curso de genómica - uat (vhir) 2012 - arrays de proteínas zeptosens

Institut de RecercaHospital Universitari Vall d’Hebron

Arrays de ProteínasZEPTOSENS

5 de Diciembre del 2012

Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

Arrays de Proteínas1

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Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens

Flujo de trabajo de un ensayo con Reverse Protein Arrays

Optimización del Servicio en la UAT

Resultados y Análisis de Datos

Programa

Arrays de Proteínas

Definición

Es una técnología de alto rendimiento que permite el estudio en forma simultánea y

masiva de miles de protéinas.

Dispositivo que utiliza proteinas inmovilizadas de forma ordenada en soportes sólidos

(vidrio, bolas, pocillos) para ser posteriormente interrogadas con otras moléculas con el

fin de detectar interacciones específicas.

Ventajas

Rápida, automatizada

Muy sensible

Económica, consume pequeñas cantidadades de muestra y reactivos

Muchos datos a partir de un experimento

1

Áreas de aplicación:

1.- Diagnóstico: Descubrir nuevos biomarcadores; efecto de nuevos fármacos.

2.- Proteómica: Estudio de perfiles diferencial de protéinas

3.- Análisis funcional Proteico: Interacciónes proteina-proteina; propiedades de unión al ligando de

receptores; actividad enzimática.

4.- Caracterización de Anticuerpos: reactividad cruzada y especificidad; epitope mapping.

Arrays de Proteínas

Tipos de Arrays de Proteínas

1

Necesidad de la técnica

El elevado grado de redundancia de las vías de señalización celular pueden compensar vías de transducción anómalas.

La cantidad de mRNA a menudo no es un reflejo de los niveles de expresión protéica.

El análisis del mRNA no proporciona información acerca de las modificaciones post-transduccionales a las que están sometidas las proteinas.

Los cambios genéticos pueden ser detectados en biopsias de tejido tumoral, pero la sangre y otros fluidos corporales contienen poca o ninguna cantidad de mRNA para propósitos diagnóstico.



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Programa

Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens2

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Esta tecnología se basa en el Principio deConducción planar de ondas. Gracias aldiseño del vidrio donde se crean los arrayspodemos excitar solo la muestra y reducir elruido de fondo.

Arrays en fase Reversa (RPA=Reverse Protein Array)


ZeptoMark RPA

• 1x32x4_3T_AAAAAA

• 3x32x4_3T_ABCABC

• 6x32x4_3T_ABCDEF

Distribución Muestras en el chip:

2 Servicio Arrays de Proteínas UAT: Tecnología Zeptosens

• Lisados proteicos de tejidos• Lisados proteicos de cultivos de células• Suero• Orina

Tipo de Muestras que admite el chip:

Nanoplotter 2.1(80 chips/480 arrays)

Arrayer- Cell Lysate Spotter

ZeptoGOGChip blocking Station

Zeptocarrier

Equipamiento

Lysis buffer &Spotting Buffer


ZeptoreaderMicroarray Reader


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Programa

Flujo de Trabajo

Test d

e Bra

dfor

d

Test de Bradford para la Normalización del lisado protéico a 2 mg/ml. Los pasos 1-3 los realiza el usuario y el resto el personal técnico de la UAT.

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3

Guía Experimental Arrays de Proteínas Elaboración del Diseño experimental entre las partes implicadas en la realización del experimento.

Consideraciones:

• Aplicación

• Elección de Anticuerpos. Los anticuerpos los proveerá el usuario. Zeptosens dispone de una lista

validada de anticuerpos:

Zeptosens dispone de: list of validated antibodies:

http://www.zeptosens.com/en/pdf/ZeptoMARK_Reverse_Array_Validated_Antibodies_LR.pdf

• En caso de necesitar un Anticuerpo que no figure en la lista, se requerirá una validación previa del

mismo.

La obtención del Lisado proteico la realiza el usuario. Consideraciones:

• Diferentes protocolos con diferentes tampones de lisis en función fuente proteica

• Si la fuente protéica es a partir de suero, se recomienda la realización del llamado proceso de depleción de

plasma, con el que se eliminan las proteinas más abundantes así como tb las inmunoglobulinas, previa al

espoteado de la muestra. (IgY/Supermix plasma depletion columns; Genway, from Sigma-Aldrich)

La cuantificación proteica (así como el resto de la técnica) la realiza la parte técnica responsable de la

plataforma en la UCTS mediante Test de Bradford. Consideraciones:

• Se necesitan 2.5 µl de lisado proteico para la cuantificación.

• Para proceder al espoteado se recomienda empezar con un mínimo de 2 mg/ml de lisado proteico en un

volumen mínimo de 10 µl. En caso de no conseguir la mínima concentración recomendada es decisión del usuario la

continuación del procedimiento del experimento o la obtención de más lisado proteico con el fin de conseguir las

cantidades recomendadas.

Flujo de Trabajo3


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7





Programa


Fuente protéica: Lisados celulares de MCF7 obtenidos por el personal técnico de la UCTS. Lisados celulares de JIMT1 y KPL4 obtenidos por personal grupo Violeta (Onco). Muestras humanas de orina obtenidas por personal grupo Ana Meseguer (dpt

Nefropatologia renal)

Fuente de Anticuerpos Primarios (Validados previamente por western Blot)

Comprados por la UCTS (AKT, p-AKT, P53, p-P53) Cedidos por los usuarios

Fuente de Anticuerpos Secundarios Comprados por la UCTS

El resto de reactivos necesarios, incluidos los arrays, son los que se compraron por la UCT en el 2010.

4

Obtención Lisado Proteico de MCF7

Lisado 1

+ =

450 µl Tampón Lisis zeptosens

+1.4 mg/ml

Lisado Proteico

Lisado 2

~70% confluentes

~70% confluentes ~50% confluentes

+ + =3 mg/ml

Lisado Proteico

MCF7 es una línia celular humana de cáncer de mama. Tampón de Lisis CLB1, Zeptosens#9000 (75 µl/10cm2 pocillo en placas de 6p y 450 µl en placa de 60cm2) Cuantificación proteica mediante Test de Bradford (recomendado por zeptosens) El lisado proteico tiene que estar normalizado a 2 mg/ml.

75 µl/pocillo Tampón Lisis

zeptosens

+

Test de Bradford

4 Optimización del Servicio en la UAT

Lisado 22 mg/ml

1A_Exp3 Humidificat/estufa

Lisado 11.4 mg/ml

Mg/ml0.2 0.1

0.050.150.2 0.1

0.05

L1 L1

L1

L1

L1

L2

L2

L2

L2

L2

(Mg/ml)

0.150.2 0.10.05

Diluciones Lisado

A

B

C

D

E

F

Chip-1

1/500PS6-240/244

1/500P4EBP16S

1/500P53-p

1/250AKT

1/250PS6-240/244P

1/250P4EBP16S

EXPRESION PROTEICA DE PS6-240/244 EN MCF7

BSA-AlexaFluor647

4 Optimización del Servicio en la UAT


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Programa

Institut de RecercaHospital Universitari Vall d’Hebron

Arrays de ProteínasZEPTOSENS

5 de Diciembre del 2012

Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

Ferran Briansó Castilla (UEB) [email protected]


de Zeptosens


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Programa

Ferran Briansó Castilla (UEB) [email protected]

5Resultados y Análisis de Datos

5.1 - Visualizado y análisis básico de resultados (ZeptoView)

5.2 - Exportar resultados

5.3 - Análisis y representación de datos “a medida” en la UEB

Visualización de resultados: Calcular datos a partir de las imágenes5

Árbol del

experimento(nodos

expandibles)

Selector de

imágenes

Panelde visualización

de resultados


Calcular resultados


Configuraciónde

parámetros

Visualización de resultados: Árbol de selección de datos5

Selección del chip

Visualización de resultados: de un array en un chip5

Selección del

array

Visualización de resultados: “Base Module” (RNFI values)5

Valores obtenidos porcada dilución

Visualización de resultados: “Base Module” (RNFI values)5

Visualización delarray completo

Visualización de resultados: “Reverse Array Module” (RFI values)5

Valores calculados por cada posición

Visualización de resultados: “Reverse Array Module” (RFI values)5

Gráfico de valores RFI calculados

Visualización de resultados: “Concentration Series”5

Series de concentración(2 valores por cada dilución relativa)





5

Exportar resultados: tablas de RNFI5

Desde el nodo de imágenes exportar tablas RNFI

Exportar resultados: tablas de RNFI5

Exportar resultados: tablas de RFI5

Desde el nodo de imágenes exportar tablas RFI

Exportar resultados: tablas de RFI5

Exportar resultados: gráficos (?!?)5

Parámetros gráficos configurables caso a caso

(no en global?!?!)





5

Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5

Análisis avanzado y representación de datos “a medida”

Estudio de los valores obtenidos en cada serie de 8 lecturas de cada posición del array

5

0.2 0.10.05

0.150.2 0.10.05

L1 L1

L1

L1

L1

L2

L2

L2

L2

L2

(Mg/ml)

0.150.2 0.10.05

Diluciones Lisado


Construcción de la regresión linealy detección de valores extraños

5


RFI = Valor predicho parauna RelDilution de 0.625

lecturas reales a cada dilución relativa

límite superior de la predicción puntual

límite superior de la predicción conjunta

recta de regresión a partir de los 8 valores

límite inferior de la predicción conjunta

límite inferior de la predicción puntual

según el nivel de confianza(usualmente a 95%)

5


Representación gráfica agrupando por

experimentos, chips, arrays, anticuerpo factores secundarios ...

Que nos permitan comparar muestrasentre ellas, según condiciones expe-rimentales...

5

Análisis avanzado y representación de datos “a medida”5


Otras formas de representación gráfica

5


Outputs (pdf, jpg...) hechos a medida(y con calidad para ser publicados!)

5

http://ueb.vhir.org/NGS2012

Materiales disponibles en:

curso de genómica - uat (vhir) 2012 - arrays de proteínas zeptosens

Education