU PURTĂTORI2.1. Recoltarea produselor normal contaminatea. Secreţia faringiană

Se recoltează cu tamponul de exudat faringian steril. Indicaţii: pentru diagnosticul faringitelor şi anginelor streptococice, pentru

confirmarea diagnosticului de difterie, pentru diagnosticul bacteriologic al altor angine bacteriene, fungice, virale, pentru depistarea stării de purtător de Steptococcus pyogenes şi de Corynebacterium diphteriae.

Materiale necesare: tampoane de uz general (figura 1), apăsător de limbă, sursă de lumină, mască (pentru protecţia celui ce recoltează).

Tehnica de recoltare: Se aşează pacientul pe scaun cu faţa spre lumină, gâtul în uşoară extensie şi ceafa sprijinită de perete. În condiţii de iluminare adecvată, după deschiderea largă a gurii, se deprimă baza limbii cu apăsătorul steril şi, în timp ce pacientul pronunţă litera A, se şterg cu tamponul ferm, dar nu brutal, amigdalele şi perele posterior al faringelui, vizând în special orice zonă inflamată, ulcerată, cu depozite purulente sau cu false membrane. Când există false mambrane, acestea se detaşează de la periferie, iar mucoasa subjacentă trebuie tamponată.

Atât la introducerea, cât şi la scoaterea tamponului din faringe nu trebuie să se atingă baza limbii sau palatul moale.

După recoltare, taponul se rintroduce în tubul protector etichetat cu numele şi prenumele pacientului, denumirea produsului recoltat, secţia de unde provine, data şi ora recoltării.

Recoltarea se face dimineaţa, fiind interzise gargarismele cu antiseptice, spălarea dinţilor sau alimentaţia sau la 3-4 ore interval de la toaleta gurii ori ingestia de alimente.

Prelucrarea probei trebuie să se facă în interval de maximum 3 ore de la recoltare. Dacă acest interval nu poate fi respectat, se impune fie imersia şi transportul tamponului în bulion de conservare-îmbogăţire, fie transportul probei uscate pe dreptunghi de hârtie de filtru.

Figura 1: Tampon de uz general

b. Secreţia nazală sau nazo-faringiană Se prelevă cu tamponul, cel mai uşor per-nazal. Analiza de laborator se numeşte:

exudat nazal, respectiv, exudat nazo-faringian.

Exudatul nazo-faringianIndicaţii. Efectuarea exudatului nazo-faringian se recomandă pentru: diagnosticul

tusei convulsive, diagnosticul infecţiilor cu Mycoplasma pneumoniae şi Chlamydia, diagnosticul virozelor respiratorii, depistarea stării de purtător pentru Streptococcus pyogenes, bacili difterici, meningococi, Bordetella pertussis.

Materiale necesare: tampoane confecţionate pe aplicator de sârmă crom-nichel de 20 cm lungime şi 1 mm diametru, cu una din extremităţi îndoită, sursă de lumină, mască (pentru protecţia celui ce recoltează).

Tehnica de recoltare: Se aşează pacientul pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină şi ceafa sprijinită de perete pentru imobilizarea capului. Se introduce blând tamponul printr-o nară, în lungul planşeului nazal, până atinge peretele poterior al nazo-faringelui. Se lasă tamponul pe loc câteva secunde , apoi se roteşte pentru a se încărca cu exudat şi se retrage. Cantitatea de prelevat creşte dacă tamponul se retrage puţin şi se reinseră în aceeaşi poziţie (prima tamponare stimulează secreţia de mucus nazo-faringian).

La sugari este indicat aspiratul nazo-faringian pe cale per-nazală. Acesta se recoltează cu o sondă Nélaton introdusă printr-o nară şi adaptată la o seringă etanşă de 20 ml.

Exudatul nazal Indicaţii: se recomandă pentru diagnosticul unor viroze respiratorii sau pentru

depistarea stării de purtător de Staphylococcus aureus sau Streptococcus pyogenes.Recoltarea se face cu tamponul nazal.Tehnică: se şterge, pe rând, vestibulul foselor nazale cu tamponul de uz general,

umectat cu soluţie salină izotonă.

c. Secreţia otică Se recomandă recoltarea acestui produs patologic în cazul unor otite medii sau

extene.În cazul otitelor medii se recomandă examinarea acestui produs pentru diagnosticarea, ca agent etiologic al acestor boli, a: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, mai rar enterobacteriacee, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus şi/sau bacterii anaerobe.

Prelevatul de elecţie este exudatul aspirat prin timpanocenteză sau se poate recurge la însănânşarea extenporanee cu lanţeta de puncţie.

În caz de perforare spontană a timpanului exudatul se prelevă pe un tampon fin steril, ghidat prin speculum auricularum către fistulă.

În cazul otitelor externe, pacienţilor cu scurgere otică sero-sanguinolentă sau purulentă din conductul auditiv extern (nu din urechea medie) li se recontează exudat din conductul auditiv extern, pe tampon cu mediu de transport.

d. SputaRecoltarea corectă este dificilă, pentru că trebuie avut grijă să se obţină un produs

strict reprezentativ (microorganismele din spută, nu din salivă sau din căile respiratorii superioare). Sputa se recoltează de preferinţă dimineaţa, când bolnavul îşi face toaleta

bronşiilor, în plăci Petri, borcane sau pahare sterile (preferabil din plastic) de cca 100 ml, cu gura largă şi capac ermetic, după o prealabilă clătire a gurii cu soluţie salină fiziologică sterilă sau gargară cu apă, periajul simplu al dinţilor înaintea prlevării. Folosirea antisepticelor este interzisă.

- În infecţii acute este suficientă o cantitate de 1-2 ml de spută mucopurulentă.- La tuşitorii cronici, pentru diagnosticul tuberculozei sau al infecţiilor fungice bronho-pulmonare, cantitatea de spută trebuie să fie mai mare: toată sputa de la expectoraţia matinală sau cea expectorată în interval de 1-2 ore. Nu se examinează niciodată probele sumate din 24 ore pentru că multiplicarea microorganismelorde contaminare falsifică rezultatele.

- La pacienţi cu tuse slab productivă, stimularea expectoraţiei se face prin inhalare de aerosoli calzi cu soluţie salină10% şi glicerinată 15%.

- La copii mici, care înghit sputa, se efectuează recoltarea prin sondaj gastric.Sputa se recoltează în afecţiuni pulmonare (pneumonii, bronhopneumonii,

tuberculoză, etc.).

e. Lichidul gastricLichidul gastric normal, recoltat dimineaţa pe nemâncate, este puternic acid (pH

0,9-1) şi fără germeni viabili, dar deseori cu germeni din nazofaringe şi salivă. Pot supravieţui doar unii bacili acidorezistenţi, fungi şi bacterii sporulate.

La unii bolnavi cu anaciditate, cu stază gastrică sau neoplasm gastric, cavitatea gastrică poate fi populată de un număr mare şi variat de germeni ingeraţi, proveniţi din alimente sau înghiţiţi o dată cu saliva.

În gastritele microbiene (gastrite flegmonoasă) se evidenţiază bacterii, fungi, celule epiteliale şi leucocite.

La copii şi la femei cu suspiciunea de tuberculoză pulmonară care nu expectorează, ci înghit sputa, se recomandă examenul sucului gastric pentru evidenţierea bacilului Koch.

Tehnică de recoltare. Bolnavul, nemâncat de 12 ore, face o toaletă a cavităţii bucale cu o soluţie sterilă, apoi se introduce în stomac o sondă sterilă - sonda Einhorn. Se aspiră lichidul de stază, dacă există, sau se spală cavitatea gastrică cu 100-200 ml de apă distilată sterilă, care se aspiră imediat. Acest lichid este supus determinării pH şi prelucrat specific pentru evidenţierea agentului etiologic (efectuare de frotiuri din sedimentul obţinut prin centrifugarea lichidului şi însămânţare pe mediile adecvate, inclusiv pentru bacilul Koch-BK).

f. Lichidul de vărsăturăSe prelevează obligatoriu în cazul gastroenteritelor acute, toxiinfecţiilor

alimentare, în borcane sau plăci Petri sterile.

g. Materiile fecaleÎn cazul coproculturii, se urmăreşte evidenţierea agentului patogen din fecale.

Prelevarea se face direct din rect şi din scaunul emis spontan.

Direct din rect cu sonda Nelaton sau cu tamponul rectal, în dizenteria cronică (în care leziunea este localizată în partea terminală a sigmoidului) şi la purtătorii de Shigella şi Salmonella, cu excepţia celor de Salmonella typhi.

Nu se recomandă acest mod de recoltare în infecţiile acute în care agresiunea bacteriană este ileo-jejunală sau colică inaltă.

Prelevarea corectă prin acestă modalitate de recoltare se realizează astfel: tamponul sau sonda Nelaton se umectează în prealabil cu soluţie salină izotonă; se penetrează prin sfincterul anal prin rotare lentă şi se introduce intrarectal 15 cm. În cazul sondei Nelaton se va ataşa la aceasta o seringă de 10 ml cu care se fac1-2 aspiraţii.

După recoltare, atât sondele cât şi tampoanele se introduc în tuburi sterile cu dop sau eprubete cu mediu de conservare, preferabil lichid, care să permită o bună eluare a prelevatului.

Scaunul emis spontan este o a doua modalitate de recoltare a materiilor fecale. Se recomandă în toate formele de diaree acută când emisia de materii fecale este frecventă.

Prelevarea din masa fecaloidă se face cu tamponul sau cu „linguriţa“ coprorecoltorului vizând porţiunile reprezentative ale scaunului - mucus, puroi, sânge, porţiuni lichide (figura 2). Volumul recoltei: 3-5 cm3.

Pentru depistarea purtătorilor se administrează în prealabil purgativ salin (sulfat de sodiu şi magneziu în părţi egale) .

Probele trebuie însămânţate imediat, în unele cazuri, cum este dizenteria, chiar la patul bolnavului sau în cel mult 2 ore de la recoltare. Dacă nu este posibil acest lucru, se impune folosirea unui mediu special de conservare - mediul Cary-Blair sau mediul Stuart care asigură o bună conservare la temperatura mediului ambiant până la 7 zile a enterobacteriaceelor, dar şi a germenilor din genul Vibrio.

Coprocultura se recomandă în infecţiile intestinale: salmoneloze, dizenterie, holeră, enteroviroze, parazitoze etc.

Figura 2 : Coprocultor

h. Secreţiile uretrale Se recomandă a se recolta în cazul pacienţilor cu uretrită, care acuză disurie şi

scurgeri uretrale. Scurgerea uretrală pote fi abundentă sau discretă. Macroscopic, ea poate fi : albă, gălbuie, verzuie, brună sau muco-purulentă sau clară, filantă.

Etilogic, uretritele pot fi :- gonococice (peste 70%);- negonococice (detrminate de Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalim, Trichomonas vaginalis, virusul Herpes simplex);

- post-gonococice (determinate de Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealiticum, Cryptococcus neoformans).

Recoltarea se face cu tamponul steril.Momentul recomandat pentru recoltare: la cel puţin 2 ore după micţiune, dar în

cazul suspiciunii infecţiei cu Trichomonas vaginalis, prelevarea trebuie făcută înaintea micţiunii matinale, iar tamponul trebuie imersionat în cca 1 ml de soluţie salină izotonă încălzită la 370C.

Dacă secreţia este abundentă, se şterge mai întâi meatul uretral cu o compresă

sterilă, apoi se recoltează secreţia uretrală cu tamponul, după expresia postero-anterioară

a uretrei şi comprimarea glandului.

Dacă secreţia este redusă cantitativ, se folosesc procedee de activare a acesteia : instilaţii cu nitrat de argint intrauretrale, masaj de prostată sau ingestie de alcool seara , recoltarea făcându-se a doua zi dimineaţa. În acest caz, recoltarea se va face cu tampoane speciale, alcătuite din alginat de calciu cu un capăt acoperit de vată hidrofilă, sau cu o tijă de lemn foarte fină (ca o scobitoare) cu vată hidrofilă la un capăt. Acest tampon se introduce 1 cm în uretră, se roteşte şi se retrage tamponul.

Alternativ, se poate folosi o ansă din platină, perfect închisă circular, sterilizată şi complet răcită, introdusă în uretră 1-2 cm, după care produsul recoltat se însămânţează direct pe mediile de cultură destinate izolării germenilor.

i. Secreţia vaginalăSe recomandă recoltarea acesteia în caz de leucoree (scurgere patologică la

nivelul organelor genitale feminine sau când nu există simptomatologie, dar există un anume context epidemiologic (infecţii manifeste clinic la partenerul sexual sau la nou-născut).

Din punct de vedere etiologic, sunt descrise :- vulvo-vaginite specifice, determinate de Trichomonas vaginalis, gonococ sau fungi- Candida albicans;

- vulvo-vaginite nespecifice sau vaginoze, determinate de: stafilococul auriu, Steptococcus pyogenes, Gardnerella vaginalis, diverse specii de anaerobi.

Se recoltează secreţia acumulată în fundul de sac vaginal posterior, secreţie detaşată cu ajutorul unei valve şi recoltată pe trei tampoane.

۰ Tamponul 1 este descărcat în soluţie izotonă sterilă, încălzită la 370C, din acest omogenizat efectuîndu-se un preparat umed între lamă şi lamelă care se examinează la microscop.۰ Tamponul 2 este folosit la efectuarea unui frotiu colorat Gram, care se examinează la microscop.۰ Tamponul 3 serveşte pentru diagnosticul bacteriologic (pentru germenii specifici-gonococ, şi nespecifici-mai sus menţionaţi) şi fungic, prin însămânţarea lui pe medii pentru bacterii şi mediu pentru fungi (mediu Sabouraud cu cloramfenicol).

j. Secreţia conjunctivalăSe recomandă a se recolta în caz de: conjunctivite şi keratite, infecţii ale

pleoapelor, infecţii ale aparatului lacrimal, endolftalmite (infecţia tunicilor şi umorilor globului ocular), panoftalmite (infecţia se extinde şi la scleră şi capsula lui Tenon), celulite orbitare, abcese, flegmoane orbitare.

Produsul patologic poate fi:- exudatul acumulat în sacul conjunctival şi pe suprafaţa ambelor conjunctive palpebrale, prelevat pe tampone umectate cu bulion nutritiv. Exudatul poate fi: seros, sero-purulent, purulent, muco-purulent, fibrinos, pseudomembranos. Exudatul seros sau sero-purulent poate fi recoltat prin capilaritate cu micropipeta, din sacul conjunctival.

- raclatul realizat cu spatula de platină sterilă, separat de pe conjunctiva tarsală superioară şi inferioară.

Prelevarea probelor trebuie să se facă :۰ înainte de toaleta feţei, care îndepărtează din secreţii şi exudatul conjunctival;۰ înainte de machiaj, care face dificil examenul citobacteriologic;۰ înainte de aplicarea unei terapii antimicrobiene, topică sau sistemică, pentru că reduce şansa izolării agentului infecţios; înainte de aplicarea oricărei corticoterapii, care modifică citologia.

k. Puroiul Este un exudat fibrinos, uneori sanghuinolent, care conţine leucocite

(predominant polimorfonucleare neutrofile-în inflamaţiile acute, sau mononucleare-în inflamaţiile cronice specifice), resturi celulare şi microorganismul sau microorganismele determinante ale supuraţiei.

Supuraţia înseamnă formarea sau scurgerea de puroi. Supuraţiile pot afecta orice ţesut şi organ, cu acumulare de puroi în:- interstiţiile cutanate: pustule, furuncule, hidrosadenită, abcese, gome;- ţesuturile musculo-scheletice: abcese, flegmoane, osteomielită;- ganglionii limfatici;- viscere: abcese;- cavităţi preformate: sinusuri paranazale, ureche medie, seroase- meninge, pleură, pericard, peritoneu, sinovialele articulare;

- pe suprafeţe tisulare denudate: plăgi, arsuri.Colecţiile purulente se pot deschide spontan sau cu mai multe fistule.

Prelevarea probelor din supuraţii este frecvent unică, de aceea trebuie o existe o legătură ireproşabilă între clinician şi medicul de laborator, puroiul reprezentând un

produs patologic care trebuie recoltat corect, trebuie trimis în timp util la laborator (în maxim 1-2 ore de la recoltare), iar laboratorul trebuie să realizeze o prelucrare imediată şi adecvată a probei.

Tampoanele sunt contraindicate pentru prelevarea puroiului ori de câte ori putem obţine probe prin puncţie-aspiraţie, chiuretaj sau biopsie. Izolarea bacteriilor anaerobe de pe tampoanele uzuale este imposibilă. Cu precauţii speciale (utilizarea unui mediu de transport) tampoanele pot fi utilizate numai pentru prelevarea puroiului din colecţii foarte mici.

Când este necesară (în cazul colecţiilor deschise) se realizează irigarea leziunilor cu soluţii saline non-inhibitorii, de tipul soluţiei Ringer lactozată.

Leziunile cronice sunt sărace în bacterii, de aceea se impune prelevarea unei cantităţi mai mari de produs decât în leziunile acute.

Unele bacterii anaerobe sunt omorâte după câteva secunde de contact cu oxigenul atmosferic; altele supravieţiuesc 30-90 minute. De aceea se recomandă recoltarea puroiului în 2 recipiente sterile: unul pentru aerobi, altul pentru anaerobi. În lipsa containerelor speciale pentru anaerobi puroiul se recoltează cu seringa prin aspiraţie, se elimină bulele de aer din seringă şi se obturează cu un dop de cauciuc, procedeu numit „seringă anaerobă“ şi care asigură supravieţiurea anaerobilor cel puţin 30 de minute.

Procedee de recoltare:- din colecţii închise (flegmoane, abcese superficiale, colecţii din cavităţile seroase) se recoltează prin puncţie cu o seringă sterilă şi ac gros cu bizoul scurt după aseptizarea loului de puncţie cu alcool sau tinctură de iod. Puroiul se introduce într-un recipient steril;

- din colecţii deschise se recoltează după curăţirea plăgii cu soluţie Ringer lactozată sau ser fiziologic steril, îndepărtându-se prima cantitate de puroi eliminată. Recoltarea se face cu un tampon sau ansă sau compresă sterilă sau cu pipeta Pasteur bine efilată şi se introduce în recipiente sterile (pentru aerobi şi pentru anaerobi) (figura 3).

Figura 3 : Tipuri de pipete

B. Recoltarea produselor normal sterile

a. Sângele Se recoltează pentru:

- examinări bacteriologice: hemocultură;- examinări serologice: determinarea anticorpilor;- examinări parazitologice;- examinări hematologice;- examinări biochimice.

a.1. Hemocultura Înseamnă evidenţierea bacteriilor din sânge. Indicaţii:

۰ sindroame febrile fără cauză precizată;۰ infecţii bacteriene plurietiologice (meningite, peritonite, pielonefrite, infecţii puerperale, infecţii ale plăgilor şi arsurilor, alveolite pulmonare);۰ sindrom septicemic;۰ endocardită subacută;۰ nou-născuţi, sugari, gazde imunocompromise la orice vârstă;۰ infecţii sistemice cu patogeni specific (febre enterice, bruceloză, leptospiroză);۰ stări febrile postintervenţie chirurgicală.

Materiale necesare recoltării

- seringă de unică utilizare cu volum adecvat (20 ml sau mai mică pentru copii) sau un set de transfer (tub cu ace la ambele capete pentru a permite însămânţarea direct în mediul de cultură, ceea ce minimalizează riscul contaminării);

- garou-pentru stază,- alcool sau tinctură de iod: pentru dezinfecţia tegmentelor;- mănuşi: pentru protecţia mâinilor celui care recoltează;- flacoane pentru hemocultură cu mediu adecvat pentru dezvoltarea germenilor, preîncălzite la 370C (figura 4 şi 5).

Figura 4: Recoltarea sângelui pentru hemocultură

Sunt indicate flacoane speciale cu membrană de cauciuc sau plastic fixate cu capac înşurubat, care permit însămânţarea fără îndepărtarea capacului. Volumul de mediu per flacon este de 50-100 ml pentru adulţi şi de 20-50 ml pentru prelevarea de la copii.

În lipsa unor flacoane speciale se pot „confecţiona“ astfel de flacoane, folosind flacoane pentru plasmă de 150 ml sterile în care se toarnă mediul adecvat, iar pentru anaerobi tuburi de 25/250 mm cu mediu repartizat în coloană de 15 cm înălţime.

Există flacoane pentru hemocultură care conţin un singur mediu pe care se dezvoltă atât germenii aerobi, cât şi anaerobi (mediu I al Institutului Cantacuzino - I I.C). Există şi flacoane separate pentru germeni aerobi şi germeni anaerobi, conţinând mediile adecvate, şi care sunt inoculate cu sânge imediat după recoltare.

Pentru depistarea unor microorganisme cu creştere lentă (brucele, leptospire, fungi) se recomandă utilizarea unor medii difazice: pantă de agar-sânge şocolat cu bulion tripticază soia pentru brucele sau pantă de agar nutritiv şi bulion infuzie cord-creier pentru fungi.

Momentul recoltăriiHemocultura se recoltează înaintea tratamentului antimicrobian. În caz contrar

se indică pe buletinul care însoţeşte proba antibioticele care s-au administrat, pentru a se utiliza inhibitori specifici. Adăugarea inhibitorilor se face prin înglobarea de la început în mediul de cultură, sau în momentul însămânţării (exemplu: acid paraaminobenzoic pentru sulfamide, penicilinază pentru penicilină, cisteină pentru streptomicină). Se recomandă creşterea raportului de inocul folosit/mediu nutritiv de la 1/10 la 1/30, 1/50 când sunt întrebuinţate chimioterapice pentru care nu există inhibitori specifici.

În bolile care evoluează sistematic cu fază bacteriemică (alveolite pulmonare, febre enterice, leptospiroză, bruceloză), hemocultura trebuie recoltată cât mai aproape de debutul bolii.

În bolile cu bacteriemii continue (endocardite subacute) prelevarea se poate realiza în orice moment al zilei.

În bolile cu bacteriemii intermitente (supuraţii, pielonefrite) fiecare descărcare bacteriemică se însoţeşte de frisoane şi este urmată de un croşet febril. Ca urmare, hemocultura trebuie recoltată în momentul apariţiei croşetului febril sau/şi în momentul când bolnavul semnalează apariţia frisoanelor.

Numărul recoltărilorMajoritatea bacteriemiilor sunt intermitente. În aceste cazuri se recomandă 3

prelevări/24 ore. În urgenţe, ritmul prelevărilor poate fi la intervale de 30-60 de minute.În bolile cu descărcare bacteriemică continuă (endocardite subanute) sunt

suficiente 2 prelevări/24 ore.

VOLUMUL RECOLTĂRILOR

Pentru adult: 20-30 ml/ recoltare; la nou-născuţi, sugari, copii mici: 1-3 ml/prelevare. Proporţia sânge/mediu trebuie să fie de 1/10.

Zone de prelevare

۰ electiv: venele de la plica cotului sau venele jugulare sau temporală la nou-născuţi şi sugari;۰ alternativ: venele antebraţului sau venele dorsale ale mâinii;۰ puncţie arterială la nivelul pliului inghinal (în endocarditele cu focar septic pe valvulele mitrale sau aortice).

Procedura de recoltareÎn cazul în care se abordează venele de la plica cotului, se aplică garoul proximal

de zona puncţiei. Se dezinfectează tegumentul suprajacent venei cu alcool iodat 2%. După 1 minut se badijonează zona cu eter pentru a îndepărta iodul şi a lăsa tegumentul cât mai uscat. Se antiseptizează membrana de cauciuc a flacoanelor cu mediu de cultură.

Se puncţionează vena, recoltându-se 10-30 ml sânge care se repartizează imediat în 1-2 flacoane cu mediu de cultură (pentru incubare aerobă şi anaerobă). Flaconul se agită pentru omogenizarea sângelui în masa mediului. Se transportă la laborator, unde unul din flacoane trebuie aerisit prin perforarea membranei cu un ac protejat cu filtru de vată, pentru germenii aerobi, celălat flacon fiind folosit pentru urmărirea dezvoltării anaerobilor.

Flacoanele se incubează la 370C şi se examinează zilnic macroscopic, radiometric sau microscopic timp de 7 zile. Dacă la aceste examinări se semnalează prezenţa germenilor se fac subcultivări pe medii speciale şi se trece la identificarea acestora şi efectuarea antibiogramei. O incubare mai prelungită se impune la pacienţi cu endocardită subacută, la cei la care recoltarea hemoculturii s-a efectuat sub antibioticoterapie (până la 14 zile) sau în cazul unor microorganisme particulare (BK, brucele, leprospire).

Figura 5: Recoltarea sângelui pentru hemocultură

a.2. Determinări serologice

În acest caz se recoltează 10 ml de sânge din vena plicii cotului, se lasă să se coaguleze, iar serul separat prin centrifugare este supus examinărilor.

b. Lichidul cefalorahidian (LCR)LCR normal este un fluid steril, incolor şi clar. Conţine :

۰ între 3-10 celule nucleate/mm3, de regulă limfocite;۰ 15-40 mg/dl proteine (reacţia Pandy negativă);۰ 50-70 mg/dl glucoză;۰ 6,8-7,3 g/l cloruri.

Barierele hematomeningee şi hematoencefalică reduc accesul agenţilor infecţioşi, al metaboliţilor toxici, dar şi al chimioterapicelor către LCR şi ţesutul nervos.

Infectarea SNC se poate face:- pe cale hematogenă, în cursul unor bacteriemii sau viremii cu variate porţi de intrare;- pe tecile limfatice olfactive din nazofaringe;- prin contiguitate, din focare infecţioase juxtameningiene (otomastoidită, sinusite);- din exterior: conduct auditiv extern, tegumente, nazofaringe, puncţii rahidiene, intervenţii chirurgicale pe nevrax;

- de la nivelul tegumentelor infectate cu Staphylococcus epidermidis, ce reprezintă sursă de infecţie pentru şunturile efectuate pentru controlul hidrocefaliei;

- rar, pe cale intraneurală, prin rădăcinile nervului trigemen ori ale nervilor sacraţi.

Indicaţii pentru recoltarea LCR

- meningite : bacteriene, virale, parazitare, fungice ;- meningoencefalite ;- sindroame meningeale apărute în cadrul altor afecţiuni, precum cele ce constituie

punct de plecare pentru infectarea SNC ;- supuraţii cerebrale(abcese cerebrale, subdurale, epidurale).

Prelevarea probelor

Prelevarea LCR este de competenţa specialiştilor infecţionişti, neurologi, neurochirurgi. Se face prin rahicenteză, obişnuit lombară L4-L5, sau ventriculară (suboccipitală) în condiţii de strictă asepsie.

Puncţia lombarăBolnavul este aşezat în decubit lateral, în poziţia de „cocoş de puşcă“ (cu

genunchii apropiaţi de bărbie). Pielea bolnavului se dezinfectează cu alcool şi apoi cu tinctură de iod pe o suprafaţă pătrată cu latura de 20 cm. Medicul se spală pe mâini, şi apoi îşi pune mănuşi sterile. După aproximativ 2 minute, timp necesar acţiunii de dezinfecţie, se face puncţia prin pătrunderea în spaţiul intervertebral L4-L5 fie cu seringa cu acul lung (de 8-10 cm pentru adult şi 6-7 cm pentru copil), fie numai cu acul lung steril. Se preferă ace speciale pentru puncţii rahidiene sau, în lipsa lor, ace sterile de oţel inoxidabil, cu bizoul scurt şi bine ascuţit, prevăzute cu un mandren, care la un capăt să nu depăşească vârful acului, iar la celălalt capăt să fie îndoit în dreptul pavilionului. Se introduce mandrenul în ac în mod steril, se apucă acul de pavilion, prin intermediul unei comprese sterile şi se pătrunde în spaţiul L4-L5. Pătrunderea în spaţiul subarahnoidian este însoţită de senzaţia de a fi ajuns intr-un spaţiu gol şi de scurgerea LCR.

În meningite LCR este de obicei hipertensiv şi poate ţâşni prin ac. Dacă primele picături sunt sanguinolente, acestea nu se vor recolta, ci se aşteaptă puţin, pentru a se observa dacă şi restul lichidului păstrează acelaşi aspect. Se colectează 5-10 ml de LCR în 2-3 tuburi, dintre care unul este obligatoriu steril pentru examen microbiologic.

Puncţia suboccipitalăDupă raderea părului şi dezinfecţia minuţioasă a pielii din regiunea cefei, se

menţine capul bolnavului mult flectat înainte, fără să fie înclinat sau rotat într-o parte sau alta. Se pătrunde cu acul exact pe linia mediană, pe linia care uneşte vârful celor două mastoide, la mijlocul distanţei dintre protuberanţa occipitală externă şi apofiza spinoasă proeminentă (a 7- vertebră cervicală). Se pătrunde cu acul perpendicular pe tegumente, apoi îndreptat către baza nasului. După 2-3 cm se simte o rezistenţă dată de ligamentul atlantooccipital, după care vârful acului pătrunde într-un spaţiu liber (în cisterna mare). Este recomandabil ca acul să fie ataşat la o seringă cu care se aspiră LCR, deoarece presiunea lui la acest nivel poate fi aproape de zero.

În laborator se face examinarea macoscopică a LCR, care poate ridica o anume suspiciune etiologică; unul din tuburi se centrifugheză, iar din sedimentul obţinut se fac frotiuri care se colorează diferit pentru orientare etiologică, iar cea de-a treia eprubetă sterilă se foloseşte pentru izolarea germenilor prin însămânţare pe medii adecvate.

c. UrinaMetoda uzuală recomandată pentru recoltarea acestui produs patologic este cea a

jetului întrerupt (mijlociu): după toaleta exterioară a organelor genitale, efectuată prin spălare cu apă caldă şi săpun, se recoltează porţiunea din mijloc a micţiunii - prima porţiune a jetului este aruncată, şi fără a se întrerupe jetul de urină, se recoltează cca 20ml de urină în recipient steril, închis ermetic cu capac (figura 6).

Prelevări speciale: Aspiraţia suprapubiană

Se recomandă la nou-născuţi şi sugari, paciente adulte, la care examinarea repetată a probelor din jetul mijlociu a dat rezultate echivoce. Este singura metodă care poate atesta semnificaţia clinică a bacteriilor anaerobe din urină.

Tehnică de recoltare. Pacientul, bine hidratat, se abţine de la micţiune până când percuţia suprapubiană evidenţiază matitate vezicală, iar palparea regiunii evidenţiază fundul vezicii urinare şi declanşează necesitatea micţiunii urgente. Se pregăteşte tegumentul suprajacent (depilare, decontaminare cu alcool iodat). Se puncţionează vezica urinară deasupra simfizei pubiene cu o seringă de 10 ml, aspirându-se urină. Proba se pune într-un recipient steril cu capac, închis ermetic, care se etichetează cu numele pacientului, ora recoltării, diagnostic, secţia de unde provine, şi se expediază laboratorului.

Figura 6: Urocultor

Prelevări prin cataterAre indicaţii limitate: pacienţi necooperanţi, pacienţi care nu micţionează din

cauze neurologice sau urologice, pacienţi cataterizaţi pentru explorare urologică, pacienţi cu catater á „démeure“.

Recoltarea se face numai de specialistul urolog, cu instilarea, la sfârşitul procedurii, de soluţie salină cu neomicină şi polimixină sau colimicină, pentru a preveni infecţia.

Evidenţierea microorganismelor din urină este denumită urocultură. Ea se însoţeşte de calcularea bacteruiriei, şi de aceea se numeţte urocultură cantitativă.

Se practică în infecţiile aparatului renal, salmoneloze, leptospiroze, tuberculoză etc.

d. Bila Se recoltează pentru examinări bacteriologice (bilicultură), parazitologice,

biochimice, cu sonda Einhorn sterilizată, metoda recoltării purtând numele de tubaj duodenal. Recoltarea se face dimineaţa, după clătirea cavităţii bucale cu apă sau soluţie salină fiziologică sterilă. Se introduce sonda Einhorn până la diviziunea 45. Se culcă pacientul pe dreapta şi se introduce sonda până la diviziunea 65. Se adaptează seringa şi se introduc pe sondă 30-50 ml de soluţie de sulfat de magneziu steril (40%), încălzit la 30-370C. Se penseză sonda şi, după 5-10 minute, se începe recoltarea lichidului, care este colectat în recipiente sterile.

Primul lichid care se scurge, în cantitate de 10-30 ml, este de culoare galbenă, limpede sau uşor opalescentă şi constituie bila A (lichid duodenal sau bilă coledociană).

După 15-25 de minute ce scurge o cantitate de 100-200 ml de lichid vâscos, brun-castaniu, care reprezintă bila B „veziculară“.

Lichidul care se scurge în continuare, uneori îndelungat, este galben deschis şi reprezintă bila C „hepatică“.

Aceste 3 feluri de bilă în mod normal sunt perfect limpezi; în stări patologice pot fi opalescente, cu mucus sau chiar net tulburi sau purulente. Se considră o bilicultură pozitivă dacă se evidenţiază un număr mai mare de 105 bacterii/ml.

Agenţii etiologici implicaţi în producerea unei infecţii a bilei şi căilor biliare pot fi: bacterii Gram negative de origine intestinală (Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella, Proteus), coci Gram pozitivi (enterococi), paraziţi (Giardia, amibe, Fasciola hepatică), levuri (Candida).

e. Exudatele seroaselor (lichid pleural, peritoneal, sinovial) Se recoltează după asepsie locală prin puncţie în partea declivă a regiunii.

۰ Puncţia pleurală se execută în plină zonă de matitate, în spaţiul intercostal respectiv, folosindu-se acul montat la o seringă sterilă. Se extrag 20-40 ml lichid pleural care este repartizat în 2 tuburi sterile, unul conţinând un anticoagulant (soluţie sterilă de citrat trisodic 3,8 g/100 ml sau soluţie sterilă de EDTA). Nu se îndepărtează cheagul de fibrină sau nu se triturează, deoarece în reţeaua de fibrină rămân o serie de elemente, eventual şi germeni, şi procedând ca mai sus aceştia vor fi distruşi.

Dacă lichidul extras este tulbure sau purulent, se păstrează o cantitate de 2-3 ml în seringă, din care se fac însămânţări pentru anaerobi.۰ Puncţia pericardică, trebuie făcută cu precauţii, iar lichidul extras este examinat citologic, bacteriologic, virusologic, ca şi lichidul pleural.۰ Puncţia peritoneală se face în plină zonă de matitate, bolnavul aflându-se în decubit lateral, respectând aceleaşi reguli ca şi pentru lichidul pleural.

Prelucrarea produsului recoltat se face ţinând cont de faptul că peritonitele bacteriene sunt rareori unietiologice; de obicei sunt plurietiologice, germenii implicaţi fiind aerobi (coliformi, enterococi - mai ales la copii, streptococi β-hemolitici grup A, eventual B), anaerobi (mai ales bacili Gram negativi nesporulaţi: Bacteroides şi Fusobacterium), sau sporulaţi (clostridii).۰ Puncţia articulară se execută folosind ac steril ataşat la o seringă sterilă, după dezinfecţia tegumentelor articulare cu soluţii antiseptice. După pătrunderea în cavitatea articulară, se extrage prin aspiraţie lichidul articular care se repartizează în 2 recipiente sterile cu capac, unul fiind cu anticoagulant.

Laboratorul va prelucra produsul de puncţie articulară în funcţie de etiologia suspicionată, dar în general se are în vedere etiologia banală cu germeni aerobi: streptococi, stafilococi, germeni enterali, etiologia gonococică, dar şi tuberculoasă.

f. Produs de puncţie ganglionarăSe obţine prin puncţie aspiratorie ganglionară, după prealabilă dezinfecţie a

tegumentelor suprajacente. Agentul etiologic bacterian principal suspicionat a fi prezent este bacilul Koch (tuberculoză ganglionară). Ca atare, se va recolta produsul în două recipiente sterile, închise ermetic; unul va fi folosit pentru examen direct pe frotiu colorat Ziehl-Nielsen, iar celălalt pentru însămânţare pe mediul Lőwenstein-Jensen.

IZOLAREA BACTERIILOR IN VITRO ŞI IN VIVO

Bacteriile se pot dezvolta, în afara organismului, in vitro, prin însămânţare pe medii nutritive, şi/sau in vivo, prin inoculare la animale de laborator sensibile.

IZOLAREA BACTERIILOR IN VITRO

MEDII DE CULTURĂ

Mediul de cultură reprezintă substratul nutritiv folosit pentru creşterea şi multiplicarea microorganismelor în condiţii artificiale, iar cultura microbiană, totalitatea microorganismelor dezvoltate.

Prin utilizarea mediilor de cultură se pot izola microorganismele în cultură pură, ceea ce permite identificarea lor, studiul unor proprietăţi caracteristice, prepararea de antigene, vaccinuri şi alte produse biologice.

CONDIŢIILE PE CARE TREBUIE SĂ LE ÎNDEPLINEASCĂ MEDIILE DE CULTURĂ

Corectitudinea cercetărilor microbiologice depinde şi de calitatea mediilor de cultură, acestea trebuind să îndeplinească câteva condiţii esenţiale:- să ofere substanţele plastice şi energetice necesare fiecărui microorganism (să conţină o sursă de N şi C, factori de creştere, săruri minerale;

- să aibe un pH optim pentru specia respectivă, de obicei uşor alcalin 7,2-7,4;- să asigure, după caz, cerinţele de aerobioză sau anaerobioză;- să aibe un anumit grad de umiditate;- să fie stabil (trebuie să-şi păstreze toate calităţile iniţiale pe toată durata incubării);- să fie sterile, pentru a nu se dezvolta şi alte microorganisme, în afara celor însămânţate;

- să se păstreze ferite de contaminare, atât înainte, cât şi după folosire.

PREPARAREA MEDIILOR DE CULTURĂ

În prepararea mediilor de cultură trebuie respectate următoarele etape:- stabilirea reţetei, respectarea cantităţii de ingrediente cu amestecul acestora în proporţia şi ordinea indicată;

- verificarea pH-ului, eventual cu ajustarea acestuia;- filtrarea mediului pentru degrosisare (îndepărtarea sărurilor alcalino-pământoase);- repartizarea în recipiente adecvate (eprubete, baloane) şi sterilizarea în condiţii care nu diminuează proprietăţile lor nutritive (autoclavare).

Controlul sterilizării se face prin menţinerea la termostat 24 ore, timp după care mediile trebuie să rămână în continuare sterile.

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ a. după consistenţă:· mediile lichide (apă peptonată, bulion): folosite în special pentru studiul unor proprietăţi ale microorganismelor şi obţinerea toxinelor;· medii solide (geloză): utilizate mai ales pentru obţinerea microorganismelor în cultură pură.

b. după provenienţă:

· medii naturale: nu necesită o prelucrare specială (lapte, bilă, ser, cartof);· medii artificiale: medii la care este obligatorie o prelucrare prealabilă, pornind de la proteine animale (carne şi organe de vită, făină de peşte), sau vegetale (mazăre, soia, drojdie);

· medii sintetice: sunt acele medii compuse exclusiv din substanţe chimice (aminoacizi, factori de creştere, săruri). Compoziţia mediilor sintetice variază după dorinţa experimentatorului, cu ajutorul lor putându-se studia necesităţile nutritive ale diverselor specii microbiene;· medii semisintetice: sunt acele medii care pe lângă substanţe chimice mai conţin şi proteine animale sau vegetale.

c. după compoziţie şi mod de utilizare:Medii uzuale sau simple

Pe aceste medii se dezvoltă majoritatea microorganismelor, având în compoziţie extract de carne, peptonă, clorură de sodiu. Pot fi:- lichide: bulion (utilizat ca mediu de înmulţire şi menţinere a bacteriilor, serviind ca element de bază pentru obţinerea mediilor lichide complexe), apă peptonată (utilizat ca mediu de îmbogăţire pentru vibrioni);

- solide: geloză simplă (provine din bulion în care se introduce, la cald, fibrele unei alge marine din familia Florideea, cunoscute în comerţ sub numele de agar-agar, care-i conferă acestuia suportul solid). Este utilizată pentru obţinerea fie de colonii izolate, fie de culturi masive, în funcţie de scopul urmărit (figura 1).

Figura 1: Geloză simplăMedii complexe

Sunt mediile cu adaus de lichide organice (sânge, ser) sau zaharuri (glucoză, lactoză etc.) la mediile simple, pentru cultivarea speciilor mai pretenţioase (gonococi, meningococi, hemofili), sau evidenţierea unor proprietăţi. Prin adăugarea acestor ingrediente se obţin medii cu bulion-sânge, bulion-ser, bulion-ascită, bulion glucozat sau geloză ser (sânge, ascită)

- mediul geloză sânge (evidenţiază fenomenul de hemoliză caracteristic unor specii bacteriene (stafilococi, streptococi, pneumococi). Pentru izolarea gonococilor, meningococilor se foloseşte un mediu derivat al amestecului geloză-sânge, şi anume, geloză chocolat.Acest mediu constă din sânge defibrinat de berbec 5% peste care se toarnă geloză încălzită la 70C. Sub influenţa căldurii se produce denaturarea mediului şi punerea în libertate de aminoacizi necesari dezvoltării unor specii bacteriene (figura 2);

- medii elective: asigură cu precădere dezvoltarea unui germen în raport cu alţi germeni

* mediul Loeffler cu ser coagulat de bou pentru izolarea bacilului difteric;

- medii selective: selectează un anumit germen, conţinând substanţe bacteriostatice pentru flora de asociaţie:

* mediul Lowenstein Jensen, cu verde malahit pentru inhibarea florei de asociaţie, pentru izolarea bacilului Koch. Mediul mai conţine săruri minerale, amidon, ou, glicerină.

* mediul hiperclorurat solid Chapman (clorură de sodiu, manită, roşu fenol) pentru izolarea stafilococilor manito-pozitivi patogeni;

Figura 2 : Geloză sânge

* mediul Tinsdale, mediul Gundel-Tietz cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric;

* mediul Rogose este un mediu selectiv pentru lactobacili care necesită pentru izolare un pH foarte scăzut (amestec de geloză nutritivă topită şi răcită apoi la 50C, amestecată extemporaneu cu părţi egale de suc de roşii centrifugat în prealabil)

* medii pentru izolarea enterobacteriilor (geloză, bilă sau săruri biliare, lactoză, indicator - albastru de bromtimol, roşu fenol, tinctură de turnesol):

- generale: Istrate-Meitert, Leifson, Mac-Conkey (figura 3);- speciale: Levine (E. coli); Wilson-Blair (Salmonella typhi);

* mediul Tinsdale, mediul Gundel-Tietz cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric;

Figura 3: Agar Mac Conkey

* mediul PPLO pentru izolarea mycoplasmelor este un mediu solid în care s-a introdus cristal-violet şi telurit de potasiu pentru inhibarea florei de asociaţie. La geloză se adaugă ser (cal, bou sau iepure) sau colesterină şi glucoză la un pH 7,6-8.

* mediul Diudonne este un mediu pentru izolarea veillonellelor şi a vibrionilor (apă peptonată hiperalcalină - pH 9-9,2 cu adaus de compuşi intermediari de metabolism de tip piruvat, lactat sau oxalacetat);

- medii de îmbogăţire: medii lichide care favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene inhibând selectiv dezvoltarea florei de asociaţie (pentru produsele care conţin o cantitate mică de bacterii patogene în raport cu flora saprofită):

* mediul OCST (ou, cistină, ser, telurit de potasiu) pentru bacil difteric;* mediul hiperclorurat lichid Chapman pentru stafilococi;* mediul Picke (bulion glucozat 0,2%, cristal-violet şi azidă de sodiu) pentru streptococ -hemolitic grup A;

* mediul Muller-Kauffmann, mediul cu selenit acid de sodiu pentru izolarea genului Salmonella;

- medii diferenţiale: diferenţiază diferite tipuri de bacterii: * mediul Drigalski care diferenţiază bacteriile care fermentează lactoza de cele care nu fermentează lactoza;

- medii pentru punerea în evidenţă a anumitor proprietăţi biochimice (de identificare)

* medii politrope (TSI, MIU, MILF);* mediul Hiss;* mediul Clark-Lubs;* mediul Simons (mediul cu citrat);* mediul cu fenilalanină;* mediul cu lizină;* mediul cu esculină.

- medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe: mediul Veillon, mediul Tarozzi, mediul Willis-Hobbs;

- medii pentru cultivarea fungilor: mediul Sabouraud (geloză cu zaharuri de tip glucoză 4% sau maltoză 4%).

ÎNSĂMÂNŢAREA PRODUSELOR PATOLOGICE ŞI IZOLAREA ÎN CULTURĂ PURĂ

ÎNSĂMÂNŢAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Însămânţarea produselor patologice reprezintă introducerea acestora pe medii de cultură potrivite, pe suprafaţă sau în profunzime, cu scopul obţinerii de culturi microbiene pure. Însămânţarea se face în mod steril, cu ansa, tamponul de exudat sau pipeta, folosind medii de cultură sterile şi de compoziţie adecvată.

Se recomandă însămânţarea imediată a probelor; dacă nu există posibilităţi imediate acestea se vor păstra la 4C.

Pentru obţinerea unor rezultate corecte trebuie să se ţină seama de anumite reguli:

- folosirea de instrumentar steril: ansa bacteriologică, pipeta Pasteur sau gradată;

- flambarea orificiilor recipientelor (baloane, eprubete) ce conţin mediile de cultură, dopurile flacoanelor se vor ţine între degetul mic şi podul palmei drepte);

- nu se vorbeşte, nu se tuşeşte, uşile şi ferestrele trebuie închise (se preferă boxe sau camere separate) pentru a împiedica contaminarea cu floră din aer sau cavitatea bucală a manipulatorului.

Însămânţarea se face pe medii lichide şi solide, primele favorizând o primă înmulţire numerică a bacteriilor. Dezavantajul lor este posibilitatea însămânţării la început (însămânţare primară) din materialul patologic al unui amestec bacterian nedorit. De aceea este obligatoriu în toate cazurile ca însămânţările pe mediile lichide să fie urmate ulterior de însămânţări pe medii solide pentru a obţine colonii izolate.

ÎNSĂMÂNŢAREA ÎN MEDII LICHIDEa. Cu ansa

Ansa se ţine în mâna dreaptă. Se sterilizează prin încălzire la incandescenţă, utilizând becul Bunsen. Dacă produsul patologic se află într-o ebrubetă, se scoate dopul de vată între degetul mic şi palma mîinii drepte, ţinând recipientul în mâna stângă. Se flambează gura eprubetei, se ia din produsul patologic cu vârful ansei, se flambează din nou gura recipientului, se pune dopul la loc. Eprubeta cu mediu se ţine în măna stângă, uşor înclinată pentru a evita riscurile contaminării cu microorganisme din aer, se scoate dopul, se flambează, se depune conţinutul ansei pe peretele eprubetei deasupra mediului lichid şi se omogenizează apoi cu acesta. Urmează repunerea dopului după flambarea şi sterilizarea ansei.

b. Cu pipeta PasteurSe rupe vârful pipetei şi se flambează trecând-o prin flacară. După răcirea pipetei,

se scoate dopul eprubetei cu produsul patologic, se flambează şi se aspiră 0,5-1 ml din

produs. Conţinutul pipetei se introduce în eprubeta cu mediu, după ce s-au respectat regulile de asepsie. Urmează incubarea la termostat. Pipeta folosită este pusă în vasul cu amestec sulfocromic.

Dacă se însămânţează în anaerobioză, mediul se fierbe în baia de apă 20-30 minute, se răceşte la 40-450C şi se introduce conţinutul pipetei în mediu, având grijă să nu se introducă bule de aer.

ÎNSĂMÂNŢAREA PE MEDII SOLIDEÎn operaţia de însămânţare pe medii solide avem două situaţii:

- însămânţarea în suprafaţă: pe medii solide în poziţie înclinată şi pe medii solide turnate în plăci Petri;

- însămânţarea în profunzime: pe medii solide turnate în coloană dreaptă şi pe medii solide în plăci Petri: metoda plăcii turnate şi metoda între două straturi.

a. Însămânţarea în suprafaţăCu ansa- Pe geloză înclinată. Se sterilizează ansa şi după răcire se încarcă cu produsul respectiv. Se introduce ansa aproape de fundul eprubetei cu mediu, dar deasupra lichidului de condens şi se trece uşor pe suprafaţa mediului în zig-zag sau în linie dreaptă, fără a zgâria suprafaţa mediului (figura 4).

- Pe geloză în plăci Petri. Se înclină placa cu mediu şi se depune produsul aproape de margine. Se trag striuri paralele cu ansa, prin mişcări scurte şi dese pe o suprafaţă mică la polul superior al mediului, fără a zgâria suprafaţa mediului. Apoi ansa se trece pe suprafaţa mediului trasându-se linii paralele şi perpendiculare, în formă de pentagon (regula pentagonului pentru obţinerea de colonii izolate) (figurile 5, 6 şi 7).

Cu pipeta Pasteur

- Pe geloză înclinată. Se însămânţează lichidul de condens al mediului cu câteva picături din produsul patologic aflat în pipetă. Prin uşoară agitare şi înclinare a eprubetei, lichidul se răspândeşte pe toată suprafaţa mediului.

- Pe geloză în plăci Petri. Se depune pe suprafaţa mediului aproximativ 1 ml din produsul lichid şi se răspândeşte uniform pe toată suprafaţa prin înclinarea plăcii sau cu pipeta Pasteur îndoită. Se ţine înclinată şi se aspiră excesul de lichid cu pipeta.

- În mediul Veillon pentru anaerobioză. Geloza Veillon se topeşte pe baia de apă, se răceşte la 450C şi se introduce conţinutul pipetei fără bule de aer. Apoi se aşează eprubetele în apă rece pentru solidificare rapidă.

b. Însămânţarea în profunzimeÎNSĂMÂNŢAREA PE MEDII SOLIDE TURNATE ÎN COLOANĂ

DREAPTĂ

Se deschide eprubeta cu mediu de cultură, se răstoarnă cu gura în jos, iar însămânţarea se face prin prin înţeparea în profunzime a mediului, utilizând ansa fir pentru a străpunge mediul, fără a-l deplasa (exemplu însămânţarea mediului MIU).

Figura 4: Tehnica însămânţării în suprafaţă pe mediul solid înclinat

Însămânţarea pe medii solide în profunzime: - metoda între două straturi: produsul se însămânţează pe suprafaţa plăcii cu geloză, după care se toarnă un alt strat subţire de geloză deasupra zonei de descărcare a produsului;

- metoda plăcii turnate: în placa Petri se pune o cantitate de produs, se toarnă geloza, se amestecă şi se lasă să se solidifice. Prin această metodă se crează condiţii de semianaerobioză necesare izolării unor bacterii patogene (exemplu: însămânţarea urinii).

IZOLAREA MICROORGANISMELOR ÎN CULTURĂ PURĂ

Pentru a obţine un rezultat corect, microorganismele trebuie studiate totdeauna în cultură pură, pornind de la colonii izolate. Colonia este o populaţie microbiană formată din indivizi proveniţi dintr-o singură celulă (clonă). Cultura pură se obţine preluând cu ansa o singură colonie şi însămânţând-o pe un mediu de cultură adecvat.

Izolarea este operaţia prin care se separă microorganismele dintr-un produs în care se găsesc mai multe specii, în vederea identificării fiecăreia. Pentru obţinerea coloniilor izolate se folosesc diverse tehnici.

TEHNICI OBIŞNUITE DE IZOLARE

a. Dispersia pe placă PetriO cantitate mică din produsul patologic se depune într-o zonă periferică a

mediului, de unde se întinde cu ansa în striuri paralele. Se sterilizează ansa şi pornind de la ultimile striuri, perpendicular pe acestea, se mai efectuează câteva striuri paralele. Operaţia se repetă până la epuizarea suprafeţei mediului.

Figura 5: Tehnica însămânţării prin epuizarea încărcăturii ansei bacteriologice

b. Metoda diluţiilorSe folosesc mai multe tuburi cu geloză înclinată. Se însămânţează cu pipeta

Pasteur lichidul de condens al primului tub. Prin înclinare se răspândeşte lichidul pe toată

suprafaţa mediului. Se trece o picătură în lichidul de condens al celui de al doilea tub,

procedându-se la fel, până la ultimul tub. În ultimele tuburi vor apare colonii izolate.

Diluţia poate fi realizată şi în tuburi cu mediul lichid, de unde se pasează câte o picătură

în lichidul de condens al tuburilor cu geloză înclinată.

Figura 6: Tehnica însămânţării prin epuizarea încărcăturii ansei bacteriologice

Figura 7: Tehnica însămânţării prin epuizarea încărcăturii ansei bacteriologice

TEHNICI SPECIALE DE IZOLARE

a. Bacteriile sporulate. Se izolează de cele nesporulate prin încălzirea produsului patologic la 800C timp de 30 de minute, sau la 1000C timp de 2 minute, pentru distrugerea formelor vegetative. După răcire, se însămânţează în vederea izolării fiecărei specii sporulate prin metode obişnuite.

b. Izolarea bacteriilor anaerobe dintr-un produs care conţine şi specii aerobe, se face pe medii lipsite de oxigen, prin metoda diluţiilor. Apoi se însămânţează în mediul Tarozzi, pentru a obţine o cultură pură abundentă. Dacă bacteriile anaerobe din produsul patologic sunt şi sporulate, acestea se izolează prin încălzirea prealabilă a culturii la 800C timp de 30 de minute.

Mediile de cultură utilizate pentru speciile aanaerobe trebuie să fie lipsite de aer şi cu un potenţial redox cât mai coborât. Cultivarea în condiţii de anaerobioză se face prin mai multe metode : - introducerea plăcilor însămânţate în aparate metalice din care se scoate aerul cu o pompă de vid;

- înlocuirea aerului atmosferic cu gaze inerte, cu un amestec de 90% hidrogen şi 5% bioxid de carbon;

- însămânţarea pe medii sterile conţinând organe proaspete (fragmente de ficat, rinichi) care să scadă potenţialul redox al mediului (mediul Tarozzi);

- cultivarea în tuburi lungi şi subţiri cu geloză semisolidă de tip Veillon;- însămânţarea în medii lichide se face după ce acestea se fierb 15 minute şi se răcesc brusc la un jet de apă (se regenerează). Prin această manevră se elimină aerul din conţinutul lor.

c. Izolarea pe medii speciale. Anumite microorganisme pot fi izolate din produsul patologic pe medii speciale: mediul Loffler pentru bacilul difteric, mediul Lowenstein pentru bacilul tuberculozei, etc.

INCUBAREA

Constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate în condiţii necesare dezvoltării germenilor: la majoritatea speciilor bacteriene cultura apare după 18-24 de ore de incubare la temperatura de 37C. La unele specii perioada de incubare este mai lungă, de la câteva zile la câteva săptămâni (exemplu: bacilul Koch). Unele bacterii necesită pentru dezvoltare o atmosferă de 5-10% CO2 (exemplu: pneumococul, meningococul).

IZOLAREA BACTERIILOR IN VIVO

Izolarea bacteriilor in vivo se realizează prin inocularea la animale sensibile a produselor patologice (exemple: pneumococul sau Klebsiella pe şoarece, bacilul tuberculozei pe cobai, etc.).

Produsul patologic se inoculează ca atare sau suspensionat în soluţie cloruro-sodică izotonă, utilizând seringi şi ace sterile.

Calea de inoculare este diferită în funcţie de afinităţile pentru ţesut ale germenului: calea subcutanată pentru produsele cu floră de asociaţie care rămâne cantonată la poarta de intrare; calea intraperitoneală utilizată pentru produsele patologice monomicrobiene; calea intravenoasă; instilare pe mucoasa nazală, calea conjunctivală, per os, intramuscular, intracerebral etc.

Dacă operaţiunea de inoculare a animalului nu este urmată de leziuni, animalul rămânând sănătos, se pot efectua o suită de pasaje oarbe pe animale în scopul exacerbării virulenţei germenului.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE CU STAFILOCOCStafilococii sunt germeni ubicvitari, răspândiţi în natură (în apă, aer, sol),

prezenţi pe pielea şi mucoasele organismului uman. Stafilococii, în special S. aureus şi S. epidermidis, fac parte din flora normală a unor indivizi (“purtători asimptomatici”), ca germeni saprofiţi, localizarea predilectă fiind fosele nazale. Ei se pot afla la originea unor procese infecţioase, fie prin auto-infecţie, fie prin transmitere la alţi indivizi.

Aproximativ 20-75% dintre indivizi sunt purtători de S. aureus, fapt deosebit de important în urmărirea şi apariţia infecţiilor nosocomiale. Se apreciază că peste 80% din personalul medico-sanitar este purtător de S. aureus. Transmiterea este în special interumană directă (contact direct, mâini murdare) sau indirectă, prin alimente sau din mediul exterior.

Infecţiile umane stafilococice sunt foarte variate. La nivelul pielii şi mucoaselor pot genera impetigo, furuncule, foliculite, sindromul “pielii oparite” sau boala Ritter von Rittershain prin secreţie de exfoliatine; la nivel visceral pot fi implicaţi în producerea de osteomielite, endocardite, septicemii, infecţii urinare, toxiinfecţii alimentare, enterocolite acute şi temutul sindrom al şocului toxic TSST-1 (Toxic Shock Syndrome Toxin 1),

consecinţa unei vaginite cu S. aureus secretor de exotoxina 1 la femeile folosind tampoane intravaginale.

Diagnosticul de laborator în infecţiile stafilococice este bacteriologic: se urmăreşte însămânţarea şi identificarea germenilor, precum şi testarea sensibilităţii la antibiotice în vederea instituirii unei conduite terapeutice adecvate.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Recoltarea trebuie facută înaintea administrării de antibiotice şi cu respectarea riguroasă a regulilor de antisepsie, atât în ceea ce priveşte hemocultura, LCR, lichidul articular, urina, dar şi în cazul secreţiilor purulente, aspiratul bronşic, exudatele faringiene şi nazale. Cel mai mare risc este reprezentat de contaminarea accidentală a prelevatelor cu tulpini de S. aureus şi S. epidermidis prezenţi la nivelul pielii.

În cazul toxiinfecţiilor alimentare se vor recolta materii fecale, lichid de vărsătură, resturi din alimentul ingerat. În situaţiile când sunt incriminate epidemiile hidrice se recoltează probe de apă din reţaua de aducţiune sau din piscine.

În mediul spitalicesc se recoltează probe de pe suprafeţe şi din aer conform normelor antiepidemice în vigoare şi în colaborare cu medicul epidemiolog.

Pentru depistarea purtătorilor nazofaringieni de stafilococ patogen se recoltează

exudatul faringian şi nazal.

Transportul probelor recoltate se face cât mai repede la laborator folosind mediile de transport gelozate sau recipiente sterile corespunzătoare (urocultoare, coprocultoare, tampoane pentru exudat faringian sau nazal etc.).

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1. Examenul direct:

Se efectuează direct din produsele patologice, prin două tipuri de preparate:- între lamă şi lamelă: pentru aprecierea mobilitaţii germenului, a prezenţei sau absenţei capsulei bacteriene;- pe frotiuri fixate şi colorate: Gram, albastru de metilen şi May-Grunwald Giemsa.

Frotiurile efectuate direct din produsele patologice, colorate Gram, evidenţiază coci Gram pozitivi sferici, aşezaţi în grămezi (în ciorchine de strugure), nesporulaţi, uneori încapsulaţi, care, în cazul produselor normal contaminate, pot fi însoţiţi de alţi coci sau bacili (floră de asociaţie), polimorfonucleare (PMN) şi celule epiteliale, întregi sau detritusuri (figurile 1 şi 2).

Examenul direct între lamă şi lamelă evidenţiaza germeni imobili. Coloraţiile cu albastru de metilen şi May-Grunwald Giemsa evidenţiază aspectul

citologic şi relaţia dintre fagocite şi germeni.

2.2. Izolare in vitroSe însămânţează produsele pe medii de cultură simple (bulion glucozat, geloză

simplă), stafilococii fiind germeni puţin exigenţi din punct de vedere metabolic, ca şi pe geloză cu 5% sânge defibrinat de berbec (geloză sânge). De asemenea, se pot folosi mediile de cultură hiperclorurate, lichide şi solide, care conţin NaCl în concentraţie de 7,5 g%, deoarece permit dezvoltarea preferenţială a stafilococului inhibând flora de asociaţie (pentru produsele patologice polimicrobiene sau alimente). Mediul hiperclorurat lichid Chapman este un mediu de îmbogăţire pentru stafilococ. După însămânţarea produsului pe acest mediu şi incubare 48 de ore la 37C se fac treceri pe mediul

Figura 2: Frotiu colorat Gram din sputa unui pacient cu pneumonie stafilococică. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 1: Frotiu colorat Gram dintr-un abces: Stafilococi. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

hiperclorurat solid Chapman, care evidenţiază fermentarea manitei, caracter de patogenitate al stafilococului.

Stafilococii sunt aerobi, facultativ anaerobi, iar incubarea mediilor se face la 37C fără precauţii deosebite.

2.3. IdentificareDe departe, cea mai importantă specie incriminată în patologia umană este cea a

S. aureus, dar, în cazul izolatelor repetate ce provin din hemoculturi, LCR, lichid intraarticular, seroase, în cazul purtătorilor de valve cardiace, imunodeprimaţi, sunt de aceeaşi gravitate şi identificarea altor specii de stafilococi, de ex. S. epidermidis, S. schleiferi, S. lugdunensis, S. warneri sau S. haemolyticus.

În acest context, utilizarea termenului de “stafilococ patogen”, “stafilococ auriu hemolitic” în editarea buletinelor de analiză trebuie proscris, ţinând cont de semnificaţia clinico-epidemiologică, dar şi datorită faptului, unanim acceptat astăzi, că specificitatea unor caractere precum hemoliza, pigmentogeneza sau fermentarea manitei este inconstantă şi nu numai apanajul definitoriu al tulpinilor de S. aureus.

De aceea stabilirea diagnosticului bacteriologic de certitudine în infecţiile stafilococice trebuie să reprezinte, în final, rezultatul colaborării dintre medicul clinician şi medicul microbiolog.

2.3.1. Caractere de culturăPe mediile lichideStafilococii tulbură uniform mediul cu depozit moderat la fundul tubului de

cultură.

Pe mediile solidePe mediile cu geloză determină apariţia de colonii de tip S (“smooth” - neted),

opace, convexe, de aspect cremos, cu diametrul de 2-3 mm, dar putând atinge şi dimensiuni de 7 mm în cazul unei incubări prelungite, de la 48 la 72 de ore. Marginile coloniilor sunt regulate, suprafaţa lucioasă. Tulpinile de stafilococi cu alterări ale peretelui celular provenind din probe ce conţin substanţe antimicrobiene pot da colonii de tip G (“glossy”- lucios), pitice, sau de tip G-R (“rough”- rugos), mici, cu margini imperfecte, granulate. Pe mediu lichid acest tip de germeni nu tulbură mediul, depunându-se doar la baza tubului sub forma unui mic depozit granular.

În cazul stafilococilor cu capsula polizaharidică (“slime”) aceştia dezvoltă colonii de tip M, mucoase, în special în cazul culturilor efectuate direct din prelevate.

Coloniile sunt pigmentate diferit (alb, aureu, citrin). Clasic, coloniile de S. aureus sunt descrise ca producând un pigment de culoare galben-auriu (oranj), ca o caracteristică relativ constantă, dar acestă producţie este descrisă şi la alte specii cum ar fi S. saprophyticus, S. hominis, S. haemolyticus şi de aceea are o valoare mai mult orientativă. Pigmentogeneza se intensifică dupa 1-2 zile la temperatura camerei. Mediile cu suplimente nutritive (ou, ser, lapte etc.), cum ar fi, de exemplu, geloza P cu lapte, favorizeaza pigmentogeneza. Mai sunt descrise şi colonii de S. aureus de culoare galben citrin, portocalii sau albe (figurile 3, 4 şi 5).

Pe mediul cu telurit Baird-Parker coloniile de S. aureus au diametrul de 1-1,5 mm, sunt convexe, negre strălucitoare cu bordură îngustă, albă şi halou clar cu diametrul de 2-5 mm.

Pe geloza cu 5% sânge defibrinat de berbec (geloză sânge) tulpinile de S. aureus, dar şi S. haemolyticus, produc o zona de hemoliză completă, clară, netă, de tip alfa (se datorează eliberării hemolizinei alfa). Mai pot determina şi o hemoliză incompletă, nebuloasă după 24 de ore de termostatare, dar după depunerea la frigider a plăcii cu mediu se accentuează (hemoliza de tip “cald-rece”), datorată hemolizinei beta.

2.3.2. Caractere morfologiceExamenul microscopic al frotiurilor efectuate din culturile crescute în medii

lichide sau pe mediile solide şi colorate Gram evidenţiază coci Gram pozitivi sferici, aşezaţi în grămezi neregulate, necapsulaţi, nesporulaţi (figurile 6 şi 7).

Pe preparatul nativ între lamă şi lamelă se observă lipsa mobilităţii.

Figura 3: Stafilococi albi - geloză sânge (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Figura 4: Stafilococi aurei - geloză sânge (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Figura 5: Stafilococi aurei - geloză sânge (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Figura 6: Frotiu colorat Gram din cultură - Stafilococi. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

2.3.3. Caractere metabolice

• Fermentarea hidraţilor de carbonStafilococii au un metabolism oxidativ fermentativ, spre deosebire de micrococi.

Ei fermentează hidraţii de carbon, precum: glucoza, lactoza, maltoza, zaharoza, acidificând mediul.

Stafilococii tolerează medii cu concentraţie crescută de NaCl (7,5 g%), iar 94% dintre tulpinile de S. aureus, spre deosebire de majoritatea celorlalte specii de stafilococi fermentează manita cu producţie de acid. Aceste proprietăţi sunt exploatate de mediul Chapman, care conţine 7,5 g% NaCl (ceea ce face mediul selectiv pentru genul Staphylococcus) şi manită care este fermentată de către S. aureus. Acidifierea mediului se traduce prin virajul culorii indicatorului de pH (roşu metil) în galben.(figura 8).

• Testul catalazei Stafilococii ca şi micrococii, spre deosebire de streptococci, posedă o catalază

capabilă să transforme peroxidul de hidrogen în oxigen şi apă. Testul se efectuează pe o lamă de sticlă port-obiect (prin descarcarea unei colonii dintr-o cultură de stafilococi într-o picătură de peroxid de hidrogen) sau în tub. Degajarea unor bule de gaz traduce prezenţa catalazei. Se preferă recoltarea coloniilor de pe mediul nutritiv gelozat, evitând geloza sânge, deoarece pot apare reacţii fals positive, în cazul existenţei streptococilor, prin antrenarea de hematii din mediu (figura 9).

Figura 7: Frotiu colorat Gram din cultură - Stafilococi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979.

Figura 8: Testul fermentării manitei pe mediul Chapman: negativ (roşu) la stânga şi pozitiv (viraj în galben) la dreapta (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

• Testul oxidazeiStafilococii sunt oxidazo-negativi, spre deosebire de micrococi care sunt

oxidazo-pozitivi. În practică se folosesc fie benzi de hârtie, fie discuri de oxidază.

Figura 9: Testul catalazei în tub. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Reacţie pozitivă: Staphilococcus aureus

Martor

Reacţie negativă: Streptococcus faecalis

Descarcarea unei colonii bacteriene poate duce la apariţia unei reacţii colorate în violet în primele 30 de secunde pentru germenii oxidazo-pozitivi (micrococii), sau lipsa unei reacţii de culoare în cazul tulpinilor oxidazo-negative (stafilococii, streptococii). O reacţie de culoare ce apare într-un interval de timp mai mare de 30 secunde se va interpreta ca reacţie fals pozitivă!

• Determinarea sensibilităţii la novobiocină Stafilococii “coagulazo-negativi”, iniţial consideraţi germeni comensali, sunt

astăzi recunoscuţi ca bacterii potenţial patogene, responsabili de infecţii nozocomiale, în special în serviciile de reanimare, la purtătorii de catetere sau de proteze. Cei mai des întâlniţi sunt S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis (considerat ca fiind cel mai patogen), S. schleiferi, S. saprophyticus, S. hominis.

Determinarea sensibilităţii la novobiocină a diferitelor specii de stafilococi izolaţi la om, a permis să se individualizeze 2 categorii: stafilococii sensibili la novobiocină, aici fiind cuprins şi S. aureus, dar şi 9 specii de stafilococi “coagulazo-negativi” şi stafilococii rezistenţi la novobiocină, cuprinzând numai 3 specii de stafilococi “coagulazo-negativi” (tabelul I).

Sensibili la Novobiocina S.aureusS. auricularis

S. capitis subsp. capitisS. capitis susp. ureolyticus

S. caprae (*)S. epidermidis

S. haemolyticusS. hominis

S. intermediusS. lugdunensis

S. schleiferi subsp. coagulans (*)

S. schleiferi subsp. schleiferiS. simulansS. warneri

Rezistenti la Novobiocina S. cohniiS. saprophyticus

S. xylosus

(*) = caz unic de tulpină izolată la omTabelul I: Clasificarea stafilococilor de origine umană după sensibilitatea la Novobiocină (dupa F. Vandenesch ., M. Bes, J.Etienne - Staphylococcus. În: Manuel de Bacteriologie

clinique, Ed. Elsevier, 1995)

Testul se realizează studiind creşterea bacteriană în jurul unui disc de novobiocina (5 mg/disc). Tulpinile sunt considerate rezistente dacă diametrul zonei de inhibiţie este mai mic de 12 mm în cazul tulpinilor însămânţate pe mediu gelozat adiţionat cu 5% sânge de berbec, sau mai mic de 16 mm în cazul tulpinilor însămânţate pe mediu gelozat

tip Mueller Hinton (figura 10).

• Stabilirea profilului biochimic (biochemotipia) Biochemotipia conta în stabilirea profilului biochimic (reacţiile specifice în

prezenţa anumitor substraturi) al fiecarei tulpini izolate, prin utilizarea galeriilor biochimice standardizate şi miniaturizate.

Au la bază utilizarea unui număr variabil de teste biochimice (acidifierea diferiţilor hidraţi de carbon şi producerea de reacţii specifice în prezenţa unor substraturi ca: ureaza, nitraza, fosfataza, ornitildecarboxilaza etc.). Rezultatele se bazează pe citirea vizuală sau automată a reacţiilor de culoare apărute după inocularea galeriilor cu o suspensie din tulpina de testat şi termostatate timp de 18-24 ore la 37 oC.

Figura 10: Aspectul testului la Novobiocină pentru o tulpină pozitivă (stânga) şi o tulpina negativă (dreapta) (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

Extrem de folosite la nivel mondial în cadrul laboratoarelor de analize medicale, dar şi al laboratoarelor de cercetare, aceste galerii biochimice standardizate şi miniaturizate încep să-şi facă loc şi în practica obişnuită a laboratoarelor de bacteriologie din România.

Fiabilitatea rezultatelor, scurtarea timpului de investigaţie, gradul mult mai redus de eroare faţă de tehnicile clasice (cu condiţia respectării acurateţei tehnicii preconizată de producător), acceptarea internaţională a datelor astfel obţinute sunt tot atâtea argumente care pledează pentru utilizare lor pe scară largă în cadrul identificărilor bacteriologice de rutină în vederea stabilirii unui diagnostic microbiologic corect.

Studiile multicentrice internaţionale realizate în ultimii ani au demonstrat buna reproductibilitate a acestor sisteme, ele permiţând identificarea corectă în mai mult de 95,5% din cazuri pentru majoritatea speciilor bacteriene cunoscute.

Dintre galeriile de identificarea speciilor de stafilococi amintim :o galeriile API STAPH (bioMerieux): folosesc 19 teste de identificare - 19 specii de

stafilococi identificate; citire vizuală şi automată.o ID 32 STAPH (bioMerieux): folosesc 26 de teste de identificare - 24 specii

identificate; citire vizuală şi automată.o galeriile ATB 32 STAPH (France Api System): folosesc 26 de teste de identificare -

identificarea inclusiv şi a speciilor nou descrise în ultimul deceniu; citire vizuală şi automată.

o Micro Scan Pos Combo (Baxter Diagnostic) şi Rapid Pos Combo (Baxter Diagnostic) - au şi avantajul deteminării sensibilităţii la antibiotice; citire automată.

2.3.4. Caractere de patogenitateSe evidenţiază prin teste de patogenitate in vitro şi in vivo.

Teste de patogenitate in vitro• Testul pigmentogenezei: stafilococii citrini sunt nepatogeni, cei albi sunt 20% patogeni şi 80% nepatogeni, cei aurei sunt 80-90% patogeni şi 10-20% nepatogeni.

• Testul hemolizei: stafilococii hemolitici sunt patogeni (hemoliză de tip “cald-rece” datorată hemolizinei beta).

• Testul fermentării manitei: pe mediul hiperclorurat solid Chapman (NaCl, manită, roşu fenol ca indicator) (figura 8).

• Testul coagulazei (coagulaza: enzimă legată de virulenţa-patogenitatea germenului, cu rol antifagocitar).

Identificarea coagulazei liberePrezenţa coagulazei libere este un element major pe baza căruia se poate afirma

caracterul patogen al unei tulpini de stafilococ.Este considerat, încă, testul principal de identificare a S. aureus, dar şi o serie de

alte specii de stafilococi, precum S. delphini, S. intermedius, S. schleiferi subsp. coagulans, S. hyicus produc coagulaza. Aceste tulpini sunt, însă, în mod cu totul excepţional izolate la om.

Deşi testul permite identificarea a 99% dintre tulpinile de S. aureus, s-au descris tulpini de S. aureus care nu produc coagulaza liberă ca urmare a unui deficit transcripţional sau post-transcripţional al genei coagulazei: identificarea speciei, în acest caz, se realizează prin coroborarea rezultatelor altor teste.

Tehnica - Se efectuează în tuburi de hemoliză, punând în contact 0,5 ml plasmă liofilizată de iepure şi resuspendată extemporaneu în apa distilată cu 0,5 ml din cultura în bulion (ex. apă peptonată, bulion cord-creier, bulion Tripcase-soia) a tulpinii de testat, incubată în prealabil timp de 18-24 de ore la 37oC.

- Se agită amestecul astfel realizat punându-se la etuvă sau la bain-marie la 37oC.- Se citeşte reacţia prin înclinarea uşoară a tubului, la: 30 minute, 1 oră, 3 ore, 4 ore. Apariţia unui cheag de fibrină complet semnifică o reacţie pozitivă. După citirea cheagului la 4 ore, cultura se lasă în continuare la termostat la 37oC timp de 18 ore. Apariţia unui cheag incomplet în acest interval de timp defineşte tot o reacţie pozitivă. Reacţia negativă se traduce prin lipsa apariţiei fenomenului de coagulare al plasmei în condiţiile de mai sus (figura 11).

Identificarea coagulazei legate, sau evidenţierea factorului de afinitate pentru fibrinogen sau clumping factorul (Clumping factor test)

Factorul de afinitate pentru fibrinogen, un receptor proteic pentru un fragment al fibrinogenului prezent la nivelul peretelui bacterian al S. aureus, permite constituirea unui agregat bacterian în prezenţa fibrinogenului în soluţie. In vivo el determina aderarea germenilor de micro-cheagurile prezente la nivelul breşelor vasculare şi de materialele străine (ex. valve cardiace).

În interpretarea rezultatelor se va ţine cont de faptul că, un procent cuprins între 1 şi 10% dintre tulpinile de S. aureus, în special cele rezistente la meticilină, nu produc factorul de afinitate pentru fibrinogen; pe de altă parte, şi alte specii de stafilococi, cum ar fi: S. schleiferi subsp. Schleiferi, S. lugdunensis şi S. intermedius pot da rezultate positive.

Tehnica

Metoda clasică, dar care la ora actuală este în mare parte abandonată, constă în determinarea aglutinarii pe lamă a stafilococilor, proveniţi dintr-o cultură de 24 de ore la 37oC pe geloza înclinată, în prezenţa unei picături de plasmă umană diluată 1/5.

Metode moderneLipsa standardizării, riscul bio-contaminării personalului de laborator şi

posibilitatea reacţiilor neconcludente sub influenţa diferiţilor factori individuali în cazul metodei clasice sus-amintite a făcut ca, la ora actuală, să fie comercializate şi puse la dispoziţia laboratoarelor suspensii standardizate de hematii de berbec sensibilizate cu fibrinogen uman purificat (ex. Staphyslide Test, Bio Merieux, Franta; Staphyloslide - BBL, USA etc).

Ca tehnică, în paralel cu un martor negativ de control, se pune în contact o picătură de reactiv anti-stafilococic şi o colonie de talie mijlocie din tulpina de testat recoltată cu ansa de pe suprafaţa mediului de cultură gelozat.

Timp de 10-15 secunde se imprimă lamei o uşoară mişcare de rotaţie.

Figura 11: Testul coagulării plasmei în tuburi (sursa: http://www. microbes_med.sc.edu 85)

O reacţie pozitivă se traduce prin apariţia unei aglutinări sub formă de grunji. Reacţia este neinterpretabilă dacă reactivul de control prezintă aglutinare. O reacţie negativă, deci lipsa factorului de afinitate pentru fibrinogen, este evidenţiată prin absenţa aglutinării (figura 12).

Figura 12: Identificarea coagulazei legate (evidenţierea factorului de afinitate pentru fibrinogen) (sursa: http: //www.2

ac-lyon.fr/enseigne/biotech/microbio/tests_microbiologie 2.htm)

• Testul fibrinolizinei. Se efectuează pe un mediu alcătuit din 7 părţi geloză şi o parte plasmă oxalatată care se adaugă la geloza topită şi răcită la 50C. După însămânţarea tulpinii izolate şi incubarea la 37C se observă o zonă clară în jurul coloniilor prin topirea de către fibrinolizină.

Teste de patogenitate in vivo

Există tehnici prin care se testează patogenitatea stafilococilor pe animale de

laborator (iepure, pisoi) care, însă, astăzi, nu mai sunt de actualitate:

- testul dermonecrotic (inoculare intradermică) şi testul letal (inoculare intravenoasă) la iepure;- testul Dolman: inoculare intraperitoneală la pisoi de 3-6 săptămâni, a filtratului de cultură fiert 30 de minute la 100°C (evidenţiază enterotoxina ce este produsă de anumite tipuri de stafilococi capabile să producă toxiinfecţii alimentare).

Clumping factor test

Test pozitiv: Staphilococcus

aureus

Test negativ: Staphilococcus

epidermidis

Mai nou detectarea toxinogenezei stafilococilor este apanajul laboratoarelor de specialitate (Institutul Ion Cantacuzino - Bucuresti, laboratoare de igiena si supraveghere antiepidemica etc.). Se utilizeaza truse standardizate comercializate de diferite firme pentru evidentierea productiei de enterotoxine stafilococice (Oxoid, Ridascreen Germany etc.). Medodele utilizate au la baza fie tehnica ELISA, fie reactii cromogenice, fie reactii de aglutinare pasiva inversata (reversed passive latex agglutination - RPLA).

2.3.5. Sensibilitatea la bacteriofagii litici (lizotipia)Lizotipia constă în determinarea sensibilităţii unei tulpini bacteriene la

acţiunea litică a unor bacteriofagi. Este metoda cea mai utilizată în epidemiile cu S. aureus. Setul de bază de bacteriofagi folosiţi şi metodologia de lucru sunt standardizate şi revizuite periodic sub controlul Comitetului Internaţional pentru Lizotipia Stafilococilor cu sediul la Colindale (Anglia) încă din 1950. În 1998 acest comitet a stabilit setul de bază internaţional al bacteriofagilor utilizaţi pentru tiparea S. aureus de provenienţă umană, la recomandarea Subcomitetului OMS pentru Lizotipia Stafilococului. Utilizarea acestor seturi standardizate de bacteriofagi permite exprimarea unitară la scară internaţională a diferitelor lizotipuri. care definesc urmatoarele grupe litice :

Grupul I (29/52//52A/79/80); Grupul II (3A/3C/55/71); Grupul III (6/42E/47/53/75/77/83A/84/85); Grupul V (94/96); Grupul Miscellaneous (81/95); Grupul experimental (88,89,90,HK2,

D11); Grupul aditional (69,73,78,42B, 47C,52B).

Prima citire a acţiunii fiecărui fag, tradusă prin prezenţa sau absenţa

plajelor de liză, se face dupa 24 de ore de incubare la 30oC, iar a doua citire după

menţinerea placilor timp de 24 de ore la temperatura camerei (laboratorului).

Rezultatul acţiunii fiecarui fag se traduce prin prezenţa sau absenţa plajelor

de liză.

Pe plan epidemiologic se consideră că două tulpini sunt diferite dacă ele

variază prin cel puţin două atacuri fagice puternice (lize confluente).

Tulpinile de stafilococ de origine umană fac parte în majoritatea lor din

grupurile fagice I şi III. Există de asemenea şi multe atacuri mixte.

Tulpinile de grup fagic II au tropism accentuat pentru ţesutul dermic, iar

cele enterotoxigene din grupurile III şi IV.

Tulpinile de SARM sunt cel mai frecvent de grup fagic III sau nelizotipabile.

2.4. AntibiogramaAntibiograma (antibiotipia) reprezintă stabilirea caracterelor de sensibilitate

ale tulpinii bacteriene la acţiunea diferitelor antibiotice şi substanţe dezinfectante uzuale.

Spectrul de sensibilitate la antibiotice oferă informaţii preţioase asupra

circulaţiei unei tulpini pe arii restrânse, dar şi exprimarea unor caractere cu

specificitate regională sau chiar de tară.

Este obligatorie după identificarea unei tulpini recunoscute ca având un potenţial patogen declarat sau care poate deveni patogenă în anumite situaţii clinico-epidemiologice, în vederea instituirii unei terapii adecvate. Coroborarea cu datele clinice e DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE STREPTOCOCI

Manifestările clinice determinate de streptococi includ: - infecţii acute supurative (angina eritematoasă, sinuzite, otite, mastoidite, endocardite, pneumonii, bronhopneumonii etc.) şi nesupurative (scarlatina);- complicaţii: glomerulonefrita acută difuză, reumatismul articular acut, cardita reumatismală, eritemul nodos, coreea Hungtington.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (izolarea şi identificarea germenului) şi imunobiologic (confirmă diagnosticul etiologic, diagnostichează complicaţiile poststreptococice, urmăreşte eficienţa tratamentului).

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICEProdusele patologice recoltate pot fi: exudat faringian, exudat nazal, spută, LCR,

puroi, exudat pleural, secreţie otică, secreţie vaginală, secrceţie de col uterin, sânge, urină, material necroptic.

Recoltarea produselor patologice trebuie să se facă înainte de începerea oricărui tratament cu antibiotice, înainte de toaleta de dimineaţă şi înainte de masă.

Însămânţarea produselor patologice trebuie să se facă în cel mult 1-2 ore de la recoltare.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1. Examen direct:

Frotiul efectuat din produsul patologic, în scop orientativ, are importanţă pentru produsele normal sterile; se efectuează 2 frotiuri: unul colorat Gram şi celălalt albastru de metilen, ultimul important pentru studiul elementelor celulare.

Coloraţia Gram evidenţiază: coci Gram pozitivi sferici, aşezaţi în lanţuri, nesporulaţi, floră de asociaţie (alţi coci sau bacili), polimorfonucleare (PMN), celule epiteliale întregi sau detritusuri (figurile 1, 2 şi 3).

În cazul exudatului faringian, frotiul serveşte numai pentru diagnosticul diferenţial (pentru eliminarea altei etiologii microbiene).

De remarcat faptul că pe un astfel de frotiu nu se poate face diferenţierea între streptococii hemolitici şi streptococul viridans, un comensal obligatoriu al căilor respiratorii superioare.

Figura 1: Streptococi. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

Figura 2: Streptococi. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

2.2. Izolare in vitro Se utilizează următoarele medii de cultură: medii de imbogăţire - mediul Picke

(cristal violet şi azidă de sodiu), medii de izolare complexe (bulion glucozat, geloză sânge).

Însămânţarea produsului patologic se face: fie în suprafaţa mediilor, fie în condiţii de semianaerobioză pentru produsele patologice lichide din cavităţi închise (puroi otic, mastoidian, sinusal, LCR). Produsul patologic se depune la fundul unei plăci goale, peste care se toarnă sânge sau se incubează în atmosferă de CO2 5%.

Urmează incubarea la 370C 18-20 de ore şi etapa de identificare. Tampoanele introduse în mediul de îmbogăţire se incubează 3-5 ore la 370C, după

care se fac treceri pe geloză-sânge, care se incubează 18-20 de ore la 370C.

2.3. Identificare2.3.1. Caractere de cultură

Medii lichide: tulbură uşor mediul cu formarea unui depozit; Pe medii solide: pe geloză sânge streptococul de grup A poate să determine:

• colonii mucoide: colonii rotunde, cu suprafaţa convexă, lucioase, de consistenţă mucoasă, filantă; sunt caracteristice streptococilor încapsulaţi, virulenţi şi cu proteină M;

• colonii „mtt“: colonii turtite, apoase, cu suprafaţa neregulată, mamelonată, cu tendinţă de confluare (aspect de hartă geografică);

• colonii „glossy“: colonii rotunde, bine delimitate, mici, lucioase, cu suprafaţă conică; corespund streptococilor neîncapsulaţi, cu conţinut variabil de proteină M;

• colonii „rough“: colonii turtite, uscate, cu margini dinţate şi cu suprafaţă rugoasă, care se detaşează în totalitate de pe suprafaţa mediului, lăsând pe locul respectiv o amprentă;

Figura 3: Streptococi. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Pe acelaşi mediu (geloză sînge) streptococii pot să determine sau nu hemoliză,

care poate fi (figurile 4, 5, 6, 7, 8 şi 9):

- β hemoliză: coloniile sunt înconjurate de o zonă completă, clară, de hemoliză, cu diametrul variabil în raport cu grupul antigenic;

- α hemoliză: coloniile sunt înconjurate de o zonă de hemoliză incompletă cu înverzirea mediului şi a coloniei. După menţinerea peste noapte la +40C poate să mai apară la exterior un alt inel de hemoliză completă.

Figura 4: Beta hemoliză. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 5: Beta hemoliză. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Figura 6: Streptococi beta hemolitici (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

- α’ hemoliză: colonii înconjurate de o zonă de hemoliză incompletă cu aspect voalat, înceţoşat. Îi spune hemoliză incompletă pentru că în zona de hemoliză din jurul coloniei se observă hematii intacte, nelizate.

- γ hemoliză: dată de streptococi nehemolitici.Streptococii de grup A sunt streptococi β-hemolitici.

2.3.2. Caractere morfologice

Figura 7: Streptococi beta hemolitici (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

Figura 8: Streptococi alfa-hemolitici (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

Frotiul din cultură evidenţiază coci Gram pozitivi sferici, aşezaţi în lanţuri, capsulaţi, nesporulaţi (figurile 10 şi 11).

2.3.3. Caractere biochimice• Testul sensibilităţii la bacitracină

Diferenţiază streptococii β-hemolitici de grup A de cei β-hemolitici non-grup A.Se prelevă 3-4 colonii β-hemolitice sau o ansă din cultura în bulion. Se etalează

inoculul pe placa cu agar-sânge. Se plaseză apoi în centrul ariei însămânţate un disc cu bacitracină. Se incubează 18-20 de ore la 370C (figurile 12 şi 13).

Figura 9: Tipuri de hemoliză (http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

Figura 10: Frotiu din cultură - streptococi. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Test pozitiv: zonă de inhibiţie cu diametrul de minim 11 mm în jurul discului.Test negativ: zonă de inhibiţie cu diametrul mai mic de 11 mm sau lipsa zonei de

inhibiţie în jurul microcomprimatului cu bacitracină.

Streptococii de grup A sunt sensibili la bacitracină.

Figura 12: Testul la bacitracină. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Test pozitiv la bacitracină - streptococ beta-hemolitic grup A

Test negativ la bacitracină - streptococ, dar nu beta-hemolitic grup A

Figura 11: Frotiu din cultură - streptococi. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

• Testul CAMPSe foloseşte pentru identificarea streptococilor de grup B. Streptococii de grup B

produc un factor difuzibil, factorul CAMP, care acţionează sinergic cu β-lizina stafilococică, determinând liza completă a hematiilor de berbec sau de bou.

Se însămânţează un striu din tulpina indicatoare de stafilococ auriu pe un diametru al plăcii. Tulpinile de testat şi tulpinile martor se însămânţează în striuri fine, liniare, de cca 2 cm lungime, perpendicular pe striul tulpinii indicator, dar fără a o atinge. Se incubează plăcile la 370C peste noapte.

Test pozitiv: lărgirea cuneiformă în vârf de săgeată sau în flacără a ariei de hemoliză produsă de cultura stafilococului (figura 14).

Test negativ: nici o modificare a hemolizei. Testul poate fi pozitiv şi pentru alte grupuri: E, P, U, V.

• Testul PYR (L-pyrrolidonyl-β-naphtylamidă)

Figura 13: Testul la bacitracină. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 14: Testul CAMP (http//www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p. 45)

Test pozitivTest negativ

Diferenţiază streptococii de grup A , de cei β-hemolitici non-grup A. Este mai specific decât testul la Bacitracină.

Streptococii β-hemolitici de grup A hidrolizează substratul PYR în L-pirolidonă şi β-naphtylamidă, care prin reacţie cu reactivul PYR (p-dimetilamino-cinamaldehidă) dă culoare roşie.

Se suspensionează o ansă încărcată cu cultură într-un tub cu bulion PYR. Se incubează 4 ore la 370C, apoi se adaugă o picătură de reactiv PYR.

Test pozitiv: culoare roşie - purpurie după 2 minute de la adăugarea reactivului

PYR.

Test negativ: apariţia oricărei culori.

• Testul SXT (sulfametoxazol-trimetoprim)Este folosit pentru diferenţierea streptococilor de grup A şi B, de ceilalţi

streptococi β-hemolitici; majoritatea streptococilor de grup A şi B sunt rezistenţi la SXT atunci când sunt incubaţi în atmosferă normală.

Se prelevă 2-3 colonii sau o ansă din cultura pură şi se însămânţează o placă cu agar-sânge. Se depune în mijlocul ariei însămânţate un disc cu SXT. Se incubează peste noapte în atmosferă normală la 370C.

Test pozitiv (germeni sensibli la SXT): orice zonă de inhibiţie în jurul discului cu SXT. Ex: streptococii de grup C ori G.

Test negativ (rezistent la SXT): creştere până la disc. Exemplu: streptococii de grup A ori B.

• Testul bilă-esculinăSe foloseşte pentru identificarea streptococilor de grup D şi a enterococilor,

fiind probabil testul cel mai fidel.

Enterococii şi streptococii de grup D cresc pe mediul cu 40% bilă şi hidrolizează esculina cu eliberare de glucoză şi un compus neglucidic (esculetina-dihidroxicumarina), care reacţionează cu sărurile de fier dând naştere unui produs de culoare neagră.

Se însămânţează cu 1-3 colonii panta mediului agar-esculină sau jumătatea unei plăci cu agar bilă-esculină. Se incubează la 370C peste noapte şi încă 24 de ore în cazul unui rezultat negativ.

Test pozitiv: creşterea şi înegrirea mediului din placă sau a cel puţin ½ din pantă.Test negativ: lipsa de înegrire a mediului din placă sau a pantei.

• Testul hipuratului de sodium Diferenţiază streptococii de grup B de alţi streptococi β-hemolitici.Hipuricaza hidrolizează hipuratul de sodiu în benzoat de sodiu şi glicină.

Ninhidrina dezaminează oxidativ glicina, rezultând aldehida corespunzătoare, CO2, NH3, hidrindantina (forma redusă a ninhidrinei). NH3 dă cu ninhidrina şi hidrindantina un complex colorat purpuriu.

Se suspensionează cultura de testat în 0,4 ml soluţie 1% hipurat de sodiu, până se obţine o soluţie lăptoasă. Se incubează suspensia 2 ore la 370C. Apoi se adaugă 0,2 ml din

soluţia de ninhidrină şi se reincubează 10-150 minute la 370C. Se urmăreşte virajul culorii.

Test pozitiv: culoare intens purpurie-hidroliza hipuratului.

Test negativ: culoare nemodificată.

• Testul sensibilităţii la vancomicină Diferenţiază genurile Streptococcus şi Enterococcus care sunt sensibile la

vancomicină, de genurile Leuconostoc şi Pediococus care sunt rezistente.Se prelevă cu ansa 5-10 colonii bine izolate sau un tampon bine scurs din cultura

de bulion. Se însămânţează ½ din placa de testare (plăci cu agar Mueller-Hinton). Se plasează prin presare uşoară, în centrul ariei însămânţate, un disc cu vancomicină. Se incubează peste noapte la 370C în atmosferă cu 5% CO2.

Test pozitiv (sensibilitate): apariţia oricărei zone de inhibiţie în jurul microcomprimatului.

Test negativ (rezistenţă): creştere până la discul cu vancomicină.

• Testul toleranţei la sareEste pozitiv pentru majoritatea speciilor de Enterococcus, care se dezvoltă în

bulion cu 6,5% NaCl în 24-72 ore la 370C, în timp ce tulpinile de Streptococcus nu se dezvoltă.

Tehnică: Pe un mediu cu 6,5% NaCl se însămânţează 2-3 colonii de microorganism. Se incubează 3 zile la 370C, cu urmărire zilnică pentru turbiditate şi virajul indicatorului (bromcrezol purpur).

Test pozitiv: turbiditate cu sau fără virajul indicatorului de la purpuriu la galben. Ex. Enterococcus faecalis.

Test negativ: absenţa turbidităţii şi modificării de culoare. Ex: Streptococcus viridans.

• Creşterea la 100C şi 450CEnterococul se dezvoltă la 100C şi 450C, ceea ce-l diferenţiază de speciile de

Pediococcus care se dezvoltă numai la 450C sau de Leuconostoc care se dezvoltă numai la 100C.

2.3.4. Caractere antigenice– Identificarea grupului streptococic

Se face pe baza antigenului polizaharidic C, care împarte steptococii în streptococi grupabili: notaţi cu literele A-W (cu excepţia literelor I şi J) şi streptococi negrupabili, lipsiţi de antigenul de grup.

Antigenul specific de grup (polizaharidul C sau acidul teichoic) poate fi identificat prin diferite reacţii antigen-anticorp.

Metode folosite:• Reacţia de precipitare în tuburi de precipitare

În mediu lichid seruri imune de referinţă sunt puse să reacţioneze cu antigenul de testat, aflat tot în faza lichidă. Extractul antigenic se poate obţine prin metoda

Lancefield (extracţie acidă la 1000C), sau metoda Fuller (extracţie cu formaldehidă la 1600C) sau prin autoclavare (15 min. La 1210C).

În tuburi de precipitare se pipetează extractul antigenic 0,1-0,2 ml într-un număr de tuburi egal cu numărul antiserurilor de referinţă. Se pipetează apoi o cantitate egală din fiecare antiser în tubul corespunzător, ci grijă, astfel încât cei doi reactivi să nu se amestece (se ţine tubul înclinat şi se lasă serul să se prelingă pe peretele acestuia). Serul, cu o densitate mai mare decât a extractului antigenic, se va depune la fundul tubului fără ca cei doi reactivi să se amestece.

După 15 min de incubare la temperatura camerei, se urmăreşte apariţia inelului de precipitare la interfaţa dintre cei doi reactivi. În caz de dubiu, se agită tuburile, se incubează 2 ore la 370C şi se lasă apoi peste noapte la 40C. A doua zi se urmăreşte depunerea de precipitat la fundul tubului, şi, în funcţie de cantitatea acestuia, se notează rezultatele pozitive semicantitativ (de la ++++ la +).

Se recomandă pentru identificarea streptococilor β-hemolitici de grup A, B, C, F, G, dar şi a celor non- β-hemolitici, de grup B şi D.

• Teste de aglutinare pe lamăSunt reacţii antigen-anticorp, care folosesc drept suport pentru anticorpii

specifici de grup fie stafilococi cu proteină A (reacţie de coaglutinare), fie particule de latex (reacţie de latex-aglutinare). Astfel:- Metoda coaglutinării: reacţia se efectuează pe lamă folosindu-se tulpina de identificat (antigenul) sub forma unei suspensii obţinută prin cultivarea tulpinii de identificat în bulion glucozat şi o trusă de antiseruri: A, B, C, F, G.

Principiul metodei: cuplarea stafilococului Cowan cu proteină A cu anticorpii specifici antistreptococici de grup. Fragmentul Fc al anticorpilor se fixează de proteina stafilococică, iar fragmentul Fab rămas liber reacţionează cu polizaharidul specific de grup, dând o reacţie vizibilă macroscopic, sub forma unor grunji, cu clarificarea fazei lichide.- Metoda latex-aglutinării: particularitatea reacţiei este dată de faptul că anticorpii specifici antigrup sunt fixaţi pe un suport reprezentat de particule de latex. Reacţia se desfăşoară pe lamă, rezultatul pozitiv (corespondenţă imună) însemnând apariţia grunjilor în faza lichidă clarificată.

Comparativ cu testul clasic al reacţiei de precipitare, testele de aglutinare pe lamă sunt mai rapide, mai economice, cu o sensibilitate şi specificitate cel puţin egale.

– Identificarea tipului M streptococicStreptococcus pyogenes se clasifică, după proteina M, în 80 de serovaruri M, care

pot fi identificate prin:• Reacţia de precipitare în tuburi capilare

Principiul reacţiei este ca cel de mai sus, dar în locul tuburilor de precipitare se

folosesc tuburi capilare cu diametrul de 0,7-1 mm şi lungimea de 75-90 mm. Se înmoaie

extremitatea capilarului în antiserul de referinţă şi se aspiră o coloană de 25-30 mm de

ser. Se aspiră în mod similar, peste antiserul de referinţă, o coloană de extract antigenic

cu înălţime egală cu a celei de ser, fără a interpune vreo bulă de aer la interfaţa dintre cei

doi reactivi. Se obturează orificiul inferior prin inplantarea verticală a tubului în blocul de

plastilină.

Reacţia se citeşte după 5 min., urmărindu-se apariţia unui precipitat alburiu la limita de separare a celor doi reactivi, pe fond întunecat.

– Identificarea tipului T streptococicPe baza proteinei T, Streptococcus pyogenes este împărţit în 28 serovaruri T, care

se identifică prin :• Reacţia de aglutinare pe lamă

Se efectuează între serurile anti-T adsorbite şi suspensia tulpinii de identificat cultivată în bulion (vezi tehnicile de aglutinare de mai sus).

Observaţie: Ultimele date de literatură fac diferenţiere între streptococii de grup D şi enterococi, considerându-se că enterococii fac parte dintr-un gen separat de genul Streptococcus, şi anume genul Enterococcus.

Alte metode de detectare rapidă a antigenului streptococic:

- detectarea directă din exudatul faringian a streptococilor de grup A: există truse comerciale cu reactivi care pot realiza extracţia enzimatică sau chimică a polizaharidului specific de grup A şi detectarea antigenului extras prin reacţii de aglutinare sau reacţii ELISA;

- detectarea streptococului de grup B direct din prelevate placentare, uterine, cervicale;- detectarea antigenelor streptococice de grup A, B, C, D, F din hemoculturi;- detectarea directă a streptococilor de grup A din exudatul faringian sau a streptococilor de grup B din hemoculturi prin utilizarea de sonde nucleotidice (sonde ADN comercializate pentru aceşti germeni).

2.4. AntibiogramaNu se efectuează pentru că, deşi infecţiile streptococice s-au tratat cu penicilină,

până acum nu s-au semnalat cazuri de rezestenţă ale acestuia la penicilină. Antibiograma se efectuează doar la persoanele alergice la penicilină.

3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGICAre la bază investigarea răspunsului imun umoral şi celular.

Răspunsul imun umoral In vitro • Determinarea anticorpilor antistreptolizină O (ASLO) prin reacţia ASLO

Reacţia ASLO

Elementele reacţiei

- ser de cercetat (anticorpi antistreptolizină O ?);

- antigen standard - streptolizina S- (SLO);- suspensie de hematii de iepure.

Principiul reacţiei: prezenţa anticorpilor antistreptolizină O în serul de testat neutralizează antigenul standard (SLO), care nu-şi mai manifestă efectul hemolitic asupra hematiilor (reacţie de seroneutralizare).

Titrul reacţiei: cea mai mare diluţie de ser cu hemoliză absentă.Titrul ASLO normal: 250 unităţi ASLO/ml. Titrul peste 250 unităţi ASLO/ml

semnifică infecţie cu streptococ beta-hemolitic grup A, fie o infecţie recentă (în urmă cu 2-3 săptămâni), fie repetate infecţii streptococice în antecedente, netratate sau incorect tratate.

• Determinarea anticorpilor anti-MAPSe realizează prin reacţia de latex-aglutinare.Se fac diluţii binare ale serului de bolnav care se pun în contact cu antigenul

latex-MAP. Se agită, se incubează acoperit la 370C 2 ore, apoi se lasă la temperatura camerei până a doua zi. Reacţie pozitivă înseamnă aglutinare vizibilă cu ochiul liber. Se consideră titrul pozitiv peste 40 U. Anticorpii anti-MAP au o importanţă deosebită, fiind singurii anticorpi capabili să protejeze organismul de o nouă infecţie streptococică , dar numai faţă de acelaşi tip, imunitatea anti-M fiind specifică de tip. Anticorpii anti-MAP apar la 3-4 săptămâni de la debutul infecţiei acute şi se menţin luni şi chiar ani de zile.

Anticorpii anti-MAP se găsesc la titruri foarte ridicate la cei cu RAA şi cardită reumatismală, cât şi în perioadele de acalmie, servind la diagnosticul acestor complicaţii, în special în aceste perioade dintre pusee.

• Determinarea anticorpilor anticarbohidrat (anti-CHO) Se efectuează prin reacţia de hemaglutinare pasivă (HAP). În această reacţie se

pun în contact serul de bolnav diluat binar, cu antigenul standard reprezentat de antigen streptococic grup A extras prin metoda Fuller, antigen cu care se sensibilizează hematii de berbec. Reacţia se icubează 1 oră la 370C.

Reacţie pozitivă înseamnă apariţia unei hemaglutinări pe fundul godeului, hamaglutinare care apare sub formă de stea, faţă de martor unde hematiile sunt dispuse omogen pe fundul godeului. Titrul pozitiv se consuderă peste valoarea de 20 U.

Anticorpii anticarbohidrat au aceeaţi semnificaţie şi evoluţie ca a anticorpilor anti-MAP.

In vivoIDR Dick prin care se testează susceptibilitatea la scarlatină (prezenţa sau

absenţa anticorpilor antitoxină eritrogenă). Se injectează 0,1 ml de toxină eritrogenă pe faţa anterioară a antebraţului. La 24-48 de ore se citeşte reacţia.

Reacţie pozitivă (prezenţa unui eritem cu diametru mai mare de 10 mm) semnifică lipsa de anticorpi protectori anti-toxină eritrogenă, deci susceptibilitatea de a face scarlatină.

Reacţie negativă (absenţa eritemului la locul administrării toxinei eritrogene) semnifică prezenţa anticorpilor protectori anti-toxină eritrogenă, deci un organism protejat faşă de o astfel de infecţie.

Fenomenul de stingere Schultz-Charlton: diferenţiază erupţia scarlatinoasă de alte erupţii, pe baza neutralizării in vivo a toxinei eritrogene de către serul de

convalescent injectat intradermic în zona eruptivă a bolnavului suspect de scarlatină. Dispariţia erupţiei de la locul administrării serului semnifică erupţie scarlatiniformă; menţinerea erupţiei semnifică o altă etiologie a erupţiei decât cea scarlatiniformă.

Răspunsul imun celular Se evidenţiază prin teste in vivo şi in vitro, dar care vor constitui obiectul de

studiu al imunologiei.ste d DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE

PNEUMOCOCStreptococcus pneumonie este un germen condiţionat patogen care determină:

pneumonii sau bronhopneumonii (mai frecvent la copii şi bătrâni), meningită, otită, sinuzită, pleurită, pericardită, infecţii oculare, cutanate, abcese etc.

Pneumococii sunt germeni frecvent întâlniţi în flora orofaringiană normală, purtătorii sănătoşi reprezentând 30-70%.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic şi constă din izolarea şi identificarea germenului, ca şi efectuarea antibiogramei.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICESe recoltează sputa mucopurulentă, cărămizie, cu striuri sanguinolente, aspirat

traheal, exudat faringian sau nazal, sînge, LCR, lichid pleural, sucul pulmonar extras prin puncţie albă, fragmente tisulare prelevate prin puncţii-biopsii.

Sputa, recoltată în recipiente sterile, se spală de 2-3 ori cu ser fiziologic şi se

omogenizează prin agitare (după adăugarea a câtorva perle de sticlă sterile) în scopul

îndepărtării florei bacteriene ce provine din căile respiratorii superioare, după care este

utilizată pentru efectuarea de frotiuri, însămânţări şi inoculări în şoarece.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1. Examen direct

Frotiul efectuat direct din produsul patologic evidenţiază: coci „in diplo”, lanceolaţi sau „în flacără de lumânare”, Gram pozitivi, capsulaţi, nesporulaţi, imobili. În funcţie de produs patologic (normal steril sau normal contaminat) se poate evidenţia: floră de asociaţie, polimorfonucleare (PMN), celule epiteliale întregi sau ratatinate (figurile 1, 2, 3, 4 şi 5).

Frotiul efectuat direct din spută evidenţiază pe lângă coci „in diplo”, Gram pozitivi, capsulaţi, nesporulaţi, imobili şi macrofage alveolare abundente, eritrocite care au transvazat la nivelul alveolelor.

2.2. Izolare In vitro pneumococii nu se dezvoltă pe medii simple. Ei necesită medii

suplimentate cu ser, ascită, sânge, incubate la 37C în atmosferă de CO2 5% (bulion cu infuzie proaspătă de carne de bou, bulion glucozat cu thioglicolat ca agent reducător, geloză-sânge, -ser, -ascită, iar pentru antibiogramă Muller Hinton cu sânge).

Figura 1: Pneumococi evidenţiaţi pe frotiu colorat Gram din lichid cefalorahidian. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 2: Frotiu colorat Gram din produs patologic - pneumococi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 3: Frotiu colorat Gram din produs - pneumococi. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

Figura 4: Pneumococi capsulaţi evidenţiaţi pe frotiu colorat Gram din spută. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 5: Pneumococi capsulaţi în produs patologic. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

In vivo pentru izolarea pneumococilor se utilizează şoarecele alb. După 24-48 de ore de la inocularea intraperitoneală, şoarecele moare de septicemie, izolându-se pneumococi în cultură pură din cord, exudatul peritoneal şi splină.

2.3. Identificarea. Caractere cultură

Pneumococii tulbură uniform mediile lichide; după mai mult de 3-4 ore are loc fenomenul de „autoliză”(sinuciderea corpilor bacterieni).

Pe medii solide, de tip geloză sânge, pneumococii determină colonii asemănătoare

streptococului viridans: colonii de tip „S”, mici, punctiforme, cu zonă de hemoliză

(diametrul mai mare decât diametrul coloniei) de tip alfa (incompletă cu tentă verzuie)

(figura 6 şi 7). La pneumococi, dacă iniţial coloniile sunt în „cupolă de catedrală”, pe

parcurs iau aspect de „strachină” sau „blid”(figura 8).

Caracterele culturale mai sus menţionate sunt asemănătoare streptococului alfa-

viridans, faţă de care pneumococul trebuie diferenţiat.

Figura 6: Cultură de pneumococ pe geloză sânge. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 7: Cultură de pneumococ pe geloză sânge.După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

b. Caractere morfologiceFrotiul din cultură (figura 9) evidenţiază coci „in diplo”, lanceolaţi sau „în

flacără de lumânare”, Gram pozitivi, capsulaţi, nesporulaţi, uneori în lanţuri scurte. Apariţia lanţurilor şi lungimea lor este corelată cu vechimea culturii, cu condiţii nefavorabile de mediu), cu absenţa ionilor de magneziu din mediu sau cu prezenţa anticorpilor specifici de tip.

c. Caractere biochimice Există trei teste biochimice care diferenţiază pneumococii de streptococii viridans:

fermentarea inulinei, biloliza, sensibilitatea la optochin. Toate aceste teste sunt pozitive la

pneumococ şi negative la streptococul viridans.

Fermentarea inulinei este testată pe mediul Hiss cu inulină 1%, în prezenţa unui

indicator (roşu fenol). Se însămânţează cultura din bulion glucozat cu thioglicolat.

Reacţia pozitivă, fermentarea inulinei, este evidenţiată de virarea în galben a

indicatorului, demonstrând prezenţa pneumococului (figura 9).

Figura 8: Geloză sânge: colonii de pneumococ „în strachină”. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Figura 10: Fermentarea inulinei. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

- Biloliza sau fenomenul Neufeld constă în liza pneumococilor în prezenţa bilei, sărurilor biliare sau acizilor biliari, substanţe care activează enzimele lipolitice ale pneumococului. Într-o eprubetă se pune 1 ml de cultură (în bulion glucozat cu thioglicolat) cu 1 ml bilă de bou (eprubeta din mijloc), în prezenţa unui martor reprezentat de o altă eprubetă care conţine 1 ml cultură cu 1 ml ser fiziologic (SF) (prima eprubetă din figura 11). După 30 de minute, în eprubeta din mijloc cultura se clarifică, identificând pneumococul (enzimele lipolitice ale pneumococului lizează cultura, în timp ce în prima eprubetă conţinutul rămâne tulbure.

- Sensibilitatea la optochin. Testul este asemănător cu cel la bacitracină. Tulpina de identificat se însămânţează, în striuri foarte dese - „în pânză” - pe geloză sânge. În

Figura 9: Frotiu efectuat din cultură de pneumococ. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Reacţie pozitivăReacţie negativă

centrul zonei însămânţate se aplică o rondea împregnată în soluţie de optochin. După termostatare, dacă în jurul comprimatului apare o zonă de inhibiţie a creşterii germenului mai mare de 20 mm, testul este considerat pozitiv, fiind identificat pneumococul. Rezistenţa sau zonă de inhibiţie mai mică, denotă un test negativ, fiind cazul streptococului viridans (figurile 12 şi 13).

Figura 11: Biloliza. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 12: Sensibilitatea la optochin - test pozitiv (pneumococ). După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Martor:

Cultură + SF

® tulbure

Cultură + bilă ®

clarificarea

conţinutului

pneumococ

Cultură + bilă

® conţinut

tulbure

streptococ

Figura 13: Sensibilitatea la optochin - test negativ (streptococ viridans). După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone

1979

d. Caractere serologice (antigenice)Pentru identificarea serotipului se pot practica: reacţia de umflare a capsulei şi

reacţia de aglutinare pe lamă cu seruri polivalente şi monovalente, ultima fiind o metodă mai accesibilă, în condiţiile creşterii incidenţei infecţiilor pneumococice.

Reacţia de umflare a capsulei este folosită pentru identificarea polizaharidului capsular (substanţă solubilă specifică - SSS) care împarte pneumococii în peste 83 tipuri, cel mai agresiv fiind tipul 3, posesor al celei mai mari capsule.

Tehnică: se amestecă pe o lamă curată de sticlă o picătură din cultura de

pneumococ în bulion glucozat cu tioglicolat, sau din exudatul peritoneal de la şoareci

inoculaţi intraperitoneal, cu o picătură din serurile specifice de tip (preparate pe iepuri

imunizaţi cu suspensii microbiene de pneumococ) şi cu o picătură de colorant. Se acoperă

cu o lamelă şi se examinează cu imersia. În cazul corespondenţei imune între cei doi

reactanţi, capsula îşi măreşte volumul de câteva ori (2-3 ori) comparativ cu martorul

(cultură de pneumococ + o picătură de ser fiziologic + o picătură de colorant) (figurile 14

şi 15).

Reacţia de aglutinare pe lamă se face cu serul polivalent (A+B+C) şi serurile monovalente A (1, 2 şi 3), B (4, 5 şi 6) şi C (8, 12, 14 şi 19).

Tehnică: o cultură de 24 de ore în bulion glucozat se centrifughează, sedimentul obţinut fiind suspensionat în 1 ml bulion. Pe o lamă de sticlă se pipetează patru picături din cultura de pneumococ, în care se adaugă câte o picătură din serul polivalent (A+B+C) şi serurile monovalente A, B şi C. Grunjii de aglutinare vor apărea la serul polivalent şi de exemplu la serul monovalent B. Ca urmare, pe o a doua lamă se adaugă, separat,

serurile componente ale monovalentului B, grunjii de aglutinare identificând tipul de pneumococ.

Coaglutinarea, ELISA, RIA sunt alte tehnici de identificare serologică, care urmăresc evidenţierea polizaharizilor capsulari ai pneumococilor direct din produsele patologice: LCR, spută, sânge.

d. Caractere de patogenitate Se poate efectua testul in vivo prin inoculare intraperitoneală sau subcutanată la

şoarecele alb care moare prin septicemie în 24-48 de ore.

Figura 14: Reacţia de umflare a capsulei. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

2.4. AntibiogramaPrin apariţia tulpinilor rezistente la antibiotice (exemplu penicilină) este

obligatorie efectuarea antibiogramei.

Figura 15: Reacţia de umflare a capsulei. După A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE REPREZENTANŢII GENULUI NEISSERIA

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIEI PRODUSE DE MENINGOCOC

Genul Neisseria (N) cuprinde specii care populează mucoasele. Cuprinde pe lângă specii patogene pentru om (N. meningitidis şi N. gonorrhoeae) şi specii nepatogene ce fac parte din flora normală (N. flavescens, N. subflava, N. sicca, N. mucosa).

Meningococii sunt paraziţi strict la om, cu localizare pe mucoasa căilor respiratorii superioare. Determină meningita meningococică sau meningită cerebrospinală epidemică.

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (izolarea şi identificarea germenului, urmată de efectuarea antibiogramei).

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICEProdusele patologice recoltate sunt: LCR (tulbure sau net purulent), sânge,

exudat faringian, exudate ale seroaselor, lichid peteşial. Toate aceste produse se transportă la 37C şi se însămânţează rapid, meningococii fiind germeni foarte sensibili la variaţii de temperatură şi uscăciune şi prezentând tendinţă de autoliză.

Sângele pentru hemocultură se însămânţează direct pe medii de cultură lichide (bulion glucozat 2%, respectând proporţia de 5% sânge).

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1. Examen direct

Din sedimentul obţinut la centrifugarea LCR, se fac frotiuri, care, în cazul prezenţei meningococului, spre deosebire de pneumococ (tabel 1), evidenţiază: - coci Gram negativi, “in diplo”, reniformi, cu concavităţile faţă în faţă, uneori capsulaţi (capsulă vizibilă pe preparatele proaspete sau la germenii recent izolaţi), dispuşi frecvent intracelular, imobili, la unele specii se evidenţiază prezenţa pililor;

- polimorfonucleare (PMN) în număr foarte mare (figura 1).

LCR Pneumococ Meningococ

Aspect macroscopic - uşor opalescent - intens tulbure, sub presiune

Aspect microscopic- coci Gram pozitivi, “in diplo”, lanceolaţi, dispuşi frecvent extracelular- polimorfonucleare

- coci Gram negativi, “in diplo”, reniformi, dispuşi frecvent intracelular- număr extrem de mare de polimorfonucleare

Tabel 1: Diagnostic diferenţial între meningita meningococică şi meningita pneumococică

2.2. Izolare Se folosesc medii de cultură îmbogăţite - medii complexe (geloză-sânge, -ser, -

ascită, -şocolat), mediul HYL (cu adaus de antibiotice: colimicină, lincomicină), mediul Muller-Hinton, cu incubare în atmosferă de CO2 5-10%.

Examinarea culturilor pe medii solide se face la 24 şi 48 ore, iar hemoculturile se examinează zilnic timp de 5-7 zile prin subculturi pe medii adecvate.

2.3. Identificare- caractere cultură: pe mediile lichide tulbură uniform mediul; geloză sânge: colonii de tip „S”, transparente, uşor gri, fără hemoliză (figura 2);

- caractere morfologice: frotiu din cultură care evidenţiază coci Gram negativi, “in diplo”, reniformi, uneori capsulaţi, nesporulaţi;

- caractere biochimice: fermentează glucoza şi maltoza (pe medii cu geloză şi 1% zahăr, 10% ser de cal şi indicator albastru de brom timol); nefermentarea levulozei, lactozei şi zaharozei; produce citocrom-oxidază (pe hârtie de filtru împregnată cu tetrametilen parafenilendiamină, apariţia unei culori albastre în 3-10 secunde indică oxidarea enzimatică a reactivului);

Figura 1: Meningococi. Frotiu colorat Gram din lichid cefalorahidian. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

- caractere serologice: reacţia de aglutinare pe lamă cu seruri polivalente şi apoi cu seruri monovalente. Reacţia pozitivă, apariţia grunjilor de aglutinare, indică grupul (A, B, C, D, X, Y, Z, Z şi W135).

2.4. AntibiogramaTerapia cu Rifampicină, Eritromicină, Penicilină, Sulfamide sau Cefalosporine

este în general suficientă.Tulpinile de meningococ secretoare de penicilinază sunt rare, de aceea rezistenţa

la Penicilină a meningococilor reprezintă un marker epidemiologic cu capacitate discriminatorie bună.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIEI PRODUSE DE GONOCOCGonococul, bacterie exclusiv umană şi întotdeauna patogenă, este agentul

etiologic al gonoreei (boală cu transmitere sexuală). Poate interesa orice fel de mucoasă a organismului uman, cum este conjunctiva (oftalmia la nou-născuţi).

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (izolarea şi identificarea germenului; efectuarea antibiogramei).

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICEProdusele patologice sunt reprezentate de secreţia uretrală şi secreţia vaginală.

Ele au un aspect purulent, sunt opace, cremoase, cu tentă gălbuie, desprinzându-se uşor.

Recoltarea se face cu ansa sau cu tamponul. La bărbaţi, prin uşoara exprimare a uretrei, se obţine o picătură de material ce se recoltează cu ansa sau cu tamponul. La femeie recoltarea se face din colul uterin, la cabinetul de ginecologie, având grijă să nu se contamineze proba cu floră vaginală. Transportul se face utilizând mediul de transport Stuart.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

Figura 2: Cultură de meningococ pe geloză sânge. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

2.1. Examen directFrotiurile efectuate din probele recoltate se fixează chimic (alcool metilic) 2-10

minute şi se colorează albastru de metilen şi Gram. În coloraţia Gram se prelungeşte cu un minut acţiunea soluţiei Lugol şi se prelungeşte decolorarea cu alcool-acetonă. Se evidenţiază (figurile 1 şi 2 ): - coci Gram negativi, “in diplo”, reniformi, cu concavităţile faţă în faţă; - floră de asociaţie bogată (alţi coci sau bacili);- polimorfonucleare (PMN) în număr foarte mare;- celule epiteliale, întregi sau detritusuri.

În formele cronice apare polimorfismul dimensional şi tinctorial.

2.2. Izolare Gonococul este un germen foarte pretenţios, necesitând medii complexe (geloză-

sânge, -ser, -ascită, -şocolat; mediul HYL; mediul Muller-Hinton), cu incubare în atmosferă de CO2 5-10%

2.3. Identificare- caractere cultură: examinarea culturii după 24-48 de ore pe geloză sânge evidenţiază două tipuri de colonii: unele sunt de tip „S”, mici, transparente, uşor gri „în picătură de rouă” (virulente), iar altele sunt mari, plate, uscate, granulate (nevirulente) (figurile 3 şi 4);

Figura 1: Frotiu colorat Gram din secreţie uretrală: gonococi. După A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

- caractere morfologice: frotiu din cultură care evidenţiază coci Gram negativi, “in diplo”, reniformi, nesporulaţi;

- caractere biochimice: fermentează glucoza (figura 5), produce citocrom-oxidază (testul oxidazei pozitiv) (figura 6);

- caractere serologice: PCR (polymerase chain reaction) este o metodă de determinare a prezenţei gonococilor în urină sau LCR.

2.4. Antibiograma

Figura 2: Frotiu colorat Gram din secreţie uretrală: gonococi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 3: Cultură din col uterin. Stânga: mediul geloză-şocolat: mai multe tipuri de colonii. Dreapta: mediul Thayer-Martin: cultură pură de gonococi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh

Edition, Edward J. Bottone 1979

Pentru testarea sensibilităţii se foloseşte metoda difuzimetrică. Se foloseşte mediul HYL şi suspensie microbiană. În terapie sunt indicate Penicilina, Tetraciclina, Kanamicina. Se pot utiliza de asemenea aminociclitolii (Spectinomicină) în doză unică.

Figura 4: Gonococ - geloză sânge. După A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Figura 5: Fermentarea glucozei gonococ. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

e maxim DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU ENTEROBACTERII

Enterobacteriile reprezintă o vastă familie din grupul bacteriilor Gram negative, cu o mare variabilitate genetică (morfologică, biochimică, antigenică, de patogenitate). Aceste microorganisme, dezvoltate în intestinul omului şi animalelor în condiţii ecologice complexe, cu un metabolism foarte activ, sunt supuse frecvent fenomenelor de transfer genetic (transformare, transducţie, conjugare) cu posibilitatea apariţiei atât de populaţii bacteriene rezistente sau multiplu rezistente la antibiotice, cât şi de populaţii bacteriene cu patogenitate crescută. Prin aceste mecanisme de recombinare in vivo, plasticitatea enterobacteriilor este nesfârşită, cu implicaţii pe plan terapeutic, epidemiologic şi profilactic.

Enterobacteriile sunt bacterii de formă bacilară, majoritatea mobile (imobile: Shigella, Klebsiella), majoritatea necapsulate (excepţie Klebsiella), aerob sau facultativ anaerobe, nesporulate.

Unele dintre ele sunt întotdeauna patogene (Shigella şi Salmonella), altele sunt comensale, intrând în componenţa florei intestinale normale, dar la care se evidenţiază un potenţial de patogenitate (E. coli, Proteus, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter etc.). Acestea din urmă sunt incriminate mai ales în etiologia infecţiilor tractului digestiv, urinar, respirator şi în infecţiile intraspitaliceşti. Patogenitatea intrinsecă a enterobacteriilor condiţionat-patogene (determinată de un bogat echipament enzimatic, de prezenţa antigenelor de înveliş, a endotoxinei, enterotoxinei, prezenţa plasmidelor etc.) se exacerbează atunci când statusul biologic al macroorganismului agresionat este modificat în sensul receptivităţii, prin deficite imune, boli medico-chirurgicale de fond, tratamente imunosupresive etc.

Majoritatea enterobacteriozelor predominent digestive precum şi a celor extradigestive se pot complica cu bacteriemii, septicemii, şoc endotoxinic, complicaţii severe greu de stăpânit terapeutic.

Clasificarea enterobacteriilor, care a suferit o serie de modificări în decursul anilor, a avut la bază mai ales proprietăţile biochimice şi antigenice. În acest sens, se admite în momentul de faţă existenţa următoarelor triburi şi genuri (tabelul 1):

Figura 6: Testul oxidazei - gonococ. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Test negativ Test pozitiv

Tribul Genul

Escherichieae

Escherichia

Shigella

Edwarsielleae

Edwarsiella

Salmonelleae

Salmonella

ArizonaCitrobacter

Klebsielleae Klebsiella

Enterobacter

Proteus Proteus

Providencia

Yersinieae Yersinia

Erwiniene Erwinia

Pectobacterium

Tabelul 1: Încadrarea enterobacteriilor

La majoritatea enterobacteriozelor, care evoluează ca boli infecţioase acute, investigaţiile de laborator se axează pe diagnosticul bacteriologic, în timp ce în febrele tifoide şi febrele paratifoide, boli sistemice cu evoluţie prelungită, se practică în plus şi diagnosticul imunologic sau serodiagnosticul.

1. RECOLTAREA ŞI PRELUCRAREA PRODUSELOR PATOLOGICE

Produsele patologice se vor preleva cât mai aproape de debutul bolii şi în funcţie

de diagnosticul clinic, înainte ca pacientului să i se fi administrat antibiotice. Recoltarea

se face corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectând toate normele de

asepsie şi antisepsie.

Se recoltează:

- materii fecale (E. coli, Shigella, Salmonella) din scaunul emis spontan sau direct din rect (sonda Nelaton); în cazul purtătorilor de Salmonella şi Shigella (elimină intermitent germenii) se recoltează 3 coproculturi, 3 zile succesiv, după administrarea unui purgativ salin. Prelevatele se introduc în mediul de conservare şi transport Carry-Blair;

- sânge (Salmonella) recoltat prin puncţie venoasă: pentru hemocultură şi pentru diagnostic serologic;

- urina (Proteus, E. coli, Klebsiella) recoltată prin metoda jetului mijlociu, după toaleta riguroasă a organelor genitale externe;

- sputa (Klebsiella pneumoniae);

- bila (Salmonella, Klebsiella) prin tubaj duodenal cu sonda Einhorn;

- puroi (Proteus, Klebsiella) recoltat în funcţie de tipul colecţiei purulente: cu ansa, tamponul, pipeta Pasteur sau puncţionare şi aspirare cu seringa.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (MICROBIOLOGIC)2.1. Examenul direct

Se efectuează frotiuri direct din produsele patologice, colorate Gram, cu mare importanţă pentru produsele patologice normal sterile. Se evidenţiază bacili Gram negativi, necapsulaţi (excepţie Klebsiella - figura 1), mobili pe preparatele native prin prezenţa cililor - figura 2)(excepţie Klebsiella, Shigella), monomorfi, rareori polimorfi (forme cocoide, filamentoase în cazul genului Proteus).

Figura 1: Bacili Gram negativi, capsulaţi, in diplo - Klebsiella. După Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F.

Acar. 1993

2.2. Izolarea

Se realizează prin însămânţarea pe medii de cultură şi inocularea produselor patologice la animalele sensibile de laborator (exemplu. izolarea Klebsiellei pe şoarecii albi).

Categorii de medii de cultură utilizate:

Figura 2: Bacterii intestinale ciliate (http //www. Lab Index, Photo Atlas)

- mediu de conservare şi transport: mediul semisolid Carry-Blair (thioglicolat de sodiu, clorură de calciu, fosfat disodic) ce permite viabilitatea germenilor patogeni aproximativ 4-6 zile;

- medii de îmbogăţire (medii lichide care favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene inhibând selectiv dezvoltarea florei de asociaţie): bulion tetrationat Muller-Kauffmann şi bulion selenit acid de sodiu pentru Salmonella;

- medii simple: bulion, geloză simplă;

- medii complexe: geloză sânge;

- medii selective (geloză, bilă sau săruri biliare, lactoză, indicator) generale (Istrate-Meitert, Leifson, Mac-Conkey) şi speciale (Levine pentru E. coli; Wilson-Blair pentru Salmonella typhi);

- medii diferenţiale (diferenţiază diferite tipuri de bacterii): mediul Drigalski, geloză lactozată cu albastru de brom timol, care diferenţiază bacteriile lactozo-pozitive de cele lactozo-negative.

2.3. Identificarea

a. Caractere de cultură

Pe medii simple solide, după incubare 24 de ore la 37C, enterobacteriile formează, de regulă, colonii mari, rotunde, convexe (de tip „S”), opace, semitransparente sau transparente; cele capsulate determină colonii mucoase, filante, în picătură de miere (Klebsiella) (figura 3); la genul Proteus apare fenomenul de invazie şi căţărare (figura 4).

Pe medii simple lichide: tulbură intens mediile, cu formarea unei pelicule fine la suprafaţă (genul Proteus) sau a unei membrane groase (Klebsiella).

Pe medii simple lichide: tulbură intens mediile, cu formarea unei pelicule fine la suprafaţă (genul Proteus) sau a unei membrane groase (Klebsiella).

Pe mediile selective coloniile au următoarele aspecte:

- pe mediul Leifson: prin fermentarea lactozei de către bacteriile lactozo-pozitive (E. coli, Klebsiella, unele tulpini de Citrobacter) se realizează un mediu acid care determină virajul indicatorului, coloniile aparând de culoare roşie; bacteriile lactozo-negative (Proteus, Salmonella, Shigella) sunt necolorate, cu centru negru pentru Salmonella şi Proteus;

Figura 3: Colonii mucoase, filante, în picătură de miere - Klebsiella pneumoniae. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 4: Proteus - fenomenul de invazie. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

- pe mediul Istrate-Meitert: colonii de tip „S”, galbene la germenii lactozo-pozitivi (E. coli, Klebsiella) sau, la germenii lactozo-negativi, în culoarea mediului (Proteus, Salmonella, Shigella), opace (E. coli, Klebsiella, Proteus), semitransparente şi albăstrui (Salmonalla), transparente şi verzui (Shigella);

- pe mediul Mac Conkey coloniile lactozo-pozitive sunt roşii, iar cele lactozo-negative necolorate;

- pe mediul Levine: coloniile lactozo-pozitive sunt negre cu luciu metalic, cele lactozo-negative sunt necolorate;

- pe mediul Wilson-Blair coloniile de Salmonalla sunt negre cu luciu metalic; Salmonella typhi produce şi colonii verzi, mici, fără halou. Celelalte bacterii din această familie se dezvoltă greu pe acest mediu, dând colonii brune;

- pe mediile diferenţiale (geloză lactozată cu albastru de brom timol), coloniile lactozo-pozitive sunt galbene, cele lactozo-negative sunt verzui.

b. Caractere morfologice

Pentru testarea mobilităţii se efectuează fie un preparat proaspăt între lamă şi lamelă, fie se urmăreşte mobilitatea în urma însămânţării pe geloză semisolidă (metoda tubului în U) sau se utilizează mediul politrop MIU (figurile 5, 6, 10 şi 11).

Frotiul colorat Gram evidenţiază bacili Gram negativi, nesporulaţi, necapsulaţi (excepţie Klebsiella) (figura 7).

Figura 5: Mediul MIU - testarea mobilităţii. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Figura 6: Mediul MIU - testarea mobilităţii. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Mobilitate prezentăUrează pozitiv

Mobilitate absentăUrează negativ

Producere de H2S

Figura 7: Bacili Gram negativi - frotiu cultură. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

c. Caractere metabolice (biochimice)Dintre testele biochimice care permit încadrarea în familie, trebuie menţionate:

- degradarea oxidativă şi fermentativă a glucozei (figura 8);- reducerea nitraţilor în nitriţi;- lipsa citocromoxidazei.

În continuare, diferenţierea triburilor şi a unor genuri şi specii se realizează prin alte reacţii biochimice cum ar fi:- testul indol (figura 9);- reacţia la roşu de metil;- reacţia Voges-Proskauer;- utilizarea citratului ca unică sursă de carbon şi energie (figura 12); - producerea de hidrogen sulfurat (figurile 10 şi 11); - producerea ureazei; - producerea lizindecarboxilazei, fenilalanindezaminazei etc.

Producerea de indol

Triptofanul din mediul de cultură este transformat (prin dezaminare) în acid indol-carbonic şi apoi în indol (figura 9).

Tehnică: cultura de cercetat este trecută în apă peptonată cu incubare 24 de ore la 37C; apariţia indolului se evidenţiază cu ajutorul reactivului Ehrlich, care se adaugă peste cultură. Apariţia unui inel roşu-rubiniu la suprafaţa mediului indică prezenţa indolului.

Se mai poate utiliza pentru demonstrarea prezenţei indolului şi mediul MIU. Reacţia pozitivă este apreciată pe baza colorării în roşu a hârtiei indicatoare ataşate la dop (îmbibată în prealabil în reactiv Ehrlich).

Exemple de bacterii indol pozitive: E. coli, biotipuri de Proteus, biotipuri de Shigella.

În tabelul 2 sunt prezentate principalele caractere de diferenţiere ale genurilor mai importante.

Testul Escherichia

Sigella Salmonella

Klebsiella

Proteus

Indol + variabil - variabil +Roşu-metil + + + - +Voges Proskauer - - - + -Utilizarea citratului - - + + variabilHidrogen sulfurat - - + - variabilLizin decarboxilază variabil - + + -Fenil alanindezaminază

- - - - +

Fermentarea glucozei, cu

producere de gaz colectat în

tubuşor Durham

Lipsa fermentării

glucozei

Figura 8: Degradarea oxidativă şi fermentativă a glucozeiDupă: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Urează - - - + +

Tabelul 2: Teste biochimice diferenţiale ale principalelor genuri

O categorie importantă de medii sunt cele politrope (testează mai multe caractere biochimice pe acelaşi tub): - TSI (trei zaharuri cu fier) (figurile 10 şi 11);- MIU (mobilitate, producerea de indol, urează).

Reacţie negativă

Reacţie pozitivă

Figura 9: Producerea de indol. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Mediu

control

Urmărind identificarea bacteriilor pe baza proprietăţilor metabolice şi încadrarea lor în gen, specie şi biotip, se mai folosesc şi alte medii de diagnostic biochimic:- pentru urmărirea spectrului fermentativ al zaharurilor se foloseşte apa peptonată cu adaus de diverse zaharuri şi un indicator de culoare (roşu fenol sau albastru de brom timol) (figura 12);

Figura 10: Variante ale mediului TSI. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Mediu

neînsmânţat

Klebsiella

E. coli

Citrobacter

Figura 11: Variante ale mediului TSI. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Proteus-speciiSalmonalla typhiShigella-specii

Shigella

flexneriSalmonalla

typhi

Specii Proteus, Salmonella

- mediul Clark-Lubs pentru evidenţierea reacţiei la roşu-metil şi pentru urmărirea reacţiei Voges-Proskauer;

- mediul cu citrat - Simmons şi mediul malonat pentru evidenţierea surselor de carbon şi azot folosite de enterobacterii (figura 13);

Figura 12: Spectrul fermentativ al zaharurilor (http //www. Lab Index, Photo Atlas)

Figura 13: Spectrul fermentativ al zaharurilor (http //www. Lab Index, Photo Atlas)

- pentru demonstrarea prezenţei unor enzime cu acţiune asupra unor aminoacizi, cum ar fi fenilalanindezaminaza (figura 14), sau lizindecarboxilaza, se foloseşte mediul gelozat care include pe rând aminoacidul respectiv

d. Caractere antigenice (identificarea serologică)Proprietăţile antigenice servesc pentru caracterizarea genurilor şi, în special, a

speciilor din cadrul acestora şi serotipurilor circulante într-o anumită perioadă de timp într-o colectivitate, ţinând cont de existanţa antigenelor somatice (O), de înveliş (K şi Vi) şi flagelare (H).

Identificarea serologică a reprezentanţilor familiei Enterobacteriaceae se realizează prin reacţii antigen-anticorp, în care elementul necunoscut este antigenul (antigenele bacteriei izolate) şi elementul cunoscut este reprezentat de anticorpii specifici dintr-un ser imun standard (obţinut prin inocularea unui animal de laborator).

În acest scop se folosesc două reacţii: reacţia de aglutinare pe lamă şi în tuburi (pentru Salmonella, Shigella, E. coli enteropatogen) şi reacţia de umflare a capsulei (pentru Klebsiella).

Reacţia de aglutinare pe lamă se face amestecând o picătură din serul standard cu o suspensie de germeni provenind din cultura pură a germenului de pe mediu neselectiv. Se urmăreşte apariţia grunjilor de aglutinare care apar numai în cazul corespondenţei imune dintre antigen şi anticorp, identificând cu certitudine bacteria izolată. În cazul în care nu există corespondenţă imună dintre cei doi reactanţi imuni lichidul rămâne lactescent (figura 15).

Figura 14: Decarboxilarea fenilalaninei. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975,1986

Poate exista şi o corelaţie între diferitele serotipuri de enterobacterii şi patogenitate. Un exemplu este întâlnit la E. coli. Astfel, în infecţiile urinare s-au izolat serotipurile O4, O7, O75, în diareea malignă a noului-născut serotipurile O55B5, O126B6. Dintre tulpinile enteropatogene (EPEC) s-a evidenţiat O157H7 iar dintre tulpinile enterohemoragice (EHEC) s-a identificat O26H11, O119H2.

Pentru identificarea tulpinilor patogene infantile de E. coli se practică şi tehnica imunofluorescenţei directe. Se efectuează frotiuri din materiile fecale, care se acoperă cu seruri fluorescente anti E. coli polivalent şi monovalente. După incubarea necasară se citesc în lumină ultravioletă. În cazul corespondenţei imune vor apare aglutinate fluorescente.

e. Caractere de patogenitate Această identificare se practică în cazul reprezentanţilor genului Klebsiella şi

Shigella prin studiul patogenităţii in vivo, în urma inoculării cu prelevat din cultura suspectă la şoarecele alb în primul caz şi prin inoculare intraconjunctivală la iepure sau cobai, în al doilea caz (testul Serenny).

Şoarecele alb inoculat subcutanat cu un filtrat de cultură de Klebsiella moare cu septicemie în 18-24 ore. Se izolează Klebsiella din sângele din cordul animalului prin tehnica hemoculturii.

Testul Serenny se recomandă pentru diagnosticul complementar al tulpinilor de Shigella izolate recent. Tehnica constă în introducerea unei anse de cultură (obţinută pe mediu simplu) sub pleoapa unui iepure sau cobai. După 12 ore în cazul în care germenii sunt din genul Shigella apare o congestie conjunctivală, o secreţie mucopurulentă abundentă urmată de opacifierea corneei şi se instalează keratoconjunctivita.

f. Sensibilitatea la bacteriofagii litici (lizotipia)Lizotiparea tulpinilor aparţinând aceleiaşi specii se efectuează pentru a elucida

problemele legate de stabilirea sursei de infecţie, a căilor de transmitere şi filiaţiei cazurilor în enterobacteriozele epidemice (Salmonella).

Figura 15: Reacţia de aglutinare pe lamă. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

2.4. Antibiograma Datorită comportamentului variat faţă de chimioterapice a enterobacteriilor, se

impune efectuarea obligatorie a antibiogramei.

3. DIAGNOSTIC SEROLOGICÎn această etapă se evidenţiază anticorpii apăruţi în serul bolnavilor, ca urmare a

infecţiei sau eventual a vaccinării. Are la bază reacţii antigen-anticorp de aglutinare în care elementul necunoscut

este reprezentat de anticorpii din serul de bolbav, iar elementul cunoscut de antigenele standard (reacţia Widal în salmonelozele majore).

Evidenţierea anticorpilor şi mai ales creşterea titrului la dublu între două recoltări de ser are valoare de diagnostic de boală, dar poate depista şi purtătorii de germeni, ca şi trecerea prin infecţii inaparente.

ă importanţă.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE BACILUL KOCH

Bacilul Koch (Mycobacterium tuberculosis) este agentul etiologic al tuberculozei, boală cu evoluţie cronică. Agentul patogen face parte din genul Mycobacterium, alături de bacilul leprei (Mycobacterium leprae). Bacilul tuberculos se prezintă sub trei variante: varianta hominis şi bovis (agenţii tuberculozei mamiferelor) şi varianta avium (agentul tuberculozei păsărilor). Forme clinice de tuberculoză sunt: pulmonară şi extrapulmonară (renală, intestinală, osteo-articulară, genitală, a seroaselor, meningeală).

Figura 16: Lizotipia. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Diagnosticul de laborator este bacteriologic (izolarea şi identificarea germenului; efectuarea antibiogramei).

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE Se face în funcţie de localizarea tuberculozei: spută, urină, produs de puncţie

articulară, puroi, produs de raclaj uterin, secreţie de col, produs de puncţie ganglionară, lichid pleural şi peritoneal, LCR.

• Sputa se recoltează prin emisie spontană, dacă bolnavul e tuşitor sau prin spălătură bronşică.

• Pentru tuberculoza renală, urina se recoltează dimineaţa, în recipiente sterile. Cu o zi înainte de recoltare, bolnavul va reduce pe cât posibil cantitatea de lichide ingerate, pentru a reduce volumul de urină acumulat în cursul nopţii.

• La femei, în caz de tuberculoză genitală, se recoltează sânge menstrual, secreţii ale colului uterin, sau produs de chiuretaj uterin. La toate aceste produse e obligatoriu adăugarea de apă distilată pentru distugerea hematiilor şi obţinerea unui sediment fără hematii prin centrifugare.

• Lichidul cefalorahidian, lichidul pleural, lichidul peritoneal, lichidul sinovial se recoltează prin puncţiile acestor cavităţi, respectând regulile generale de asepsie.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1. Examenul direct

Prezintă o etapă esenţială în diagnosticul de laborator al tuberculozei şi constă în efectuarea de frotiuri direct din produsul patologic. Produsele patologice (în special sputa) sunt supuse în prealabil omogenizării prin tratare cu hidroxid de sodiu şi agitare (fluidificarea produsului şi repartizarea uniformă a bacililor) şi concentrării bacililor în stratul superior cu xilol şi apă distilată.

Se efectuează: - „screeningul” prin fluorescenţă cu auramină şi rodamină şi examinare în ultraviolet (puncte strălucitoare pe fondul pal-verzui al câmpului, în caz de prezenţă a bacililor Koch). Probele pozitive trebuie controlate prin coloraţia Ziehl-Neelsen;

- baciloscopie directă prin coloraţia Ziehl-Neelsen permite diagnosticul de certitudine: bacili roşii, dispuşi în cordoane, celelalte elemente (floră de asociaţie, polimorfonucleare, celule epiteliale întregi sau detritusuri) albastre (figurile 1 şi 2).

2.2. Izolare: Se face:

• in vitro pe mediul Lowenstein-Jensen (bogat în substanţe nutritive şi conţinând verde-malahit ca inhibitor al florei de asociaţie) (figura 3) cu incubare la 37 C timp de 2 luni;

• in vivo: se utilizează cobai masculi de 400 g, se inoculează subcutanat, pe faţa internă a coapsei 1-2 ml produs patologic.

Figura 1: Frotiu colorat Ziehl-Neelsen din produs patologic (sursa: http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

Figura 2: Frotiu colorat Ziehl-Neelsen din produs patologic (sursa: http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text Ref: Ex. 2-5)

2.3. Identificare• Caractere cultură:

Pe mediul Lowenstein: colonii „R” (margini neregulate, suprafaţa mamelonată), „conopidiforme”, uscate, alb-gălbui; cele de tip uman cresc după 14 zile, cele de tip bovin după 30 de zile, cele atipice cresc în primele zile şi sunt colorate (figurile 4, 5, 6 şi 7).

• Caractere morfologice:Frotiul din cultură (colorat Ziehl-Neelsen) evidenţiază bacili acido-alcoolo-

rezistenţi, roşii, uneori dispuşi în cordoane prin bogăţia de factor „cord” (factor de

patogenitate), alături de celule epiteliale, leucocite, floră de asociaţie, colorate în albastru (figura 8).

• Caractere biochimice:- Testul catalazei diferenţiază mycobacteriile atipice la care reacţia este pozitivă de bacilul Koch, unde reacţia este negativă. Se acoperă coloniile obţinute pe suprafaţa mediilor solide cu soluţie de pirocathelor, perhidrol şi apă distilată. După 2-5 minute se face citirea reacţiei. Reacţia este pozitivă dacă se observă apariţia bulelor de gaz.

Figura 3: Mediul Lowenstein Jensen (sursa: http //www. Lab Index, Photo Atlas Reference: p.7 Lab Text)

Figura 4: Colonii de bacil Koch pe mediul Lowenstein Jensen. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

- Testul la niacin (Konno) este utilizat pentru punerea în evidenţă a niacinei. Este o metodă colorimetrică şi constă în punerea în contact a unei culturi de bacili vii cu o soluţie compusă din: anilină 4% (1ml), alcool 96% (1 ml), bromură de cianogen 10% (1ml). În cazul în care tulpina produce niacin apare o coloraţie galbenă. Este pozitiv la M. tuberculosis (figura 9).

Figura 6: Colonii de bacil Koch pe mediul Lowenstein Jensen (http:// wanadoo.com/images.htm)

Figura 4: Colonii de bacil Koch pe mediul Lowenstein Jensen. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 7: Colonii de bacil Koch pe mediul Lowenstein Jensen(http:// wanadoo.com/images.htm)

Figura 8: Dispunerea bacililor Koch în cordoane. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 9: Testul la niacin. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Test negativ:

M. atipice Test pozitiv:

M. tuberculosis

Diferenţierea între M. tuberculosis şi M. bovis se mai poate face şi după una din condiţiile de cultivare: necesarul de oxigen (figura 10).

• Caractere de patogenitateAnimalul de elecţie pentru reproducerea experimentală a infecţiei tuberculoase e

cobaiul, care se inoculează subcutanat pe faţa internă a coapsei, iar evoluţia bolii se face timp de 2-6 luni, după care cobaiul slăbeşte şi moare. După 10-15 zile, de sănătate aparent deplină, cobaiul devine apatic, pofta de mâncare scade, iar la locul inoculării apar modificări, în sensul că regiunea se împăstează, apoi devine fluctuentă, iar la nivelul plicii inghinale se palpează un ganglion, care creşte şi se ramoleşte, abcedând. La scurt timp sunt prinşi ganglionii regionali. La autopsie se poate observa invadarea întregului sistem limfatic şi a viscerelor.

2.4. AntibiogramaSe efectuează prin includerea antibioticului, în diferite concentraţii, în mediul

Lowenstein-Jensen. Se însămânţează în paralel produsul patologic pe mediu cu, şi, respectiv, fără antibiotic şi se compară rezultatele, după 2-4 săptămâni de incubare.

Chimioterapicele la care bacilul tuberculos este sensibil sunt: rifampicina, sterptomicina, HIN, PAS, etambutol.

3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGICPrezenţa imunităţii celulare, principala modalitate de apărare specifică

antituberculoasă, se testează prin IDR la tuberculină. Organismele infectate cu bacili tuberculoşi reacţionează diferit faţă de tuberculină, comparativ cu cele indemne. Intradermoreacţia la tuberculină testează răspunsul imun celular (hipersensibilitate întârziată), faţă de tuberculină. Se injectează pe faţa anterioară a antebraţului 0,2 ml tuberculină, dintr-o diluţie de 1/10.000. Reacţia se citeşte după 72 de ore de la injectare,

Figura 10: Diferenţierea între M. tuberculosis şi M. bovis după una din condiţiile de cultivare: necesarul de oxigen. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

M. tuberculosis - strict

aerob: creşterea numai la

M. bovis - microaerofil:

creşterea până la 1,5 cm de

când la locul inoculării apare un eritem şi un edem cu diametru diferit, în funcţie de gradul de răspuns imun faţă de tuberculină.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR PRODUSE DE GERMENI AEROBI SPORULAŢI ŞI ANAEROBI

A. GERMENI AEROBI SPORULAŢI: GENUL BACILLUSAcest gen cuprinde bacili mari, până la 10 m, drepţi cu capete retezate, Gram

pozitivi, capsulaţi, imobili, cu spor central, care nu deformează corpul bacterian, aerobi, facultativ anaerobi, cu aproximativ 48 de specii, patogene pentru om fiind următoarele:۰ B. anthracis care determină boala numită antrax sau infecţie cărbunoasă;۰ B. cereus, B. subtilis care pot cauza uneori infecţii umane.

Restul speciilor sunt saprofite, găsindu-se în mediul extern, pe tegumente şi la nivelul colonului.

BACILUL ANTRAXULUI (BACILLUS ANTHRACIS)Germenii sunt răspândiţi în sol, fiind germeni foarte rezistenţi în mediul exterior;

pe sol se găsesc sub formă de spori care pot fi ingeraţi în timpul păşunatului de către animale ierbivore (boala este astfel o zoonoză); în organismul animalului sporul se transformă în formă vegetativă care traverseză mucoasa lezată a tubului digestiv şi trece în torentul circulator dând o boală septicemică, cu mortalitate foarte ridicată, cu consecinţe economice grave. Omul poate interveni în lanţul epidemiologic al germenului prin consum de carne de animal infectată sau prin contact direct cu animalele bolnave sau pe cale respiratorie.

La om Bacillus anthracis determină infecţia cărbunoasă ce poate fi, în funcţie de calea de pătrundere, cutanată, respiratorie, digestivă. Cărbunele cutanat, manifestarea cea mai frecventă, este reprezentat de pustula malignă, localizată mai ales pe faţă, gât sau membre. La locul de inoculare apare o veziculă cu lichid sero-sanguinolent, care se ulcerează şi se usucă, dănd naştere unei cruste negre (cărbune).

Regiunea subjacentă leziunii prezintă un edemul alb, nedureros, gelatinos.Dacă tabloul clinic este dominat de un edem extins, febră, stare generală toxică se

vorbeşte despre edem malign, care reprezintă o formă gravă a cărbunelui cutanat. Cărbunele pulmonar se manifestă printr-o pneumonie sau bronhopneumonie hemoragică severă, cu spută hemoptoică, însoţită de stare septicemică, ce poate duce la deces. Prognosticul este foarte grav.

Cărbunele digestiv se manifestă sub formă de enterocolită acută, cu scaune cu sânge, febră, stare toxică, colaps, deces.

Meningoencefalita cărbunoasă este o formă rară, fiind aproape totdeauna mortală.

Diagnosticul de laborator vizează izolarea germenului şi reproducerea bolii la animal şi implică următoarele etape:

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE Se face în funcţie de afecţiunea clinică; pentru majoritatea produselor patologice

se face înlăturarea florei saprofite prin inactivare 60 de min la 30C, etapă ce permite numai supravieţuirea formelor sporulate care, în condiţii optime de mediu, vor duce la dezvoltarea formelor vegetative. Aceste produse patologice pot fi:

- serozitatea din veziculă sau pustulă, lichidul de edem; - sânge;

- LCR: însămânţare direct pe medii de cultură;- spută;- materii fecale, produs de vărsătură, alimente; - material necroptic pentru diagnostic retrospectiv (fragmente de splină, ficat,

piele).

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1 Examenul direct Se fac frotiuri care se colorează cu albastru de metilen sau după metoda Gram.

Pe frotiul colorat Gram se evidenţiază bacili Gram pozitivi, cu capetele tăiate drept, izolaţi sau în lanţuri scurte de 2-3 indivizi, cu aspect de „trestie de bambus” sau „vagoane de tren”, imobili, capsulaţi, alături de detritusuri celulare, leucocite şi floră de asociaţie redusă.

Frotiul efectuat din leziunile vechi evidenţiază bacili necapsulaţi cu spor central sau subterminal, cu diametrul sporului mai mic decât diametrul formei vegetative. Se acoperă cu ser imun fluorescent anticapsular (reacţie de imuofluorescenţă) pentru detectarea rapidă a bacteriei cărbunoase.

Pentru punerea în evidenţă a capsulei se pot folosi coloraţii speciale:- coloraţia cu tuş de China;- coloraţia Hiss (bacilul cărbunos apare cu corpul roşu şi capsula roz);- coloraţia cu albastru de metilen învechit sau albastru de toluidină (în care

corpul bacilului este albastru, iar capsula roz);În coloraţiile obişnuite, deoarece capsula are o afinitate slabă faţă de coloranţi, ea

apare ca un halou incolor în jurul celulei bacteriene. Pentru evidenţierea sporului se pot folosi coloraţii speciale, ex. coloraţia Mőller, în care sporul se colorează în roşu.

În coloraţiile uzuale sporii nu se colorează, ci apar sub forma unei vacuole ovalare în corpul colorat al formei vegetative.

2.2. Izolarea germenuluiPentru izolarea germenului se pot folosi medii simple (bulion simplu, geloză-

simplă, geloză-sânge) sau mediu cu cartof sau medii sintetice cu tiamină.Bacilul anthracis nu este exigent, crescând bine pe medii simple, în condiţii de

aerobioză, la temperatura de 350C şi pH între 7,2-7,4.Produsele care conţin floră de asociaţie se însămânţează în bulion, se incubează

24 de ore la 370C, apoi se încălzeşte cultura la 700C timp de 20-30 de minute, pentru a distruge germenii nesporulaţi , după care se fac treceri pe geloză simplă sau geloză-sânge.

2.3. Identificarea a. Caracterelor de cultură۰ În bulion simplu: Bacillus anthracis determină un depozit floconos, mediul rămânând limpede; tulpinile de tip S tulbură uniform mediul.

۰ Pe geloză simplă: determină colonii de tip „R”: colonii mari, de 2-4 mm, albe-cenuşii, cu suprafaţă rugoasă, cu margini neregulate datorită prelungirilor laterale

similare şuviţelor de păr, care conferă coloniilor un aspect caracteristic de „cap de meduză“ (figura1).

۰ Pe geloză sânge: aspectul coloniilor este identic cu cel de pe geloză simplă; bacilul antraxului nu produce hemoliză sau la unele tulpini, după 24 de ore poate să apară o zonă discretă de hemoliză β (figurile 2 şi 3).

۰ Pe geloză dreaptă, însămânţat prin înţepare, se dezvoltă sub forma unui „brad inversat“.

۰ Pe mediu cu cartof se dezvoltă repede şi abundent, formând un strat alb-cenuşiu, mat.

۰ Pe medii sintetice cu tiamină, formează colonii mici, după 24 de ore.

b. Caracterelor morfologicePe frotiul din cultură colorat Gram se evidenţiază bacili Gram pozitivi, cu

capetele tăiate drept, izolaţi sau în lanţuri scurte sub formă de „ trestie de bambus“, cu un halou incolor în jurul celulei bacteriene (capsula) şi cu o vacuolă ovalară centrală, în corpul colorat al formei vegetative (sporul) (figurile 4 şi 5).

Figura 1: Colonii de B. anthracis la microscop, x 28. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Figura 2: Colonii de tip R - Bacillus anthracis.

După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

Figura 3: Colonii de Bacillus anthracis nehemolitice pe geloză sânge.

După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition,

Edward J. Bottone 1979

Figura 4: Frotiu din cultură colorat Gram - Bacillus anthracis (http://www. microbes_edu.org./diagn.antrax)

c. Caractere biochimiceBacillus anthracis produce catalază, fermentează fără gaz glucoza, maltoza,

fructoza; este uree negative; nu produce indol, reduce nitraţii în nitriţi, reacţia Voges-Proskauer este pozitivă, citrat pozitiv, lichefiază gelatina, hidrolizează cazeina, produce lecitinază, reduce albastrul de metilen din lapte.

d. Caractere de patogenitateInocularea subcutanată la cobai sau şoarecii de laborator generează, după 24-72

ore, o septicemie mortală. La examenul necroptic se evidenţiază la locul inoculării un edem gelatinos, saiguinolent, viscerele sunt congestionate, sângele este de culoare închisă şi se coagulează tardiv, splina este mărită, foarte friabilă şi de un roşu închis. În lichidul de edem, dar mai ales în sânge, în organele toracice şi abdominale, se găsesc numeroşi bacili încapsulaţi.

e. Caractere antigeniceSe studiază prin reacţia de precipitare în inel (termoreacţia Ascoli) cu importanţă

în diagnosticul retrospectiv al antraxului. Antigenul este reprezentat de substanţa P capsulară de natură polipeptidică şi fracţiunea somatică polizaharidică, preparat din fragmente de organ ale animalului suspect (splină, ficat) sub forma unui filtrat. Serul imun standard anticărbunos se prepară pe cal.

Principiu: serul anticărbunos formează un precipitat specific în contact cu extractele de organe provenite de la cadavre cu infecţie cărbunoasă.

Tehnică: Într-un tub de precipitare se pun 0,5-0,6 ml filtrat, iar cu o pipetă Pasteur se întroduce încet în fundul tubului aceeaşi cantitate de ser anticărbunos, având grijă să nu se amestece. Dacă în decurs de 5-10 min, la linia de contact a celor două lichide se formează un inel albicios de precipitare, reacţia este pozitivă.

Figura 5: Frotiu din cultură colorat Gram - Bacillus anthracis După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

2.4. AntibiogramaBacillus anthracis este sensibil la antibiotice şi sulfamide, de tipul: penicilină,

tetraciclină, eritromicină, cloramfenicol. Aceste antibiotice se asociază terapiei cu ser anticărbunos.

B. GERMENI ANAEROBIGermenii anaerobi sunt microorganisme al căror metabolism este incompatibil

cu prezenţa oxigenului atmosferic.Germenii anaerobi patogeni pentru om se împart în două categorii: floră telurică

(anaerobi sporulaţi) şi floră endogenă (anaerobi nesporulaţi).Incidenţa reală a implicării germenilor anaerobi în patologia umană nu este pe

deplin cunoscută, deoarece, în condiţiile unei recoltări şi prelucrări incorecte a produsului patologic în care sunt prezenţi anaerobii, aceştia nu vor fi izolaţi şi identificaţi, iar produsul poate fi etichetat „steril“.

În patologia umană mai frecvent încriminaţi sunt anaerobii nesporulaţi, care reprezintă flora fundamentală a cavităţilor naturale şi a învelişurilor cutanate sau mucoase.

Aceşti germeni pot determina: abces cerebral, sinuzită cronică, infecţii ale regiunii gâtului, infecţii în sfera buco-maxilo-facială, pneumonie de aspiraţie, abces pulmonar, bronşiectazie, empiem nechirurgical, abces hepatic, infecţii post-chirurgicale abdominale, diverse infecţii în obstetrică-ginecologie, abces pelvian, abces vulvo-vaginal, abcese ale ţesuturilor moi, abcese cutanate.

Germenii anaerobi sporulaţi sunt reuniţi în genul Clostridium; sunt larg răspândiţi în sol, dar pot fi prezenţi şi în colonul omului şi animalelor. Aceşti germeni determină boli foarte bine individualizate clinic, şi anume:

۰ Clostridium tetani: tetanosul;۰ Clostridium perfringens, în asociere cu Clostridium novy sau Clostridium septicum: gangrena gazoasă;۰ Clostridium botulinum: botulismul;۰ Clostridium difficile: enterocolita postantibiotică.Cel mai frecvent întâlnit în patologia umană dintre aceşti anaerobi sporulaţi este

Clostridium perfringens.Factori favorizanţi ai unei infecţii anaerobe: infecţii aerobe, diabet zaharat,

alcoolism, boală neoplazică, operaţii, angiopatie, terapie corticosteroidă, terapie imunosupresivă, terapie aminoglicozidică (la care anaerobii sunt rezistenţi).

Particularitatea diagnosticului de laborator în infecţiile determinate de anaerobi este dată de faptul că, obligatoriu, produsele patologice în care se suspicionează prezenţa acestor germeni trebuie însămânţate în condiţii de anaerobioză.

Mijloace de realizare ale anaerobiozei sunt: fizice, chimice şi biologice.Metode fizice:• regenerarea mediilor de cultură lichide prin fierbere 30 min şi răcire bruscă;• realizarea unui vid cu ajutorul pompei de vid ataşată la un exicator ce conţine

recipientele cu mediile însămânţate;• evacuarea aerului din mediu, urmată de insuflarea unui amestec de gaz dezoxigenat

(N2 sau H2 în proporţie de 90-95% şi CO2 5-105).

Metode chimiceAu la bază absorbţia oxigenului din mediu cu substanţe reducătoare:

• utilizarea unui reducător chimic care se introduce în mediul de cultură. Ex: acid tioglicolic sau tioglicolat de sodiu, iar mediile în care sunt introduce sunt mediul I sau mediul VF;

• utilizarea reducătorului în afara mediului de cultură, într-un spaţiu închis.Ex.: pirogalolul, livrat de Institul Cantacuzino, care se pune într-un pliculeţ din

hârtie de filtru şi se fixează pe exteriorul capacului cutiei Petri, capac care se fixează cu pliculeţul spre interior, spre mediu.

Pentru mediile lichide se pot introduce substanţe reducătoare: glucoza, cisteina, acidul thioglicolic.

Metode biologice• se însămânţează pe aceeaşi placă microorganismul anaerob în vecinătatea unuia

puternic aerob (B. prodigiosus, B. subtilis);• introducerea în mediul de cultură lichid a fragmentelor de ţesuturi de la animale de

laborator (ficat, rinichi, creier, carne tocată şi prăjită)

Anaerobioza poate fi realizată şi prin procedee combinate din cele de mai sus.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE۰ materii fecale, eşantion din aliment conservat, produs de vărsătură: C. botulinum;۰ produs de la nivelul plăgii înţepate, tăiate care a venit în contact cu solul în care ar putea exista sporii de bacil tetanic;۰ fragmente de organe de cadavru: C. tetani, C. perfringens;۰ materii fecale, secreţii din sfera puerperală, produse de puncţie a diverselor colecţii ce evoluează cu mionecroză, secreţii din plagi accidentale sau postoperatorii: C. perfringens;۰ materii fecale: C. difficile;۰ sânge pentru hemocultură: infecţii septicemice;۰ spută sau alte secreţii ale tractului respirator;۰ secreţii din sfera genitală;۰ produs de puncţie aspiratoare (abces cutanat sau ale părţilor moi, abces vulvo-vaginal) sau recoltat întraoperator în caz de abcese (cerebral, rectal, scrotal, pelvian);۰ lichid peritoneal;۰ produs de puncţie sinusală;۰ produse patologice din sfera stomatologică.

Recoltarea produselor patologice trebuie să se facă cu respectarea normelor de asepsie şi antisepsie, cu evitarea contaminării accidentale în cursul recoltării.

Pentru produsele patologice lichide se recomandă aspirarea într-o seringă din care se evacuează aerul şi apoi acul se înfige într-un dop de cauciuc.

Însămânţarea produselor patologice trebuie să se facă în 1-2 ore de la recoltare. În caz contrar germenii pot muri în contact cu oxigenul atmosferic.

Pentru produsele recoltate pe tampoane se recomandă utilizarea mediului de transport Carry-Blair, în care se cufundă tamponul după recoltare.

2.DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1. Examenul direct

Examinarea directă, macroscopică şi microscopică, a prelevatului patologic oferă informaţii imediate, orientative, asupra prezenţei bacteriilor anaerobe. Aceste informaţii sunt utile pentru decizia terapeutică iniţială, în aşteptarea rezultatelor de laborator.

Macroscopic, suspiciunea infecţiei cu bacterii anaerobe este sugerată de:- miros fetid (datorat produşilor finali de metabolism);- fragmente de ţesut necrotic ori scurgeri de culoare neagră (determinate de bacili Gram negativi pigmentogeni anaerobi);

- prezenţa de puroi şi sânge în plagă.Microscopia directă a produsului patologic se realizează pe frotiu colorat Gram

care evidenţiază microorganismul sau microorganismele implicare, numărul lor, prezenţa sau absenţa celulelor inflamatorii.

Anaerobii sporulaţi Apar ca bacili Gram pozitivi groşi, de lungimi variate, cu capete rotunjite sau

tăiate drept cu spori ovalari sau sferici, subterminali, centrali sau terminali, cu diametrul mai mare, mai mic sau egal cu corpul bacterian. Bacilul tetanic: bacil alungit, cu capete nerotunjite, cu spor terminal cu un diametru ce depăşeşte diametrul corpului bacterian de 2-4 ori; sporul are un contur net refringent, o formă rotundă, mai rar ovalară. Aspectul germenului este de „rachetă de tenis“ (figura 6);

Clostridium perfringers: bacil gros, cu capete rotunjite, Gram pozitiv. În condiţii obişnuite de cultură sau în organismul animal. Sporulează foarte rar, sporii fiind subterminali, clostridieni. Germenul este încunjurat de o capsulă, vizibilă în coloraţia Gram ca un halou subţire, necolorat în jurul corpului bacterian (figurile 7 şi 8);

Figura 6: Frotiu din produs colorat Gram - Clostridium tetaniDupă Atlas de Bacteriologie: Examens directs par colorations usuelles. J.L. Gestin, F.W. Goldstein, J.F. Acar. 1993

Figura 7: Frotiu din produs colorat Gram - Clostridium perfringens(http://www. microbes_edu.org)

Clostridium novy (Cl. oedematiens): bacil Gram pozitiv cu spor sobterminal clostridian, alungit şi voluminos;

Clostridium septicum: bacil Gram pozitiv polimorf, incluzând forme de bacil, virgulă, filamente, cu spori mari, subterminali, dând aspect navicular germenilor;

Clostridium botulinum: bacil lung şi gros, Gram pozitiv, cu spor subterminal (figura 9).

Figura 8: Frotiu din produs colorat Gram - Clostridium perfringens(http://www. microbes_edu.org)

Figura 9: Frotiu din produs colorat Gram - Clostridium botulinum(http://www. microbes_edu.org)

Anaerobii nesporulaţi Microscopia directă a acestora nu este atât de importantă ca în cazul infecţiilor

clostridiale, deoarece aceste bacterii nu au aspect morfologic deosebit, putându-se prezenta sub formă de: coci, bacili, spirili, vibrioni, Gram pozitivi sau Gram negativi, asemănători morfologic cu cei aerobi, dar mai pleomorfi.I. În infecţiile determinate de bacili anaerobi Gram negativi nesporulaţi, apar frecvent aspecte morfologice particulare formelor „L“: elemente sferice de diferite mărimi sau forme filamentoase;۰ Diagnosticul genului Fusobacterium se poate face direct când se întrunesc două condiţii esenţiale: lipsa creşterii în aerobioză şi prezenţa simultană pe frotiu a 3 aspecte morfologice determinate de deficienţele peretelui bacterian: forme bacilare, forme filamentoase (filamentele putând prezenta umflături terminale sau mediane care se desprind şi se transformă în sferule libere), forme sferice (figura 10).

Sferulele libere şi filamentele pot avea corpusculi metacromatici, iar sferulele numeroase granulaţii.۰ Diagnosticul speciilor de Bacteroides: bacili Gram negativi cu coloraţie bipolară.

Toate aceste forme particulare nu sunt obligatorii a se vizualiza în produsul patologic; frotiurile din produsul patologic pot evidenţia doar bacili Gram negativi fără aspecte caracteristice.

Figura 10: Frotiu colorat Gram - Fusobacterium (http://www. microbes_edu.org)

II. Bacilii Gram pozitivi anaerobi nesporulaţi sunt bacili ramificaţi sau neramificaţi, izolaţi, în lanţuri sau palisade ori încrucişaţi.۰ Propionibacterium: bacili corineformi, rar ramificaţi;۰ Eubacterium, Bifidobacterium, Actinomyces: bacili Gram pozitivi ramificaţi.

2.2. Izolarea germenilor anaerobiPentru izolarea germenilor anaerobi produsele patologice se însămânţează pe

următoarele medii:

2.2.1. Pentru reprezentanţii genului Clostridium: mediul VF (viande-foie) sau mediul I IC cu carne tocată regenerat; un agar-sânge, care poate fi:

- geloză Martin 3%, glucozată 1%, cu 10% sânge de berbec;- agar Brucella, agar Columbia, agar infuzie cord-creier suplimentat cu extract de levură, vitamina K1 şi 5% sânge de berbec;

- agar cu alcool feniletilic şi 5% sânge pentru inhibiţia creşterii invazive a unor specii;

mediul Nagler cu gălbenuş de ou (se testează producerea de lecitinază, lipază, protează); se foloseşte în cazul probelor din abcese şi plăgi (în gangrena gazoasă).

Pe aceste medii clostridiile cultivă după 12 zile de incubare la 370C.Pentru izolarea clostridiilor din produse contaminate însămânţarea acestor

produse patologice trebuie să se facă pe mediile agarizate menţionate mai sus, suplimentate cu Neomicină ca agent selectiv. Aceste produse patologice contaminate trebuie prelucrate în mod special pentru izolarea clostridiilor prin tratare cu alcool sau inactivare termică, pentru distrugerea formelor vegetative şi menţinerea în viaţă numai a sporilor.

2.2.2. Pentru izolarea bacteriilor anaerobe nesporulateSe folosesc aceleaşi medii ca mai sus, la care se mai adaugă medii selective, şi

anume:

pentru bacili Gram negativi şi cocii Gram negativi:- agar cu sânge lacat de berbec, selectiv prin Kanamicină şi Vancomicină. În lipsa Vancomicinei se poate folosi amestecul selectiv realizat din: Kanamicină, Streptomicină, Neomicină, Polimixină B;

- agar-sânge-bilă, suplimentat cu antibiotice, pentru Bacteroides fragilis;- agar-sânge-esculină pentru B. fragilis şi Bilophila;

pentru bacili Gram pozitivi şi pentru coci Gram pozitivi: nu se foloseşte Vancomicina ca agent selectiv, ci Kanamicina, Neomicina, Polimixina sau asocierea Colistin cu Acid nalidixic sau Biseptol-Polimixină B pentru Mobiluncus.

Culturile însămânţate cu produse în care se suspicionează prezenţa anerobilor se incubează la 370C şi după 48 de ore se urmăresc zilnic până la 7 zile. Un rezultat negativ nu poate fi comunicat decât după acest interval.

2.3. Identificarea bacteriilor anaerobe2.3.1. Caractere de cultură2.3.1.1. Germenii din genul Clostridiuma. În bulion anaerob:۰ Cl. tetani se dezvoltă după 24-48 de ore şi determină o tulburare uniformă a mediului, cu degajarea a câtorva bule de gaz cu miros caracteristic de corn ars sau de materie animală arsă şi acid butiric;۰ Cl. perfringens se dezvotă cu extrem de mare rapiditate în mediile de cultură, mai ales la temperaturi crescute(450C-460C), la care germenul se dezvoltă în în câteva ore. În bulion anaerob determină tulburare şi producere intensă de gaz;۰ Cl. oedematiens: tulbură uniform mediul, cu depunere ulterioară şi cu producere moderată de gaz;۰ Cl. septicum se dezvoltă rapid şi bogat, dând o producţie intensă de gaz;۰ Cl. botulinum tulbură uniform mediul, dănd un miros uşor rânced al culturii;

b. Pe geloză în suprafaţă:۰ Cl. tetani: creştere delicată, subţire, cu margini transparente şi, dacă mediul nu are o concentraţie sporită de geloză, în câteva zile se întinde ca un văl uniform pe toată suprafaţa mediului;۰ Cl. perfringens: determină colonii în varianta S, SR, R;۰ Cl. oedematiens: determină colonii de tip R, turtite, cu margini neregulate;۰ Cl. septicum: dă o creştere cu aspect particular, de dantelărie fină, în extensie continuă;۰ Cl. botulinum: colonii cu limite neregulate, translucide, cu suprafaţă granulară şi cu o margine în extensie continuă.

c. Pe geloză sânge: ۰ Cl. tetani: nu determină hemoliză;۰ Cl. perfringens: produce hemoliză de tip „cald-rece“ (prima zonă de hemoliză apărută la termostat, se înconjoară de o a doua zonă, mai largă, apărută după menţinerea în continuare la rece-+40C) (figura 11);۰ Cl. oedematiens: determină hemoliză;۰ Cl. septicum: intens hemolitic;

۰ Cl. botulinum: determină colonii hemolitice.

d. Pe mediul Nagler: ۰ Cl. perfringens: colonii asemănătoare unui precipitat, înconjurate de o zonă opacă;۰ Cl. oedematiens: acelaşi aspect al coloniilor, înconjurate de un inel strălucitor în lumină oblică, numit strat perlat, datorat acţiunii unei lipaze;۰ Cl. septicum: nu produce lecitinază;۰ Cl. botulinum: produce opalescenţă şi strat perlat.

2.3.1.2. Germenii anaerobi nesporulaţi:a. În bulion anaerob:۰ Cocii Gram pozitivi: se dezvotă sărac şi lent, obişnuit sub formă de agregate, mai rar cu tulburarea mediului;۰ Cocii Gram negativi: se dezvoltă redus în mediul lichid, dar produc o foarte mare cantitate de gaz (Veillonella);۰ Bacilii Gram pozitivi:

- Propionibacterium: se dezvoltă abundent în bulion.۰ Bacilii Gram negativi:

- Bacteroides: B. fragilis se dezvoltă relativ abundent în 1-2 zile;- Fusobacterium: se dezvotă pe mediile lichide, după 2-3 zile de cultivare depunându-se la fundul eprubetei.

b. Pe geloză-sânge:۰ Cocii Gram pozitivi: produc colonii minuscule, transparente ca picăturile de rouă; ulterior, după 2-3 zile, coloniile se opacifică şi se extind; obişnuit sunt nehemolitice sau ocazional β-hemolitice (Peptostreptococcus magnus) sau pigmentate în galben-citrin, nehemolitice (P. asaccharolyticus);۰ Cocii Gram negativi: colonii nehemolitice;۰ Bacilii Gram pozitivi:

Figura 11: Hemoliză pe geloză sânge - Cl. perfringens.

După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition,

Edward J. Bottone 1979

- Propionibacterium: colonii înconjurate de o zonă de hemoliză, uneori pigmentate în roz;

- Eubacterium: colonii nehemolitice;۰ Bacilii Gram negativi:

- Bacteroides: B. fragilis determină colonii de tip S, rotunde, uşor convexe, transparente, regulate, înconjurate frecvent de o zonă de hemoliză, după mai multe zile;

- Fusobacterium determină 2 tipuri de colonii:cu diametrul 2-4 mm, contur neregulat, cu aspectul unei piramide, de culoare roşii-verzui, intens β-hemolitice;

cu diametrul 2-3 mm, formă rotundă, contur regulat, suprafaţă bombată, uneori aproape semisferice, de culoare albă-gălbuie, tardiv β-hemolitice .

c. Pe medii solide în suprafaţă:۰ Cocii Gram-pozitivi:

- Peptosteptococii: cresc relativ lent, după 48 de ore de incubare la 370C, determinând colonii mici, rotunde, convexe, alb-cenuşii, opace;

- Peptostreptococcus magnus: colonii cu diametrul între 0,5-2 mm după 5 zile de incubare, obişnuit transparente, dar pot varia între alb, cenuşiu şi gălbui, rotunde, uşor convexe, cu suprafaţa lucioasă sau lipsite de strălucire;

- Peptostreptococcus anaerobius: creşte cel mai repede dintre toate speciile (după 24 de ore): colonii între 1-4 mm după 5 zile de incubaţie, rotunde, plate, gri, cu centrul uşor acuminat, alburiu, cu un miros dulceag, pătrunzător;

- Peptostreptococcus asaccharolyticus: colonii minuscule, care ajung la 2-3 mm diametru, rotunde, uşor convexe, strălucitoare;

- Peptococcus niger: colonii mici, rotunde, convexe, netede, lucioase, negre sau măslinii, dar devin gri după expunere la aer; în culturi mai vechi de o săptămână pot fi pigmentate în galben-muştar;

۰ Cocii Gram negativi:- Veillonella: după 48 de ore de incubare la 370C determină colonii de 1-1,5 mm, transparente până la opac-albe la examinarea în lumină transmisă, şi transparente până la albastre-verzui în lumină reflectată;

- Acidaminococcus: după 48 de ore de incubare: colonii minuscule (0,1-0,2 mm), rotunde, uşor bombate, alb-cenuşii sau aproape transparente;

- Megasphaera: 0,2-2 mm, rotunde, uşor bombate, cu margini regulate, lucioase, până la uşor rugoase, untoase;

۰ Bacilii Gram pozitivi:- Propionibacterium: colonii de aspect alb-sidefiu;- Eubacterium: colonii mici, semitransparente;

d. Pe agar-sânge, selectiv prin bilă:۰ germenii din genul Bacteroides, în speţă B. fragilis, se dezvoltă chiar mai bine pe acest mediu decât pe suprafaţa mediului solid; dau colonii înconjurate de un precipitat maroniu, datorită descompunerii sărurilor biliare din mediu;

e. Pe mediul selectiv agar-sânge-bilă-antibiotice (Kanamicină, Streptomicină, Neomicină, Polimixină B) pe acest mediu nu creşte nici un alt germen anaerob, decât B. fragilis, iar dintre cele aerobe decât unele tulpini de Proteus şi coci Gram pozitivi, care vor fi regăsiţi în cultura aerobă.

f. Pe geloză cu sânge lacat: Bacteroides melaninogenicus se dezvotă lent în 1-2 săptămâni şi produce un pigment negru caracteristic, care poate să coloreze colonia sau să o înconjoare sau să apară sub colonie; uneori pigmentul este brun-roşcat.

g. Pe mediul Nagler: ۰ Bacilii Gram negativi:

- Fusobacterium: produce lecitinază.

2.3.2. Caractere morfologice2.3.2.1. Germeni anaerobi nesporulaţi:a. Cocii Gram pozitivi:

- Peptostreptococii: coci Gram pozitivi aşezaţi în perechi, tetrade, mase neregulate sau lanţuri;

- Peptococii: coci Gram pozitivi aşezaţi în grămezi.b. Cocii Gram negativi:

- Coci Gram negativi cu dimensiuni reduse, aşezaţi izolaţi sau în grămezi;

c. Bacilii Gram pozitivi: morfologia rămâne numai un criteriu orientativ de diferenţiere a acestor bacterii pentru că multe specii sunt microscopic asemănătoare.

- Actinomyces: filamente Gram pozitive, ramificate, cu aspect micelial şi extremităţi măciucate; se pot fragmenta uşor în bacili corineformi dispuşi în Y, V, T.

- Bifidobacterium: bacili Gram pozitivi scurţi, cu capete frecvent bifurcate şi extremităţi măciucate ori spatulate, dispuşi izolat, în lanţuri scurte, în agregate stelate, în V sau palisade.

- Eubacterium: bacili Gram pozitivi pleomorfi: E. alactolyticum: bacili mai lungi, uşor încurbaţi, dispuşi frecvent în V, asemănători păsărilor în zbor, sau aglomeraţi, sub forma „literelor chinezeşti“;

E. lentum: forme cocobacilare dispuse izolat, în perechi sau lanţuri scurte;E. imosum: bacili cu lungime intermediară, groşi, cu extremităţi frecvent bifurcate şi umflate, singuri, în perechi sau mici aglomerări;

- Mobiluncus: bacili Gram variabil, uşor încurbaţi, cu aspect difterimorf, sau cu aspect semilunar sau chiar de semicerc.

d. Bacili Gram negativi:- Bacteroides, Prophyromonas, Prevotella: bacili şi cocobacili Gram negativi

polimorfi; rareori generează forme L şi sferoplaşti; de aceea filamentele şi formele bizare sunt numai ocazional observate; la ultimele două genuri sunt frecvente formele cocobacilare.

- Fusobacterium: bacili Gram negativi cu un polimorfism remarcabil: bacili cu capetele rotunjite sau ascuţite, frecvent încurbaţi şi cu umflături sferice, posibile forme cocobacilare şi filamentoase cu incluzii granulare.

2.3.2.2. Germeni anaerobi sporulaţi: identic cu aspectul morfologic descris la examenul direct.

Figura 12: Frotiu din cultură - Cl. tetani(http://www. microbes_edu.org)

2.3.3. Caractere biochimice2.3.3.1. Germeni anaerobii nesporulaţi: ۰ Cocii Gram pozitivi:- testul sensibilităţii la Vancomicină: cocii Gram pozitivi sunt sensibili; cocii Gram negativi sunt rezistenţi;

- testul catalazei: diferenţiază Peptococcus constant, deşi slab catalază pozitiv, de genul Peptostreptococcus catalază negativ;

- testul coagulazei: singurul pozitiv este Peptostreptococcus indolicus;- producerea de indol: pozitiv Peptostreptococcus asaccharolyticus.- reducerea nitratului: pozitiv Peptostreptococcus indolicus;- testul ureazei: pozitiv pentru unele specii de Peptostreptococcus;- fermentarea carbohidraţilor: Peptostreptococcus fermentează zaharurile, dar unele specii sunt azaharolitice; germenii din genul Peptococcus sunt azaharolitici.۰ Cocii Gram negativi:- examinare sub radiaţie ultravioletă, la 360 nm: coloniile de Veillonella au fluorescenţă roz până la roşu, care păleşte după 2 ore; ceilalţi coci Gram negativi nu dau colonii fluorescente;

- reducerea nitraţilor: pozitiv pentru Veillonella;- producere de catalază: variabil Veillonella;- fermentarea glucozei: pozitiv doar pentru Megasphaera;۰ Bacili Gram pozitivi:- testul catalazei: pozitiv pentru Propionibacterium;- fermentarea zaharurilor: zaharolitici;- producere de H2S: pozitiv Propionibacterium; - producere de indol: pozitiv Propionibacterium;- reducerea nitraţilor la nitriţi: negativ pentru bacilii Gram pozitivi;

- acţiunea asupra laptelui turnesolat: Propionibacterium coagulează, reduce şi acidifică laptele turnesolat;

- hidroliza gelatinei: Propionibacterium acnes lichefiază gelatina.۰ Bacili Gram- negativi: - creştere pe medii cu 20% bilă: toate speciile de Bacteroides şi unele specii de Fusobacterium;

- producere de indol: variabil pentru genul Bacteroides( pentru B. fragilis negativ); variabil pentru Fusobacterum (pozitiv pentre F. necrophorum, negativ pentru F. mortiferum);

- hidroliza esculinei: toţi bacilii Gram negativi hidrolizează esculina;- fermentarea zaharurilor: Bacteroides fermentează constant glucoza, lactoza, zaharoza, iar pe celelalte zaharuri variabil, Fusobacterium este slab zaharolitic, de regulă fermentând glucoza şu fructoza;

- fermentarea treoninei: se evidenţiază prin producerea gazului din substratul cu treonină, prin metoda albastrului Nil sau prin cromatografie. Testul este pozitiv pentru Fusobacterium, şi negativ pentru Bacteroides.

- hidroliza gelatinei: Bacteroides este negativ;- acţiunea asupra laptelui turnesolat: Bacteroides coagulează, reduce şi acidifică laptele turnesolat;

- examinare sub radiaţie ultravioletă, la 360 nm: coloniile de Bacteroides dau fluorescenţă roşie în lumină ultravioletă.

2.3.3.2. Germeni anaerobi sporulaţi:- sensibilitatea la Vancomicină versus Colistin: toate clostridiile sunt rezistente la Colistin şi sensibile la Vancomicină;

- producerea de lecitinază şi lipază: pe o placă cu mediu Nagler sau Willis-Hobbs se repică un striu longitudinal. Se incubează anaerob la 370C. După 48 de ore se urmăreşte producerea de lecitinază: precitat opac în mediul din jurul creşterii, iar pentru producerea de lipază se zrmăreşte cultura o săptămână: film perlat, iridiscentpe creşterea bacteriană şi mediul imediat adjacent. Germeni lecitinază pozitivi: Cl. perfringens, Cl. oedematiens, Cl. botulinum; germeni lecitinază negativi: Cl. septicum;

- creşterea în lapte turnesolat sau cu broncrezol purpur: Cl. perfringens formează cheag alveolar: laptele este iniţial redus, apoi fermentat virând spre roşu, apoi coagulat, cheagul fiind lipit de un perete şi sfâşiat de gaze; apare un zer care se limpezeşte complet şi totul este surmontat de un alt cheag, cu aspect buretos şi virat spre roşu (figura 13);

- fermentarea zaharurilor: Cl. perfringens fermentează majoritatea zaharurilor; Cl. septicum fermentează ajoritatea zaharurilor cu excepţia zaharozei; Cl. botulinum fermentează variat zaharurile;

- Cl. perfringens este un puternic sulfito-reducător, înegrind rapid mediile care conţin sulfit de sodiu şi un compus feric.

2.3.4. Caractere antigenice- Cl. perfringens: reacţia de seoneutralizare Nagler. Pe o ½ de placă cu mediu Nagler se acoperă cu ser antiperfringens; germenul suspicionat a fi Cl. perfringens se însămânţează în striuri perpendiculare pe linia de demarcaţie. În caz de reacţie pozitivă germenul se dezvoltă pe ½ fără ser şi nu apare în cealaltă jumătate. Aceeaşi reacţie poate fi evidenţiată şi în cazul Cl. tetani (figura 14).

Cl. perfringens: cheag de cazeină fragmentat de bule de gaz - aspect

de “nor de furtună”

Cl. tetani: cazeificare omogenă a mediului

Cl. sporogenes: precipitarea

cazeinei

Figura 13: Acţiunea clostridiilor pe mediul cu lapte turnesolat. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J.

Figura 14: Reacţia de seroneutralizare - Cl. tetani.

- Cl. botulinum: prezintă 7 tipuri antigenic distincte de toxină, notate A, B, C, D , E, F, G, deşi toate provoacă aceeaşi îmbolnăvire clinică, botulismul. Toxinele sunt strict specifice de tip, fiind neutralizate numai de antitoxinele corespunzătoare.

Evidenţierea toxinei botulinice şi determinarea tipului acesteia poartă numele de toxinotipie.

Pentru acesta se iau 4 loturi de animale de laborator (şoareci sau cobai).La primul lot se administrează pe cale intraperitoneală (i.p) produsul patologic

filtrat ca atare (lichid de spălătură gastrică, de vărsătură, conţinut intestinal, lichid din conserva alimentară incriminată, serul sanguin).

La al doilea lot se administrează prudusul tot i.p., dar după ce acesta a fost ţinut 15 min la 1000C.

La al treilea lot se administrează produsul patologic după ce acesta a fost pus în contact, înainte de administrare, cu ser anti-botulinic anti-A şi lăsat 30 min la 370C.

La al patrulea lot se administrează produsul patologic după ce acesta a fost pus în contact, înainte de administrare, cu ser anti-botulinic anti-B şi lăsat 30 min la 370C.

Rezultatul: dacă supravieţuiesc animalele lotului II şi IV, înseamnă că este intoxicaţie botulinică, iar toxina este de tip B, pentru că a fost inactivată de temperatură şi serul specific anti-B.

La noi în ţară toate cazurile diagnosticate cu botulism s-au datorat toxinei botulinice de tip B, cu o excepţie - un caz dat de toxina botulinică de tip A.

2.3.5. Caractere de patogenitateSe bazează pe reproducerea bolii experimental la animale de laborator, mai ales în

cazul germenilor anaerobi sporulaţi, mai greu sau imposibil de realizat în cazul anaerobilor nesporulaţi. Astfel:- Cl. tetani. Patogenitatea bacilului tetanic este dominată de toxina tetanică, o exotoxină capabilă să determone tetanosul experimental, după o incubaţie de numai 8 ore, indiferent de doza inoculată. Acţiunea biologică a sa se exsercită prin fixarea exclusivă şi ireversibilă pe sistemul nervos, mai ales SNC, legându-se de gangliozizii legaţi de cerebrozizi. Injectată la animalul de laborator (şoarece, cobai, iepure), toxina reproduce boala, determinând o paralizie spastică, care începe de partea şi cu membrul în care s-a injectat; membrul este fixat în extensie forţată, corpul se curbează de aceeaşi parte; urmează generalizarea contracturilor, acesta este tetanosul ascendent. La om tetanosul începe cu contractura muşchilor masticatori (trismus) indiferent de locul de pătrundere al toxinei sau infecţiei tetanice, realizând tetanosul descendent, care afectează iniţial nervul cel mai scurt şi apoi continuă cu formele generalizate.

- Cl. perfringens. Factorul principal de patogenitate îl reprezintă α-toxina, care este o enzimă pură, lecitinaza. Ea are efect: hemolitic, dermonecrotic, letal, prin acţiunea sa asupra lecitinei din SNC. În cazul gangrenei experimentale s-a constatat că apariţia leziunilor hemoragice în organe reprezintă momentul când animalele nu mai sunt recuperabile prin tratament; pe când leziunile degenerative sunt compatibile cu vindecarea.

- Cl. oedematiens este puternic toxigen. Cultura injectată i.m. la cobai, produce un edem palid, gelatinos la locul injectării, care prinde toate ţesuturile, de la piele până la os. Edemul accentuat este vizibil cu ochiul liber atât la animalul de laborator, cât şi la om.

- Cl. septicum se caracterizează printr-o extrem de mare virulenţă. Injectarea a câţiva spori i.m. în condiţii de anaerobioză la cobai, duce la moartea animalului în mai puţin de 24 de ore, germenul producând o hemoliză intensă în toate ţesuturile şi organele.

2.4. AntibiogramaÎn general germenii anaerobi sunt rezistenţi la acţiunea aminoglicozidelor; sunt

sensibili la penicilină, eritromicină, tetraciclină, metronidazol, clindamicină, cefoxitină. Asocierea penicilină-metronidazol este deosebit de eficientă.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU PARVOBACTERII

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU GERMENI DIN GENUL BRUCELLA

Bruceloza, antropozoonoza cea mai răspândită de pe glob, este determinată de germeni din genul Brucella.

Brucelele infectează numeroase specii animale (caprine, ovine, bovine, porcine, ecvine), omul contaminându-se cu produse de la animalul bolnav (sânge, lână, piei, produse de avort, etc). Bruceloza este o boală profesională a crescătorilor de vite, medicilor veterinari, etc.

Din punct de vedere clinic, bruceloza umană se caracterizează prin marea varietate a simptomelor (accese febrile neregulate cu caracter recidivant, transpiraţii, artralgii, mialgii, dureri osoase), a complicaţiilor de natură inflamatoare şi prin durata sa nedeterminată, variind de la 4-5 luni la 2-3 ani în medie.

Diagnosticul de laborator se bazează pe izolarea şi identificarea germenului (diagnostic bacteriologic), dar şi pe diagnosticul imunobiologic.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICEDe la om sau animalul bolnav se recoltează: sânge (pentru izolare şi diagnostic

serologic), produs de puncţie sternală (pentru medocultură) şi ganglionară, în caz de adenopatie, urină (pentru urocultură), lichid articular (în caz de artrite), bilă (pentru bilicultură), materii fecale (pentru coprocultură), de la bovidee: produs de avort spontan, lochii, lapte.

2. DIAGNOSTIC MICROBIOLOGICSe bazează pe izolarea şi identificarea germenului.

2.1. Izolarea Se realizează prin însămânţarea pe medii de cultură şi inocularea la animalul de

laborator.

• Însămânţarea pe medii de izolareHemocultura

Sângele recoltat prin puncţie venoasă (2-4 ml) se însămânţează fie pe mediu lichid, glucozat şi citratat, fie de preferinţă, pe mediu gelozat glucozat 1%, la care se adaugă mediu lichid glucozat 1% şi citratat 2% (tehnica Castaneda). Se procedează astfel: mediul gelozat glucozat 1%, moale (încălzit) se toarnă în baloane Erlenmayer de

100 ml, în volum de 15 ml/balon, apoi balonul se înclină lăsându-se ca mediul să se solidifice. După solidificare, se adaugă mediu lichid glucozat 1% (10-15 ml/balon).

Se însămânţează sângele, apoi balonul se înclină, pentru a „scălda” suprafaţa gelozei cu mediul lichid conţinând sânge. Se incubează la 370C, repetându-se la interval de 2 zile mişcarea de clătiare a balonului, pentru umezirea cu lichid a suprafeţei gelozei. După 4-5 zile, în cazul prezenţei brucelelor, apar coloniile caracteristice. Alteori, dezvoltarea brucelelor necesită un timp mai îndelungat (până la 45 zile). Incubarea se face în paralel şi în atmosferă de CO2 5% (pentru izolarea Brucellei abortus).

UROCULTURA

Sedimentul obţinut după centrifugarea urinei (300 ml) se însămânţează după tehnica Castaneda.

Celelalte produse patologice Se însămânţează ca atare, în condiţiile expuse pentru hemocultură.

• Inocularea la animalSe inoculează la un cobai pe cale intraperitoneală sau subcutanată 0,5 ml

produs/inoculare şi se observă clinic timp de 45 de zile. Se urmăresc următorii parametrii:- izolarea şi identificarea brucelelor din ganglionii limfatici, splină, ficat, măduvă osoasă;

- diagnosticul serologic (titrara aglutinelor în ser);- intradermoreacţia la brucelină;- examenul histopatologic.

2.3. Identificarea Se face pe baza următoarelor caractere:

a. Caractere de culturăDupă 3-15-45 de zile pe mediul gelozat (în tehnica Cataneda), apar colonii mici

iniţial cu diametrul de 0,25 mm şi care cresc până la 3-4 mm, rotunde, bombate, cu margini netede, cu suprafaţă regulată, nepigmentată. În cazul Brucellei abortus, coloniile apar numai dacă incubarea s-a făcut în atmosferă de CO2 5%.

b. Caractere morfologiceEfectuarea unui frotiu bacteriologic dintr-o colonie şi colorarea cu metoda Gram,

evidenţiază prezenţa cocobacililor gram negativi, nesporulaţi cu dimesiunea de 0,5-1,5 microni/0,5-0,7 microni (figura 1).

c. Caractere metaboliceCaracterele biochimice permit diferenţierea tipurilor de Brucella după:

- Influenţa CO2 asupra dezvoltării microbilor: dezvoltarea Br. melitensis şi a Br. suis se face pe mediile de cultură menţinute la termostat într-o atmosferă obişnuită de aer, în timp ce obţinerea culturilor de Br. abortus bovis este necesară o atmosferă de CO2 în proporţie de 5-10%.

- Modul de producere a H2S: se studiază cultivând brucelele pe medii de geloză înclinată cu pH-6,6, tuburile având ataşată lângă dop o bandă de hârtie de filtru înmuiată în soluţie de 10% acetat de Pb. La fiecare 24 de ore hârtia este înlocuită cu alta. După producerea de H2S se pot diferenţia biotipurile de Brucella: Br. melitensis produce H2S numai în primele 24 ore (sau deloc), apoi nu mai produce. Br. abortus produce H2S timp de 48 ore, apoi încetează de a mai produce. Br. suis produce H2S continuu, abundent, timp de 96 ore.

- Acţiunea bacteriostatică a coloranţilor: testul bacteriostatic prin coloranţi (fuxină1/25.000 şi tiamină 1/30.000). Pe mediile la care s-au adăugat aceşti coloranţi, brucelele cresc diferit: Br. melitensis se dezvoltă pe mediile suplimentate fie cu tionină, fie cu fuxină; Br. abortus creşte numai pe mediu cu fuxină; Br. suis creşte pe mediu de tionină (figura 2).

Frotiu 1: Brucella suis: frotiu din cultură. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

d. Caractere antigeniceCele trei biotipuri de Brucella aparţin aceluiaşi serotip. Identificarea serologică se

face prin reacţia de aglutinare pe lamă, punând în contact o picătură dintr-o suspensie de cultură suspectă cu o picătură de ser standard anti-Brucella diluat conform instrucţiunilor (uzual 1/10). Rezultatul este pozitiv, dacă apar grunji de aglutinare vizibili.

3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGIC3.1. Teste de imunitate umorală

Se folosesc: reacţii de aglutinare, reacţia de fixare a complementului, reacţia opsono-citofagică.

a. Reacţia de aglutinareEste larg utilizată în diagnosticul serologic, având două variante:

• Aglutinarea lentă (Wright)Este o reacţie de aglutinare în tuburi în care se pun în contact diluţii binare din

serul de cercetat cu o concentraţie determinată dintr-un antigen standard (antigen Wright) reprezentat de suspensia de brucelle (10 miliarde germeni/ml) în soluţie clorurosodică izotonă, fenolată 5%. Tuburile se agită şi se lasă la 370C timp de 24 de ore. Rezultatul se apreciază astfel:

- reacţie negativă: suspensie tulbure, omogenă;- reacţie pozitivă: prezenţa unui sediment în formă de umbrelă, cu lichidul de deasupra perfect limpede; prin agitare sedimentul se desface sub formă de granule.

• Aglutinarea rapidă (Huddleson)Este o reacţie de aglutinare pe lamă. Se foloseşte un antigen standard

(Huddelson), livrat de Institutul Cantacuzino, conţinând o suspensie densă de brucelle în

Figura 2: Identificarea speciilor de Brucella după sensibilitatea la coloranţi. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Tionină

Pironină

Metil-violet

Fuxină

apă sărată 12%, fenolată 5% şi colorată cu verde brilliant şi cristal violet (coloraţia suspensiei este albastru-violetă).

Reacţia se efectuează astfel: pe o lamă de sticlă se depun cu o micropipetă, cantităţi descrescânde de ser de testat. Alături de fiecare picătură se depune câte o cantitate determinată de antigen Huddelson. Se adaugă un martor de ser (ser + soluţie clorurosodică izotonă) şi un martor de antigen (antigen + soluţie clorurosodică izotonă). Cu colţul unei lame, se amestecă picătura de ser cu picătura de antigen. Se incubează la 370C timp de 1-2 minute. Rezultatul se citeşte repede, în maximum 8 minute de la expirarea timpului de incubare.Interpretarea:

- reacţie negativă: picătură omogen colorată, fără grunji;- reacţie pozitivă: grunji, colorati albastru-violet.

b. Reacţia de fixare a complementuluiSe efectuează după tehnica Bordet-Wassermann, folosind ser de cercetat într-o

singură diluţie, antigen standard pentru RFC (suspensie de brucelle) livrat de Institutul Cantacuzino, diluat conform instrucţiunilor, alexină şi sistem hemolitic. RFC se pozitivează în toate formele bolii (acută, cronică, latentă). Această reacţie dă rezultate pozitive în 97% din cazuri.

c. Reacţia opsono-citofagicăSe realizează punând în contact: sânge proaspăt recoltat pe citrat de sodiu cu

antigen brucelos (suspensie de Brucella în soluţie clorurosodică izotonă 8,5 g%0

inactivată prin căldură 45 de minute la 700C, care conţine 4 miliarde germeni/ml). După incubare 20 de minute la 370C se fac frotiuri, se colorează cu Giemsa şi se apreciază gradul de fagocitoză care a avut loc, numărându-se germenii fagocitaţi în citoplasma celulei.

După Huddelson, rezultatul determinării indicelui opsonocitofagic (I.O.C.) se exprimă astfel în raport cu intensitatea fagocitozei:

· 0-10 indice negativ (-);· 11-24 indice slab pozitiv (+): susceptibil la infecţia bruceloasă;· 25-49 = indice pozitiv (++): infecţie probabilă, dacă mai există şi alte reacţii specifice pozitive (aglutinare, RFC);

· 50-72 indice intens pozitiv (+++): infecţie netă; apărarea organismului eficientă.

3.2. Teste de imunitate celularăSe efectuează printr-o reacţie cutanată (intradermoreacţie), care testează

hipersensibilitatea de tip întârziat (imunitatea celulară în bruceloză). Se foloseşte ca antigen brucelina (filtrat de cultură de Brucella abortus şi suis), livrat de Institutul Cantacuzino. Se inoculează intradermic 0,1 ml brucelină pe faţa anterioară a antebraţului. În paralel se inoculează la celălalt antebraţ 0,1 ml bulion (martor). Citirea se efectuează la 24 şi 68 de ore.Interpretare:

· = reacţie dubioasă: eritem uşor (roşeaţă), fără edem;· + = reacţie slab pozitivă: eritem şi edem net cu diametru de 1-2,5 cm;

· ++ = reacţie pozitivă: eritem şi edem cu diametru de 3-6 cm;· +++ = reacţie intens pozitivă: edem cu eritem, cu diametru mai mare de 6 cm, la care se adaugă fenomene generale (febră, cefalee, etc).

La cazurile tratate: aglutinarea şi RFC se pot negativa, dar IOC şi IDR la brucelină rămân pozitive.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU HEMOFILIInfecţiile umane produse de reprezentanţii genului Haemophilus sunt variate ca

manifestare şi gravitate: meningita, epiglotita, pneumonia, bronşita acută, acutizarea bronşitelor cronice şi bronşiectaziilor, pleuropneumonia, sinuzita, otita medie acută şi cronică, mastoidita, conjunctivita, endocardita, pericardita, osteomielita, artrita, peritonita, hepatita, colecistita, uretrita, prostatita, orhiepididimita, vaginita, salpingita, endometrita etc.

Speciile de hemofili izolate de la om la om sunt: - H.influenzae;- H.aegyptus (conjunctivitidis);- H.haemolyticus;- H.parahaemolyticus; - H.dycrey;- H.vaginalis.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICESe recoltează: sputa, exudat faringian, exudat nazal, spălătură bronşică, LCR,

secreţie conjunctivală, otică, uretrală, vaginală, sânge, lichid pleural, pericardic, articular, raclaje cutanate sau mucoase, materii fecale, fragmente de ţesuturi sau organe - în caz de intervenţii chirurgicale sau deces.

Tampoanele de recoltare trebuie să fie îmbibate în bulion înainte ca proba să fie recoltată şi transportate rapid la laborator. Probele vor fi păstrate până la însămânţare la temperatura laboratorului, nu în frigider, iar durata să nu depăşească 2 ore, întrucât viabilitatea hemofililor este mult mai redusă prin uscare şi răcire.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1. Examenul direct

Se foloseşte pentru: spută, exudate, aspirate, secreţii şi sedimentul obţinut prin centrifugarea LCR şi a exudatelor lichide, numai pentru a determina prezenţa bacililor Gram negativ.

În efectuarea coloraţiei Gram, trebuie avută mare grijă în efectuarea decolorării, deoarece formele cocobacilare de H.influenzae pot fi confundate în morfologie cu pneumococii. Dacă ei se colorează bipolar, iar restul organismului să fie colorat pal, se pot confunda cu Gram pozitivii.

Se poate efectua un test direct de umflare a capsulei cu ser de tip H.influenzae.Imunofluorescenţa cu ser capsular conjugat cu fluoresceină este un alt mijloc

excelent de identificare a tulpinilor capsulate.

2.2. Izolarea

Se folosesc medii în care celulele sanguine au fost lizate printr-o încălzire uşoară (agar-chocolat şi Lewinthal) sau prin digestie peptică (agar Fildes). În astfel de medii hemina şi NAD sunt prezente în aprox. 500 micrograme şi respectiv 150 micrograme/ml. Incubarea se face la 370C în 5-10 % CO2, timp de 18-72 de ore.

2.3. Identificareaa. Caractere de cultură

H.influenzae dă colonii mici, gri sau semiopace, netede şi plat convexe, cu margini regulate. Tulpinile capsulate tind să se dezvolte confluent, în contrast cu coloniile tulpinilor necapsulate, care rămân separate. Coloniile de H.parainfluenzae pot avea un diametru până la 3 mm după incubare de 24 de ore şi apar netede sau rugoase şi crenelate, gri-lucioase şi semiopace. Activitatea hemolitică a hemofililior hemolitici poate fi evidenţiată pe agar Fildas sau Lewinthal, cu 5% sânge bovin sau de cal şi agar-sânge de la aceleaşi specii (figura 1).

În jurul coloniilor de Staphilococcus aureus dezvoltă colonii mai mari (fenomen de satelitism), datorită suplimentului de factor V furnizat de stafilococi (figurile 2 şi 3).

b. Caractere morfologice

Frotiul colorat Gram evidenţiază cocobacili Gram negativi polimorfi. Tulpinile virulente prezintă uneori capsulă (figura 4).

c. Caractere metabolice

Reacţiile fermentative sunt foarte valoroase pentru diferenţierea speciilor de hemofili. Carbohidraţii cu valoare de identificare sunt: glucoza, zaharoza, lactoza, xiloza, manitolul şi riboza.

Alte teste folosite: testul indolului, testul ureazei, activitatea decarboxilazelor şi a betagalactozidazei. Suplimentarea mediului cu factorii X, V sau X+V diferenţiază speciile de Haemophilus: H.influenzae şi H.aegyptus necesită factor X+V; H.ducrey necesită numai factor X.

Figura 1: H. influenzae - cultură pe agar-cholat din lichid cefalorahidian. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

d. Caractere antigeniceSe foloseşte identificarea serologică pentru tulpinile capsulate de H.influenzae

care pot fi diferenţiate în 6 serotipuri bazate pe 6 polizaharizi capsulaţi distincţi: a, b, c, d, e, f. Se folosesc: reacţia de umflare a capsulei, dubla difuzie în gel de agar, imunofluorescenţa, contraimunoelectroforeza, latexaglutinarea, aglutnarea pe lamă şi coaglutinarea.

Figura 2: H. influenzae - satelitism în prezenţa stafilococilor pe geloză sânge. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

Figura 3: H. influenzae - satelitism în prezenţa stafilococilor pe geloză sânge. După: A Colour Atlas of Microbiology, R.J. Olds 1975, 1986

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR CU BORDETELLA

PERTUSIS

Bordetella pertusis este agentul etiologic al tusei convulsive, alături de alte două specii ale aceluiaşi gen: B. parapertissis şi B. bronchiseptica..

Etapele diagnosticului de laborator sunt:

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE- exudatul faringian cu tamponul;- sputa prin metoda plăcii tuşite;- sângele pentru diagnosticul serologic.

2. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGICConstă în izolare şi identificare.

2.1. IzolareaSe face pe mediul de elecţie Bordet- Gengou (macerat de cartof glicerinat şi

gelozat cu adaus de sânge).

2.2. Identificarea

a. Caractere de cultură

B. pertussis creşte sub formă de colonii de tip “S”, mici, lucioase („picătură de mercur”), convexe, înconjurate de alfa hemoliză (figurile 1 şi 2).

Figura 4: H. influenzae - frotiu colorat Gram din cultură. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

b. Caractere morfologicePe frotiul colorat Gram apar sub formă de cocobacili Gram negativ, nesporulaţi,

capsulaţi, cu tendinţă de colorare bipolară, dispuşi izolat, în perechi sau scurte lanţuri.

c. Caractere biochimice

Diferenţiază cele trei specii ale genului Bordetella: alcalinizarea laptelui turnesolat (în 12-14 zile la B.pertussis, 1-4 zile la celelalte două), producerea de urează, utilizarea citratului (reacţii negative la B.pertussis şi pozitive la celelalte două), transformarea nitraţilor în nitriţi (reacţie pozitivă doar la B.bronchiseptica).

d. Caractere de patogenitate

La cobai (testul intradermic).

e. Caractere antigenice

Identificarea serologică se efectuează prin reacţia de aglutinare pe lamă cu seruri imune standard şi reacţia de IF directă.

3. DIAGNOSTICUL IMUNOBIOLOGICConstă în efectuarea reacţiilor de aglutinare în tuburi şi reacţia de fixare a

complementului.

Figura 1: B.pertussis pe mediul Bordet-Gengou. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIA CU

TREPONEMA PALLIDUM

Genul Treponema aparţine familiei Spirochaetaceae şi cuprinde: a. Treponeme patogene pentru om۰ Treponema pallidum, cu trei subspecii diferenţiate numai prin caracterele clinico-epidemiologice ale bolilor determinate: subspecia pallidum (agentul etiologic al sifilisului venerian), subspecia endemicum (agentul etiologic al bejelului, care determină sifilisul endemic non-venerian ce afectează copiii şi adulţii din regiunile deşertice africane), subspecia pertenue (agentul etiologic al pianului, responsabil de leziuni cutaneo-mucoase la copii în zonele tropicale umede).۰ Treponema carateum, agentul etiologic al bolii numită pinta, boală cutanată ce afectează populaţia tânără (copii şi adolescenţi) din regiunile tropicale ale Americii Centrale şi de Sud.

b.Treponeme saprofite۰ Treponema genitalis şi Treponema caligryrum, întâlnite pe mucoasa genitală. ۰ Treponema microdentium şi Treponema mucosum, întâlnite pe mucoasa bucală sau în unele infecţii locale.

c. Treponeme de interes medical۰ Treponema Reiter: tulpină de laborator, izolată de la om, cultivată pe medii artificiale, în condiţii de anaerobioză. Este nepatogenă şi se înrudeşte antigenic cu Treponema pallidum, de aceea este folosită pentru prepararea unor antigene de diagnostic serologic al sifilisului. ۰ Treponema pallidum-tulpina Nichols, tulpină patogenă de laborator a Treponemei pallidum. Se obţine prin inocularea prelevatelor de la bolnavii de sifilis, intratesticular la iepuri, unde generează orhita experimentală. Sifilisul experimental la iepuri reprezintă singura posibilitate de păstrare în laborator a tulpinilor de treponeme patogene folosite

Figura 2: B. pertussis pe geloză sânge după primă izolare pe mediul Bordet-Gengou. După: Schneierson`s Atlas of Diagnostic Microbiology - Seventh Edition, Edward J. Bottone 1979

în testele serologice de diagnostic al sifilisului.۰ Treponema cuniculi: patogenă în mod natural pentru iepure, la care produce o infecţie genitală, care o deosebeşte de tulpina Nichols.

Treponema pallidum este agentul etiologic al sifilisului, boală dermato-venerică. Transmiterea se face totdeauna prin contact sexual direct (vitalitatea treponemelor în afara organismului uman este slabă).

După o perioadă de incubaţie silenţioasă de aproximativ 3 săptămâni (cu limite între 2 şi 10 săptămâni), treponemele se multiplică la nivelul porţii de intrare (genitală, anală, ocazional bucală), unele diseminând şi la nivelul ganglionilor limfatici de unde trec apoi în marea circulaţie.

Faza primară a infecţiei se caracterizează prin apariţia şancrului sifilitic, o papulă care se ulcerează rapid, dând o leziune superficială, nedureroasă, cu baza indurată şi acompaniată de adenopatie satelită. Şancrul şi ganglionii sateliţi sunt bogaţi în treponeme. Netratată, leziunea se vindecă spontan în 3-6 săptămâni, iar adenopatia se remite puţin mai târziu.

Faza secundară corespunde etapei de diseminare a treponemelor. Ea debutează aproximativ în două luni de la contactul infectant şi se caracterizează printr-un tablou lezional cu localizare cutaneo-mucoasă variată (rozeole, sifilidele, plăci mucoase, condiloame, alopecie, atingeri unghiale etc.) şi care poate fi acompaniat de micro-poliadenopatii şi de un sindrom infecţios. Toate leziunile secundare sunt bogate în treponeme de unde rezultă şi marea lor contagiozitate. Aceste manifestări se remit spontan, dar recăderile se pot produce în următorii 3-5 ani.

Urmează faza de latenţă, etapă în care sifilisul este clinic asimptomatic şi necontagios.

După o perioadă de timp variabilă, de 2 până la 10 ani, boala intră în faza terţiară caracterizată prin atingeri viscerale, cardio-vasculare (aortitită luetică, anevrism de aortă, insuficienţă aortică) sau neurologice (tabes, paralizie generală), asociate cu leziuni osoase sau cutaneo-mucoase granulomatoase (goma sifilitică). În toate leziunile terţiare treponemele sunt rare.

Etapele primară, secundară şi de latenţă reprezintă fazele precoce sau bacteriologice ale maladiei.

Sifilisul congenital. Boala se poate transmite la făt de la o mamă cu sifilis evolutiv. Pasajul transplacentar al Treponemei pallidum va determina o atingere sistemică a produsului de concepţie ducând fie la moarte fetală, fie, în cazul în care copilul trăieşte, la manifestări clinice caracteristice sifilisului congenital (leziuni cutanate buloase, ragade, sau leziuni sistemice, precum keratita, malformaţii dentare şi nazale, periostită, anomalii ale SNC, retard intelectual).

Treponema pallidum este un germen fragil care nu supravieţuieşte în mediul exterior fiind adaptat strict patologiei umane.

Injecţia intratesticulară a Treponemei pallidum la iepure provoacă în câteva zile o orhită, ţesutul inflamat fiind bogat în treponeme. Tulpina Nichols este întreţinută în acest mod în vederea testului de diagnostic Nelson.

Diagnosticul de laborator constă în diagnostic bacteriologic minor (urmăreşte punerea în evidenţă a Treponemei pallidum prin examen direct, posibil numai în sifilisul

primar) şi diagnostic serologic major.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICESifilisul va fi luat în discuţie în faţa unei eroziuni sau ulceraţii cu localizare ano-

genitală şi bucală, la un subiect în perioadă de activitate sexuală. Diagnosticul bacteriologic al prelevatelor se va efectua înaintea tratamentului cu antibiotice, treponemele dispărând în câteva ore după administrarea de penicilină.

Prelevatele vor consta din serozităţi nesângerânde de la nivelul şancrului sifilitic, plăcilor mucoase, mai rar produs de puncţie gaglionară.

2. DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIC2.1. Examenul direct

Se realizează pe preparat proaspăt şi preparat colorat. Preparatul proaspat se examinează între lamă şi lamelă, pe fond întunecat. Treponemele apar sub formă de filamente foarte subţiri cu 7-13 spire strânse, regulate, cu capetele efilate, mobile. Mişcarea lor este de rotaţie axială, pendulare, translaţie şi flexiune (figura 1).

Preparatul colorat. Se folosesc coloraţii precum Gram prelungit, Vago, impregnaţia argentică (figurile 2 şi 3).

Dacă în coloraţia Gram treponemele se colorează în roz palid (de aici denumirea de Treponema pallidum - este vorba despre o coloraţie a peretelui de tip Gram - negativă), în impregnaţia argentică (metoda Fontana-Tribondeau), treponemele apar de culoare neagră.

Coloraţia Vago este utilizată pentru evidenţierea Treponemelor, Leptospirelor şi Borreliilor. Reactivii pentru colorat au avantajul de a fi mai ieftini şi mai stabili decât cei pentru impregnaţia argentică.Tehnica:- Se etalează un frotiu pe o lamă port-obiect de sticlă. Nu se fixează la cald.- Se acoperă preparatul cu o soluţie filtrată de mercurocrom 2% timp de 3-5 minute.- Se spală cu apă distilată.- Se colorează timp de 5 minute cu o soluţie filtrată de Verde de metil 2%.- Se spală cu apă distilată şi se lasă să se usuce. - Se examinează cu obiectivul cu imersie.

Bacteriile apar colorate în violet clar pe un fond aproape incolor.Prepararea reactivilor:

- Soluţia de mercurocrom 2%. 1 g mercurocrom pulbere fină dizolvat în 50 ml apă distilată calduţă. Se agită şi se lasă în repaus câteva minute dupâ care se filtrează. Se conservă în flacoane de sticlă închisă la culoare, filtrând din când în când.- Soluţia de verde de metil 2% . Într-un mojar se fărâmiţează foarte fin 1 g verde de metil, peste care se adaugă 50 ml apă distilată fierbinte. Se agită bine, după care se lasă în repaus; se filtrează şi se păstrează în flacon de sticlă de culoare închisă, filtrând din când în când. Aceşti reactivi se conservă timp de o lună.

Metodele de coloraţie au dezavantajul de a deforma treponemele, de unde şi preferinţele microbiologilor pentru examenul în imunofluorescenţă.

Figura 1: Aspectul treponemelor la examenul direct, la microscopul cu fond întunecat. (sursa: http://www.atlas.dermato.org./images)

Figura 2: Tr. pallidum - Coloraţie Gram(sursa: http://www.pelin.mf.uni_lj.si/pedag/microbi.html)

2.2. Identificarea Se bazează pe caracterele de patogenitate prin inocularea treponemelor la iepure

intratesticular, care în 7-14 zile face o orhită.Identificarea se poate face şi prin examen în imunofluorescenţă atât prin tehnica

directă cât şi indirectă.- Tehnica imunofluorescenţei directe. Frotiul este acoperit cu anticorpi anti-Treponema pallidum marcaţi cu o substanţă fluorescentă (izotiocianat de fluoresceină) şi diluaţi într-un contracolorant (albastru de Evans). După spălare frotiul se examinează în lumina ultravioletă.- Tehnica imunofluorescenţei indirecte. Frotiul este acoperit cu anticorpi anti-Treponema pallidum nemarcaţi (umani sau animali) care se fixează pe treponeme; ca revelator se folosesc antiglobuline fluorescente de specie (antiglobulină umană sau animală), diluate într-un contra-colorant (figura 4).

Prezenţa treponemelor nu semnifică totdeauna o infecţie treponemică, existând la nivelul mucoaselor şi treponeme saprofite, după cum nici un examen negativ nu exclude o infecţie reală.

Figura 3: Treponeme - frotiu din serozitate (sursa: http://www.pelin.mf.uni_lj.si/pedag/microbi.html)

Figura 4: Treponeme - aspect în imunofluorescenţă (http://www.primer.ru/std/ gallery_std/treponema.htm)

3. DIAGNOSTICUL SEROLOGICTreponemele patogene nefiind cultivabile, dianosticul de certitudine al sifilisului

este realizat în urma examenelor serologice.Prezenţa anticorpilor apăruţi în urma contactului organismului cu Treponema

pallidum se evidenţiază prin două mari grupe de teste:- teste cu antigene cardiolipinice;

- teste cu antigene treponemice.Dintre numeroasele tehnici şi variante tehnice preconizate, cele mai utilizate sunt

următoarele:Pentru bilanţul iniţial de depistare:

۰ RPR: Rapid Plasma Reading test;۰ VDRL: Veneral Disease Reaserch Laboratory;۰ TPHA: Treponema Pallidum Haemagglutination Assay ( mai specifică).

Ca bilanţ complementar:۰ TIT: testul de imobilizare a treponemelor (Testul Nelson, specific).۰ FTA-ABS: Fluorescent Treponema Assay.

3.1. Teste cu antigene cardiolipinicePermit identificarea anticorpilor de tip reaginic. Reacţiile nu sunt specifice,

antigenul cardiolipinic fiind prezent şi în celulele animale şi vegetale, nu numai în membrana citoplasmatică a treponemelor.

A fost utilizat în prima metodă de determinare a sifilisului de catre Wasermann, care a folosit reacţia de fixare a complementului a lui Bordet, de unde şi denumirea comună dată tehnicii: reactia Bordet-Wasermann, prescurtat RBW.

Reacţia are astăzi valoare istorică: deşi încă indicată de unii medici, reacţia de fixarea a complementului Bordet-Wasermann în diagnosticul serologic al sifilisului nu mai figurează în Nomenclatorul Internaţional al actelor biologice din octombrie 1980 !

3.1.1. Reacţia de floculare - testul V.D.R.L. (Veneral Disease Research Laboratory)Reacţie clasică, singura ce se mai practică încă. Este o reacţie de precipitare în

mediul lichid cu un antigen cardiolipinic de origine animală şi comun cu Tr. pallidum. Reacţia calitativă

În godeul unei plăci se pun în contact 0,05 ml ser de bolnav inactivat şi o picătură

de antigen cardiolopidic diluat 1/60 ml. După agitare timp de 4 minute cu ajutorul unui

agitator mecanic cu 100 rotaţii/minut prezenţa anticorpilor se traduce prin apariţia de

aglutinate (flocoane) mai mult sau mai puţin voluminoase exprimate astfel:

۰ 0 = rezultat negativ, fără aglutinate (flocoane). ۰ + = rezultat incert, nesigur.۰ + + = rezultat slab pozitiv (apariţia de flocoane vizibile la aglutinoscop, lichid tulbure).۰ + + + sau + + + + = rezultat pozitiv (apariţia de flococoane voluminoase, vizibile, iar lichidul devine limpede).

Citirea se face cu ajutorul unei lupe puternice sau cu ochiul liber (figura 5).

Reacţii calitative fals pozitive se întâlnesc în sarcină, dar şi în stări patologice, ca: disproteinemii, ciroză, hepatită virală, lupus eritematos diseminat, unele parazitoze, lepră, toxicodependentă etc.

Figura 5 : Reacţia VDRL carbon (stânga - reacţie pozitivă; dreapta - reacţie negativă)(http://www.lycos.fr/vdrl-carbon.htm)

Reacţia cantitativăÎn tuburi de hemoliză se realizează diluţii de ser de bolnav, în progresie

geometrică în baza 2 (nediluat, diluat 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32…), fiecare tratat cu antigen

cardiolipinic.

Titrul este dat de ultima diluţie prezentând o reacţie slab pozitivă ++. Testul cantitativ constituie o bună metodă de depistare şi urmărire a evoluţiei bolii şi a tratamentului, precum şi eventualele recontăminări.

3.1.2. Testul RPR carbon (rapid plasma reding test)Este o reacţie de aglutinare care utilizează particule de carbon învelite cu antigen

cardiolipinic.

Sunt teste rapide, de aglutinare pe lamă. Reacţia pozitivă se traduce prin apariţia de grunji de culoare gri şi limpezirea suspensiei(figura 6).

Figura 6: RPR carbon test.(http://www.tdh.sate.tx.us./lab.serology_agg.htm)

3.1.3. Reacţia de fixare a complementului (Bordet-Wassermann)

Dă mai puţine rezultate biologice fals pozitive, dar poate da rezultate negative la bolnavii cu sifilis terţiar. Deşi se mai foloseşte în practica medicală, nu mai figurează în Nomenclatorul Internaţional al actelor biologice din octombrie 1980.

Cinetica anticorpilor anticardiolipinici: aceştia apar între a 8-a şi a 20-a zi de la debutul şancrului. Nivelul lor creşte rapid în timpul sifilisului secundar. Se negativează printre ultimele reacţii serologice în sifilis. În lipsa unui tratament, nivelul lor se menţine în platou, la valori variabile de la un individ la altul. În anumite forme viscerale de sifilis, se pot negativa în mod excepţional.

3.2. Reactii cu antigene treponemice (TPHA, FTA-ABS, NELSON, ELISASunt realizate cu germeni vii sau omorâţi, sau cu fracţiuni antigenice specifice Tr.

pallidum.3.2.1. TPHA (Treponema Pallidum Haemagglutination Assay)

Este o reacţie de hemaglutinare pasivă a hematiilor, sensibilizate cu un antigen extras din Tr. pallidum, la contactul cu serul uman de cercetat.

Reacţia se efectuează în microplăci cu fund rotund; în paralel cu proba de testat se face şi un test martor cu hematii nesensibilizate (figura 7).۰ Reacţia calitativă este un test de depistare. Se foloseşte ser de bolnav diluat 1/80.۰ Reacţia cantitativă permite stabilirea titrului de anticorpi la un bolnav depistat pozitiv prin reacţia precedentă. Se realizează diluţii din serul de testat, în progresie geometrică în baza 2 (1/80; 1/160; 1/320…). Titrul anticorpilor este dat de ultima diluţie care dă o reacţie pozitivă.

Cinetica anticorpilor: testul TPHA se pozitivează către a 3-a sau a 4-a săptămână de la debutul infecţiei (aproximativ o săptămână de la apariţia şancrului. În timpul negativării testelor serologice, TPHA este cel care persistă cel mai mult.

Figura 7: Testul TPHA( http://www.bmb.eeds.ac.uk/tpha.htlm)

3.2.2. Reacţia de imunofluorescenţă FTA 200 (Fluorescent Treponemal Antibody Test)

Este o reacţie de imunofluorescenţă indirectă care se realizează punând în contact treponeme omorâte integral cu serul de bolnav diluat 1/200. După spălare, anticorpii

fixaţi pe treponeme erau evidenţiaţi cu ser fluorescent antiglobuline umane totale.Deoarece testul a dat destul de multe reacţii fals pozitive, el a fost înlocuit cu

testul FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody-Absorbtion test).

3.2.3. FTA-Abs (FTA-Absorbit) Derivă din precedentul: serul de bolnav este în prealabil absorbit cu treponeme

saprofite nepatogene (tulpina Reiter) în scopul de a suprima antigenele dirijate către antigenele de grup ale treponemelor. Etapele ulterioare sunt similare testului FTA 200. ۰ Rezultatele calitative se exprimă în trepte de pozitivitate (+ = limita pozitivităţii; + + până la + + + + test pozitiv).۰ Rezultatele cantitative se realizează din testarea diluţiilor geometrice în baza 2 a serului de bolnav (1/50; 1/100; 1/200; 1/400…). Titrul este dat de ultima diluţie care prezintă o fluorescenţă ++ (slab pozitivă).

Testul este sensibil şi specific, pozitiv în toate stadiile bolii, confirmând un diagnostic de sifilis şi permiţind, totodată, urmărirea eficacităţii tratamentului.

Reacţii fals positive apar în boli auto-imune, boala de Lyma, herpesul genital.Testul necesită personal calificat, experimentat şi aparatură şi reactivi de calitate.Cinetica anticorpilor fluorescenţi arată ca sunt decelabili încă de la apariţia

şancrului. Există în toate etapele bolii, dispariţia lor spontană fiind cu totul excepţională. Se negativează lent.

3.2.4. Determinarea IgM specifice anti-treponemice (FTA-Abs IgM)Imunoglobulinele IgM apar încă din a doua săptămână de la contactul infectant.

Ele sunt evidenţiate printr-o reacţie de imunofluorescenţă indirectă având drept revelator un conjugat fluorescent monospecific anti-lanţuri m (anti IgM).

La bolnavii netrataţi ele se regăsesc încă din faza secundară; la pacienţii trataţi corespunzator, imunoglobulinele scad rapid şi dispar în general din prima lună care urmează tratamentului.

Testul are ca indicaţie majoră sifilisul congenital, dar este util şi în depistarea infecţiei recente, a reinfecţiilor şi în sifilisul neurologic.

Din păcate poate da atât reacţii fals pozitive, determinate de prezenţa factorului reumatoid, a anticorpilor nucleari, cât şi reacţii fals negative legate de competiţia cu IgG pentru receptori.

3.2.5. Testul de imobilizare a treponemelor (TIT sau TPI) sau testul NelsonTehnică de referinţă, dar care nu mai este utilizată decât în laboratoare de

cercetare specializate, deoarece implică întreţinerea de animale vii infectate şi preţuri de cost ridicate.

Principiu: tulpini de Tr. pallidum vii, virulente, deci mobile, sunt imobilizate ca urmare a acţiunii anticorpilor bolnavului (numiţi “imobilizine”) şi a complementului cobaiului.

Tehnica: după 18 ore de incubare la 35oC în atmosferă de azot îmbogăţită cu 5% CO2 treponemele din tubul de testat (T) se numără şi se compară cu cele dintr-un tub martor (M) fără complement.

Procentul de imobilizare, în care se exprimă rezultatele calitative, este dat de raportul: M – T/ M astfel :

۰ 0 – 20% = test negativ;۰ 21 – 50% = test suspect;۰ 51 – 100% = test pozitiv.۰ Testul este considerat “toxic”, adică neinterpretabil, atunci când în tubul martor treponemele sunt moarte. Cauzele acestei toxicităţi nu sunt cunoscute.

Recoltarea probei de la bolnav se face a jeun şi după întreruperea oricărui tratament cu antibiotice.

Cinetica anticorpilor. ,,Imobilizinele” sunt decelabile între a 25-a şi a 40-a zi de la apariţia şancrului, adică la finele fazei primare şi debutul fazei secundare. În lipsa tratamentului, aceşti anticorpi persistă în toate stadiile, dispariţia lor spontană fiind cu totul excepţională. Tratamentul precoce determină negativarea testului Nelson; în schimb, testul rămâne pozitiv cu atât mai frecvent cu cât tratamentul a fost instituit mai tardiv.

3.3 Alte teste 3.3.1 Tehnicile imuno-enzimatice de tip ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) cu diferite tipuri de antigene purificate de T. pallidum, pentru IgG şi IgM. 3.3.2 Testul de inunoaderenţă-dispariţie (TPIA).3.3.3 Testul de imunodispariţie intraperitoneală (TPID).

Alegerea reacţiilor serologiceMultitudinea de reacţii de diagnostic serologic al sifilisului se explică prin faptul

că nici una nu este perfectă pentru a confirma sau infirma cu certitudine infecţia sifilitică pe toată durata bolii.

Ca o regulă generală, nu este recomandabil niciodată să se folosească o singură reacţie serologică atunci când se urmăreşte depistarea şi diagnosticarea acesti boli. În campaniile de depistare se vor executa pentru fiecare ser două reacţii dintre care obligatoriu una cu antigen treponemic. Pentru confirmarea diagnosticului şi urmărirea eficienţei tratamentului se va folosi un set de teste de rutină cu antigene cardiolipinice şi treponemice. Este indicată şi efectuarea reacţiilor serologice cantitative care oferă indicaţii privind scăderea titrului anticorpilor în cursul tratamentului specific.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN INFECŢIILE CU LEPTOSPIREFoarte răspândite în natură, leptospirele sunt bacterii care, emise prin urina

animalelor infectate, determină la om, în mod accidental, infecţii (zoonoze) cu un grad variat de gravitate, dintre care cea mai severă formă este leptospiroza ictero-hemoragică. Parte componentă a familiei Spirochetae, genul Leptospira cuprinde atât specii saprofite (Leptospira biflexa), cât şi specii patogene pentru om şi animal (Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira pomona, Leptospira canicola). În patologia umana sunt descrise peste 230 de serotipuri, grupate în 23 de serogrupe, şi 7 specii patogene asociate bolilor umane şi animale.

Leptospirele sunt bacterii fin spiralate, flexibile, mobile cu extremităţile de forma unui cârlig (figura 8). Au diametrul de aproximativ 0,1 mm şi o lungime cuprinsă între 6-12 mm.

Figura 1: Imaginea unei leptospire la microscopul electronic(http://www.ucmp.berkeley.edu/bacteries.html)

Ca urmare a polimorfismului clinic, diagnosticul este greu de stabilit în etapa de debut a bolii. Contextul epidemiologic şi testele de laborator nespecifice (neutrofilie, aspect de tip inflamator) sunt importante în vederea excluderii etiologiei virale.

1. RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE.Prelevatele vor respecta o anume secvenţialitate: hemoculturile se vor recolta în

primele 10 zile de la apariţia sindromului febril (sângele fiind recoltat pe un anticoagulant de tipul heparinei sau oxalatului; citratul determină o acidifiere nefastă dezvoltării leptospirelor), LCR, recoltat prin puncţie rahidiană, în a 2-a săptămână de boală, iar uroculturile, începând cu a 3-a săptămâna de boală când se recoltează şi sânge pentru diagnosticul serologic. Prelevatele se vor recolta înaintea instituirii oricărui tratament cu antibiotice şi nu vor fi congelate.

Prelevatele necroptice de la cadavru vor include probe de sânge, de ţesut hepatic şi de ţesut renal, LCR şi urină.

Tinând cont de faptul că leptospirele se lizează în câteva ore de la recoltare, transportul şi prelucrarea produselor patologice va fi cât mai rapidă.

2.DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC2.1 Examenul direct

Examenul direct al preparatului proaspăt la microscopul cu fond întunecat este de interpretat cu prudenţă, din cauza aspectelor fals pozitive determinate de resturi celulare, fibrină etc. Examinarea preparatului proaspăt se face între lamă şi lamelă cu obiectivul cu imersie.

Pentru examinarea directă se foloseşte: sânge (5 ml) recoltat pe un anticoagulant fiind lăsat un timp în repaus pentru sedimentarea hematiilor; urină (50-100 ml) ca atare, după o prealabilă alcalinizare prin administrarea bolnavului de bicarbonat de sodiu sau sedimentul urinar, după centrifugare timp de o oră la 3000 t/minut. Se mai pot examina prin acestă metodă şi supernatantele trituratelor de fragmente de ţesut din ficat, rinichi recoltate de la cadavru (2 g.ţesut / 3-5 ml diluant lăsat să se sedimenteze timp de 30-60

minute).Preparatele fixate şi colorate se fac din sânge, sedimentul urinar, LCR şi

amprente de organe post-mortem. Ca tehnici de coloraţie se folosesc metoda Giemsa, coloraţia Fontana-Tribondeau, cu acridină oranj şi Vago (figura 9).

Metoda Giemsa: frotiul se usucă sau este fixat cu acid osmic, după care se colorează timp de 30 minute cu soluţie Giemsa proaspătă (2 picaturi de colorant/1 ml apă tamponată cu pH 7). Se spală şi se recolorează cu Giemsa, după care preparatul se spală şi se usucă. Examinarea la microscopul optic se face cu obiectivul cu imersie.

Coloraţia Fontana-Tribondeau: frotiul etalat pe o lamă port-obiect se acoperă cu soluţie Rugge pe bază de formol, acid acetic glacial, apă distilată; procedura se repetă de 3 ori în răstimp de 1 minut, după care se acoperă lama cu acid tanic, se încălzeşte până la emisia de vapori şi se lasă apoi să se răcească 3 minute. Se spală lama şi se acoperă cu filtrat de soluţie amoniacală de nitrat de argint; se încălzeşte din nou lama, de 2-3 ori, pâna la emisia de vapori. După 10 minute se spală cu apă distilată, se usucă şi se examinează la microscopul optic cu obiectivul cu imersie.

Coloraţia cu acridină oranj este preferată de un număr important de microbiologi. Coloraţia se practică pe preparatul etalat pe lama port-obiect şi fixat în prealabil cu etanol. Se acoperă frotiul timp de 2 minute cu amestecul colorant (acridina oranj 10 ml/tampon acetat pH 3,5 100 ml; se filtrează şi se păstrează la întuneric). Se examinează la microscopul cu fluorescenţă şi cu obiectivul cu imersie.

Figura 9: Imaginea unei leptospire prin coloratia Vago(sursa : http://www.bioltrop.org/15-techbacterio/leptospira.jpg)

2.2. IzolareaÎnsămânţarea în vederea izolării leptospirelor se efectuează in vivo şi in vitro.

- In vitro, pe medii speciale semisolide şi lichide, pe bază de peptonă, îmbogăţite cu ser de iepure şi adaos de factori care stimulează creşterea şi multiplicarea germenilor, precum vitamina B1, vitamina B12, fier, hemoglobină, acid oleic. Mediile au pH 7,2-7,4. La noi este folosit indeosebi mediul Kortof. Mai sunt comercializate şi utilizate mediile specifice Tween-albumină sau mediul EMJH (Ellinghausen-McCullough modificat de Johnson şi Harris).

Sângele total se însământează în 3 tuburi, fiecare tub conţinând câte 5 ml de mediu de cultură, în cantitate crescătoare de la o picătură la 3 picături; urina şi LCR se

însămînţează ca atare sau sedimentul lor (0,5 ml inocul/tub cu 5 ml mediu de cultură).Culturile sunt incubate la 30oC, la întuneric, timp de 2 luni. Agitarea periodică a

culturilor lichide stimulează creşterea (metabolism aerob).Săptămânal se va efectua un examen direct la microscopul cu fond întunecat, cu

respectarea strictă a normelor de protecţie în vederea evitării contaminării umane

accidentale (risc biologic de clasa a 2-a şi a 3-a). Când se observă leptospire se fac

subculturi pe medii proaspete.

-In vivo se face prin inoculare la cobai sau, de preferat, la hamster care este sensibil la mai multe serovaruri. Tehnica prezintă câteva inconveniente deoarece leptospirele îşi pierd repede virulenţa in vitro, nu toate serovarurile produc semne clinice evidente, iar sensibilitatea animalelor de laborator variază în funcţie de indivizi (sensibilitatea poate fi crescută printr-un tratament prealabil cu ciclofosfamidă).

2.3. IdentificareaCaracterele morfologice, mobilitatea şi creşterea pe mediile speciale susţin

apartenenţa la genul Leptospira.a. Caractere de cultură

Pe mediile specifice semisolide leptospirele se dezvoltă lent, în grosimea mediului, la 2-3 mm de la suprafaţă, determinând apariţia a 5-6 tipuri de colonii identificate prin reacţia oxidazelor. Speciile patogene au nevoie de un interval de timp mai mare, de peste 20 de zile, pentru a se dezvolta, în timp ce leptospirele nepatogene apar după 7 zile de la însămânţare. Creşterea leptospirelor se apreciază prin studiul culturilor la microscopul cu fond întunecat.

Pe mediile lichide creşterea leptospirelor nepatogene determină o uşoară opalescenţă, în timp ce tulpinile patogene nu produc modificarea clarităţii mediului.

b. Caractere morfologice. La microscopul cu fond întunecat leptospitele apar ca microorganisme de formă

spiralară, extrem de mobile, cu mişcări de rotaţie în jurul axului longitudinal, de flectaţie şi translaţie, subţiri şi strălucitoare pe fondul întunecat al câmpului.

Frotiurile colorate Giemsa şi examinate cu microscopul optic evidenţiază leptospirele care au un aspect spiralat regulat, capetele îndoite ca un cârlig şi o lungime dublă faţă de dimensiunile unei hematii.

La coloraţia specială Fontana-Tribondeau leptospirele apar colorate maron spre negru pe fond galben-bej (figura 10).

Nu se colorează Gram.

Figura 10: Aspectul leptospirelor la coloratia Fontana-Tribondeau(http://www.microbisome.com)

c. Caractere metaboliceÎn cazul leptospirelor patogene acestea sunt caracterizate printr-o activitatea

ureazică slabă, folosesc acetatul de calciu ca sursă de carbon şi fermentează inconstant zaharurile.

Sunt bacterii strict aerobe, catalază pozitive, oxidază negative.

d. Caractere de patogenitateAnimalele de laborator inoculate cu leptospire virulente dezvoltă un sindrom

febril, icter intens, hemoragii subcutanate şi viscerale, urmate de deces în 4-5 zile. Probele necroptice din ficat, rinichi, sânge, plamâni evidenţiază prezenţa leptospirelor.

Cobaii inoculaţi cu tulpini cu virulenţă redusă, se vindecă spontan după un sindrom febril ce apare la 7-12 zile de la inoculare. Animalele sunt sacrificate în a 21-a zi de la inoculare, la examenul post mortem constatându-se în special leziuni hemoragice pulmonare, leziunile hepatice şi renale fiind mai rare.

Fragmentele de ţesut recoltate sunt însamânţate pe mediile de cultură specifice pentru izolarea leptospirelor.

e. Caractere antigenicePentru determinarea tipului serologic al leptospirei izolate se utilizează reacţia

de microaglutinare-liză pe lamă. Pe o lamă de sticlă port-obiect se pune o picătură din cultura pozitivă cu leptospire şi o picătură ser standard. Lama se lasă în repaus timp de 15 minute după care se examinează la microscopul cu fond întunecat. În prezenţa serului specific se produce aglutinarea leptospirelor.

Rezultatul se exprimă în grade de intensitate a pozitivării reacţiei de la – la ++++: - la o reacţie negativă, leptospirele apar izolate pe câmpul miscroscopic, predominând

formele libere; - la o reacţie slab pozitivă (+) apar câteva leptospire aglutinate sub formă de gheme,

predominând însă leptospirele libere; - într-o reacţie pozitivă (++) predomină ghemele de leptospire;- în reacţia intens pozitivă (+++) ghemele sunt rare, iar leptospirele libere lipsesc; - în reacţia intens pozitivă (++++) lipsesc ghemele şi leptospirele.

3. DIAGNOSTIC IMUNOBIOLOGICDiagnosticul serologic este rezervat anumitor laboratoare de specialitate din

cadrul Centrelor Nationale de Referinţă. Testele se pozitivează din a 8-a sau a 10-a zi de boală când apar anticorpii specifici. Titrul de anticorpi scade în următoarele 3-6 luni, un oarecare titru rezidual putând persista mai mulţi ani. Studiul cineticii anticorpilor este indispensabil pentru diagnosticul biologic, testele urmând a fi efectuate în dinamică, la interval de 2 săptămâni. Testul ELISA

Foloseşte un antigen nepurificat extras dintr-o tulpină de Leptospira patoc anti-IgM umane cuplat cu peroxidază. Titrul de graniţă este de 1/400. Anticorpii serici detectabili apar din ziua a 8-a de boală ce urmează instalării sindromului febril. Principalul inconvenient este legat de faptul că este destul de des negativ atunci când infecţia este determinată de anumite serotipuri precum L. grippotyphosa sau australis. În forma sa actuală testul ELISA este considerat un test de depistare. RFC cantitativă

Foloseşte ca antigen Leptospira biflexa Patoc I (2 unităţi antigenice), un sistem hemolitic (eritrocite de oaie şi ser hemolitic), seruri pereche de la bolnav, inactivate, recoltate unul în prima săptămână de boală, al doilea după 7-12 zile şi alexina titrată (vezi tehnica RFC). Anticorpii fixatori de complement ating valoarea maximă în săptămâna a 3-a şi a 4-a de boală, scăzând către finele lunii a doua de boală. Au valoare în diagnosticul precoce al bolii.

Reacţia de micro-aglutinare Cunoscută şi sub numele de reacţia de aglutinare-liză Martin–Lepetit, reacţia

constă în evaluarea la microscopul cu fond întunecat a gradului de aglutinare a leptospirelor cu serul de bolnav. Reacţia rămâne tehnica de referinţă pentru determinarea serotipului de leptospire şi are la bază un set de antigene format din tulpini vii, reprezentative, ale principalelor serogrupe (20-23 de antigene).

Ca tehnică, pe o lamă port-obiect de sticlă se pun atâtea picături din serul de bolnav, diluat 1/50, câte tulpini de testat sunt în setul de reacţie. Se lasă în contact 15-20 de minute după care se examinează la microscop.

Microaglutinatele din reacţia pozitivă dau o imagine caracteristica de ,,cer înstelat’’ sau ca nişte gheme mici. Liza (L) se caracterizează prin umflarea şi imobilizarea leptospirelor care capătă un aspect granular. Aglutinarea se notează: + dacă sunt 4-5 gheme, ++ dacă sunt peste 6 gheme şi leptospire libere, +++ când are loc aglutinarea tuturor leptospirelor de pe lama examinată. Un ser este considerat pozitiv, la o diluţie dată şi pentru tulpina testată, dacă cel puţin 50% dintre leptospire sunt aglutinate faţă de o tulpină martor.

La om titrul prag de referinţă corespunde valorii de 1/100, fiind semnificativă pentru diagnostic şi creşterea în dinamică a titrului cu cel puţin 4 trepte binare la serul de convalescenţă faţă de serul de debut.

Omul este sensibil la toate serotipurile de Leptospira interrogans sensu lato, gravitatea bolii depinzând mai mult de inocul, de virulenţa tulpinii precum şi de gradul de sensibilitate individuală, decât de serovarul propriu-zis. Toate serotipurilor pot antrena o formă gravă, letală, cu toate acestea serovarurile grippotyphosa sau pomona, şi mai ales, icterohaemorrhagiae au reputaţia de a fi cele mai patogene.

VIRUSOLOGIE

1. DEFINIŢIE. CARACTERE GENERALE. CLASIFICAREVirusurile, formă de viaţă situată la limita inferioară de organizare biologică, sunt

microorganisme de dimensiuni foarte reduse (sub limita de decelare prin microscopie optică), a căror multiplicare necesită realizarea obligatorie a parazitismului intracelular. Această necesitate se impune datorită faptului că virusul, fiind lipsit de aparat propriu de sinteză, foloseşte ribozomii celulei parazitate (vegetală, animală, bacteriană) în vederea programării propriilor sinteze.

Printre caracterele generale ale unui virus pot fi enumerate: - dimensiuni reduse de ordinul nanometrilor;- orice virus este compus dintr-un miez de acid nucleic (fie ADN, fie ARN, niciodată ambele), înconjurat de proteine de suprafaţă ce alcătuiesc capsida virală;- sunt lipsite de echipament enzimatic, pentru programarea propriilor sinteze utilizează “materiale” (aminoacizi şi energie) împrumutate de la celula gazdă; - infecţia virală a celulelor organismului poate determina o viroză care evoluează fie inaparent, fie prin manifestări clinice şi fiziopatologice caracteristice.

CLASIFICAREA VIRUSURILOR

După natura celulei parazitate virusurile se împart în: - bacteriene; - animale (categorii importante pentru practica medicală); - vegatale.

Virusurile bacteriene (bacteriofagi-fagi), pot fi clasificate, după acidul nucleic

conţinut, în fagi ADN şi fagi ARN, iar după tipul de relaţie bacteriofag-celulă bacteriană

gazdă, în fagi litici şi fagi simbiotici sau temperaţi.

Virusurile animale se împart, la rândul lor, după mai multe criterii: dimensiuni, tropism, acidul nucleic conţinut etc.

După dimensiuni:- virusuri mici, cu diametrul de 15-30 nm: picornavirusurile (enterovirusuri);- virusuri mijlocii, cu diametrul de 70-180 nm: mixovirusurile, virusurile grupului Herpes, rhabdovirusurile, arbovirusurile, virusurile HIV;- virusuri mari, cu diametrul de 200-300 nm: poxvirusurile.

După tropism: - virusuri enterotrope: enterovirusurile, rotavirusurile;- virusuri neurotrope: arbovirusurile, tulpinile neuropatogene de enterovirusuri şi de virus rujeolos, virusul rabic;- virusuri dermotrope: virusurile grupului Herpes, poxvirusurile, virusul rujeolos, virusul rubeolic;

- virusuri cu tropism pentru căile respiratorii: mixovirusurile, adenovirusurile, coronavirusurile, rinovirusurile;- virusurile hepatotrope: virusurile hepatitelor virale, unele virusuri Coxsackie de grup B, unele arbovirusuri;- virusuri limfocitotrope: virusul jujeolos, virusurile HIV.

Unii agenţi virali prezintă afinităţi multiple. Astfel, unele variante de virus

rujeolos, pe lângă tropismul pentru căile respiratorii şi pentru piele, au şi neurotropism,

unele enterovirusuri manifestă pe lângă enterotropism şi neurotropism, în timp ce

virusurile Coxsackie de grup B pot fi concomitent hepatotrope, pancreatotrope,

miocardotrope şi neurotrope.

După simetrie virusurile se împart:- virusuri cu simetrie icosaedrică: parvovirusuri, adenovirusuri, Herpesvirusuri şi picornavirusuri;- virusuri cu simetrie helicoidală: orthomyxovirusuri, paramyxovirusuri.

După acidul nucleic conţinut virusurile animale se împart în virusuri ADN şi virusuri ARN (tabel 1).

Acid nucleic Grup virus Exemple

ARN

Picornavirus Enterovirusuri: polio, ECHO, CoxsackieVirusul hepatitei ARhinovirusuri

Orthomyxovirusuri

Virusurile gripale

Paramyxovirusuri

Virusurile paragripaleVirusul rujeolosVirusul urlianVirusul respirator sinciţial

Rhabdovirus Virusul rabicArbovirus Virusurile encefalitice transmise prin

artropodeTogavirus Virusul rubeolicRetrovirus Virusurile oncogene (tip C)

Virusurile HIV

Acid nucleic Grup virus Exemple

ADN

Adenovirus Adenovirusuri umaneAdenovirusuri simieneAdenovirusuri murine

Herpesvirus Virus Herpes simplexVirus varicella-zosterVirusul citomegalicVirusul Epstein-Barr

Poxvirus Virusul vacciniaVirusul variolic

Oncodnavirus Virusuri ADN oncogene grup Papova (virus papiloma, virus polyoma)

Hepadnavirus Virusul hepatitei BParvovirus Virusuri asociate adenovirusurilor

Tabel 1: Clasificarea virusurilor după acidul nucleic conţinut

2. MORFOLOGIE VIRALĂ

Virusurile posedă o varietate de forme şi o structură diferită, uneori foarte complexă (figura 1).

2.1. Forma virusurilor Există virusuri cu formă cilindrică (variante morfologice de virus gripal; unele

virusuri vegetale: virusul mozaicului tutunului), sferică (virusurile gripale, paramyxovirusurile), cristaliformă sau poliedrică (enterovirusurile: polio), formă de prismă sau cărămidă (virusurile pox).

2.2. Structura virusurilor Orice particulă virală (virion) conţine un miez de acid nucleic (nucleoid) şi un

strat proteic înconjurător, denumit capsidă. La unele virusuri există la exterior şi un înveliş numit anvelopă (peplos).

· Acidul nucleic (nucleoidul)Miezul de acid nucleic, constituit fie din ADN, fie din ARN (niciodată din

ambele tipuri), are structură polinucleotidică: polimer de radicali fosforici, pentoză şi baze purinice sau pirimidinice (adenină, guanină, timină şi citozină în cazul ADN viral şi adenină, guanină, uracil şi citozină în cazul ARN viral).

Majoritatea virusurilor animale conţin o moleculă de acid nucleic monocatenar, dar există şi virusuri cu acid nucleic bicatenar (reovirusurile conţin două lanţuri de ARN legate complementar).

Acidul nucleic poate fi dispus liniar, circular sau încolăcit în interiorul virionului şi este constituit din mai multe segmente sau dintr-o singură moleculă.

Acidul nucleic este genomul virusului conţinând genele, capabile să codifice sintezele de tip viral în celula parazitată.

· Capsida şi învelişulCapsida este dispusă în jurul nucleotidului viral, formând, împreună cu acesta, un

complex denumit nucleocapsidă. Capsida conţine proteine virale, grupate în unităţi denumite capsomere. Relaţiile

spaţiale acid nucleic-capsidă sunt foarte stricte, existând un raport între subunităţile (nucleotidele) moleculei de acid nucleic şi capsomerele capsidei.

Analiza chimică a compoziţiei capsidei relevă:

12

34

5

6

7

8 9

10

11

12

13

14

15

1: Bacteriofag T4; 2: Bacteriofag M13; 3: Virusul rabic; 4: Hematie; 5: Adenovirus; 6: Rinovirus; 7: Corpuscul elementar Chlamydia; 8: Bacteriofag MS2; 9: Virusul mozaicului tutunului; 10: Viroid; 11:

Virusul polio; 12: Prion; 13: Virusul vaccinia; 14: Virusul Ebola; 15: E.coli

Figura 1: Morfologie virală (comparaţie bacterii - virusuri)(sursa: http://www.futura_sciences.com)

- proteine simple, omogene (poliovirusuri şi alte enterovirusuri);- proteine complexe:

proteină suport legată de lipide: fosfolipide, colesterol, lecitină (myxovirusuri, paramyxovirusuri, poxvirusuri); proteină suport legată de fracţiuni glucidice ® glicoproteine (arenavirusuri, virusurile oncogene de tip C). La virusurile mici există un singur tip de monomer capsidal, constituit din lanţuri

polipeptidice omogene sub raportul greutăţii moleculare.

În general virusurile animale mai complexe, virusurile mari şi cele cu înveliş, au o

compoziţie capsidică mai complexă decât virusurile mici şi mijlocii fără înveliş,

monomerii fiind alcătuiţi din lanţuri polipeptidice heterogene.

Învelişul (peplos sau anvelopă) este constituit atât din proteine virale (simple sau complexe), cât şi din material lipoproteic “împrumutat” de la celula gazdă, în cursul multiplicării intracelulare a virusului.

Exemple de virusuri cu înveliş: virusurile gripale, paramyxvirusurile (virusurile paragripale, virusul rujeolos, virusul urlian), virusurile HIV, arbovirusurile, virusul rabic.

Elementele învelişului pot fi asamblate sub forma unei “mantii”, de la care pornesc prelungiri (virusul gripal, virusul HIV).

La nivelul învelişului se pot exprima antigene de mare însemnătate prin imunogenitatea lor, care servesc uneori şi la ataşarea virionului de receptorii celulei-gazdă (antigenele hemaglutininice şi neuraminidaza la virusul gripal, antigenele glicoproteice gp 120 şi gp 41, la virusurile HIV).

2.3. TIPURI DE SIMETRIE VIRALĂ

În cazul structurii unui virus, aşezarea spaţială a capsomerelor capsidei, ca şi poziţia acestora faţă de unităţile de bază ale acidului nucleic viral (nucleotide) prezintă caracteristici, ceea ce a dus la încadrarea virusurilor în categoria formelor anizotrope de organizare a materiei, asigurând componentelor structurii un maximum de energie legată (respectiv, un minimum de energie liberă).

Există două tipuri de simetrie: helicoidală şi icosaedrică.

· Simetria helicoidalăComplexul nucleocapsidei este dispus sub forma unei spirale (elice), constituit din

nucleoid (ex. virusul mozaicului tutunului) sau întreaga nucleocapsidă (ex. virusurile gripale).

Elicea (helixul) prezintă un singur ax rotaţional care coincide cu axul cilindrului nucleocapsidei sau a nucleoidului. Monomerii capsidei formează capsomere identice şi sunt ei înşişi identici, stabilind cu monomerii vecini acelaşi tip de legături.

Monomerii capsidei formează o figură în formă de panglică (figurile 2 şi 3).

· Simetria icosaedricăExistă la virusuri cu dimensiuni mici (enterovirusuri) şi mijlocii (virusurile

grupului Herpes). Acidul nucleic, de regulă monocatenar, este dispus central, ca un ghem lax. În

jurul lui sunt aşezate capsomerele, după planuri de simetrie riguroase, astfel încât conturul nucleocapsidei, privit în plan, apare ca un hexagon şi privit în spaţiu apare ca o figură poliedrică, cu feţe şi muchii egale între ele “icosaedru” (20 de feţe, 30 de muchii, 12 vârfuri).

Virusul EbolaSimetrie helicoidală cu înveliş

Figura 3: Virusuri cu simetrie helicoidală cu înveliş )(sursa: http://www.futura_sciences.com)

Simetrie helicoidală cu înveliş Particule virale gripale

Figura 2: Virusuri cu simetrie helicoidală cu înveliş )(sursa: http://www.futura_sciences.com)

Spiculi

Spiculi

Monomerii proteici ai capsomerului 6 sau 5 pentru fiecare capsomer (6 - capsomer hexagonal şi 5 - capsomer pentagonal).

Numărul de capsomere în icosaedru este de 42, din care 12 pentagonale şi 30 hexagonale.

Aşezarea capsomerelor se face după anumite axe: axele ideale trec prin centrul edificiului şi prin colţurile capsidei. Axele ce trec prin colţuri împart icosaedrul în 5 sectoare. Dacă icosaedrul se învârteşte în jurul axului central cu 1/5 la fiecare rotaţie, se obţine aceeaşi figură. Deci prin rotaţie completă figura se reproduce pe ea însăşi de 5 ori.

Există şi axe de simetrie care împart icosaedrul în 3 sectoare egale (axe ce trec prin centrul feţelor triunghiulare). Dacă icosaedrul se roteşte cu 1/3, la fiecare rotaţie se va reproduce aceeaşi figură.

Dacă se roteşte cu ½ axul ce uneşte centrele a 2 capsomere hexagonale opuse, icosaedrul poate fi reprodus.

Deci, icosaedrul viral are o simetrie rotaţională de tip 5: 3: 2, cu unele excepţii (adenovirusuri, reovirusuri).

3. RELAŢII VIRUS-CELULĂ GAZDĂ

Între virusul animal şi celula gazdă pe care o parazitează se pot stabili două feluri de relaţii: de tip litic (citocid) şi de tip simbiotic.

3.1. Relaţii virus-celulă gazdă de tip litic (citocid) În acest tip de relaţie (figurile 4 şi 5), infecţia cu virus a unei celule animale se

soldează cu moartea celulei şi cu eliberarea de particule de virus neoformate (progeni) în mediul extracelular.

Etapele acestei relaţii sunt: adsorbţia, penetrarea, decapsidarea, sinteza

particulelor virale neoformate, eliberarea particulelor virale neoformate.

· AdsorbţiaProcesul implică doi timpi: colizinea şi ataşarea.

Coliziunea reprezintă alipirea particulei (prin situsurile virale de ataşare) de suprafaţa celulei sensibile (tabel 2). Ea depinde, pe de o parte, de proporţia între numărul de virioni şi numărul de celule (raportul de infectivitate), iar pe de altă parte, de unele condiţii ale mediului de reacţie (temperatură, pH, concentraţie ionică).

Ataşarea semnifică unirea strânsă între virion şi unele zone de pe suprafaţa celulei, numite receptori.

Receptorii celulari pot fi specifici anumitor agenţi virali, explicând tropismul unor virusuri faţă de anumite substrate celulare (myxovirusuri, picornavirusuri) sau pot fi nespecifici (neselectivi în raport cu mai multe categorii de virusuri - arbovirusuri, poxvirusuri). - Ataşarea specifică a myxovirusurilor (v. gripale) şi paramyxovirusurilor (v. urlian, v. bolii Newcastle) se datoreşte intervenţiei unei enzime virale (neuraminidaza) care prezintă proprietatea de a ataca substanţa receptor constituită din situsuri de mucoproteină (bogate în acid neuraminic sau sialic).

Agent viral Situs viral de ataşare Receptori celulariVirus gripal hemaglutinină,

neuraminidază (înveliş)

mucoproteine (acid sialic)

Virus HIV gp 120 (înveliş) receptor limfocitar CD4Virus poliomielitic situs capsidal receptor specific (cu exprimare

diferită in vivo sau in vitro pe celula renală de maimuţă)

Virus rabic hemaglutinină (înveliş)

Receptor acetilcolinic (muşchi striat)

Virus Herpes simplex

g (înveliş) Receptor pe celula fibroblastică de hamster, şoarece, om

Tabel 2: Exemple de situsuri virale de ataşare şi receptori celulari

- Ataşarea specifică a picornavirusurilor a fost cercetată îndeosebi la poliovirusuri. Astfel, extrăgându-se un material proteic din membranele celulelor susceptibile la infecţia cu poliovirusuri, s-a demonstrat capacitatea acestui material de a inactiva virusul. În prima etapă a ataşării, receptorii specifici poliovirusurilor realizează un complex reversibil, pentru ca, în timp, legătura receptor-virus să devină stabilă (capacitatea infectivă a virusului nu mai poate fi recuperată prin diverse tentative de desfacere a complexului). Tot referitor la receptorii pentru poliovirusuri este de remarcat că, uneori, celulele aparţinând unei anumite specii sau unui anumit allotip, rezistente in vivo la infecţia poliovirotică, devin deosebit de sensibile la acelaşi virus, odată cu scoaterea lor din organism şi cultivarea in vitro (exemplu: celulele renale de maimuţă). Acest fenomen poate fi explicat prin derepresarea in vitro a unei gene celulare care codifică exprimarea activităţii receptorului de membrană pentru poliovirus. Pe de altă parte, sunt şi situaţii în care poliovirusul se ataşează pe receptorii celulari, fără a se declanşa etapele consecutive ale infecţiei de tip litic, ceea ce relevă complexitatea fenomenului de ataşare, în funcţie de tipul de celulă şi de virusul infectant.

· PenetrareaÎn această etapă are loc trecerea virusului din exteriorul celulei în interiorul

acesteia. Înglobarea virusului în citoplasmă (“viropexie”) a fost confirmată numai în unele cazuri de relaţie de tip litic (poliovirusuri, myxovirusuri, reovirusuri), prin prezenţa în citoplasma celulelor virus infectate, în primele ore de la iniţierea infecţiei virale, a unor vacuole de fagocitare care conţin particule virale intacte.

· Desfacerea capsideiSpre deosebire de bacteriofagi, la care numai acidul nucleic este “injectat” în

celula parazitară, la virusurile animale se impune pierderea unei părţi a capsidei virale, prin enzimele lizozomale ale celulei. Lizozomii se aliniază de-a lungul pereţilor vacuolelor de fagocitare, eliberând enzime litice care desfac atât peretele vacuolei, cât şi o parte a capsidei virionilor conţinuţi în vacuolă.

Pentru virusurile ADN mari (poxvirusuri) decapsidarea este catalizată şi de enzime virus-induse în celula gazdă.

· Sinteza particulelor virale neoformateEste cea mai importantă etapă a relaţiei virus celulă gazdă de tip litic şi constă în

esenţă, din codificarea unui nou program, folosind aparatul ribozomal al celulei parazitate. Această etapă cuprinde două categorii de fenomene: precoce (“early”) şi tardive (“late”).

FENOMENE PRECOCE

În primele 6-8 ore de la pătrunderea virusului în celulă, acidul nucleic viral induce

două procese:

- Oprirea sintezelor proteice de tip celular, prin “paralizarea” funcţională a ADN celular;- Codificarea unor enzime numite polimeraze virus-specifice (ARN polimeraza virus-indusă, în cazul virusurilor ARN; ADN polimeraza virus-indusă în cazul virusurilor ADN). Aceste polimeraze catalizează formarea de copii ale acidului nucleic viral, folosind ca matrice nucleoidul viral decapsidat după intrarea în celulă. Se iniţiază, în acest fel, replicarea acidului nucleic viral, cu apariţia unor multiple “copii” conţinând genele de tip viral.

Figura 4: Etape ale infecţiei virale: Ataşare, penetrare, decapsidare (sursa: http://www.futura_sciences.com)

Ataşare Endocitoză Penetrare Decapsidare

FENOMENE TARDIVE

- “Copiile” de acid nucleic viral programează la nivelul ribozomilor celulari sinteze proteice noi, folosind ca “materie primă” aminoacizii celulari, prin legarea acestora într-o ordine (secvenţă) diferită, conform modelului înscris în genomul viral.

· În cazul virusurilor ARN, moleculele de acid nucleic viral rezultate din replicarea intracelulară reprezintă ele însele un ARN mesager nou, “citit” direct de ribozom. · În cadrul virusurilor ADN, pe matricea acidului nucleic viral se sintetizează mai întâi un ARN mesager virus specific, care funcţionează apoi ca un nou “programator” la nivelul ribozomilor.

- Proteinele virale sintetizate de către ribozomi, potrivit unui nou program, se aşează în jurul moleculelor de acid nucleic viral şi astfel se produce asamblarea şi maturarea particulelor virale neoformate. În cadrul acestui proces, are loc şi aşezarea subunităţilor capsidale (monomerilor) după simetria caracteristică tipului de virus infectant, fenomen codificat şi el de către unele gene virale.

· Eliberarea particulelor virale neoformateVirionii nou formaţi, care, cu rare excepţii (mutante) sunt identici morfologic şi

genetic cu particula care a iniţiat infecţia virală a celulei, sunt eliberaţi în mediul extracelular. De regulă, acest fenomen se însoţeşte de dezintegrarea (moartea) celulei gazdă.

Figura 5: Etapele ciclului viral de tip litic (sursa: http://www.futura_sciences.com)

Ataşare

PătrundereReplicare

Eliberare

Asamblare

3.2. RELAŢII VIRUS-CELULĂ GAZDĂ DE TIP SIMBIOTIC

În urma acestui tip de relaţie virus-celulă gazdă, celula nu moare, ci câştigă proprietăţi noi.

Etapele infecţiei virale de tip simbiotic sunt asemănătoare cu cele din infecţia de tip litic în ce priveşte adsorbţia, penetrarea şi desfacerea capsidei. Deosebirile apar în etapele următoare: programarea sintezelor de tip viral, apariţia unor proprietăţi de tip nou.

· Programarea sintezelor de tip viralInducerea unui nou program de către acidul nucleic viral în celula animală virus

infectată nu se soldează cu oprirea activităţii ADN celular, astfel încât ribozomii vor sintetiza concomitent proteine celulare şi virale. Modul programării sintezelor virale diferă la virusurile ADN şi ARN capabile să stabilească relaţie simbiotică.

Virusurile ADNADN viral pătruns în celulă poate urma două modele de codificare a sintezelor

proprii (figurile 6 şi 7). Modelul 1: ADN viral se integrează (inseră) într-o zonă a ADN celular. Ulterior, se va sintetiza un ARN mesager complementar mixt, conţinând anticodoni de tip celular şi anticodoni de tip viral. ARN mesager va ajunge la ribozomi, care vor “citi” mesajul. Model 2: ADN viral nu se integrează în genomul celular, ci induce sinteza unei enzime precoce (ARN-polimeraza virus indusă) care catalizează sinteza de ARN mesager nou, pe matricea de ADN viral. Pe de altă parte, ADN celular comandă sinteza de tip celular prin intermediul ARN mesager normal. În acest fel, unii ribozomi vor citi mesajul de pe molecula de ARN mesager celular, alţii de pe ARN mesager de tip viral, în aceeaşi celulă apărând proteine celulare şi virale.

Proteine capsidale

ARNm

Fenomene precoceale transcripţieiFenomene tardive

ale transcripţiei

Ataşarea virusului pe celula gazdă

Pătrunderea virusului în celulă

Translaţie

Virion complet

Virion eliberat

Papovavirus

Astfel, un acelaşi ribozom va sintetiza proteine cu secvenţe de aminoacizi dictate de ADN celular, precum şi proteine cu secvenţe de aminoacizi dictate de ADN viral.

Virusurile ARNÎn cazul virusurilor ARN, mecanismul integrării acidului viral în ADN celular a

fost propus de Temin 1972, modelul fiind confirmat apoi experimental la virusurile integrate de tip C (retrovirusuri). Procesul este cunoscut sub numele de “revers-transcripţie”. ARN viral pătruns în celulă reprezintă o nouă matrice, care induce formarea unei enzime, numită revers-transcriptază. Această enzimă catalizează sinteza unui ADN complementar folosind ca matrice ARN viral (invers decât la celula eucariotă normală, unde pe matricea de ADN se formează ARN complementar).

ADN complementar viral (“provirus”) se integrează în ADN celular şi apoi urmează aceeaşi cale ca la modelul 1 de programare de la virusurile simbiotice ADN, rezultând proteine mixte celular-virale.

“Revers-transcripţia”, caracteristică pentru virusurile oncogene tip C şi pentru virusul HIV, implică intervenţia mai multor enzime, după cum urmează (tabel 3):

Secvenţă a revers-transcripţiei Enzime virale responsabileFormarea primei catene de ADN proviral

Revers-transcriptaza

Depolimerizarea nucleotidelor din ARN viral care nu funcţionează ca “matrice”

Ribonucleaza H

Formarea ADN proviral dublu catenar (ataşarea celei de a doua catene)

Revers-transcriptaza

Integrarea provirusului în ADN celular IntegrazaActivarea genomului viral activat Complex genic de activare

(exemplu: tat/nef la virusul HIV), plus un complex enzimatic

Tabel 3: Etape ale revers-transcripţiei şi enzimele responsabile

Figura 6: Ciclul replicativ viral (sursa: http://www.futura_sciences.com)

· Apariţia unor proprietăţi noiConsecinţa stabilirii unei relaţii de tip simbiotic virus-celulă gazdă, constă în

apariţia unor proprietăţi modificate ale celulei infectate faţă de celula normală-neinfectată.

Printre proprietăţile modificate menţionăm:

- Transformarea celulară: implică modificări profunde morfologice, genetice, biochimice, de suprafaţă, de potenţial oncogen, proces complex, echivalent până la un punct malignizării;

- Exprimarea de antigene noi pe suprafaţa celulei;

- Instalarea unor modele metabolice particulare, care asigură un echilibru între sinteza concomitentă de proteine de tip celular şi de tip viral în aceeaşi celulă.

Mecanismele care stau la baza apariţiei acestor noi proprietăţi sunt, pe de o parte, introducerea, concomitent cu acidul nucleic viral, a unor gene noi, capabile să codifice proprietăţile modificate (exemplu: genele “pol”, “gag”, “env”, “onc”, ale virusurilor oncogene ARN-retrovirusuri, codifică sinteza revers-transcriptazei, proteinelor p10, p12, p15, p30, glicoproteinei majore gp70, malignizarea celulei), iar pe de altă parte, derepresia unor gene celulare datorită pătrunderii şi integrării acidului nucleic viral în

Celula gazdă

Catene ARN identice

AND celulă gazdă

ARN viral dublu catenar

Maturarea retrovirusului

Sinteza ADN proviral prin reverstranscripţie

Integrarea ADN proviral în ADN celulei gazdă

Transcripţia provirusului în două catene ARN identice

care codifică sinteza de proteine virale

Penetrarea retrovirusului în celula gazdă

Proteine virale

Figura 7: Ciclul replicativ al retrovirusurilor (sursa: http://www.futura_sciences.com)

genomul celulei cu codificarea consecutivă a exprimării de noi proprietăţi (exemplu: antigenul carcino-embrionar, prezent numai în celulele embrionate şi fetale şi, respectiv, în celula cancerizată, dar absent în celula normală adultă).

3.3. ASPECTE PARTICULARE DE RELAŢII VIRUS-CELULĂ GAZDĂ

- Între virus şi celula-gazdă, există posibilitatea coexistenţei celor două tipuri de relaţii: litică şi simbiotică (virusurile de tip C la multe specii de mamifere). În acest caz, într-o populaţie celulară sau într-un ţesut cancerizat, unii virioni induc transformare (prin integrarea acidului nucleic viral în genomul celular), alţii induc relaţie litică (producerea de progeni virali, eliberarea de particule neoformate şi moartea celulei gazdă).- O alt caz deosebit este oferit de virusurile lente. Aceşti agenţi virali stabilesc o relaţie de tip litic, cu o rată foarte joasă de infectivitate, astfel încât, în acelaşi ţesut, unele celule prezintă leziuni, altele sunt normale. Consecinţa este evoluţia lungă (ani, decenii) a unei afecţiuni degenerative, la care se poate adăuga apoi şi un mecanism autoimun de întreţinere.- Un alt aspect particular al relaţiilor virus-celulă gazdă este reprezentat de virusurile “mascate” (virusuri din grupul Herpes, v. rubeolic, v. rabic, v. HIV). Aceste virusuri, în anumite circumstanţe, pot produce o infecţie latentă a celulei, genomul viral fiind integrat în genomul celular fără să-şi trădeze prezenţa. La un moment dat, la intervenţia unui factor “demascator”, genomul viral intră în activitate, se desprinde din inserţia cu genomul celular şi declanşează ciclul de multiplicare virală de tip litic, cu dezintegrarea celulei gazdă.

4. IZOLAREA VIRUSURILOR ŞI EFECTELE VIRUS SPECIFICEVirusurile se multiplică numai pe celulele vii, care le furnizează materia primă,

energia şi chiar mecanismele de sinteză, replicarea având loc conform informaţiei

genetice induse de acidul nucleic viral. Ele cultivă, în laborator, pe ouă de găină

embrionate, culturi celulare sau animale de laborator.

Modificările apărute la gazdele inoculate dau indicaţii asupra grupului de virusuri

căruia îi aparţine virusul inoculat, identificarea speciei sau a tipului făcându-se prin

reacţii antigen-anticorp.

4.1. Ouă de găină embrionateCultivarea virusurilor în oul embrionat de găină a constituit un progres remarcabil

în virusologie, prin utilizarea unui sistem de celule constituit din ţesuturi în dezvoltare, cu multiplicare activă, practic steril, lipsit de mijloacele de apărare antiinfecţioasă existente

la animalele adulte. Cultivarea se face prin inoculare în anexele embrionare: cavitatea amniotică şi alantoidiană, sacul vitelin, pe membrana corioalantoidiană.

Ouă de găină embrionate, de aproximativ 6-10 zile, sunt utilizate pentru izolarea

şi identificarea unor virusuri din produsele patologice sau pentru prepararea de antigene

şi vaccinuri virale. Inocularea în cavitatea alantoidiană şi amniotică se foloseşte pentru

cultivarea virusurilor gripale, paragripale, v. urlian, rujeolic; pe membrana

corioalantoidiană se cultivă v. herpetic şi poxvirusuri.

Efecte virus-specifice pe ou embrionat: efectul hemaglutinant prin hemaglutininele virale (depozit cu marginile crenelate, franjurate în prezenţa hematiilor de diverse specii); leziuni pe membrana corioalantoidiană; incluzii virale; hemoragii şi moartea embrionului.

4.2. Culturi celulareSunt substrate de celule eucariote întreţinute in vitro, sub forma monostratului

celular. Ţesuturile fragmentate în piese mici sunt disociate cu tripsină în celule individuale, diluate într-un mediu nutritiv şi introduse în recipiente de sticlă sau plastic, unde se ataşează şi se multiplică pe suprafaţă.

Culturile de celule reprezintă astăzi metoda cea mai adecvată pentru izolarea unor virusuri: enterovirusurilor, adenovirusurilor, v. paragripale, v. respirator sinciţial etc. Se cunosc trei tipuri de culturi celulare (tabel 4): culturi primare (rinichi de maimuţă); culturi diploide (din ţesuturile embrionare), linii celulare continue (din ţesuturile tumorale).

ProprietăţiCulturi primare

Celule (tulpini) diploide

Linii celulare (stabilizate)

CariotipNr. de pasajeDependenţă de ancorare (pe suprafaţă solidă)Necesitate de ser în mediuSusceptibilitate la infecţia viralăOrigine tisulară

Tipuri morfologice

diploidcâtevada

5-10%

largăţesut normal adult sau embrionaramestec al celor două tipuri

diploidaproximativ 50da

5-10%

largăţesut normal embrionarfibroblastic

heterodiploidnelimitatnu (pot fi cultivate în suspensie)

2-5%

restrânsăţesut canceros sau ţesut normal embrionarepitelial sau fibroblastic

Tabel 4: Tipuri de culturi celulare

Multiplicarea virusurilor în culturile de celule se evidenţiază prin examen microscopic direct, care demonstrează degenerarea celulelor de cultură (apariţia unor

modificări morfologice ale celulelor sub acţiunea virusurilor): efect citopatic (distructiv, sinciţial, în focar). Astfel enterovirusurile (virusurile poliomielitice) determină apariţia unor celule mari, refringente cu desprinderea în întregime a monostratului celular în 2-3 zile; alte virusuri determină apariţia unor celule mari, multinucleate-sinciţii (v. respirator sinciţial, v. rujeolos, v. herpes); adenovirusurile determină o alterare localizată, cu aspect de mură - în focar.

Alte efecte virus specifice pe culturile celulare sunt: efectul hemaglutinant şi efectul hemadsorbant. Unele virusuri hemaglutinante (gripal, paragripal), multiplicate în culturi de celule, îşi manifestă proprietatea de a aglutina hematiile anumitor specii de animal. De asemenea, celulele în care s-a multiplicat un virus hemaglutinant sunt capabile să adsoarbă hematiile provenite de la diferite specii animale (hemadsorbţie).

Pe culturi celulare au mai fost evidenţiate şi alte efecte virus specifice: incluzii virale; interferenţă (competitivitate); efectul transformant - modificări morfologice, genetice, metabolice.

Incluziile virale sunt formaţiuni intracelulare cu o colorabilitate modificată, dezvoltate progresiv în timpul multiplicării, reprezentând, în general, locul în care se sintetizează componente virale sau se asamblează virioni. Sunt unice sau multiple, mari sau mici, rotunde sau de formă neregulată, acidofile sau bazofile, intranucleare sau intracitoplasmatice (tabel 5).

Interferenţă. Unele virusuri (v. rubeolic) fără a produce efect citopatic determină un fenomen de interferenţă. Cultura inoculată pentru izolarea v. rebeolic este testată câtva timp mai târziu prin infectare cu un v. citopatogen. Lipsa multiplicării acestuia pledează, cu mare probabilitate, pentru prezenţa în cultură a v. rubeolic.

4.3. Animale de laboratorInocularea animalelor de laborator a fost prima metodă folosită pentru izolarea

virusurilor şi precizarea tropismului lor pentru diferite ţesuturi, tropism însoţit de leziuni caracteristice. Efecte virus specifice la animalele de laborator sunt: efecte clinice (v. rabic); paralizii (flască - v. Coxsackie grup A; spastică - v. Coxsackie grup B); incluzii virale (Babeş Negri - v. rabic); modificări histopatologice (v. polio - leziuni ale corpului neuronului motor periferic din coarnele anterioare ale măduvei).

Localizare Colorabilitate

Virus

Nuclear

Citoplasmatic

Nuclear şi citoplasmatic

BazofilăAcidofilă

Acidofilă

Acidofilă

AdenovirusuriHerpetoviridaePapovaviridaeParamyxoviridaeReoviridaeRhabdoviridae (corpi Babeş-Negri)Poxviridae (corpi Guarnieri)V. rujeoleiCitomegalovirus

Tabel 5: Exemple de virusuri ce determină incluzii virale

5. ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI ŞI CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR

Factorii fizici şi chimici pot acţiona asupra virusurilor (acid nucleic, capsidă, înveliş) prin modificarea unor proprietăţi fizice ale virionilor (constantă de sedimentare, încărcătură electrostatică) sau prin modificarea compoziţiei constituenţilor virali.

Rezultatul cel mai important al acţiunii convergente a factorilor fizici şi chimici este pierderea infectivităţii (capacităţii de multiplicare în celula virus-sensibilă).

5.1. ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI ASUPRA VIRUSURILOR

· CălduraVirusurile, în preparatele proaspete (produs patologic), sunt relativ stabile la

temperatura camerei, cu pierderea în timp a infectivităţii. O temperatură de 50-60C inactivează virusurile, prin denaturarea proteinelor

capsidale, uneori inactivarea fiind însoţită şi de pierderea proprietăţilor antigenice (denaturarea specificităţii antigenice).

Temperaturile joase reprezintă un mijloc eficient de conservare a virusurilor, în condiţii speciale (în azot lichid şi în mediu cu substanţe protectoare) putând fi păstrate timp indefinit. · Tratamentul mecanic

Prin agitare se asigură dezintegrarea suspensiei virale. La valori înalte de presiune mecanică virusurile sunt rezistente.Presiunea osmotică acţionează nociv numai când se produc şocuri osmotice.

Modificări mai discrete ale presiunii osmotice pot duce la schimbări în compoziţia chimică a proteinelor capsidale. · Ultrasunetele

Acţionează asupra virusurilor cu structură simplă (simetrie helicoidală, fără înveliş) în formă de baghetă, fiind ineficientă asupra virionilor sferici sau cărămidiformi.· Desicarea

La uscăciune şi la temperatura camerei unele virusuri sunt inactivate

(mixovirusuri şi paramixovirusuri), în timp ce alte virusuri rezistă destul de mult timp în

aceleaşi condiţii (enterovirusuri).

· RadiaţiileIndiferent de natura radiaţiilor, ionizante (X, radiaţii ale izotopilor radioactivi) sau

neionizante, (ultraviolete), efectul de iradiere depinde de doi factori: energia quantică şi

natura materialului absorbant. În plus există substanţe care protejează virionul împotriva

efectelor radiaţiilor, cum sunt proteinele sau agenţii reducători.

Radiaţiile ionizante acţionează prin două mecanisme: denaturarea proteinelor şi acizilor nucleici (lacună în lanţul polinucleotidic, modificarea biochimică a structurii bazelor pirimidinice) şi efectul de ionizare (formarea de radicali liberi -OH, formarea de

peroxizi). La doze mai mici de radiaţii ionizante, nu se produce inactivarea virusului, ci apar mutaţii genice induse.

Radiaţiile ultraviolete se absorb selectiv la nivelul acizilor nucleici,

îndeosebi ADN, determinând formarea dimerilor pirimidinici toxici. Modificările induse

sunt reversibile, selectându-se indivizi rezistenţi la efectul radiaţiilor, prin procesele de

fotoreactivare şi restaurare la întuneric.

- Fotoreactivarea: radiaţiile luminoase pot activa o enzimă care clivează dimerii pirimidinici toxici;- Restaurarea la întuneric (“dark repair”) constă în faptul că, la întuneric, are loc acţiunea succesivă a trei enzime: o endonuclează care desprinde dimerul pirimidinic de pe ADN; o exonuclează care formează “lacune” de-a lungul moleculei alterate de ADN, prin clivare secvenţială; o ADN-polimerază care umple lacunele, folosind ca matrice porţiunea omologă din lanţul geamăn de ADN, nealterat.

5.2. ACŢIUNEA AGENŢILOR CHIMICI ASUPRA VIRUSURILOR

· EnzimeMajoritatea virusurilor manifestă rezistenţă marcată la acţiunea RN-azei, DN-azei

şi a unor proteaze. Papaina activată inactivează unele virusuri, pronaza atacă efectiv capsida.· Agenţi care denaturează proteinele

Dintre aceşti agenţi cei mai cunoscuţi prin efectul lor asupra virusurilor sunt: detergenţi sintetici, solvenţii lipidelor de tip eter, cloroform (ambele categorii inactivează virusurile cu înveliş lipidic), ureea şi guanina (desprinderea capsidei fără a altera acidul nucleuic), valorile înalte sau joase de pH ale mediului (împiedică ataşarea pe receptorii celulari). · Agenţi oxidanţi

Sunt cunoscute acţiunile peroxizilor (procese oxidative la nivelul proteinelor capsidale), acidul nitros (mutagen în doze mici, inactivant în doze mari), agenţii alchilanţi (desfacerea lanţului polinucleotidic), beta-propiolactona (agent puternic alkilant şi acylant, inactivând virusurile rapid, uneori cu conservarea imunogenităţii). · Formaldehida

Inactivează virusurile rapid dar le conservă imunogenitatea.

6. GENETICĂ VIRALĂ6.1. Mutaţia virală

Este o greşeală în autoreplicarea acidului nucleic viral, în cursul formării de noi progeni (indivizi rezultaţi din multiplicarea virusului în celula gazdă). Progenii deosebiţi genetic de particulele virale parentale se numesc mutante virale. Aceste mutaţii pot fi: spontane (mutaţii întâmplătoare, fără intervenţie umană, prin alterarea spontană a unei baze) şi induse (apar experimental sub acţiunea unor factori mutageni fizici - radiaţiile ionizante, sau chimici - acidul nitros, coloranţii acridinici, analogii halogenaţi ai bazelor pirimidinice: 5-bromdeoxiuridina, 5-fluorouracil).

Mecanisme care stau la baza mutaţiilor sunt: substituirea unor baze; adiţia unor perechi de baze necomplementare; inserţia mutagenului între două baze vecine de pe

acelaşi lanţ de acid nucleic viral, urmată de citirea greşită a perechilor de baze; deleţia (desprinderea) unei părţi din genomul viral în cursul ciclului biologic viral, avînd drept consecinţă oprirea procesului de multiplicare şi apariţia de particule virale defective.

6.2. Interacţiuni genetice între virusuriSe produc în urma infecţiei mixte a unei celule gazdă cu două sau mai multe

virusuri diferite, astfel încât progenii produşi în urma ciclului de multiplicare virală exprimă caractere mixte, primite de la virusurile parentale.

Noţiunea de interacţiune genetică (interschimburi de segmente de acid nucleic între genomuri aparţinând unor virusuri diferite) cuprinde fenomenele de recombinare, reasortare etc. În cazul recombinării virale schimbul de material genetic se produce intramolecular. Reasortarea poate avea loc la virusuri cu genomuri plurimoleculare (fragmentate-segmentate) în care moleculele separate de acid nucleic se reasociază pentru a forma genomuri noi.

Pentru realizarea interschimbului de material genetic între virusuri diferite există

cel puţin două condiţii care trebuie îndeplinite:

- genomurile virusurilor implicate trebuie să se afle în aceeaşi celulă, condiţie îndeplinită de infecţia simultană (coinfecţie); - între genomuri să existe omologii structurale ale acizilor nucleici (nu se pot produce

interacţiuni genetice între virusuri ARN şi virusuri ADN.

Procesul de interacţiune genetică între virusuri are foarte mare importanţă pentru HIV şi virusurile gripale, la care, prin circulaţie interumană, datorită recombinărilor genice, apar noi tulpini, variante genetice.

7. APĂRAREA ORGANISMULUI ÎMPOTRIVA VIRUSURILORInfecţia virală este supusă în general legilor procesului infecţios, care reprezintă

rezultanta între capacitatea patogenă a agentului infectant şi mijloacele de apărare ale

organismului. Aceste mijloace de apărare, nespecifice şi specifice (imune), acţionează de

regulă concertat.

7.1. Apărarea nespecifică antiviralăa. Bariere naturale cutanate şi mucoase

Bariere mecanice: integritatea epiteliului (obstacol împotriva virusurilor mari: poxvirusuri, herpesvirusuri); mucusul de la suprafaţa mucoasei respiratorii; acidul hialuronic din cimentul intercelular al epidermului şi substanţa fundamentală a dermului

constituie o barieră eficientă faţă de agenţii virali cu tropism cutanat (mai ales că, spre deosebire de bacterii, virusurile sunt lipsite de echipament propriu de enzime depolimerizante);

Bariere fizice şi chimice: pH scăzut al pielii (defavorizează persistenţa virusurilor pe piele), mucopolizaharide în salivă şi în secreţiile căilor respiratorii superioare, HCl din stomac;

Bariere biologice: relaţia de antagonism între diverse virusuri ce coexistă (ocuparea prin competiţie de către enterovirus a celulelor cu platou striat din epiteliul mucoasei intestinului subţire împiedică intrarea unui agent viral omolog sau heterolog); relaţia de antagonism între flora bacteriană normală din microbiocenozele organismului şi virusuri.

b. Reacţia febrilă Se produce prin eliberarea secundară a unui factor pirogen, în cursul circulaţiei

virusului în umori. Eficienţa febrei în apărarea antivirală este tradusă atât prin accelerarea eliminării

urinare a virusului cât şi prin activarea circulaţiei centrale şi periferice, creşterea

catabolismului celular datorită eliberării de hormoni tiroidieni şi steroizi în cursul febrei.

Eliberarea acestor hormoni limitează multiplicarea virusului în celulele sensibile

(modificând susceptibilitatea receptorilor de suprafaţă ai acestora) şi potenţează unele

posibilităţi de apărare nespecifică (elaborarea de interferon, strss-ul antiviral).

În acelaşi timp, însă, nu trebuie neglijată posibilitatea ca în stări febrile

determinate de diferite cauze (virale sau nevirale) să se producă actualizarea clinică a

unei infecţii virale latente (v. herpes simplex). Astfel, putem afirma că nu întotdeauna

creşterea temperaturii reprezintă un factor propri-zis de apărare, ci, din contră, chiar

favorizează multiplicarea agentului viral în organism.

c. Stress-ul antiviralAgentul viral poate acţiona ca declanşator al activităţii axului hipotalamus -

hipofiză anterioară (ACTH) - suprarenală cu eliberarea de hormoni steroizi, în cantităţi inferioare dozelor imunosupresive şi interferon-inhibitorii, dar suficiente în limitarea dispersiei virusurilor. Glucocorticoizii determină: fixarea hormonului prin competiţie pe receptorii celulari pentru virus, împiedicând adsorbţia; solidizarea membranelor lizozomale fiind împiedicată eliberarea enzimelor lizozomale (proces necesar

multiplicării unor virusuri); potenţarea activităţii de protecţie exercitată de interferon asupra unor celule învecinate celulelor virus-infectate.

d. Factori interni umorali (serici)În cadrul factorilor serici de apărare nespecifică antivirală intervine şi sistemul

complementului care determină liza celulelor “ţintă” . Importanţa acestuia în viroze este însă mult mai puţin importantă decât în bacterioze. S-a stabilit cu certitudine rolul inactivant al complementului, în perioada de viremie, faţă de unele virusuri (gripale, urlian, Herpesvirusuri, poxvirusuri), ca şi rezistenţa marcată a unor virusuri la acţiunea acestuia (polio, adenovirusuri).

e. Factori interni celulari - fagocitoza virală Procesul activ de includere şi inactivare intraleucocitară (fagocitoza propriu-zisă)

trebuie diferenţiată de prezenţa virusului în leucocite, care reflectă tropismul leucocitar al

acestuia.

Fagocitoza virală eficientă, în care macrofagele au rol mai activ decât granulocitele neutrofile, a fost atestată în infecţiile cu virusuri gripale, virusuri Coxackie şi virusuri din grupul Herpes. Agentul viral inclus în fagocit poate fi inactivat (acţiune reală de apărare antivirală), dar poate şi supravieţui cu multiplicare ulterioară (infecţie persistentă), devenind astfel inabordabil mijloacelor de apărare imună pe linie umorală şi celulară.

Înglobarea şi distrugerea germenilor microbieni este inhibată profund de unele virusuri prin efectul imunosupresiv al acestora, cum este cazul v. gripale, v. rujeolos, virusurilor Coxackie şi virusurilor din grupul Herpes. După viroze, ce au ca agenţi etiologici virusurile enumerate mai sus, se constată scăderea rezistenţei organismului cu posibilitatea instalării unor complicaţii bacteriene.

f. Elaborarea de interferonInterferonul reprezintă un complex proteic, secretat de celulele infectate cu virus,

care protejează alte celule sănătoase împotriva infecţiei cu un agent viral omolog sau heterolog. Există trei categorii de interferon: a interferon (leucocite), interferon (fibroblaste), interferon (limfocite T imune).

Sinteza de interferon are loc sub influenţa unor inductori virali (v. gripale, v. paragripale, v. urlian, arbovirusurile, v. vaccinia, herpesvirusurile, v. polio, v. rujeolos, v. Coxackie) şi inductori nevirali (bacterii sau endotoxine bacteriene - Salmonella, E. coli, Bordetella pertussis, rickettsii, micoplasme, unele antibiotice etc.).

Mecanismele de acţiune ale interferonului au fost evidenţiate atât la nivel local cât

şi la distanţă.

Mecanisme de acţiune locală ale interferonului:

- ataşarea moleculelor de interferon pe suprafaţa celulei (la nivelul unor receptori celulari) ® semnal care prin intermediul moleculelor de AMPc (aminofosfat ciclic) este transmis către genom ® derepresarea unei gene structurale ® codifică producerea unui ARN mesager nou ® sinteza la ribozomi a unei proteine “PIT - proteină inhibitoare a translaţiei” ® maschează ribozomii celulari astfel încât acidul nucleic viral intrat în celulă nu-şi mai poate codifica sintezele de proteine proprii la nivelul aparatului ribozomal al celulei parazitate;- stoparea procesului de decapsidare a virusului;- inhibiţia sintezei unor enzime precoce (ARN polimeraza) şi implicit inhibiţia sintezei copiilor de acid nucleic;- intervenţia unei endonucleaze celulare (indusă de interferon la nivelul receptorilor

celulei protejate) care potenţează inhibiţia translaţiei mesajului genetic la nivelul

ribozomilor (alături de PIT) şi blochează sintezele de proteine virale, în fazele tardive.

Mecanisme de acţiune ale interferonului la distanţă: - stimularea producţiei de IL-2 limfocitară;- potenţarea unor funcţii macrofagice: prelucrarea antigenului, secreţia de monokine activatoare, intensificarea citotoxicităţii macrofagice (naturală, prin armare, anticorpodependentă); - activarea celulelor natural-ucigaşe (NK).

7.2. Apărarea specifică (imună) antiviralăApărarea specifică în viroze se realizează prin modificări pe linie umorală şi

celulară, celulele efectoare fiind anticorpii (în imunitatea umorală) şi limfocitele T citotoxice (în imunitatea celulară).

7.2.1. Proprietăţi fundamentale

Imunitatea specifică posedă trei proprietăţi fundamentale:· specificitatea: recunoaşterea strictă, specifică, a moleculelor străine organismului;· diferenţierea între „ self“ şi„ non-self“: capacitatea răspunsului imun de a face diferenţierea între structuri străine organismului, dar asemănătoare cu structuri proprii ale organismului uman.· memoria imunologică: capacitatea unora din celulele implicate în realizarea răspunsului imun primar (celule de memorie) de a reţine specificitatea antigenului cu care oganismul a venit pentru prima oară în contact, iar la al doilea sau următoarele contacte ale organismului cu acelaşi antigen, aceste celule să îl recunoască şi să se diferenţieze specific, inducând un răspuns imun specific secundar, mult mai prompt.

7.2.2. Caracteristicile antigenelor virale

Antigenele virale prezintă două caracteristici:- imunogenitatea: este capacitatea antigenelor virale de a produce răspuns imun

specific, umoral şi celular;

- antigenitatea: este capacitatea antigenelor de a reacţiona cu anticorpii specifici, in vivo şi in vitro.

7.2.3. Localizarea antigenelor proprii virionului

Antigenele proprii virionului pot fi:a. antigene de suprafaţă:

- antigene de înveliş (în cazul virusurilor anvelopate), de natură glicoproteică: hemaglutinine: v. gripale, v. paragripale, v. rujeolos; neuraminidaze: v. gripale, v. paragripale; glicoproteine: gp120, gp41 (HIV), gpG (v. rabic); proteine: Ag HBs (v. hepatitic B); factori de fuziune: v. paragripale, Ag Lydma (v. Epstein-Barr);

- antigene capsidale (în cazul virusurilor neînvelite): v. polio: proteinele VP1, VP2, VP3; v. polyoma: Ag VP1; adenovirusurile: proteinele structurale ale hexonilor şi proiecţiilor fibroase;

Rolul antigenelor de suprafaţă:- de ataşare la receptorul celular;- de inducere de anticorpi neutralizanţi (HA - v. gripale, întreaga capsidă - v. polio);- activitate hemaglutinantă;- de fuziune cu membranele celulare.b. antigene interne:

· antigene asociate nucleocapsidei: Ag HBc (v. hepatitic B); Ag NP, NC, N (paramyxovirusuri); Ag NP (v. gripal); Ag p24, p17, p24 (HIV); · asociate cu proteina M: v. paragripale, v. rujeolos.

Caracteristici ale antigenelor interne:- sunt mai puţin expuse decât antigenele învelişului;- induc apariţia de anticorpi fixatori de complement.

7.2.4. Superantigene

Reprezintă o categorie de antigene virale care se comportă diferit în relaţia cu limfocitul, comparativ cu modalitatea clasică de interacţiune, şi anume: dacă clasic, prezentarea antigenului de către celula prezentatoare de antigen (APC) are loc la nivelul „situsului de legare“ al CMH II, constituit din lanţurile α şi β, iar după prezentare antigenul este recunoscut de către regiunea variabilă a TCR (Vα şi Vβ) de pe limfocitul T CD4, având drept consecinţă stimularea unei clone de limfocite T, în cazul superantigenelor legarea antigenului se face numai la porţiunea variabilă a lanţului β (Vβ) a TCR, deci la exteriorul situsului combinativ, ceea ce va determina o activare excesivă de celule T, deci o hiperstimulare, ceea ce poate duce la deleţii şi anergie limfocitară.

Exemplu: retrovirusurile - HIV: datorită comportamentului său ca superantigen determină imunosupresia: subseturi de limfocite T CD4, Vβ ar fi activate specific, subseturi în care are loc multiplicarea preferenţială a HIV, ceea ce duce la infectarea şi distrugerea lor.

7.2.5. Răspunsul imun în virozeImunitatea specifică reprezintă răspunsul specific, dirijat strict faţă de un anumit

antigen, al organismului infectat cu un virus. Acest răspuns poate fi: umoral, realizat prin imunoglobuline (anticorpi) şi celular, realizat prin intermediul limfocitelot T. Cele două verigi acţionează complementar şi sinergic. Atât răspunsul imun umoral, cât şi răspunsul imun celular, pot evolua ca: răspuns imun primar şi răspuns imun secundar.

a. Răspunsul imun primarApare la primul contact al organismului cu un antigen (virus), ponderea celor

două categorii de efectori variind în funcţie de tipul antigenului şi modul în care acesta este prezentat celulelor imunocompetente. În general, răspunsul imun primar este timpuriu, puţin specific, pasager.

Răspunsul imun primar evoluează în 4 faze:

- de latenţă (de lag): durată 2-5 zile; antigenul este prelucrat şi prezentat de către APC limfocitelor B şi T, care sunt activate pentru începerea sintezei de anticorpi sau pentru activarea altor subseturi de limfocite T;

- de creştere exponenţială sau logaritmică: durată 2-3 zile şi constă în creşterea uşoară, constantă a răspunsului specific;

- de platou (staţionară): durată 3-5 zile, intensitatea răspunsului nu prea înaltă, dar el se menţine la un nivel constant;

- de declin: răspunsul diminuă progresiv în intensitate, până la epuizarea sa totală, sau până la un nivel minim, de regulă neprotector.

b. Răspunsul imun secundar Se mai numeşte şi reacţie anamnestică, deoarece se manifestă după reexpunere la

acelaşi tip de antigen, cu care organismul a mai venit în contact. Răspunsul imun secundar reflectă o reacţie mai precoce, mai promptă, mai rapidă, mai iniensă, mai persistentă, mai eficace. Etape:- faza de latenţă: apare scurtată sau absentă;- în faza exponeţială: creşterea intensităţii răspunsului imun este rapidă;- în faza staţionară: instalată după 4-7 zile de la contactul cu antigenul, apare un nivel ridicat al reacţiei imune - de 4-7 ori mai mare decât nivelul maxim al reacţiei imune primare, şi pentru o perioadă mai mare de timp;

- în faza de declin: răspunsul scade uşor, cu menţinerea de obicei a unui fond rezidual protector.

Capacitatea organismului de a dezvolta un răspuns imun secundar se bazează pe „memoria imunologică“.

Baza celulară a memoriei imunologice este expansiunea unei populaţii de limfocite sensibilizate în raport cu antigenul. Există limfocite T şi B de memorie care diferă de limfocitele nesensibilizate. Asfel, limfocitele B de memorie produc anticorpi de tip IgG, timpuriu, cu afinitate mare şi timp îndelungat. Limfocitele T de memorie răspund la doze minime de antigen, ceea ce semnifică existenţa unor receptori mai eficienţi, cu afinitate mai mare.

Intervenţia imunităţii specifice, umorale sau celulare, se realizează numai după pătrunderea antigenului viral în organism şi recunoaşterea acestuia de către celulele imunocompetente.

Pentru recunoaşterea lui de către limfocitele B sau limfocitele T antigen reactive, se impune prelucrarea acestui antigen de către celule specializate (microfage sau macrofage) care după prelucrare, îl prezintă spre recunoaştere limfocitelor T sau B antigen reactive.

Etapa de recunoaştere, prelucrare şi prezentare a antigenului viral se realizează prin intervenţia celulelor prezentatoare de antigen (APC), care pot fi:

· macrofage şi monocite; · celule dendririce: · celule Langerhans din epiderm;· astrocitele de la nivelul sistemului nervos, cu rol în imunitatea locală, funcţionând ca fagocite sau ca APC sub restricţie CMH, sintetizând totodată enzime, prostaglandine, IL-6; rol de mediere între neuroni şi limfocitele T;· limfocitele B - uneori, antigenul fixându-se pe receptorul de natură imunoglobulinică.

Prezentarea antigenului este făcută sub restricţie CMH II.

7.2.6. Răspunsul imun umoral (RIU)

Caracteristicile RIU:* intervenţie prioritară: în cazul infecţiilor virale cu evoluţie acută sau subacută;* locul impactului antigen viral/verigă efectorie: la distanţă variabilă de la locul de pătrundere al acestuia în organism;

* veriga efectorie: anticorpi sau imunoglobuline;* modaliăţi de testare a răspunsului imun: reacţii antigen-anticorp. Exemple: reacţii de aglutinare, reacţii de precipitare, reacţii de neutralizare, reacţii de fixare a complementului, reacţii de aglutinare-liză, dar şi reacţii cu reagenţi marcaţi (imunofluorescenţă, ELISA, RIA).

Clasele de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgE, IgDIgG constituie peste 75% din totalul Ig serice. Rol:

- principalii anticorpi cu rol în neutralizarea virusurilor;- în limitarea diseminării virale;- în scăderea încărcăturii virale şi eliminarea virusului din compartimentele extracelulare; mecanism: activează complementul şi, prin citotoxicitate celulară anticorpo-dependentă, elimină celulele infectate cu virus;

- rol preponderent în răspunsul imun secundar;- rol în fagocitoza opsonică.

IgM sunt anticorpi liberi prezenţi în ser sau fixaţi pe membrana celulelor B; reprezintă 10% din totalul Ig. Prezenţa IgM în ser este indicator de infecţie virală acută. Funcţii:

- sunt primii anticorpi care apar după contactul cu antigenul, prezenţa lor fiind caracteristică RI primar;

- activează complementul, acţiune extrem de eficace, o singură moleculă de Ig M fiind capabilă să iniţieze reacţiile în lanţ.

IgA este principala Ig de la nivelul mucoaselor. Este prezentă şi în diverse secreţii ale organismului (salivă, lacrimi, colostru, lapte, secreţii vaginale, intestinale), iar în ser 15%. Sunt 2 tipuri de IgA:· Ig A serică: monomer alcătuit din lanţul L (k sau λ) şi Hα;· IgA secretorie: dimer sau tetramer (rezultat prin legarea monomerilor între ei prin segmentul J). La acestea se adaugă piesa secretorie, secretată de celulele epiteliale ale mucoaselor, cu rolul de a transporta molecula de IgA la suprafaţa celulelor epiteliale şi de a conferi rezistenţă la enzimele proteolitice.

Există 2 subclase. IgA1 şi IgA2. Funcţii:- protejează mucoasele de agresivitatea vitală, prin legarea acestora la mucoase. Astfel, se controleazî prin IgA intrarea virusurilor în organism la nivelul căilor de intrare orofaringiană, respiratorie (v. gripale, v. paragripale), gastrointestinală (enterovirusuri), urogenitală;

- limitează şi împiedică viremia în infecţiile sistemice (poliomielitei). După imunizare antipolio se dezvoltă imunitatea locală mediată de IgA.

IgE se găseşte în ser în cantităţi foarte mici (0,04%), în colostru, în secreţiile nazale, oculare, bronhice, iar în intestin sunt legate citofil de receptorii Fc ai mastocitelor. Funcţii:

- declanşează reacţii de tip anafilactic, ca urmare a legării cu anumite alergene.

IgD sunt prezente în ser în cantităţi mici (0,2%) sau fixate pe suprafaţa limfocitelor B. Principala funcţie:

- în diferenţierea limfocitelor B.

Semnalul primar în sinteza anticorpilor este recunoaşterea antigenului de către IgM sau IgD de pe suprafaţa limfocitului B (receptorul pentru antigen de pe linfocitul B-BCR- „B- cell receptor“).

Mecanismele efectoare ale imunităţii umorale

a. Neutralizarea viralăNeutralizarea are loc în două faze:

· reversibilă: legătura anticorp-antigen se desface dacă intervin anumiţi factori: pH - trecerea de la pH de neutralitate la pH alcalin sau acid, mai mic de 4; factor de diluţie - amestecuri de v. gripal şi ser îşi recapătă infectivitatea după diluare;· ireversibilă: legătura anticorp-antigen devine stabilă, fiecare anticorp legându-se de două situsuri antigenice situate pe monomeri diferiţi. Complexele stabile pot fi disociate enzimatic.

Neutralizarea se realizează prin: alterări ale capsidei virale la virusurile neanvelopate, ceea ce împiedică decapsidarea, eliberarea acidului nucleic viral şi iniţierea ciclului infectant; modificări conformaţionale ale proteinelor învelişului viral la virusurile cu înveliş (v. paragripale), sub acţiunea concertată a IgM şi complementului;

alterări ale ciclului de multiplicare virală: - aderarea anticorpilor la antigenele suprafeţei virale previne adsorbţia şi pătrunderea

virusului în celula gazdă (rotavirusuri);- blocarea secvenţelor peptidice terminale ale fibrelor adenovirusului tip 3 de către

anticorpi duce la blocarea adsorbţiei şi pătrunderii intracelulare a virusului;- la virusurile învelite pătrunderea virusului în celulă se face prin fuziune între învelişul

viral şi membrana endozomului în condiţii de pH acid. Anticorpii pot produce modificări conformaţionale ale factorului de fuziune (ex.. factorul de fuziune - proteina E a virusului West-Nile) şi inhibă iniţierea ciclului infectant vital prin inhibiţia fuziunii din interiorul endozomului.

b. Neutralizarea în prezenţa complementului

Neutralizarea virusului se realizează independent de complement, dar este potenţată de prezenţa complementului, mai ales la virusurile învelite. Legarea anticorpilor la antigenele învelişului viral activează complementul, inducând viroliza (coronavirusuri).

Fenomenul predomină în răspunsul imun primar, când anticorpii din clasa IgM, sunt intens activatori de complement.· Opsonizarea

Imunoglobulinele IgG1 şi IgG2 pot favoriza distrugerea virusurilor prin fixarea lor prin capătul Fc la receptorul celular pentru Fc al macrofagului şi cu celălalt fragment -Fab- de suprafaţa virusului. Virusul acoperit de anticorpi va fi recunoscut de macrofag şi va fi fagocitat (enterovirusuri).· Citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi - antibody dependent cellular citotoxicity

Citotoxicitatea celulară dependentă de anticorpi (ADCC) este indusă de legarea IgG, mai puţin a IgM şi IgE, de determinanţii antigenici prezenţi pe suprafaţa celulei infectate (prin fragmentul Fab). Urmează ataşarea nespecifică a celulelor killer (K) şi a monocitelor la fragmentul Fc al IgG şi declanşarea lizei celulare.

ADCC are rol important în vindecarea unor boli, precum rujeola, unde activitatea

ADCC apare târziu şi la titruri mai înalte decât cele neutralizante, corelându-se cu

scăderea viremiei.

· ComplementulAcţionează solidar cu anticorpii în reacţiile de neutralizare, intervenind activ în:

- liza celulelor infectate cu virus care expun la suprafaţa membranei complexe antigen-anticorp. Cele mai susceptibile la acţiunea complementului sunt celulele infectate cu virusuri învelite (orthomyxovirusuri, alphavirusuri, retrovirusuri). Complexul C5b-C9 se încorporează în dublul strat lipidic, rezultând distorsiuni structurale ale acestuia, orificii tubulare în membrană, care permit comunicarea conţinutului celular cu exteriorul. Se produce creşterea de volum a celulei, apoi dezintegrarea acesteia;

- liza virionilor şi neutralizarea virală, fiind implicate componentele: C1q, C1r, C1s, C4. Se produce activarea pe cale alternativă, rezultând unitatea de atac membranar, care

acţionează asupra învelişului viral şi produce viroliza. La unele virusuri (v. Newcastle, oncovirusurile) calea alternativă acţionează în absenţa anticorpilor.

Alteori, interacţiunea virus-complement nu conduce la liză; inactivarea virusului se realizează datorită unei reţele ce apare ca urmare a legării complementului (C3b) la receptorii virusului.

7.2.7. Răspunsul imun celular (RIC)Este răspunsul imun de interes major în viroze, având rolul de a elimina celulele

infectate cu virus şi a promova vindecarea.Deficienţele congenitale sau câştigate ale imunităţii celulare sunt cauza evoluţiei

grave, cu generalizare şi sfârşit letal în unele viroze (herpes, rujeolă).

Caracteristicile RIC:- intervenţie prioritară: în infecţii virale „lente“, subacute sau chiar acute; - locul impactului antigen viral/verigă efectorie: aproape de poarta de intrare a

antigenului;- veriga efectorie: celule specifice - limfocitele Tc (citolitice), celule NK (natural

killer);- modaliăţi de testare a răspunsului imun: teste in vitro şi teste in vivo (IDR de tip

întârziat).Răspunsul mediat celular presupune următoarele etape succesive: recunoaşterea

antigenului ca non-self; inducerea răspunsului prin activare specifică a celulelor imune; distrugerea celulei-ţintă;

a. Recunoaşterea antigenului Se efectuează de către limfocitele T antigen-reactive prin intermediul TCR,

antigenul fiind prelucrat de către aceleaşi celule prezentatoare de antigen ca şi în cazul RIU şi prezentat spre recunoaştere sub formă de peptide şi în corelaţie cu moleculele CMH (complex major de histocompatibilitate). Limfocitele T CD8+ recunosc antigenele prezentate cu moleculele CMH clasa I, iar limfocitele T CD4+ recunosc antigenele prezentate în legătură cu cu moleculele CMH clasa II.

b. Inducerea răspunsului prin activare specifică a celulelor imuneCelulele implicate în realizarea răspunsului imun, din punct de vedere

funcţional, pot fi împărţite în:* limfocite T cu rol în reglarea răspunsului imun: Th (helper); Ta (amplificatoare); Ts (supresoare); Tcs (contrasupresoare);

* limfocite T efectoare, cu acţiune distructivă asupra celulei-ţintă, cu caracter specific (Tc-citotoxice) şi caracter nespecific (NK,K,LAK).

c. Distrugerea celulei-ţintăSe realizează sub acţiunea limfocitelor Tc, sau a celulelor NK.

· Mecanismele citotoxicităţii limfocitelor TcLinfocitele Tc induc citoliza prin două tipuri de mecanisme:

* citoliză în absenţa anticorpilor şi a complementului, cu următoarele etape:- contact stâns între limfocitul Tc şi celula-ţintă, contact favorizat de prezenţa moleculelor de adeziune;

- sinteza în endozomii limfocitului Tc de granule citolitice care conţin: perforine (proteine formatoare de pori), serinesteraze, înrudite cu componenta C9;

- perforinele, în prezenţa ionilor de Ca2+, produc leziuni transmembranare, formând în dublul strat lipidic, pori, prin care este eliminat conţinutul celulei-ţintă în exterior, ionii şi proteinele cu greutate moleculară mică. Consecutiv, în celulă intră apa, creşte presiunea osmotică, se produce deformarea nucleului, umflarea şi dezintegrarea celulei;

- după începerea lizei celulei-ţintă, imediat se produce desprinderea limfocitului Tc.* distrugerea celulei-ţintă prin apoptoză.

Fenomenul are loc în absenţa secreţiei perforinelor membranare şi este precedat de fragmentarea nucleului celulei-ţintă. Factorul responsabil de acest fenomen este interacţiunea dintre ligantul Fas, sintetizat în cursul activării limfocitului Tc, şi molecula Fas, de pe celulele-ţintă, inductoare de apoptoză.· Mecanismele citotoxicităţii NK

Sunt similare citotoxicităţii prin limfocite Tc, fiind admise ambele mecanisme.

7.2.8. Citokine

Sunt mediatori chimici solubili secretaţi de diverse populaţii celulare, cu funcţii multiple şi complexe: semnale intercelulare, modulatori ai unor răspunsuri imune nespecifice şi specifice, sau reglatori ai unor activităţi celulare (proliferare, diferenţiere).

După activităţile dominante, citokinele pot fi clasificate astfel:- citokine cu rol în imunitatea specifică: interleukine (IL);- citokine cu rol în procesele inflamatoare şi antitumorale: factorul de necroză

tumorală (TNF);- citokine cu rol în activitatea nespecifică antivirală: interferonii (IFN).

7.2.9. Autoimunitatea în viroze

Infecţia virală poate declanşa procese autoimune prin mai multe mecanisme:· modificarea antigenelor self spre non-self de către virusuri (exemple: artrita reumatoidă - v. urlian, v. rubeolic; hepatite cronice - v. hepatitice B, C, D; PES - v. rujeolos);· alterarea capacităţii normale de recunoaştere a antigenelor de către limfocitele T sau B, prin alterarea receptorilor BCR sau TCR de către virus (v. coriomeningitei limfocitare);· dezechilibru al limfocitelor imunomodulatoare cu hipertonus Th2, ceea ce stimulează producţie de autoanticorpi faţă de diverse autoantigene modificate de infecţia virală;· răspuns în anticorpi antiidiotip generaţi de infecţia virală care reacţionează cu selful.

7.2.10. Imuosupresie viralăVirusurile pot determina imunosupresie. Mecanismele imunosupresiei pot fi:

efect citocid direct al virusurilor asupra limfocitelor (HIV, v. hepatitice B, C, D);

alterarea procesului de recunoaştere a antigenului de către BCR sau TCR, prin fixarea virusului, prin competiţie cu epitopii antigenici, la nivelul receptorului pentru antigen (v. rujeolos, v. Coxsackie, HIV, v. citomegalic); interferarea virusului cu unele căi metabolice de activare a limfocitelor implicate în recunoaştere, prin situarea lui pe căile de iniţiere a senmalului fosfotirozin-kinazei, oprind procesul de transformare blastică specifică a acestora în prezenţa antigenului; alterarea cascadei citokinice prin creşterea tonusului treptelor supresoare, inclusiv prin deprimarea limfocitelor CD8+11b+ (HIV, v. citomegalic, v. gripal, HIV+HBV).

7.2.11. Imunotoleranţa în viroze

Imunotoleranţa este starea de echilibru stabilită între organism şi virusul infectant. Virusul circulă liber în umori, se multiplică în ţesuturi, fără a declanşa un răspuns imun adecvat şi nici fenomene patologice evidente (v. rubeolic, v. coriomeningitei limfocitare).

Există şi o imunotoleranţă constituţională faţă de unele virusuri, ceea ce explică insuccesul unor vaccinări.

7.2.12. Imunopotenţare virală

Agravarea evoluţiei unei viroze se poate datora intervenţiei unor factori imuni,

um ar fi Ig G, care pot modifica suprafaţa virionului, facilitând pătrunderea acestuia

în celula pentru care prezintă tropism, producând implicit accelerarea infecţiei virale de

tip litic.

Compexele antigen viral-IgG intră mai uşor în celula gazdă, deci se accelerează relaţia litică.

În cazul v. cu tropism leucocitar (v. rujeolos), prezenţa receptorilor pentru fragmentul Fc al anticorpilor antivirali pe suprafaţa leucocitelor, facilitează intrarea virionului în leucocit, deci relaţia de tip litic.

8. PATOGENITATE VIRALĂ ŞI TIPURI DE INFECŢIE VIRALĂExistă mai multe tipuri de infecţie virală la om şi la animal, şi anume: infecţii

localizate, infecţii diseminate (generalizate), infecţii inaparente, infecţii lente.

8.1. Infecţiile virale localizate Sunt mai rare, multiplicarea virală şi leziunea virus-specifică sunt limitate la

poarta de intrare. Au loc mici diseminări ale virusului, dar acestea se mărginesc la interesarea ţesutului conjunctiv din apropierea porţii de intrare.

8.2. Infecţii virale diseminate Majoritatea virusurilor determină astfel de infecţii. Pot fi enumerate mai multe

faze:

· Multiplicarea virală primară la poarta de intrareVirusurile pot pătrunde pe diferite porţi de intrare: calea respiratorie (mixo-,

paramixo-, adenovirusuri); calea digestivă (enterovirusuri); calea conjunctivală (adenovirusuri); calea sanguină directă (multiplicarea lipseşte) prin injecţii (HIV, hepatitei B); muşcături de animale (v. rabic); înţepătura unor vectori (arbovirusuri).

Rezistenţa la poarta de intrare faţă de virus se datoreşte atât barierelor mecanice cutanate sau mucoase, cât şi elaborării locale de interferon sau de IgA secretorii. Un rol important în limitarea trecerii virusului dincolo de poarta de intrare îl are şi imunitatea celulară locală, realizată de limfocitele timodependente din formaţiunile limfoide limitrofe.· Viremia primară, prezenţa virusului în torentul circulator, este o fază neobligatorie; semnele clinice manifeste lipsesc.· Multiplicarea virală secundară, fază ce se caracterizează prin localizarea şi multiplicarea virusurilor în anumite organe; este neobligatorie, fiind specifică numai anumitor virusuri.· Viremia secundară constă în răspândirea virusurilor fie pe cale circulatorie (sânge, limfă), fie de-a lungul nervilor (v. rabic, arbovirusuri). Este o fază obligatorie în infecţiile virale diseminate, semnele clinice de debut sunt prezente şi este posibilă izolarea virusurilor din sânge. · Fixarea virusului în celule (ţesuturi) ţintă, cu localizarea şi multiplicarea virusului în ţesuturile pentru care are tropism, este însoţită de apariţia leziunilor sau semnelor de boală manifestă.

În cursul unei viroze diseminate se produce şi excreţia de virus, fie prin poarta de intrare (secreţie nazofaringiană, fecale, leziune cutanată), fie la nivelul sistemelor fiziologice de eliminare (fecale, urină).

8.3. Infecţia virală inaparentăPrezenţa virusului fără semne clinice poate fi determinată de adenovirusuri,

enterovirusuri, virusuri din grupul Herpes (herpes simplex, varicella-zoster). Factorii care determină infecţiile virale inaparente sunt multipli: natura virusului infectant (circulaţia în populaţia umană a tulpinilor virale moderat virulente sau atenuate), gradul de rezistenţă nespecifică şi specifică (imună) a organismului gazdă, incapacitatea unor virusuri de a ajunge la ţesuturile ţintă sau fenomenul imunotoleranţei organismului gazdă faţă de unele virusuri.

8.4. Infecţia virală latentăÎn acest tip de viroze (prezenţa virusului cu reactivare periodică) se crează un

echilibru între virusul infectant şi organismul parazitat, care are drept consecinţă apariţia unor boli cu evoluţie lungă, uneori cu pusee şi perioade de “linişte” clinică, alteori cu alură subacută sau cronică progresivă. Exemple: infecţiile latente cu virusuri din grupul Herpes (factori declanşatori: emoţionali, nutriţionali, infecţii intercurente, ciclu menstrual, intoleranţă digestivă); infecţiile cu adenovirusuri, virusuri de tip C, infecţii cu virusuri “lente” (varianta neurotropă a virusului rujeolos care poate determina

panencefalita sclerozantă subacută demielinizantă). În cazul acestei categorii de viroze lente intervin fenomenele de autoimunitate şi imunotoleranţă.

9. VACCINURI VIRALEPrima imunizare activă (vaccinare) antivirală a fost vaccinarea antivariolică cu

virus vaccinia, efectuată în 1798 de către Jenner. După criteriile componentelor virale din vaccin, vaccinurile virale sunt de două categorii: inactivate şi vii.

9.1. Vaccinuri inactivateVirusuri multiplicate pe o gazdă sensibilă, apoi inactivate (temperatură ridicată,

formol, betapropriolactonă), cu păstrarea capacităţii imunogene dar cu pierderea capacităţii patogene. Exemple: vaccinul antirabic, antigripal, antirujeolos, antipoliomielitic. Nu sunt nocive (incapabile de a produce boală), dar prezintă anumite dezavantaje: induc imunitate antivirală umorală de scurtă durată (nu celulară, nu locală), iar agentul inactivant poate determina reacţii de intoleranţă locale sau generale.

9.2. Vaccinuri vii Conţin tulpini de virus vaccinal capabile ca, administrate receptorului uman, să se

multiplice la poarta de intrare, fără a produce boala, dar determinând un răspuns imun eficient. Sunt de două feluri. - vaccinuri vii cu virusuri nepatogene pentru om, înrudite antigenic cu agentul viral cauzator al bolii pentru care se face imunizarea activă. Exemplu: vaccinul antivariolic, care constă în aplicarea pe cale transcutană sau percutană a virusului vaccinia (nepatogen pentru om dar identic antigenic virusului variolic). Răspunsul imun umoral şi celular indus de către vaccinarea cu virus vaccinia asigură protecţia solidă şi îndelungată împotriva variolei.- vaccinuri vii atenuate - “adaptare” a unor populaţii virale pe anumite substraturi de multiplicare, cu pierderea patogenităţii. Exemple: antipolio cu administrare orală, antirujeolos cu administrare parenterală.

Avantajul vaccinurilor virale vii constă în realizarea unui răspuns imun umoral şi celular solid, de lungă durată (antipolio crează şi un ecran de protecţie locală - IgA secretor).

Dezavantajele acestor vaccinuri, deşi puţin numeroase, sunt demne de toată atenţia. În cazul vaccinurilor vii neatenuate (virus vaccinal), unii indivizi receptori, pe teren de imunodeficienţă, pot prezenta o boală generalizată (vaccină) sau reacţii de hipersensibilitate imediată (alergie), uneori cu semne neurologice grave. În cazul vaccinurilor vii atenuate nu poate fi înlăturat riscul selecţiei unor particule virale patogene cu apariţia unor cazuri de boală.

10. CHIMIOPROFILAXIE ŞI CHIMIOTERAPIE ANTIVIRALĂExită două categorii de dificultăţi care limitează introducerea chimioprofilaxiei

antivirale:

- deoarece agentul viral utilizează aparatul ribozomal al celulei parazitate în vederea

programării propriilor sinteze, este dificil de delimitat, în funcţie de natura şi doza

chimioterapicului, acţiunea inhibitorie asupra multiplicării virale de deprimarea funcţiilor

de biosinteză celulară normală (dificultatea precizării concentraţiilor virulicide şi toxice

de drog);

- acţiunea eficientă a chimioterapicelor antivirale are loc numai în fazele precoce ale infecţiei virale, înainte de apariţia manifestărilor clinice ale bolii.

După acţiunea lor întâlnim două categorii de chimioterapice: agenţi care împiedică adsorbţia, penetrarea şi decapsidarea virusului şi agenţi care inhibă sintezele de tip viral în celula virus-parazitată. La aceste două categorii de chimioterapice se poate adăuga şi interferonul, care are acţiuni terapeutice particulare.

10.1. Agenţi care împiedică adsorbţia, penetrarea şi decapsidarea Amantadina - blochează ataşarea virusului pe celula gazdă prin inhibarea

neuraminidazei (enzimă prezentă în învelişul virusului). Acţionează selectiv asupra unor virusuri ARN: v. gripale, paragripale, v. respirator sinciţial, v. rubeolic.

10.2. Agenţi care inhibă sintezele de tip viral în celula virus-parazitatăChimioterapice cu acţiune asupra virusurilor ARN: hidroxibenzil-

benzimidazol (HBB), guanidina care blochează activitatea ARN-polimerazei virus-

dependente (enterovirusuri); Ribavirinul care inhibă multiplicarea virusului rujeolos prin

substituirea unor nucleozide din molecula de ARN viral.

Chimioterapice cu acţiune asupra virusurilor ADN: Rifampicina, eficientă în

fazele timpurii ale ciclului viral, premergătoare apariţiei primelor manifestări clinice;

Thiosemicarbazonele (metisazonă) care inhibă sinteza proteinelor virale (apariţia de

proteine virale tardive nefuncţionale) la unele virusuri ADN (adenovirusuri, poxvirusuri);

compuşii citozin-arabinosid (ara-C) şi adenin-arabinosid (ara-A) care inhibă sinteza de

ADN viral (herpes simplex, varicella-zoster, v. citomegalic).

PRIONII ŞI PRIONOZELEGENERALITĂŢI

În ultimii 5 ani, preocuparea pentru bolile prionice a depăşit domeniul medical, intrând în atenţia opiniei publice mondiale datorită problemelor majore de sănătate publică ridicate, cu implicaţii atât în relaţiile economice, cât şi politice, statale şi interstatale.

Semnalul de alarmă a fost dat în anul 1994, în Anglia, de apariţia noilor variante de boală Creutzfeldt-Jakob (CJ) anume, 20 de cazuri la tineri. Variantele de CJ s-au dovedit a fi produse de tulpini prionice cu proprietăţi pe de o parte distincte de cele incriminate în alte tipuri de boală CJ (sporadică, genetică) cunoscute până atunci, iar pe de altă parte cu proprietăţi foarte apropiate de cele ale tulpinilor din ESB (encefalopatia spongiformă bovină). Aceste aspecte au condus la conluzia că prin consumul de carne de vită (probabil infectată cu agentul prionic ESB), aceste tulpini s-au transmis, odată cu carnea infectată, pe cale enterală, la om, generând boala prionică, demonstrându-se în acest fel, absenţa oricărei bariere interspecie (bovine-om) pentru agentul prionic infecţios.

PRIONII sunt agenţi infecţioşi de natură proteică, cu proprietate unică, aceea de a se multiplica, deşi sunt lipsiţi de acid nucleic, responsabili de inducerea unor afecţiuni ale sistemului nervos central, la om şi la animale, denumite encefalopatii spongiforme transmisibile (EST).

Aceste encefalopatii spongiforme transmisibile (EST), sunt boli neurodegenerative cauzate de un agent patogen a cărui natură, proprietăţi, multiplicare şi transmisie rămân încă şi astăzi incomplet cunoscute; ele se caracterizează printr-o perioadă foarte lungă de incubaţie (perioadă de infecţie ce durează luni până la 30 de ani), perioada de boală propriu-zisă (odată cu apariţia primelor semne clinice şi cu evoluţia unor tulburări grave anabolice), totdeauna cu sfârşit letal.

Până astăzi au fost descrise următoarele boli prionice: - la animale: boala scrapie, ESB (bovină), encefalopatia transmisibilă a nurcilor, a

antilopei africane şi elanilor, a felinelor şi a struţilor; - la om: boala kuru, boala Creutzfeldt-Jakob, sindromul Gerstman-Straussler (SGS),

insomnia fatală familială (IFF), boala Alper.Termenul de prion, semnificând „proteine infecţioase” - „protinaceous infectious

particle“ (PrPres, PrP), a fost introdus în biologia moleculară de către Stanley Prusiner de la Universitatea San Francisco în 1982 anterior acest agent infecţios fiind cunoscut sub numele protovirinae, virinos, virus latent, virus conveţional. După teoria lui Prusiner, aceşti prioni ar reprezenta agenţi infecţioşi lipsiţi de agenţi nucleici, formaţi exclusiv din proteine, ceea ce apărea în totală contradicţie cu dogma centrală a biologiei moleculare, prin acceptarea unei codificari şi multiplicări ale acestei proteine prionice infecţioase, nu prin intermediul propriului agent nucleic al agentului prionic, ci prin intermediul acidului nucleic al celului gazdă (figura 2).

Figura 2: Structura prionilor.(sursa: http://www.creutzfeld.univ.lyon1.fr)

Conform unei ipoteze recente (anul 2000) prionii ar fi nişte epigene care ar fi transferate de la un organism la altul prin intermediul unui ADN cu rol de vector, dar nu şi de genă.

Altă teorie susţine că responsbil (vector) de transmisia bolii prionice naturale scrapie le oi şi capre ar fi un agent microbian. Proteina acestui agent microbian s-ar asemăna cu PrPc(proteina celulară normală de la suprafaţa membranei plasmatice), fiind capabilă a se replica în celula gazdă prin folosirea ADN gazdei mamifer. Simultan cu această multiplicare, proteina microbiană ar putea declanşa în celula gazdă o reacţie autoimună şi/sau degenerativă, un fenoment asemănător fiind descris faţă de antigenul proteic al amibei Naegleria gruberii.

O altă ipoteză susţine că: expunerea bianuală în anii '80, în Anglia, a animalelor la avicidul phosmet (folosit la tratarea păşunilor pentru îndepărtarea păsărilor) şi ingerarea acestor substanţe toxice odată cu furajele (absorbţia enterală) - o primă concentrare în ţesuturile animale, urmată de a 2-a concentrare cu ocazia prelucrării industriale a prafului de oase şi organe animale pentru hrana vitelor, a dus la acţiunea nocivă, remanentă a concentratului de avicid din praful furajer asupra PrPc din SNC al bovinelor furajate artificial, având drept rezultat apariţia isoformei patologice PrPres responsabilă de apariţia ESB epidemic. Comform acestei ipoteze ESB determinată de acţiunea omului ar fi o clasă nouă de manifestări cronice neuroexcitotoxice întârziate induse de phosmet la bovinele sensibile.

PrP este produsul de clivaj al unei proteine normale de 33-35 kDa (PrPc).Proteina precursoare este o glicoproteină cu o structură tridimensională unică,

prezentă la suprafaţa membranei plasmatice a tuturor celulelor din organism, dar cu cea mai mare concentraţie pe suprafaţa celulelor neuronale (figura 3). Ea are rol în:- memorie (prin codificarea şi conservarea stabilă a informaţiei). Este foarte abundentă în special în hipocamp (sediul memoriei), primul simptom al bolii prionice (prin distrugerea PrPc şi acumularea PrPres) fiind pierderea memoriei;

- în transmisia sinaptică (interacţiuni cu receptorii de acetilcolină - în reglarea numărului de chemoreceptori pentru acetilcolină);

- rol trofic pentru celulele cerebeloase Purkinje cărora le asigură longevitatea;- rol în stabilirea conexiunilor celulă-celulă în ariile sinaptice, şi între celulele neuronale - celule gliale;

- rol în menţinerea somnului şi reglarea intensităţii acestuia;- rol în reglarea unor aspecte legate de metabolismul Cu++, determinând creşterea la stressul oxidativ prin exercitatea unei acţiuni de echilibrare a nivelurilor Cu/Zn SOD (cantitatea exagerată de PrP ducând la scăderea rezistenţei la acest tip de stres).

PrP este izoforma patologică de tip PrPSC, PrPESB şi PrPCJD a proteinei normale PrPc; structura primară a ambelor proteine este asemănătoare (de 250 de aminoacizi),

Figura 3: Patogenia infecţiei prionice (sursa: http://www.creutzfeld.univ.lyon1.fr)

Lizozom

Endozom

dar structura secundară este diferită: PrPc are structura secundară de tip α-helix, pe când cea a PrPs (scrapie) este de tip β-plisat, însoţită de modificări ale structurii terţiare.

Această PrP aparţine grupului de proteine denumite autofoldaze, capabile de autoreplicare, denumite şi „chaperone“, având rolul de supraveghere posttranslaţională în sinteza proteinelor, pentru realizarea corectă a conformaţiei structurale a acestora. Astfel, PrPc nou sintetizată, pentru a deveni activă, are nevoie de o structură secundară de tip α-helix. Plierea corectă se realizează în prezenţa unei proteine „chaperone“.

PrP apare într-un proces de alterare (conversie) postranslaţională a structurii secundare (conversie din forma de împăturire alfa-helix în conformaţie beta de foi pliate) şi terţiară (sub influenţa ionilor de Cu) a proteinei PrPc normale a gazdei, proces de conversie prin care izoforma câştigă capacitate de a-şi codifica infecţiozitatea. Astfel, această proteină PrP „chaperone“ anormală apărută va servi posttranslaţional ca matriţă pentru realizarea de structuri de tip β-plisat, în loc de α-helix. Aceste proteine PrPcanormale se comportă ca un agent infecţios, utilizând proteinele celulare pentru propagarea exponenţială a informaţiei structurale, anormale, proprii.

PrP se izolează din plăcile amiloide cerebrale, fiind componentul principal al acestora.

Morfologic, apar ca structuri filamentoase „SAF“(scrapie associated filaments).PrP are greutate moleculară de 21-30kDa.PrP purificată polimerizează sub formă de bastonaşe, cu dimensiuni de 10-20nm,

care se aseamănă cu amiloidul, ultrastructural şi biochimic.Susceptibilitatea la EST este determinată genetic.Expresia PrPc umană este codificată de gena PRNP, de pe braţul scurt al

cromozomului 20. Această genă are un cadru deschis de citire de 253 de codoni (ORF).Unele EST la om sunt familiale, ereditare: boala Creuzfeld-Jacob (BCJ), boala

Gerstman-Sträussler-Scheincker (BGSS), insomnia fatală familială (IFF), sugerând o transmitere de tip autosomal dominant.

Aspectele diferite clinice, histopatologice sunt determinate de numeroase mutaţii punctiforme care interesează codonii din regiunea ORF ai genei PRNP. Astfel, mutaţiile în codonii 200, 210, 232 determină tabloul clinic al BCJ, mutaţiile codonilor 117, 198, 217 se corelează cu BGSS, iar mutaţiile situate la codonii 129, 178 cu IFF sau BCJ (secundar mutaţiilor sinteza de valină va duce la apariţia BCJ, sinteza de metionină la IFF).

Polimorfismul codonilor poate fi factor asociat al diversităţii clinice.

CULTIVAREA PRIONILORPentru cercetarea relaţiei prioni-celulă gazdă s-au folosit animale (cimpanzei) şi

substraturi celulare de creier, la care s-au administrat suspensii de creier de la bolnavi cu boală Kuru sau BCJ.- Animale

Cimpanzeii inoculaţi intracerebral cu suspensii de creier de la bolnavi de Kuru sau filtrate acelulare de la pacienţi cu BCJ, au reprodus boala după o latenţă de 1 an.

S-a demonstrat de asemenea că numeroase alte specii animale pot fi infectate cu astfel de produse: maimuţe, şoareci, hamsteri, nurci, pisici, oi, bovidee. Concluzia: prionii pot fi transmisibili interspecii. - Culturi celulare

Culturi de explanturi de creier inoculate cu agenţi Kuru sau ai BCJ îşi păstrează infectivitatea pe o perioadă de 25-70 zile de menţinere a acestora in vitro.

ACŢIUNEA AGENŢILOR FIZICI, CHIMICI ASUPRA PRIONILORPrP sunt rezistente la agenţii care inactivează acizii nucleici: radiaţii ionizante,

radiaţii u.v., nucleaze (DN-aze, RN-aze), proteze.PrP sunt rezistente la agenţi chimici ca: aldehidele (formaldehide, glutaraldehide),

propiolactona, hidroxilamina, psoralen.PrP sunt parţial inactivate de: căldură (1000C), fenol, hidroxid de Na.Agenţii prionici sunt foarte rezistenţi la metodele obişnuite de sterilizare, iar

fixarea în formol a ţesuturilor animale determină creşterea rezistenţei agenţilor prionici chiar şi la autoclavare ulterioară la 1340C timp de o oră. În prezent se consideră drept sterilizare eficientă menţinerea probelor infectate 1 oră în soluţii NaOH 1M urmată de autoclavare la 1340C timp de 30min, doar în cazul netratării anterioare în etanol sau formol. În 1999 literatura de specialitate modernă consideră drept cel mai bun procedeu pentru distrugerea agenţilor, tratamentul cu acid picric saturat 15 minute, urmat de autoclavare sub presiune la 1210C, 10 minute, tratament cu acid formic la 5 minute, şi apoi cu guanidintiocianat 4M, 2 ore la +4 grade Celsius.

Rezistenţa particulară a PrP ar fi expresia modificărilor sale conformaţionale, care determină deficienţe de transportare la suprafaţa celulei şi de catabolizare, consecinţa fiind tendinţa de a forma agregate fibrilare, cu acumulare anormală în substanţa cerebrală şi dezogarnizarea acesteia.

PATOGENIE

Intrarea în organism a agenţilor prionici se face pe:- cale orală: este cazul bolii Kuru care a apărut datorită canibalismului practicat ca ritual de către componenţii unor triburi din Papua (Noua Guinee) prin ingestie de creier de la decedaţi, sau a encefalopatiei spongiforme bovine (ESB), care a apărut consecutiv hrănirii bovinelor cu făină de carne, insuficient prelucrată termic, provenită de la oi şi capre;

- parenteral: prin injecţii cu preparate contaminate, transfuzii, intervenţii chirurgicale, transplanturi de organe;

- căi potenţiale de contaminare iatrogenă: creierul şi alte ţesuturi (duramater, cornee).

Diseminarea în organism:- pe cale limfatică: după o primă replicare în ganglionii regionali, invadează căile limfatice, apoi calea sanguină şi, prin intermediul trombocitelor infectate, se localizează în ţesutul reticulo-endotelial;

- pe cale nervoasă, centripet, pe traseele nervoase prin măduvă la SNC.

Studii recente au demonstrat că după infectarea cu agent prionic infecţios a ţesutului cerebral al animalului respectiv se declanşează o suprastimulare a sistemelor cerebrale GABA şi glutamat-ergice pe termen lung, ceea ce corespunde perioadei de latenţă (de infecţie) până la declanşarea bolii -emergenţa primelor semne clinice- care

duce la distrugerea sistemului inhibitor GABAergic al creierului şi la un proces neurotoxic generalizat.

Nu se cunosc modalităţile de eliminare din organism ale prionilor, deşi prionii au fost evidenţiaţi în sânge şi urină.

ASPECTE ANATOMO-PATOLOGICEDin punct de vedere anatomo-patologic, toate encefalitele spongiforme se

caracterizează prin degenerarea celulelor neuronale cu vacuolizare progresivă a corpilor neuronali, dendritelor şi axonilor, cu proliferare reactivă glială astrocitară excesivă în zona corticală şi subcorticală, cu depunerea unor fibre formate dintr-o isoformă patologică (PrPs ) a proteinei prionice celulare PrPc cu aspect tubulovezicular în prelungirile postsinaptice. În final, aspect de „status spongious“ al materiei cenuşii.

ASPECTE CLINICEEST la om sunt: boala Cteuzfeld-Jacob (BCJ), boala Gerstman-Sträussler-

Scheincker (BGSS), insomnia fatală familială (IFF), boala KURU.

Boala Creuzfeld-Jacob(BCJ) Debutează în jurul vârstei de 65 de ani, cu oboseală, anxietate, confuzie. În

perioada de stare apar miocloniile, ataxia cerebeloasă, simptome piramidale şi extrapiramidale, mutism akinetic, demenţă progresivă. Evoluţia este fatală în decurs de 6 luni-1 an.

Există 3 forme de BCJ:

sporadică: corelată cu rata mutaţiilor ce pot surveni în gena PRNP;

familială-ereditară: datorată mutaţiilor punctiforme sau de inserţie în regiunea genei PrPc;

iatrogenă: urmarea unor tratamente sau manevre chirurgicale

În 1997 literatura cita mai mult de 100 de cazuri de BCJ iatrogenă. Această formă poate apărea la orice vârstă, se datorează transmiterii agentului prionic infecţios prin instrumente infectate (electrozi pentru EEG, instrumente chirurgicale, stomatologice, de explorări paraclinice, ORL), implantarea la om de biomaterie de origine umană (grefa de cornee, de duramater, de timpan, grefoane cutanate de la cadavru cu boală CJ, ipotetic grefoane de orice ţesut infectat cu agent CJ) sau de origine animală (valve cardiace de origine bovină), produse de sânge şi plasmă provenind de la persoane infectate cu agent CJ, administrare de hormoni pituitari de creştere din extrase de hipofiză de la cadavre cu boală CJ, vaccinare cu vaccin antirabic preparat din ţesut cerebral de la animal infectat cu agent prionic, preparate cosmetice sau farmaceutice din ţesut bovin, infectarea personalului medico-sanitar (chirurgi, neurochirurgi, ortopezi, ORL-işti, stomatologi, anatomo-patologi) prin microtraumatisme în cursul unor intervenţii pe bolnavi sau manipulări de ţesuturi infectate cu agent CJ.

Varianta nouă a BCJ (CJnv) reprezintă o entitate distinctă clinico-patologică, semnalată între 1994 şi 1998 în Anglia (48 de cazuri) şi Franţa (3 cazuri) care afectează adolescenţi şi persoane tinere (26-29 de ani), homozigoţi pentru metionină la codonul 129. Clinic se caracterizează prin apariţia precoce a tulburărilor psihice, urmate de ataxie,

mişcări involuntare, tulburări cognitive- pierdere de memorie, durata medie a bolii fiind 18 luni.

Boala Gerstman-Sträussler-Scheincker (BGSS)Cu caracter familial, apare la vârsta de 45-50 ani, cu o simptomatologie

asemănătoare BCJ, dominată de ataxie spinocerebelosă şi demenţă.

Insomnia fatală familială (IFF)Descrisă de Medori în 1992, este o boală cu caracter familial (într-o singură

familie au fost afectaţi 29 membri pe parcursul a 5 generaţii). Clinic se manifestă prin: insomnie netratabilă, mioclonii, ataxie, hipertermie, tahicardie, hipertensiune, confuzie, halucinaţii. Histologic: atrofie selectivă a nucleilor anterior ventral şi mediodorsal. Durata bolii: 13 luni.

Boala KURUSe caracterizează clinic prin: ataxie cerebeloasă (kuru-tremurături), rigiditate,

caşexie progresivă , cu sfârşit letal.

EST la animale: 1. Scrapie (la tremblante sau trotting desease)

Este prezentă sub formă de infecţie endemică la oi şi capre. În ultimii 4 ani au fost semnalate epidemii de scrapie în Irlanda, Islanda, Cipru (facând referire specială la Franţa - 21 de epidemii în 1998). S-a dovedit că susceptibilitatea animalelor la infecţie e legată de cea a codonilor 136, 154 şi 171. În studii efectuate s-a dovedit că la 80% din oile infectate cu scrapie, isoforma patologică PrP rezistentă la nuclează, a fost detectată în probe de ţesut de splină, ganglioni limfatici, placentă. Cea mai frecventă cale de transmitere ramâne însă calea orală.

2. ESB („boala vacii nebune”) E considerată o boală creată de mâna omului. A fost semnalată pentru prima oară

în Anglia. A apărut drept consecinţă a unei practici greşite industriale de tratare termică a prafului de carne, de creier, ce provin de la oi şi capre, probabil infectate cu PrP folosite ca adaos alimentar pentru bovidee. Carcasele acestor animale nu au mai fost pretratate prin extracţie cu solvenţi organici timp de 8 ore, proces urmat de expunerea la vapori supraîncălziţi pentru îndepărtarea solvenţilor. Fără această procedură infectivitatea prionilor se conservă, iar adaosul în hrană a determinat epidemia de encefalopatie spongiformă bovină (ESB) prin inocularea agentului scrapiei la bovine.

Perioada de incubaţie a durat 3-8 ani, primele cazuri de boală clinică (excitabilitate, mişcări nervoase ale urechilor şi ochilor, hipersensibilitate la atingere, zgomot, lumină, ataxie) apărând la 70.000 de bovine; deşi în 1989 s-a renunţat la această practică de hrănire a animalelor, între 1989 şi 1994 epidemia de ESB a cuprins 25.404 de cirezi. În 1996 o nouă epidemie în Anglia a dus la sacrificarea (incinerarea) a 14 milioane de bovine, culminând cu apariţia primelor noi cazuri de boală CJnv la om. Realitatea ultimilor ani a prezentat proba cea mai convingătoare a dipariţiei barierei dintre specii în cursul transmiterii ESB de la bovine la om. În ultimii 4 ani au fost depistate epidemii de ESB în Anglia, Irlanda, Franţa.

DIAGNOSTICUL DE LABORATORÎn ultimii ani a fost studiat un număr mare de teste de laborator pentru

diagnosticul ante-mortem al infecţiei prionice, dar dificultăţile întâmpinate s-au dovedit deosebit de mari: metodele utilizate nu au dus totdeauna la detecţia PrP în eşantioanele înalt infecţioase. S-a constatat că prezenţa PrP nu poate fi detectată (sub valoarea de 1 milion de particule infecţioase/g ţesut cerebral) în stadiile timpurii ale infecţiei (perioada asimptomatică). PrP nu a putut fi niciodată evidenţiată în elementele figurate albe ale sângelui şi nici în mixturile de hormoni de creştere cu agent prionic prezent care au provocat bloala CJ.

Produsele patologice analizate: biopsii de ţesut cerebral, ganglioni spinali, nervi periferici, sânge, LCR.

Metode de studiu:Examenul histopatologic direct al ţesutului cerebral bioptic prezintă un risc

major (în caz de CJ) de morbiditate şi frecvent poate fi făcut fără a prinde zonele cu leziuni caracteristice, obţinându-se astfel rezultate fals-negative.

Examenul imuno-histo-chimic este folosit pentru evidenţierea depozitelor de PrP în ganglionii splinali, enterici şi nervi periferici în BCJ, GSS, IFF, ESB şi scrapie prin tratarea amprentelor de ţesuturi cu anticorpi monoclonali marcaţi fluorescenţi.

Western blotting-ul (immunoassay) permite efectuare unui diagnostic preclinic, precoce al BCJ, prin detectarea markerului PrP în material bioptic de ţesut tonsilar şi apendicular uman, în LCR, sânge şi derivate de plasmă (albumină, Ig) până la doza infectantă de 5-10 μg PrP şi respectiv 10 UI/ml. Markerul PrP este evidenţiat prin cuplare cu anticorpi monoclonali.

PET-blotting-ul este o metodă mult mai sensibilă decât Western blotting-ul convenţional. Cu această metodă devine posibilă detectarea PrPres şi în perioada de incubaţie, cu mult înainte de aapariţia semnelor clinice, şi în cazul bolilor prionice cu niveluri foarte scăzute de PrP. Tehnica este sensibilă la detectarea PrP în ţesuturi fixate în formol şi incluse, în parafină. Cu această metodă poate fi investigat ţesut cerebral de arhivă provenind din cazuri BCJ sporadice şi câştigate, ESB şi scrapie. Metoda a dat rezultate concludente şi în cazurile în care imunchimia a fost echivocă sau chiar negativă.

Sunt în curs de standardizare metoda ELISA cantitativă, elecrtoforeza capilară, sprectrioscopie în infraroşu.

PCR şi cromatografia au fost introduse în ultimii ani în practica medicală pentru controlul produselor biofarmaceutice (derivate din plasmă), utilizate în tratamentul coagulopatiilor.

PCR şi hibridizarea dot blot (cu marcare 32P) se folosesc pentru determinarea variantelor alelice PrPc şi selectarea variantelor codonului 171 arginină care s-a dovedit (la oi) corespunzător animalelor rezistente natural la scrapie, în vederea selecţionării, din turmele de oi, a exemplarelor rezistente la infecţie, pentru crearea unor noi generaţii de animale rezistente în focarele endemice.

Diagnosticul bolii prionice de certitudine rămâne evidenţierea leziunilor histopatologice cerebrale, post-mortem.

EPIDEMIOLOGIE

Rezervorul de boală: omul , dar şi animalele. Căile de transmitere a bolilor prionice: orală, iatrogenă, cu caracter profesional.

1. Calea de tranmisie orală a agentului ESB Indică rezistenţa la sucul gastric şi la proteazele intestinale, acesta ajungând la

ganglionii limfatici şi ileonul distal. Cercertări efectuate în Belgia în anul 2000 au raportat 79 de cazuri confirmate anatomo-chimic şi imunohistichimic a fi boala CJD şi au fost puse în legătură cu epidemia de ESB.

Noile variante CJ semnalate în Anglia şi Franţa care au afectat persoane tinere (media vârstei 26-29 ani) în comparaţie cu cazurile clasice de CJ ce apar după 57 de ani, au fost relaţionate cu consumul de carne de vită infectată cu agent ESB. Aceste cazuri dovedesc că bariera de specie pentru agenţi prionici este depăşită. Dispariţia barierei de specie s-ar datora capacităţii de adaptare prin anumite modificări genetice a respectivului agent infecţios la noua gazdă, consecinţa acestor modificări genetice fiind creşterea virulenţei.

Tot literatura de specialitate menţionează că fiind foarte grav faptul că oficialităţile sanitare consideră drept absentă infecţia prionică acolo unde nu este detectată prezenţa PrP, deşi poate exista agent infecţios foarte virulent (dar în cantitate mică, încă nedetectabilă cu ajutorul tehnicilor de diagnostic actuale) şi care poate fi transmis foarte uşor de la indivizi cu infecţii asimptomatice la indivizi sănătoşi. Astfel, în cazul seviciilor veterinare carnea unor vite infectate (asimptomatice) considerate indemne de infecţie (din cauza unor metode de laborator cu sensibilitate scăzută) poate fi dată în consum, afectând populaţia.

Ţinând cont de aceste aspecte, cea mai urgentă datorie a specialiştilor este analizarea cu mare atenţie a tuturor situaţiilor suspecte înainte de a se lua decizia admiterii în consum a anumitor produse alimentare provenite din zone endemice, cât şi aceea de implementare a metodelor celor mai eficace de diagnostic pentru depistarea eficientă, cât mai precoce a agentului prionic infecţios.

În cazul epidemiilor de ESB carnea de la animalele (bolnave şi suspecte) se distruge prin incinerare. În prezent nu se cunoaşte încă amplitudinea reală a contaminării umane în Anglia unde au evoluat epidemiile din 1986-1996 de ESB, contaminarea bovină reală actuală în câteva ţări deja menţionate în care a fost semnalată boala. Unele lucrări de specialitate ridică ipoteza unei posibile infectări a apelor prin descărcarea agenţilor prionici în apele deversate din zona abatoarelor şi păşunilor, ţinându-se cont de rezistenţa foarte mare a infectivităţii lor în mediul extern.

2- Calea de transmitere iatrogenă Transmiterea agentului prionic infecţios se pote realiza prin:

instrumente infectate (electrozi pentru EEG, instrumente chirurgicale, stomatologice, de explorări paraclinice, ORL);

implantarea la om de biomaterie de origine:- umană (grefă de cornee, de duramater, de timpan, grefoane cutanate de la cadavru cu boală CJ, ipotetic grefoane de orice ţesut infectat cu agent CJ);- animală (valve cardiace de origine bovină);

administrarea de produse de sânge şi plasmă provenind de la persoane infectate cu agent CJ;

administrare de hormoni pituitari de creştere din extrase de hipofiză de la cadavre cu boală CJ;

vaccinare cu vaccin antirabic preparat din ţesut cerebral de la animal infectat cu agent prionic;

preparate cosmetice sau farmaceutice din ţesut bovin; infectarea personalului medico-sanitar (chirurgi, neurochirurgi, ortopezi, ORL-işti, stomatologi, anatomo-patologi) prin microtraumatisme în cursul unor intervenţii pe bolnavi sau manipulări de ţesuturi infectate cu agent CJ.

Din 1993 pe plan internaţional au fost luate măsuri de prevenire a răspândirii agenţilor infecţioşi prionici prin excluderea donatorilor de sânge cu potenţial infectant (donatori transfuzaţi). În prezent se discută excluderea donatorilor cu sejururi petrecute în Marea Britanie şi în ţări cu ESB (Irlanda, Franţa, Belgia, Danemarca, Spania, Portugalia, Italia, Germania, Luxemburg).

Având în vedere numărul mare de cazuri CJ iatrogen, cât şi rezistenţa foarte înaltă a agenţilor prionici infecţioşi la procesele obişnuite de sterilizare, apare recomandarea expresă pentru serviciile de chirurgie, anestezie şi reanimare etc. de recunoaştere a pacienţilor cu risc şi de respectare, în legătură cu aceştia, a anumitor măsuri de precauţie. Acestea se referă la faptul că instumentarul folosit pentru investigaţii paraclinice (bronhoscop, endoscop), instrumente pentru intervenţii chirurgicale, canule pentru intubaţie indotraheală la bolnavii cu CJ trebuie distrus (şi nu refolosit după o sterilizare obişnuită), în ciuda tuturor pierderilor economice foarte mari pe care aceste măsuri le provoacă serviciilor respective. Recomandările sunt valabile şi pentru serviciile stomatologice, oftalmologice.

Perioada de incubaţie: 2 luni-2 ani.

3. Transmiterea cu caracter profesionalA fost semnalată la pesoane ce vin în contact cu ţesuturi infectate şi sânge:

măcelari, personal medical (neurochirurgi, oftalmologi, anatomopatologi, în ambulatorii de asistenţă medicală, cabinete dentare, servicii chirurgicale neurologice, ORL, prosecturi, bănci de ţesuturi şi organe).

Acest lucru este posibil datorită faptului că un agent infecţios prionic foarte virulent (dar în cantitate mică, încă nedetectabilă cu ajutorul tehnicilor de diagnostic actuale) poate fi transmis foarte uşor de la indivizi cu infecţii asimptomatice la indivizi sănătoşi, de la produse de carne infectate la cei ce le manipulează.

PROFILAXIE ۰ excluderea de la donarea de organ a indivizilor cu antecedente familiale de boli prionice şi a persoanelor la care li s-a administrat hormon hipofizar;۰ manipularea cu precauţie a ţesuturilor şi organelor provenite de la pacienţi cu EST;۰ sterilizarea corectă a instrumentarului;۰ incinerarea produselor biologice contaminate;۰ incinerarea carcaselor animalelor bolnave de EST.

TRATAMENT

Până în prezent a fost testată eficenţa unui număr mare de preparate pentru tratamentul bolilor prionice. Rezultatele nu sunt satisfăcătoare. Astfel se pot administra:- amfotericina B (a determinat doar prelungirea perioadei de incubaţie în scrapie experimental);

- blocante ale sistemului polianionic (polioxometalaţi şi polianioni organici);

PARAZITOLOGIE

Parazitii sunt organisme vii animale sau vegetale, care traiesc o perioada mai lunga sau mai scurta a existentei lor in dependenta cu un alt organism viu, numit gazda. Parazitismul nu reprezintă o formă degenerată de viaţă, ci din contră, o etapă mai mult sau mai puţin perfectă de adaptare într-un mediu favorabil. Pentru a-şi asigura perpetuarea propriei specii în natură, parazitul este supus unor transformări pentru adaptarea la condiţiile organismului gazdă, derulându-se astfel ciclul biologic al parazitului. Parazitismul este o noţiune ecologică, motiv pentru care este necesară cunoaşterea paraziţilor, a gazdelor lor, precum şi a corelaţiilor care rezultă ca urmare a supravieţuirii unui organism pe seama altui organism viu. Prezenţa paraziţilor în organismul uman determina formă nosologică, parazitoza.

CLASIFICARE Paraziţii se pot clasifica după mai multe criterii:

1. După natura gazdei parazitatea) paraziţi umani;b) paraziţi ai animalelor(care se transmit si la om - antropozooparaziţi)c) paraziţi strict ai animalelor d) paraziţi ai plantelor

De stiudiul paraziţilor umani şi al antropozooparaziţilor se ocupă parazitologia medicală, de studiul paraziţilor animalelor se ocupă medicina veterinară, iar de studiul paraziţilor plantelor se ocupă parazitologia agricolă.2. După natura parazituluia) paraziţi animali: protozoare, helminţi, artropodeb) paraziţi vegetali: fungi

* PROTOZOARELE sunt organisme unicelulare încadrate după anuminte proprietăţi commune în următoarele grupe: - Rhizopodele. Reprezentanţii patogeni ai acestui grup sunt Entamoeba hystolitica şi amibele libere: Naegleria fowleri, Acantamoeba polyphaga. - Flagelatele. Au ca reprezentanţi: Giardia intestinalis şi Trichomonas vaginalis (ca flagelate cavitare) şi Leihmania, Trypanosoma (ca flagellate sanguine).

- Sporozoarele sunt protozoare complexe care au ca principali reprezentanţi genul Plasmodium(agentul etiologic al malariei), Toxoplasma gondii, Criptosporidium, Isospora belli, Sarcocystis. - Protozoarele ciliate au un singur reprezentant semificativ: Balantidium coli.

*HELMINŢII sunt viermi paraziţi care trăiesc in organismul uman, la nivel intestinal. Dupa morfologia lor, helminţii pot fi cilindrici(nemathelminţi) sau plaţi(plathelminţi).

- Nemathelminţii de importanţă medicală pentru ţara noastră sunt: Ascaris lumbricoidesEnterobius vermicularisTrichuris trichiuraAnchylostoma duodenalisAnchylostoma caninum Srongyloides stercoralis Trichinella spiralisToxocara canis- Plathelminţii frecvent întâlniţi în zona noastră geografică sunt:Fasciola hepaticaDiphylobotrium latumHymenolepis nanaTenia saginataTenia soliumDiphilidium caninumEchinococcus granulosumEchinococcus multinocularis.

Helminţii au ca trăsătură comună faptul că în urma reproducerii sexuale produc ouă, care fie direct, fie prin procese adaptative complexe, care conduc la formele larvare, pot infecta alte persoane.

*FUNGII constituie obiectul de studiu al micologiei, fac parte din regnul Myceta şi au ca reprezentanţi:CandidaAspergillusCriptococcus neoformansDermatofiţi

3) după localizarea paraziţilor: - Ectoparaziţi(care trăiesc pe suprafaţa tegumentului uman): Pediculus Acarieni Heteroptere - Endoparaziţi localizaţi în: cavităţi: intestin: Giardia, helminţi vagin: Trichomonas, Candida

ţesuturi: muşchi: Trichinela spiralis ficat: Echinococcus granulosum plămâni: Pneumocystis carini

celule: Toxoplasma gondi Plasmodium(hematii)

4) după efectul paraziţilor asupra gazdei: - Paraziţi incolini: folosesc organismul uman doar ca mediu de viaţă(Entamoeba coli, Trichomonas intestinalis) - Paraziţi comensali: trăiesc în organismul uman fară a-i produce perturbări(Candida, Entamoeba hystolitica, Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis) - Paraziţi condiţionat patogeni: paraziţi comensali pot deveni patogeni în prezenţa unor factori favorizanţi. Persoanele asimptomatice parazitate cu paraziţi condiţionat patogeni sunt considerate purtători de paraziţi şi joacă un rol important în diseminarea parazitozei. - Paraziţi oportunişti determină parazitoze simptomatice sau cu evoluţie clinică uşoară la persoanele imunocompetente şi boli grave, adesea letale, la persoanele imunocompromise, în special la pacienţii cu AIDS: Pneunocystis carinii, Toxoplasma gondii, Criptosporidium , Criptococcus, Candida. - Paraziţi patogeni: paraziţi a căror prezenţă în organismul uman declanşează perturbări mai mult sau mau puţin grave.

5) după specificitatea parazitară se disting: - Paraziţi stricţi: paraziţi adaptaţi doar la o singura gazdă definitivă, care nu pot trăi la o altă gazdă definitivă(Tenia, PLasmodium) - Paraziţi cu specificitate relativă: care pot trece de la o gazdă la alta mai mult sau mai puţin uşor(insecte hematofage vectoare ale bolilor commune omului şi animalelor) 6) După evoluţia ciclului biologic există: - Paraziţi permanenţi: întrega lor existenţă se produce în una sau mai multe gazed(Tenia, Trichinella) - Paraziţi temporary: o parte din viaţa lor se desfăşoară în stare parazitară, prezentând însă şi stadii de viaţă liberă(Strongzloides stercoralis) - Paraziţi facultative: în mod normal au o viaţă saprofită, dar uneori pot invada organismul uman(Aspergillus)

7) După repartizarea geografică - Paraziţii intâllniţi în zonele temperate determină parazitoze moderate ca manifestare clinică, dar cu incidenţă crescută şi tendinţă spre evoluţie cronică(helmintoze umane, micoze, unele protozooze) - Paraziţii întâlniţi în zonele tropicale produc parazitoze endemice sau epidemice în aceste zone, dar ocazional pot fi întâlniţi şi în zonele temperate, ca urmare a intensificării migraţiei umane şi a mijloacelor rapide de transport actuale. Este important să fie cunoscute, datorită gravităţii lor potenţiale şi necesităţii instituirii terapiei corespunzătoare(amibiaza, tripanosomiaza), unele prezentând un character de extrema urgenţă(accesul pernicios din malarie).

CLASIFICAREA PARAZIŢILOR ŞI BOLILE PRODUSE

HELMINŢI

NEMATHELIMŢIFAMILIA ASCARIDIDAEGenul Ascaris Ascaris lumbricoides Ascaridoza Genul Toxocara Toxocara cannis Larva migrans visceralăFAMILIA OXIURIDAEGenul EnterobiusEnterobius vermicularis Oxiuraza FAMILIA TRICHURIDAEGenul TrichiurisTrichuris trichiura Tricocefaloza FAMILIA ANCYLOSTOMIDAEGenul Ancylostoma Ancylostoma duodenalis Ancylostomiază Ancylostoma cannis Larva migrans cutanată Ancylostoma brasiliensis Larva migrans cutanatăGenul Necator Necator AmericanusFAMILIA RHABDITIDAE(STRONGYLOIDIDAE)Genul Strongyloides Strongyloides stercoralis Strongyloidoză FAMILIA TRICHINELLIDAEGenul trichinella Trichinella spiralis Trichineloză FAMILIA ONCHOCERCIDAEGenul Filaria Wuchereria bancrofiti Filarioza Bancroft Wuchereria pacifica Filarioza aperiodică a Pacificului Onchocerca volvulus Oncocercoza FAMILIA DRACUNCULIDAEDracunculus medinensis Dracunculoza Dracunculus loa Loază

PLATELMINŢI CLASA TREMATODEFAMILIA FASCIOLIDAEGenul Fasciola Fasciola hepatica Fascioloză Genul Fasciolepsis

Fasciolopsis buski Distomatoza intestinală Genul FascioloidesFAMILIA DICROCELLIIDAEDicrocoelium dendriticum Distomatoza hepatică FAMILIA OPISTORCHIIDAEOpisthorchis felinaeus Distomatoya hepatică Opisthorchis sinensisFAMILIA TROGLOTREMATIDAEParagonimus westermani Distomatoza pulmonară FAMILIA SCHISTOSOMIDAEGenul Schistosoma Schistosoma haematobium Schistosomoza urogenitaşă Schistosoma mansoni Schistosomoza intestinală Schistosoma japonicum Schistosomoza orientală

CLASA CESTODEFAMILIA TENIIDAEGenul Tenia Tenia saginata Teniaza de carne de vită Tenia solium Teniaza de carne de porcGenul Echinococcus Echinococcus granulosus Chist hidatic Echinococcus multilocularis Echinococoza alveolarăGenul multiceps Multiceps multiceps Cenuroza Multiceps serialis Cenuroza Multiceps crassicepsFAMILIA HZMENOLEPIDAEHymenolepis nana Hymenolepiaza Hymenolepis diminuta Hymenolepiaza murinăFAMILIA DILEPINIDAEGenul Diphillidium Duphillidium caninumFAMILIA DIPHYLOBOTHRIIDAEGenul diphylobotrium Diphylobotrium latum Botriocefaloza

PROTOZOARE CLASA RHIZOPODE FAMILIA ENTAMOEBIDAEGenul Entamoeba Entamoeba histolytica Amibiaza intestinală, hepatică Entamoeba hartmanni Entamoeba coliGenul Endolimax

Endolimax nana Genul PseudolimaxPseudolimax butschliiFAMILIA HARTMANNELIDAEGenul Acanthopodina Acanthamoeba polzphaga Meningoencefalite amibieneFAMILIA VAHLKAMPFIIDAENaegleria fowleri Meningoencefalite amibiene

CLASA FLAGELATEFAMILIA HEXAMITIDAEGenul Giardia Giardia Intestinalis Giardioza FAMILIA TRICHOMONADIDAEGenul Trichomonas Trichomonas vaginalis Trichomoniaza urogenitală Trichomonas tenax Flageloza bucala Trichomonas intestinalis Flageloza intestinală Retortamonas intestinaslia Flageloza intestinalăGenul Dientamoeba Dientamoeba fragilis FAMILIA CHILOMASTIGIDAEGenul Chilomastix Chilomastix mesnili Flageloza intestinală FAMILIA TRYPANOSOMIDAEGenul Leishmania Lieshmanioza(viscerală, cutanată)Genul trypanosoma

CLASA SPOROZOARE

Ordin HemosporidiaFAMILIA PLASMOIDIDAEGenul plasmodium MalariaOrdin PiroplasmidaGrupul Babesia BabesiozăSubclasa CoccidiaOrdin EucoccidiidaSubordin Eimeriina Toxoplasma gonadii Toxoplasmoză Isospora belli Izosporidiază Cryptosporidium Criptosporidiază Ordin SarcosporidiaGenul Sarcocystis Sarcocystis hominis SarcocistozăOrdiunul MicrosporidiaFAMILIA MICROSPORIDIA

Genul Microspora Microsporidiază

CLASA CILIATE Ordinul Spirotricha

FAMILIA TRICHOSTOMATINAGenul Balantidium Balantidium coli Balantidioză

PARAZIŢI CU TAXONOMIE INCERTĂ

Pneumocystis carinii Pneumocistoză Blastocystis homminis Blastocistoză

ACŢIUNEA PARAZIŢILOR ASUPRA GAZDEI Parazitismul nu este întotdeauna sinomin cu efectul pathogen. Prezenţa paraziţilor în organismul uman induce diverse acţiuni, mai mult sau mai puţin pronunţate. - Spolierea organisumului de substanţe nutritive Acţiunea de spoliere este practic constantă la toţi paraziţii, care se dezvoltă deăinzând de gazda lor. Dar, în majoritatea cazurilor, este nesemnificativă. Nu antrenează manifestări detectabile decât în cazul unui număr mare de paraziţi sau dacă paraziţii folosesc substanţe importante(prin spolierea vitaminei B12 rezultă anemia de tip pernicious. - Acţiunea traumatică şi bacteriferă Leziunile cauzate de paraziţi constituie porţi de intrare pentru bacterii şi suprainfecţie bacteriană: tricocefaloză, amibiază, chist hidatic. - Acţiunea toxo-alergică Manifestările alergice din helmintioze sunt cauzate de acţiunea produşilor lor metabolici. Se pot produce fenomene toxo-alergice cutanate(urticarie), pulmonare(sindrom Loffler), nervoase(cefalee, iritabilitate, insomnii, crize epileptiforme) şi chiar şoc anafilactic(chist hidatic, trichineloză). - Acţiune mecanică Acţiunile mecanice sunt cele mai numeroase şi antrenează: efecte microscopice(spargerea hematiilor parazitate de Plsmodium) sau fenomene macroscopice: ocluzie(ocluzie intestinală prin ghem de ascarizi) şi fenomene de compresie tisulară(chist hidatic, echinococoza alveolară). - Acţiune iritativ reflexă Acţiunea iritativ reflexă este mai evidentă la nivel intestinal. Creşte peristaltismul intestinal sau apar fenomene de subocluzie în helmintioze. - Acţiune iritativ tisulară Acţiunea iritativ tisulară determină formarea de granuloame inflamatorii şi de focare de fibroscleroză(colopatia postamibiană, amoebom, cisticercoză, trichineloză perichiste în chist hidatic etc).

REACŢIA GAZDEI LA ACŢIUNEA PARAZITULUI

În faţa acţiunii parazitare organismul uman răspunde prin reacţii celulare, tisulare, immune. Unele dintre ele sunt doar consecinţa sau dovada parazitismului, în timp ce altele constituie adevărate mijloace de apărare ale organismului.

REACŢII CELULARE În diverse protozooze şi unele micoze, macrofagele fagocitează paraziţii şi constituie primul sistem de apărare al organismului. Eozinofilele şi mastocitele joacă un rol probabil considerabil în imunitatea faţă de diverse helmintioze.

1. Anemia parazitară se observă într-un număr restrâns de parazitoze:- paludism(malarie): anemie normocromă cu anizocitoză, poikilocitoză, policromatofilie;- leishmanioză viscerală: anemie normocromă;- ancylostomiază: anemie hipocromă, microcitară;- botriocefaloyă: anemie macrocitară cu megaloblastoză medulară;Anemia apare în perioada de stare a parazitozei sau în faza sa cronică, distingându-se:- anemii hemolitice prin liza hematiilor prin paraziţi sau liza hematiilor prin autoanticorpi(malarie);- anemii prin sechestrare splenică(malaria viscerală);- anemii posthemoragice(în tricocefaloză);- anemii de tip megaloblastic(în botriocefaloză).2. Hipereozinofilia parazitarăHipereozinifilia poate fi locală sau generală.

Hipereozinofilia are cause diverse. Originea parazitară a unei hipereozinofilii se poate preciza ţinându-se cont de următoarelşe particularităţi: - Protozoarele şi fungi nu produc eozinofilie circulantă semnificativă; - Hipereozinofilia este prezentă în helmintioze: * în faza de maturare a helminţilor intestinali(Tenia, Tricocefal); * în faza obigatorie tisulară la om, a formelor larvare(chist hidatic, echinococoza alveolară);

*în faza tisulară de evoluţie a unor helminţi intestinali(Ascaris), biliari(Fasciola hepatica), musculari(Trichinella). În asceste cazuri hipereozinofilia sagvină existentă în faza de parazitism tisular dispare, prin dezvoltarea parazitului intraluminal sau intramuscular.

Hipereozinofilia verminoasă evoluează stadial în timp, urmând curba Lavier cu patru etape successive: latenţă, elevaţie, rapidă, platou, diminuare progresivă sau revenire la normal pentru paraziţii cu fază primară tisulară.

După tratamentul antihelmintic se observă o creşere tranzitorie a eozinofilelor ca urmare a lizei paraziţilor.

Hipereozinofilia verminoasă prezintă o deosebită importanţă practică, reprezentând un element de orientare diagnostică, în special pentru parazitozele în care atinge valori semnificativ crescute. Hipereozinofilia verminoasă apare precoce, atinge valori maxime îninte ca verminoza să poată fi detectată prin alte mijloace.

REACŢII TISULARE

1. Splenomegalia parazitarăConstituie principala cauză de splenomegalie în ţările tropicale. Ea apare în: malarie, leishmanioză viscerală, aibiază, hidatioză.2. Formaţiuni iritativ tisulareEsenţială în cadrul reacţiilor tisulare este constituirea de formaţiuni iritativ tisulare – perichiste, care evoluează progresiv spre scleroză şi/sau calcifiere cu tendinţa de izolare progresivă a parazitului(chist hidatic, trichineloză).

REACŢII IMUNEParaziţii şi produsele lor metabolice sunt antigenici şi induc apariţia de anticorpi aniparazitari la persoanele parazitate. Anticorpii pot fi specifici faţă de o specie şi chiar faţă de un anumit stadium evolutiv al parazitului, dar unele nematode prezintă antigene comune de grup care induc anticorpi heterologi care interacţionează cu paraziţii înrudiţi.Evidenţierea anticorpilor este posibilă în parazitozele profunde intratisulare care asigură un contact strâns între gazdă şi parazit, detectarea anticorpilor constituind una dintre principalele metode de diagnostic ale acestor parazitoze.Semnificaţia anticorpilor este discutabilă. Mult timp s-a negat rolul protector al anticorpilor, aceştia fiind consideraţi de unii autori doar martori ai infecţiei.În realitate, imunitatea dobândită este importantă în parazitoze. În unele infecţii parazitare o primă contaminare poate antrena o imunitate definitivă, protectoare(toxoplasmoză). În alte parazitoze profunde, imunitatea joacă un rol de atenuare. Astfel, în malaria produsă de Plasmodium falciparum se întalnesc forme grave, letale, doar la persoanele neimune.Importanţa imunităţii este relevată şi de gravitatea unor parazitoze oportuniste la imunodeprimaţi(toxoplasma cerebrală, pneumocistoză, criptococoză). Anquilluloza intestinală, afecţiune benignă la persoanele normale, poate determina forme severe la imunodeprimaţi. Anticorpii antiparazitari pot exercita şi efecte imunopatologice, determinând hemiliza autoimună în malaria, formarea de complexe immune circulante, care declanşează glomerulonefrite în anumite forme de malarie.În present, descoperirea antigenelor circulante constituie o modalitate diagnostică, în special în parazitozele instalate la persoanele imunodeprimate.

EPIDEMIOLOGIE – CICLUL BIOLOGIC

Pentru perpetuarea propriei specii, parazitul este supus unor transformări pentru adaptarea la căi evolutive, uneori complexe. Aceste transformări poată numele de ciclu parazitar(biologic). Acesta poate fi:- simplu: trecerea directă a parazitului de la omul infectat la omul sănătos;- complex: parazitul necesită intervenţia gazdelor intermediare sau a vectorilor, pentru a deveni contagios.

ELEMENTELE CICLULUI PARAZITAR

În cursul ciclului evolutiv al paraziţilor intervin: parazitul, gazda definitivă, gazda intermediară, vectori.Gazda definitivă: este organismul viu care poartă forma adultă a parazitului capabil de reproducere sexuală. În cazul helminţilor, gazda definitivă găzduieşte viermii adulţi, care produc, în urma fecundării, ouă. Ouăle pot fi: embrionate, infestante(contagioase) pentru alte persoane, sau neembrionate, neinfestante pentru alte persoane. Gazda definitivă este omul şi mai rar unele animale(pisica pentru Toxoplasma gondii, câinele pentru Diphylidium caninum, Toxocara canis, vulpea pentru Echinococcus multilocularis).Gazda intermediară este organismul viu, care găzduieşte formele asexuate le paraziţilor. Gazda intermediară este necesară în unele cazuri pentru a-I asigura parazitului maturarea, multiplicarea sau ambele.Gazdele intermeiare pot fi animale(bovine, porcine), poate fi ţânţarul pentru Plasmodium sau omul pentru Toxoplasmo gondii, Echinococcus granulosus, Toxocara canis etc.În cazul helminţilor, în special al plathelminţilor, la gazdele intermediare rezultă forme larvare, care suferă un process de poliembrionie şi adaptare, astfel încât sa devină infestate pentru gazda definitivă.

Gazdele intemediare se împart în:a) Gazde intermediare pasive: găzduiesc forma infestantă sau stadiile

anterioare formei adulte, fără a se deplasa la rezervorul de paraziţi pentru prelucrarea lor, nici spre gazda receptivă pentru a tranzmite formele infestante.

b) Gazde intermeiare active: găzduiesc parazitul in dezvoltare şi se deplasează pentru prelucrarea parazitului de la gazda rezervor şi transmiterea sau inocularea la gazda receptivă. Gazdele active sunt, în general, vectorii biologici.

Vectorii sunt agenţi transmisibili ai parazitului. Se disting:a) vectori biologici, indispensabili ciclului vital al parazitului, asigurându-i

maturarea şi multiplicarea. Sunt gazdele intermediare active.b) vectorii mecanici care au rol de transport, nefiind esenţiali în ciclul

biologic al parazitului(muşte care transportă chisturi de Giardia, chisturi de amibe).

Rezervorul de paraziţi este habitatul în care se menţine şi supravieţuieşte parazitul. Rezervorul de paraziţi poate fi mediul extern sau o gazdă definitivă. După natural or, se pot diferenţia trei tipuri de rezervoare de paraziţi:

a) Omul este rezervor de paraziţi în parazitozele strict umane. În parazitozele commune omului şi animalului, omul poate fi un accident în ciclu, fără rol epidemiologic(chist hidatic, toxoplasmoză, trichineloză).

b) Animalele constituie un rezervor esenţial pe plan epidemiologic pentru majoritatea atropozoonozelor. Există rezervoare de paraziţi, care funcţionează în diferite condiţii ecologice: aminale domestice sau animale sălbatice. Rezervorul constituit de animalele sălbatice, tolerând bine parazitismul, sub forma unei afecţiuni inaparente, reprezintă un

rezervor de bază pentru paraziţi(rozătoarele sălbatice pentru leishmanioza cutanată).

c) Solul reprezintă rezervorul de paraziţi pentru unii helminţi(geohelminţi) cum ar fi Ascaris lumbricoides, Tricocefal.

d) Apa poate fi un rezervor de paraziţi pentru forma de rezistenţă a protozoarelor(chist), declanşând epidemii hidrice(amibiază, giardioză).

CĂI DE TRANSMITERE A PARAZIŢILOR Se disting: Căi de pătrundere a paraziţilor în organismul uman. Cunoaşterea acestor căi este importantă pentru proxilaxia individuală în parazitoze. Principalele căi de pătrundere sunt: *digestive (helmintioze, giardioză, amibiază) * cutanate, mucoase passive (trichomoniază, micoze) * transcutanate active (strongiloidoză, anczlostomiază, malarie – transmitere prin vector hematofag) * pulmonare (pneumocistoză, aspergiloză, criptococoză) Căi de eliminare. Cunoaşterea lor prezintă un dublu interes, permiţând alegerea modalităţilor de optime de diagnostic parazitologic şi a măsurilor de profilaxie colectivă. Există căi digestive de eliminare prin materiile fecale, urinare, pulmonare, cutanate. De asemenea, există paraziţi fără posibilităţi normale de ieşire; sunt paraziţi în impas parazitar: larva migrans, chist hidatic, Trichinella spiralizată în muşchi.

PROFILAXIA PARAZITOZELOR

Cunoaşterea de ansamblu a elementelor ciclului biologic parazitar este indispensabilă pentru cunoaşterea şi înţelegerea modului de producere a unei boli parazitare, a modalităţilor de întrerupere a ciclului şi de evitare a contaminării umane. Profilaxia cuprinde: - Profilaxia individuală: încearca să evite contaminarea persoanelor sănătoase, acţionând la un singur nivel al ciclului biologic: împiedicarea pătrunderii parazitului, distrugerea după pătrundere sau împiedicarea dezvoltării acestuia. Este scopul igienei alimentare, al chimioprofilaxiei şi al vaccinării. - Profilaxia colectivă: se realizează prin intervenţia la toate nivelele vulnerabile ale ciclului biologic. Urmăreşte: - izolarea rezervorului de paraziţi şi sterilizarea lui prin igienă colectivă; - lupta împotriva gazdelor intermediare şi antivectorială; - vaccinarea şi tratamentul populaţiei receptive În producerea bolilor parazitare intevin şi alţi factori care influienţează transmiterea parazitozelor: - factori umani(obiceiuri almentare, mod de viaţă, nivel de cultură, nivel terapeutic) - factori economici(standard de viaţă) - factori climatici(temperatură, umiditate)

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

În cele mai multe infecţii parazitare, diagnosticul etiologic se bazează pe evidenţierea directă a parazitului în produsele biologice ale bolnavului şi pe răspunsul gazei faţă de agresiunea parazitară(martor indirect al prezenţei al prezenţei parazitului).1. Examenul direct1.1. Examenul coproparazitologicConstituie examenul de bază pentru evidenţierea infecţiilor cu: - protozoare: amibiaza, giardioză, coccidioze intestinale- helminţi: ascaridioză, tricocefaloză, strongiloidoză, achilostomiază, teniaze.

Rezultatul examenului coproparazitologic trebuie să menţioneze prezenţa parazitului precum şi abundenţa lui. Pentru protozoare(amibe), rezultatul trebuie să precizeze genul şi specia parazitului găsit şi stadiul său evolutiv: forma vegetativă sau chistică. Controlul după tratament este necesar după trei săptămâni de la terminarea tratamentului. Examenul macroscopic al materiilor fecale. Determinarea consistenţei scunului(format, semiformat, moale, lichid) poate constitui un indiciu asupra parazitului present. Trofozoiţii protozoarelor intestinale se întâlnesc de obicei în scaunul moale sau lichid; formele chisice se întâlnesc în scaunele formate. Ouăle de helminţi se pot găsi în orice scaun. Proglotele mobile de tenie pot fi găsite pe sau lângă probă, iar adultul de Ascaris poate fi găsit pe suprafaţa scaunului. Prezenţa sângelui în probă trebuie consemnată întotdeauna. Sângele proaspăt pe suprafaţa scaunui format indică prezenţa unor hemoroizi care sângerează; sângele găsit împreună cu mucusul format într-un scaun lichid sau moale sugerează o infecţie amibiană. Examenul microscopic din materiile fecale. Se efectuează următoarele preparate care vor fi examinate: - preparat direct în soluţie fizilogică şi soluţie Lugol. Este examenul cel mai ultil pentru detectarea trofozoiţilor mobile ai protozoarelor intestinale şi larvelor mobile de strongiloides stercoralis. Poate evidenţia şi chişti de protozoare şi ouă de helminţi. - preparat în strat gros(metoda Kato – Miura). Se pot decela toate ouăle de helminţi, mai ales cele cu coajă groasă. - preparat după concentrarea elementelor parazitare. Metodele de concentrare permit decelarea ouălor atunci când se găsesc în număr mic în probă şi pot scăpa neobservate într-un examen direct. Sunt flotarea şi sedimentarea. - preparat permanent colorat. Coloraţiile utilizate în identificarea trofozoiţilor şi chiştilor de protozoare sunt: tricrom, hematoxilina ferică, Giemsa, Ziehl – Neelsen. 1.2. Examenul parazitologic al sângelui. Este indicat atunci când se suspicionează: malaria, leishmanioza viscerală, tripanosomiaza, filariozele. În cazul suspectării unei malaria, se efectuează frotiu în picătura groasă cu prilejul acceselor febrile, când paraziţii sunt mai numeroşi. În filarioză trebuie să se ţină seama de periodicitatea microfilaremiei: diurnă pentru Loa- loa şi nocturnă pentru Wuchereria – Bancrofti.

1.3. Examenul parazitologic al sputei. Este indicat în suspiciunea unor infecţii cu Pneumocystis carinii şi Paragonimus westermani.

1.4. Examenul parazitologic al urinei. Este indicat în cazul suspectării unei schistosomiaze urinare sau trichomoniaze urogenitale. În urina persoanelor endemice de filorioză, se pot găsi şi microfilaria de Oncocerca volvulus.

2. Culturi de protozoare.În scop diagnostic, unele protozoare pot fi cultivate pe medii precum: Loeffler, TTY, TPS-1, TYM(pentru Trichomonas vaginalis), NNN(Novy, Nicole, Mc Neal pentru Leichmania).3. Diagnosticul immunologic al infecţiilor parazitare. Ca răspuns la o agresiune parazitară, organismul produce anticorpi specifici şi mobilizează diferite mecanisme celulare în scopul distrugerii parazitului sau limitării proliferării lui. a) investigarea imunităţii umorale. Se apelează la immunodiagnostic în

următoarele situaţii: - când localizarea parazitului în organismul uman nu poate fi accesibilă sau necesită manevre invasive de recoltare(toxoplasmoză, hidatidoză, cisticercoză, larva migrans viscerală).- când infecţiile sunt cu număr redus de paraziţi la care metodele directed au rezultate negative(schistostomiază, filarioze, leichmanioză, malarie)- când infecţia parazitară este recentă, iar parazitul este încî imatur, fie migrează în ţesuturi, fie nu produce înca ouă sau larve care ar putea permite vizualizarea sa în examenul direct. Metodele serologice folosite în diagnosticul parazitologic sunt: - raeacţii de precipitare: dublă imunodifuzie în gel, contraimunelectroforeză, imunelectroforeză- reacţii de hemaglutinare pasivă- reacţii de fixare a complementului- imunofloreşcenţa indirectă- testul imunoenzimatic(ELISA)- radioimunotestul(RIA sau RAST)

b) investigarea imunităţii celulare. Poate fi pusă în evidenţa prin următoarele reacţii: - intradermoreacţia. Evidenţiază reacţia de hipersensibilitate întârziată care apare pe pielea unor persoane sensibilizate după 24 de ore de la injectarea antigenului parazitar. Este mai puţin utilizată în ultima vreme pentru că este relative nespecifică şi rămâne pozitivă multă vreme după dispariţia parazitului din organism. Este considerată numai un test de depistare epidemiologică în: hidatidoză, schistosomiază, leichmanioză. - testul de inhibiţie a migrării macrofagelor - testul de transformare blastică - testul de degranulare a bazofilelor

FUNGI

Fungii sau micromicetii sunt bioentitati microscopice, eucariote, uni- sau pluricelulare, heterotrofe, care contin chitina in peretele celular. Cu siguranta, aceasta definitie este

incompleta si ramane perfectibilia, deoarece particularitatile morfo-structurale, eco-fiziologice si de inmultire, etalate de cele cca. 150.000 specii de fungi, fac imposibila enuntarea unei caracterizari unitare si general valabile a acestor organisme.

Din multitudinea criteriilor de clasificare a fungilor, criteriul morfologic este cel mai cunoscut si agreat in micologie medicala si permite descrierea a trei tipuri principale de micromiceti:

filamentosi

levuriformi

dimorfici

In prezent, cele patru phylum-uri acceptate in regnul FUNGI sunt Chitridiomycota, Zygomycota, Ascomycota si Basidiomycota.

Fungii se cultiva pe mediul Saubouroud.

Diagnosticul de laborator al infectiilor oculare

Conditia anatomica – globul ocular este delimitat prin trei tunici, externa, medie si interna si contine mai multe medii dioptrice rezistente. Tunica externa, groasa, fibroasa si rezistenta, da forma globului ocular si ii protejeaza structurile fragile. Este alba posterior formand sclerotica si transparenta anterior, formand corneea. Tunica medie, uveea, cuprinde o bogata retea vasculara care asigura nutritia tesuturilor oculare, pigment si doua sisteme musculare. Uveea are trei parti: anterioara(irisul), mijlocie(corpul ciliar) si posterioara(coroida). Tunica interna sau retina, delimitata intr-o parte posterioara, unde isi au originea fibrele nervului optic si o parte anterioara, lipsita de proprietati senzoriale. Organele si anexele de protectie – globii oculari sunt protejati prin sprancene, pleoape si glande lacrimale.

Conditia microbiologica. Microbiota indigena a pleoapelor o reflecta pe cea a tegumentului, cu particularitati legate de dispozitia unitatilor pilosebacee si glandulare ale marginii libere la zona de tranzitie tegument-conjunctiva. Cele mai mari densitati bacteriene sunt realizate in unitatile pilosebacee si in orificiile glandulare. Dominanti apar stafilococii coagulazo-negativi si organismele facultativ anaerobe, care colonizeaza orificiile pilosebacee si ale glandelor sudoripare. Conditii prielnice de dezvoltare gaseste aici si Stafilococul aureu. Specii de Priponibacterium, in special Priponibacterium acnes, organisme anaerobe, colonizeaza mai profund unitatile polisebacee. Conjunctiva si corneea, desi expuse continuu contaminarii cu microorganisme, raman cu o incarcatura microbiana redusa, datorita spalarii prin secretia lacrimala si miscarilor palpebrale. Entitati nosologice Complexitatea structurilor care compun globul ocular sau il protejeaza se reflecta in varietatea entitatilor nosologice cauzate de cei mai diferiti agenti infectiosi prin mecanisme patogenetice multiple:

conjunctivite si keratite endoftalmite infectii ale pleoapelor infectii ale aparatului lacrimal celulite orbitare

Spectru etiologic Bacterii: Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus ducreyi, Stretococcus pneumoniae, Strectococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Actinomyces spp., Bacillus spp., Fusobacterium spp., Lactobacillus spp., Propionibacterium spp., Peptostreptococcus spp. Chlamidii: Chlamydia trachomatis serovar: A, B, Ba, C; D-K; L1-L3. Virusuri: Adenoviride, serovaruri mai frecvente: 3, 4, 7, 14; Herpetoviride: v.herpes simplex, v.varicela-zoster, v.Epstein-Barr; Orthomyxoviridae: v.gripal; Paramyxoviridae: v.rujeolic, v.urlian; Picornaviridae: v.Coxackie; Togaviridae: v.rubeolic. Paraziti: Toxoplasma gondii. Fungi: Candida spp, Rhinosporidium seeberi, Sporothrix schenckii.

Complicatii oculare ale folosirii lentilelor de contact Lentilele de contact se folosesc astazi la scara larga, uzul lor fiind de foarte multe ori pur estetic, dar si terapeutic. Portul lentilelor de contact nu este lipsit de reactii adverse si complicatii, de aceea, trebui intotdeauna puse in balanta beneficiile si riscurile. Odata aleasa varianta folosirii lentilelor de contact, indiferent de scop, monitorizarea portului lor este vitala pentru a putea diagnostica si trata la timp complicatiile ce pot aparea in urma folosirii lor, in special cele infectioase. Portul lentilelor de contact reprezinta un factor de risc, prin: - efectul mecanic asupra ochiului al lentilelor

- modificari ale metabolismului corneean, variabile in functie de materialul din care sunt confectionate lentilele, gradul de curbura al lentilelor, portul nocturn al lentilelor

- posibilitatea dezvoltarii unei alergii fata de produsele de intretinere a lentilelor si eventual o suprainfectie bacteriana

- probleme de iginena sau de modul de intretinere al lentilelor, portul prelungit, ce pot duce la colonizarea sub lentile a microorganismelor.Contactul prelungit al acestor microorganisme cu epiteliul corneean, asciat cu prezenta microleziunilor date de punerea si scoaterea lentilelor sunt la originea complicatiilor infectioase ale ochiului la persoanele purtatoare de lentile. Complicatiile folosirii lentilelor de contact sunt:

- neinfectioase – iritativ-alergice, legate de substantele dezinfectante sau conservantii din substantele dezinfectante pentru lentile si sunt reprezentate de: conjunctivite alergice, conjunctivite papilare gigante, edeme epiteliale corneene, infiltrate sterile corneene

- infectioase – tin in special de proasta manipulare a lentilelor de contanct. Cele mai frecvente sunt reprezentate de keratite microbiene(bacteriene, virale, parazitate, fungice). Cele mai frecvente infectii la purtatorii de lentile de contact sunt date de coci Gram+(streptococi, stafilococi), desi studiile florei conjunctivale la purtatorii asimptomatici au demonstrat o modificare a florei normale prin predominenta bacililor Gram-, in special Pseudomonas, Serratia, E.coli, Klebsiela, Proteus, Citrobacter etc.