curva de crecimiento de escherichia coli: cuantificación de microorganismos equipo 1
TRANSCRIPT
Curva de crecimiento de Escherichia coli:
cuantificación de microorganismos
EQUIPO 1
Crecimiento de poblaciones
Crecimiento: aumento en el número de células microbianas de una población. Incremento de masa celular.
Velocidad de crecimiento: cambio en el número de células o en la masa celular por unidad de tiempo
Generación: intervalo para la formación de dos células a partir de una
Tiempo de generación: tiempo transcurrido para que esto ocurra
Curva de crecimientoTípica de un sistema cerrado ó cultivo en
medio no renovado ó cultivo monofásico:
Fase de latencia (Fase lag) Fase en la que el crecimiento se da tras un
periodo de tiempo Puede ser breve o larga Si se inocula en el mismo medio y
condiciones de cultivo, no hay retraso y el crecimiento exponencial inicia rápido
Si el inóculo se toma de un cultivo viejo (fase estacionaria) o las células han sido dañadas hay retraso
También ocurre cuando se transfiere un cultivo de un medio rico a uno mas pobre
Fase exponencial
Consecuencia de que cada célula se divide para formar dos
Las células están en el estado fisiológico más sano
La mayoría de los mo unicelulares tienen este crecimiento
Las velocidades son muy variables y están influenciadas por condiciones ambientales y características genéticas del mo
Fase estacionaria
En un sistema de cultivo cerrado por ejemplo tubo o matraz, el crecimiento exponencial no puede ser indefinido ya que:
1.- Un nutriente esencial del medio se usa y llega a ser un factor limitante del crecimiento
2.- Se acumulan en el medio productos de desecho No hay aumento ni descenso neto en el número
de células Funciones celulares continúan Crecimiento críptico: algunas células crecen y
otras mueren equilibrándose
Fase de muerte
Si la incubación continúa Menos células vivas y
metabólicamente activas Más células que mueren Hay lisis celular real La velocidad de muerte es
exponencial pero mucho más lenta que la de crecimiento
Métodos de cuantificación de microorganismos
El crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el número de células, en la cantidad de algún componente de las
mismas o en el peso total seco de las célulasDIRECTOS Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter)
Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula).
Cámaras de recuento
Recuento de células totales: Contando una muestra con el microscopio en muestras secas o líquidas.
Ventajas: -Método rápido
Desventajas:-No distingue células vivas de
muertas-Células pequeñas no se ven-La precisión es difícil-Se requiere microscopio de
contraste de fases cuando la muestra no se tiñe
- No adecuado para baja densidad celular
Recuento de células viables
Métodos de cuantificación de microorganismosINDIRECTOS
Turbidez (Turbidimetría) Método rápido y útil para obtener estimaciones
del número de células Se debe a que las células dispersan la luz que
atraviesa la suspensión Se mide con fotómetro o espectrofotómetro Estos miden la luz no dispersada Las lecturas se expresan en unidades
fotométricas (fotómetro) o de densidad óptica para el espectrofotómetro
Se obtiene una curva estándar donde se puede observar que las UDO son proporcionales al número de células
Se debe preparar para cada microorganismo a estudiar una curva estándar
Se pueden hacer sin destruir o modificar la muestra
Se usan mucho para seguir la velocidad de crecimiento
La misma muestra puede medirse repetidamente
Escherichia Coli
Bacilo Gram negativo Anaerobio facultativo Móvil por flagelos
perítricos No forma esporas Capaz de fermentar
glucosa y lactosa Bacteria muy utilizada
en experimentos de genética y biotecnología molecular.
Curva de crecimiento de E. coli
Fuentes de información
Jesús Ramírez Santos,* Gabriel Contreras Ferrat,** M. Carmen Gómez Eichelmann. “Revista Lationoamericana de Microbiología”. Vol. 47, No. 3-4 July - September. 2005, October - December. 2005 pp. 92 -101 www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2005/mi05-3_4f.pdf
Ciclo celular y crecimiento. “Microbiología” Universidad de Granada. http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm
Mandigan, Martinko, Parker, 2004. Brock Microbiologia. 10ª Ed. Pearson, Madird, España.
Procedimiento
Práctica # 6
15 Tubos de rosca 5 Pipetas de 1 mL 5 Pipetas de 10 mL 1Cilindro para esterilizar pipetas 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL 1 Parrilla Agitadores magnéticos 1 Vaso de precipitados 1000 mL 1 probeta de 100 mL Balanza analítica Gasa Algodón Papel de estrazaREACTIVO
Caldo nutritivo Agua destilada
Celdas para espectrofotómetro Espectrofotómetro Microscopio óptico Portaobjetos Cámara de Neubauer Cubreobjetos 2 Mecheros Fisher 1 tubo “t” de vidrio
Sesión prácticaSesión extra clase
4
Sesión extra clase
250 mL de Caldo nutritivo
• 10 mL del medio en un tubo con tapón de rosca (15 tubos)
• 50 mL del medio en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con tapón de algodón
g caldo en 250 mL de agua destilada
g X 4 = En 1000 mL
15 X 4 =60
4
1
2 Esterilizar
Autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos.
Pipetas Tubos con tapón de rosca Matraz Erlenmeyer de 125 mL
Pipetas limpias con tapón de algodón y en el cilindroParcialmente cerrados Con tapón de algodón
3Inocular con Escherichia coli el 2 matraz Erlenmeyer (A y B) un día anterior a la sesiónpráctica (19 de mayo de 2008, a las 17:00 hrs)e incubar a 37ºC.
4 Inocular con el cultivo del matraz A a otro matraz con caldo nutritivo e incubara 37ºC 20 de mayo a las 11:00 hrs
Con asada de un cultivo puro
Se agregó cierta cantidad del matraz
A
medir densidad óptica de cada tubo y realizar conteo de células5
Sesión práctica
Fecha de inoculación
Hora de inoculación
Tubo o Matraz Minutos de incubación Hora de checar
Equipo encargado de checar
19 mayo 17:00 2 matraces: A y B 1380 16:00 1
20 mayo 11:00 Del matraz A: 1 matraz
270 15:30 1
13:00 Del matraz A: 1 matraz
240 X 17:00 1
14:00 Del matraz A: 2 tubos 210 17:30 4
15:30 Del matraz B: 14 tubosEq 2: 4 tubosEq 3: 6 tubosEq 4: 4 tubos
0 No se checa 2Esterilizar
30 X 16:00 360 16:30 490 17:00 2120 17:30 3150 18:00 4180 18:30 3
Matraz (11:00) 420 18:00 1
Matraz (13:00) 330 18:30 4
Matraz(11:00)
480 6:30 3
Calibrar espectrofotómetro utilizando como blanco medio estéril.
En una celdilla limpia agregar cierta cantidad de la muestra (tratando de mantener limpia la celdilla).
Poner en el espectrofotómetro y leer su densidad óptica.
Bajo condiciones de asepsia colocar en el área hundida de la cámara de Neubauer una gota de los cultivos (muestras series 1 y 2 según sea el caso) y extenderla rápidamente.
Colocar el cubreobjetos y observar con los objetivos de 40X y 100X
Contar las células en cuadros individuales.
Densidad Óptica Conteo de Células
Cuadro 1= 5Cuadro 2= 6Cuadro 3 = 5Cuadro 4= 5Cuadro 5=Cuadro 6=Cuadro 7=Cuadro 8=Cuadro 9=Cuadro 10=
Cálculo del número de microorganismos pormililitro o gramo de la muestra original
7
tiempo Absorbancia
0 0
30 0.024
30 0.017
60 0.025
60 0.027
90 0.016
90 0.018
120 0.018
120 0.021
150 0.017
150 0.02
180 0.022
180 0.015
210 0.033
210 0.026
270 0.083
270 0.078
420 0.13
420 0.14
480 0.14
480 0.149
1380 0.236
tiempo Ln0 0
30 -3.7297014530 -4.0745419360 -3.6888794560 -3.6119184190 -4.1351665690 -4.01738352
120 -4.01738352120 -3.86323284150 -4.07454193150 -3.91202301180 -3.81671283180 -4.19970508210 -3.41124772210 -3.64965874270 -2.48891467270 -2.55104645420 -2.04022083420 -1.96611286480 -1.96611286480 -1.90380897
1380 -1.443923471380 -1.44816976
tiempo conteo de células
0 0.00000001
30 2.35E+05
60 5.00E+04
120 3.96E+05
150 7.92E+04
210 8.92E+04
270 4.28E+05
420 3.36E+05
480 7.20E+06
1380 1.02E+07
tiempo segundos) Ln
150 11.2797316
210 11.3986363
270 12.9668785
420 12.7248664
480 15.7895916
1380 16.1378983