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Curso 4: Toxicogenômica e Genotoxicidade
GENOTOXICIDADE: Aplicação do Teste de Ames, Micronúcleos, Aberrações Cromossômicas e Cometa
em avaliações ocupacionais e ambientais
Dr. Juliana da Silva (ULBRA)
Dr. Miriana Machado (GENOTOX – Centro de Biotecnologia, UFRGS)
Porto Alegre, 27 de abril de 2014
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2
Capacidade que algumas substâncias têm em
causar distúrbios da estrutura do genoma
(DNA) ou de sua função (expressão).
GENOTOXICIDADE
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3
DNA
adaptado de Baylin & Schuebel, 2007
octâmero de histonas
H2A, H2B, H3, H4
células humanas
citosina, guanina, adenina, timina
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4
AGENTES QUÍMICOS/
FÍSICOS
REPARAÇÃO
fiel
incorreta
MORTE CELULAR
± Metabolismo endógeno
MUTAÇÕES
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5
Ghosal & Chen 2013
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6
Importância do estudo das Mutações:
Mutações: se não ocorre morte celular, as células podem
proliferar e passar o gene mutado para as células filhas...
Mutações em células somáticas ou germinativas:
50 % abortos
30 % problemas de aprendizado
20 % defeitos congênitos
2 % infertilidade masculina
Câncer…
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7
MUTAÇÃO
Mutação gênica
Alteração em um gene, tornando-se um alelo diferente. Podem
envolver substituição, adição ou perda de uma única base
Mutação cromossômica
mutações estruturais
Modificações maiores, alteração nos cromossomos. Mutações
estruturais ou numéricas
Leucemia mielóide crônica
Fibrose cística
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8
CÂNCER
GENOTOXICIDADE / MUTAÇÃO
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9Adaptado de H. Ellinger-Ziegelbauer et al., 2009
EXPRESSÃO GÊNICA
ALTERADA
Reparação de DNA
Checkpoint
Ciclo celular Oncogenes
MUTAÇÃO
CÂNCER
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10
Antimetabólitos:5-FluorouracilAnálogos de folato
Alquilantes monofuncionais:TemozolomidaNitrosuréiasTrabectedina
Alquilantes bifuncionais:Mostarda nitrogenadaMitomicina CCisplatina
Inibidores da TopoisomeraseCampotencinaEtoposídeoDoxorrubicina
Inibidores da ReplicaçãoHidróxiuréiaAfidicolina
Radiomiméticos e agentes oxidativos:BleomicinaDoxorrubicina
Por outro lado…
GENOTOXICIDADE
Hurley, 2002, Chabner & Roberts Jr., 2005Reichert & Wenger, 2008, Helleday et al., 2008
CÂNCER
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ENSAIOS DE
GENOTOXICIDADE
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- Predição do potencial carcinogênico de produtos para usohumano e/ou veterinário
BATERIA DE ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE:Segurança Toxicológica - Registro de Produtos
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- Avaliação dos efeitos da exposição ocupacional e ambiental
BATERIA DE ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE:Risco Ocupacional / Ambiental
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In vitro In vivo Assays for Gene Mutations Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames test, bactéria)
X
Escherichia coli reverse mutation assay (bacteria) X Gene mutation in mammalian cells in culture X Drosophila sex-linked recessive lethal assay (fruit fly) X Gene mutation in Saccharomyces cerevisiae (yeast) X Mouse Spot test X Assays for Chromosomal and Genomic Mutations In vitro cytogenetic assay (CHO/SHE/Human lymphocyte)
X
In vivo cytogenetic assay X Micronucleus test X Dominant lethal assay X Herutable translocation assay X Mammalian germ cell cytogenetic assay X Assays for DNA Effects DNA damage and repair: unscheduled DNA synthesis in vitro
X
Mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae (yeast)
X
In vitro sister chromatid exchange(SCE) assay X
PRINCIPAIS ENSAIOS DE GENOTOXICIDADE
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Limitações de cada modelo...
(Jena et al., 2002)
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Ensaios de Genotoxicidade utilizados no Desenvolvimentode Produtos, Análises Ambientais e Ocupacionais
Ensaio Tipo de dano Medicamentos Cosméticos Agroquímicos Ambiente Ocupacional
Ames Mutação Gênica X X X X
Mouse Lymphoma
Mutação Gênica X* X
Aberrações Cromossômicas in vitro
Mutação Cromossômica X* X X
Micronúcleos in vitro
Mutação Cromossômica X* X X X
Micronúcleosin vivo
Mutação Cromossômica X X X
Cometa in vitro Quebras no DNA X X
Cometa in vivo Quebras no DNA X* X X
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Teste de Ames
- Mutagenicidade gênica – ensaio de mutação reversa
- Salmonella typhimurium: mutação no operon da histidina(his-)
2º mutação prototrófica para histidina (his+)
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Teste de Ames
- Produtos químicos
- Medicamentos
- Cosméticos
- Águas
- Sedimentos
- Lodos
- Efluentes
- Amostras atmosféricas
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Ativação Metabólica (S9 mix): utilizado em todos os experimentos in vitro
Aroclor 1254
Fração microssomal
S9S9-mix
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Erro no quadro de leitura
Substituição de pares de bases
S. Typhimurium TA97a
S. Typhimurium TA98
S. Typhimurium TA100
S. Typhimurium TA102
S. Typhimurium TA1535
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Resultado negativo: o nº de revertes/placa similar ao nº de revertentes espontâneos
Resultado positivo: Índice mutagênico (MI) 2
MI= nº rev./placa amostra
nº rev./ placa C-
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Sorcerer – Contador Automático de Colônias
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Ensaio Mouse Lymphoma
- Mutagenicidade gênica em células de mamífero em cultura
- Linhagem L5178Y tk+/-: heterozigota no locus TK1 (timidina cinase)
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Ensaio Mouse Lymphoma
- A timidina cinase é uma enzima não essencial que recicla a timidina
que pode ser incorporada no DNA.
- Trifluorotimidina (TFT) é um análogo tóxico da timidina que quanto
incorporado no DNA no lugar da timidina, interfere no metabolismo do
DNA, sendo tóxico para a célula.
- Se a cópia funcional do gene TK é perdida por decorrência de
mutações, o TFT não é incorporado e as células conseguem sobreviver
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3 h treatmentwith or without S9-mix
L5178Y cells, 37 °C, 5% CO2
24 h, 37 °C
Ensaio Mouse Lymphoma
-TFT +TFT
Agar + medium
wash-out
2 days, 37 °C
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- Avaliação de quebras cromossômicas (mutações cromossômicas).
Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro
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Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro
Manual or automatedanalysis
KCl (75 mM) 20’, RT
3 or 4 h treatmentwith or without S9-mix
Colchicine, 1,5 h
V79 cells or lymphocytes, 1.5 x 105 cells/well
37 °C, 5% CO2
24 or 48 h, 37 °C
Fixation(2x, 5’)
Staining(2 % Giemsa, 5-8’) 24 h
Slide preparation
24 h
4 °C
24 h
4 °C
1,5-2 x cell cycle
37 °C
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-Avaliação de divisão celular (viabilidade):
Índice Mitótico – quantificação de metáfases em 2000 células
Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro
Céluas de sangue periférico humano
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29
Avaliação de mutagenicidade:
Ensaio de Aberrações Cromossômicas in vitro
- Contagem de cromossomos (46 ± 2 humanos)
- Quantificação de metáfases contendo cromossomos
aberrantes
(200 metáfases/grupo /doador)
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30
Metáfase normal de sangue periférico humano
Metáfase aberrante de sangue periférico humano
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31
Chinese hamster lung fibroblast (V79 cells)
Ensaio de Micronúcleos in vitro
- Avaliação de quebras cromossômicas (clastogênese) e aneugênese.
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32Fenech, 2007
Ensaio de Micronúcleos in vitro
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33
Ensaio de Micronúcleos in vitro
Manual or automatedanalysis
KCl (75 mM) 3’, 4 °C
3 h treatmentwith or without S9-mix
Cytochalasin B (3 µg/mL), 21 h
V79 cells, 1.5 x 105 cells/well
37 °C, 5% CO2
24 h, 37 °C
21 h treatmentwithout S9-mix and with Cytochalasin B, 37 °C
Fixation(2x, 5’)
Staining(2 % Giemsa, 5-8’) 24 h
Slide preparation
24 h
4 °C
24 h
4 °C
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34
Análise Manual:
• Viabilidade celular: contagem de células mononucleadas, binucleadas
(BN) e multinucleadas em 1000 células por cultura – Índice de
Replicação.
Índice de Replicação (IR %) = [(nº cél. BN) + (nº cél. multinucleadas x2)]/nº total de cél. analisadas (grupo tratamento) x 100[(nº cél. BN) + (nº cél. multinucleadas x2)]/nº total de cél. analisadas (controle negativo)
• Mutagenicidade: avaliação da presença de células
BN com micronúcleos (BNm) em no mínimo 1000
células BN por cultura.
Ensaio de Micronúcleos in vitro
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Análise Automatizada
Pathfinder ScreenTox Cytometry System (IMSTAR, França).
Ensaio de Micronúcleos in vitro
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36
Análise Automatizada
• Captura de imagens em uma área pré-selecionada de cada lâmina;
• Identificação automatizada de células
mononucleadas, binucleadas e multinucleadas;
• Identificação automatizada de
micronúcleos em todas as
células;
• Validação das células BNm por
um técnico treinado;
Ensaio de Micronúcleos in vitro
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37
Análise Automatizada
• Viabilidade celular: contagem de células mononucleadas, binucleadas
(BN) e multinucleadas em no mínimo 1000 células por cultura – Índice
de Replicação.
• Mutagenicidade: avaliação da presença de células BN com
micronúcleos (BNm) em no mínimo 1000 células BN por cultura.
Ensaio de Micronúcleos in vitro
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38
- Avaliação de quebras simples, duplas e sítios álcali-lábeis.
- Danos recentes.
- Sensibilidade.
- Vários tipos celulares in vitro
- Vários tecidos in vivo
(sangue, fígado, pulmão etc).
Linfócito de sangue periférico
Sutherland e Costa, 2001
Células V79 (fibroblastos de pulmão de hasmter chinês)
Ensaio Cometa Alcalino in vitro
Hemócitos de Mexilhão Dourado (Villela et al., 2006)
(Azqueta & Collins, 2013)
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Neutralização
Eletroforese
(300 mA, 25V, 20 min)
Coloração (SYBR Gold)
Lise pH 10
Células+
Agarose LMP
Cultivo e tratamento das células
(3 h)
Preparo das
lâminas
PathFinderScreen Tox
Ensaio Cometa Alcalino in vitro
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40
Análise no PathFinder (SYBR Green)
Classificação pelo conteúdo de DNA na cauda (% Tail DNA) e tipo de cauda (Olive Tail Moment)
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41
Métodos Alternativos ao Uso de Animais de Experimentação – 3 R
(Replacement Reduction and Refinement)
Teste de Ames
Teste Mouse Lymphoma
Micronúcleos in vitro
Aberrações cromossômicas in vitro
Cometa
- Únicos considerados para registro de cosméticos
- Avaliação de vários endpoints no mesmo ensaio
(Toxicidade)
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42(Goodsaid et al., 2010)
Futuro…
BATERIA DE ENSAIOS DE
GENOTOXICIDADE
TOXICOGENÔMICA
&
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43
Normas de Referência:
OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS - Bacterial Reverse Mutation Test – 471/97
OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test – 473/97
OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS – Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test – 474/97
OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test – 476/97
OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS - In Vitro Micronucleus Test – 487/10
ICH Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1)
(2011)
DRAFT OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS – Rodent Alkaline single cell gel electrophoresis (Comet)
assay.
RESOLUÇÃO CONSEMA 129/2006