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CYTOSQUELETTE et MOBILITE
Master Physiopathologie Cellulaire et Moléculaire
Option Cancérologie
Eric GUERIN
Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire - Hôpital de Hautepierre
EA 4438 Physiopathologie et Médecine Translationnelle - UdS
Marqueurs Moléculaires de Progression Tumorale et de Sensibilisation aux Drogues Anticancéreuses
Le processus métastatique
� Profondes modifications dans les mécanismes d’adhérence et de migration cellulaire� Sous-tendues par des remaniements importants du cytosquelette (mobilité)
Dissociation cellulaireModification phénotypique (EMT)Franchissement Membrane Basale
Dégradation de la MEC
� Toutes les cellules eucaryotes possèdent un cytosquelette
� Formé de 3 réseaux protéiques - les microfilaments
- les filaments intermédiaires
- les microtubules
Cytosquelette - Généralités
Cytosquelette - Généralités
Microfilaments (actine) en rouge
Microtubules (tubuline) en vert
Cytosquelette - Généralités
Fonctions du cytosquelette
Forces de tension Motilité cellulaireDéplacements cellulaires
Endo et exocytose
Forme et polaritécellulaire
Ancrage des organiteset des structures cellulaires
Mouvements des organiteset des chromosomes
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments
� Structure
– Fins filaments de 5 à 9 nm de diamètre, composés de 2 chaînes enroulées en hélice
– Polymères d’une protéine globulaire = actine
– Actine = une des protéines les plus abondantes de la cellule, très conservée durant l’évolutiongénéralement de 5 à 10% des protéines totalesjusqu’à 20% dans les cellules musculaires
– 3 classes d’actine, présentant de très fortes homologies de séquenceactine α = majoritaire dans les cellules musculaires (muscles striés et lisses)
actine β et γ = majoritaires dans les autres types cellulaires
Ø 5 à 9 nm
Molécule d’actine
Microscopie électronique
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments
� AssemblageL’assemblage monomère actine G (globulaire) � polymère actine F (filament) se fait en 3 phases
Nucléation– Phase 1 = Nucléation
Formation du noyau initial = trimère
Equilibre dynamiquedes microfilaments
– Phase 3 = Equilibre dynamique
Microfilament de taille constanteavec équilibre entre les monomères qui s’accrochent et se détachent dumicrofilament
Extrémité +
Extrémité -
– Phase 2 = ElongationCroissance du microfilamentAjout de monomères aux 2 extrémités
Extrémité + � croissance rapide
Extrémité – � croissance lente
Extrémité –
Croissance lente
Extrémité +
Croissance rapide
Microfilamentpolarisé
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments
� Equilibre dynamique
– L’actine est une molécule qui lie l’ATP
– Au sein du microfilament, l’ATP est hydrolysé de façon spontanée � actine-ADP
– Conséquences : changement de conformation de l’actine
� des forces de liaisons avec les sous-unités voisines � dépolymérisation
Extrémité –
Croissance lente
Actine-ADP prédomine
Vitesse addition actine <
Vitesse hydrolyse ATP
A l’équilibreFlux net = dépolymérisation
des sous-unités
Extrémité +
Croissance rapide
Vitesse addition actine >
Vitesse hydrolyse ATP
Actine-ATP prédomine
A l’équilibreFlux net = polymérisation
des sous-unités
Phénomène du tapis roulant = treadmilling
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments
� Equilibre dynamique
Mise en évidence du treadmilling
Extr + Extr -
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
Cofiline Forte affinité pour l’actine-ADPDépolymérise les filaments d’actine à partir de l’extrémité moinsInduit des cassures dans les filaments d’actine
– Plusieurs protéines de liaison à l’actine régulent in vivo cette dynamique des microfilaments
� Rôle +++ dans le remodelage du cytosquelette lors de la migration
Profiline Stimule l’échange ADP/ATP � Régénération de monomères actine-ATP pour la polymérisation
ARP2/3 Induit la nucléation in vivo à partir de monomères libresSe fixe sur des filaments déjà existants � branchements (formation d’un réseau de microfilaments)
1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
– Plusieurs toxines interfèrent avec la dynamique des microfilaments d’actine
� Outils utilisés en Biologie Cellulaire
1°) Structure, assemblage et dynamique des microfilaments
� Les cytochalasines D ou B se lient à l’extrémité + des microfilaments d’actine
bloquent l’addition de nouveau monomères
dépolymérisation à l’extrémité - � disparition des microfilaments
� La latrunculine A se lie aux monomères d’actine G (globulaire)
inhibe la polymérisation des microfilaments
� La phalloïdine se lie latéralement aux filaments d’actine F polymérisée
stabilise les microfilaments
couplée à un fluorophore � visualisation des microfilaments
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
3 types d’arrangements selon la nature des protéines associées
a. Les faisceaux parallèles serrés
– Dans les filopodes (fines projections cytoplasmiques)
émis sur le bord des cellules en migration
Marquage de l’actine F (polymérisée) en rouge (Phalloïdine-TRICT)
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
3 types d’arrangements selon la nature des protéines associées
a. Les faisceaux parallèles serrés
– Dans les filopodes (fines projections membranaires)
émis sur le bord des cellules en migration
Faisceau de filaments d’actine
– Dans les microvillosités intestinales
– Filaments orientés avec la même polarité
– Faisceaux serrés car reliés par des protéinesintercalaires de petite taille (villine, fimbrine)
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
b. Les faisceaux contractiles
Dans les sarcomères = unités contractiles du muscle strié
2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
Dans les ceintures d’adhérencereliant les jonctions adhérentesprésentes au pôle apical descellules épithéliales
Contraction � Cohésion tissulaire
Dans l’anneau contractiledes cellules en division
Contraction � Cytodiérèse (séparation cellulaire)
2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
b. Les faisceaux contractiles (suite)
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
Dans les « fibres de stress » au niveau des plaques d’adhésion focales à la matrice extracllulaire
Contraction � force de tension (adhérence et migration)
2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
b. Les faisceaux contractiles (suite)
Marquage de l’actine F (polymérisée) en vert(Phalloïdine-FITC)
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
– Disposition lâche car reliés par un dimère d’α-actinine de grande taille
– Insertion possible d’un complexe bipolaire de plusieurs molécules de myosine II
activation de la myosine II � force de contraction entre filaments d’actine
2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
b. Les faisceaux contractiles (suite)
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
L’activation de la myosine II dépend de la phosphorylation de ses chaînes légères
DEPHOSPHORYLATION
BY MLC Phosphatase
� Activation de la Myosine Light Chain Kinase (MLCK) (voie Ca2+ - calmoduline)
� Inhibition de la MLC Phosphatase (voie impliquée dans la régulation du cytosquelette lors de la migration)
2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
b. Les faisceaux contractiles (suite)
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
c. Les réseaux formant des mailles
– Dans les lamellipodes (larges extensions membranaires) émis sur le bord des cellules en migration
2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE
c. Les réseaux formant des mailles
– Dans les lamellipodes (larges extensions membranaires) émis sur le bord des cellules en migration
– Dans le réseau d’actine corticale sous-membranaire
– Filaments en disposition +/- orthogonale
stabilisés par la filamine
2°) Organisation intracellulaire du cytosquelette d’actine
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE3°) Principales fonctions des microfilaments d’actine
� Rôle architectural
� Contraction du muscle squelettique strié
� Séparation des cellules après la mitose (anneau contractile)
� Repliement des feuillets embryonnaires en tubes (tube neural)
� Maintien de la cohésion tissulaire (ceinture d’adhérence)
� Transport de vésicules, via la myosine de type I
� Transport intracellulaire de virus et bactéries (Listeria, …)
� Phagocytose
� Migration cellulaire
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration
a. Le modèle de migration cellulaire sur un support 2D
Au bord avant : Formation de filopodes et de lamellipodesliés à une polymérisation dirigée de l’actinequi pousse la membrane sur le bord avant
Adhésion : Formation de nouveaux contacts focaux
Translocation du corps cellulaire Mise en jeu des forces contractiles actine-myosine
Rétractation avec dissolution des mécanismes d’adhésion à l’arrière de la cellule
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration
b. Mise en évidence du rôle des petites protéines G monomériques (Rho GTPases)
Cdc42Formation de filopodes
RacFormation de lamellipodes
RhoFormation de fibres destress et contacts focaux
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration
c. Que sont les petites protéines G monomériques de la famille des Rho GTPases ?
Forme active liée au GTPForme inactiveliée au GDP
Activation = Fixation GTP
Stimulée par protéinesde type GEF
Guanine nucleotide Exchange Factor
Inactivation = Hydrolyse du GTP
Stimulée par protéines de type GAPGTPase Activating Protein
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration
d. Quels sont les signaux activateurs des RhoGTPases ?
RhoGTPases sousforme activeliée au GTP
Chemoattractants � Activation de la voie Pi3K � Production de PiP3 � Activation des GEF(parmi d’autres …)
I - LES MICROFILAMENTS D’ACTINE4°) Remodelage du cytosquelette d’actine au cours de la migration
e. Quels sont les effecteurs des RhoGTPases au cours de la migration cellulaire ?
Au front de migration cellulaire � Emission de filopodes et lamellipodes
Cdc42Se lie DIRECTEMENTet active des protéines
de la famille WASP (N-WASP)
Activation du complexeARP2/3
Nucléation et polymérisationde l’actine dans les
filopodes
Active une kinase intermédiaire
PAK
Active la kinaseLIMK
Phosphoryle etINACTIVEla cofiline
Stabilisela polymérisation
de l’actine
RacSe lie INDIRECTEMENT
et active d’autres protéines de la famille WASP (WAVE)
Activation du complexeARP2/3
Nucléation et polymérisationde l’actine dans les
lamellipodes
Rho
A l’arrière de la cellule � Forces contractiles myosine-dépendantes pour la traction cellulaire
Active une kinase intermédiaire
ROCK
Phosphoryle etINACTIVE
Phosphatase de la MLC
Chaîne légèrede la myosine
PHOSPHORYLEE
Activation de lamyosine II et
force de contractile
II - LES MICROTUBULES1°) Structure, assemblage et dynamique des microtubules
� Structure
Ø 25 nm Microscopie électronique
– Longs cylindres creux de 25 nm de diamètre
– Polymérisation de sous-unités = dimères de tubulines α et β, (protéines globulaires)
– Chaque tubuline peut s’associer au GTP, mais seule la tubuline β peut hydrolyser/échanger son GTP
II - LES MICROTUBULES1°) Structure, assemblage et dynamique des microtubules
� Assemblage
(10 à 15)
(classiquement 13)
Extrémité +
Croissance rapide
Extrémité –
Croissance lente
Microtubulepolarisé
II - LES MICROTUBULES1°) Structure, assemblage et dynamique des microtubules
� Instabilité dynamique
Les MT sont caractérisés par une très grande instabilité dynamique
Alternance de cycle de croissance – décroissance � positionnementdynamique des organites cellulaires transportés par les MT
II - LES MICROTUBULES2°) Organisation intracellulaire des microtubules
In vivo, le centrosome est le centre organisateur des MT
L’extrémité – de tous les MT est enchassée dans le centrosome
Extrémité + : s’étend à la périphérie de la cellule
Centrosome = 2 centrioles perpendiculaires (9 triplets de MT STABLES)
II - LES MICROTUBULES2°) Organisation intracellulaire des microtubules
Duplication du centrosome dans les cellules en division
Formation des MT du fuseau mitotique
La protéine APC participe à la fixation des MT du fuseaumitotique sur les chromosomes
� Si APC muté : Anomalie de ségrégation des chromosomes
II - LES MICROTUBULES3°) Les protéines associées aux microtubules
Rôle structural d’organisation et de stabilisation du réseau des MT
II - LES MICROTUBULES3°) Les protéines associées aux microtubules
Transport antérograde -→ +
Transport rétrograde + → -
II - LES MICROTUBULES4°) Cibles d’agents anticancéreux
1. Agents DÉSTABILISATEURS des microtubules
� Vinblastine (Velban®), Vincristine (Onvovin®), Vinorelbine (Navelbine®)
vinca-alcaloïdes dérivés de Pervenche
se fixent sur les sous-unités de β-tubuline à l’extrémité +
bloquent la polymérisation des microtubules (interphase/mitose : poisons du fuseau)
2 classes de composés
Cellules contrôles Cellules traitées avec vinblastine
II - LES MICROTUBULES4°) Cibles d’agents anticancéreux
� Combretastatines : CA-4-Phosphate (Zybrestat®) = AGENT ANTI-VASCULAIRE
se fixent préférentiellement sur les dimères α/β-tubuline le long des microtubules
inhibent l’association latérale des protofilaments formant les microtubules
2 classes de composés
Cellules endothéliales contrôles Cellules traitées avec CA-4-P
1. Agents DÉSTABILISATEURS des microtubules
II - LES MICROTUBULES4°) Cibles d’agents anticancéreux
� Taxanes : Paclitaxel (Taxol®) et Docetaxel (Taxotere®)
se lient aux microtubules polymérisés sur la face interne du MT
stabilisent les MT en « redressant » la conformation de la β-tubuline liée au GDPinhibition de la dépolymérisation des MT (interphase/mitose avec blocage division cellulaire)
2 classes de composés
2. Agents STABILISATEURS des microtubules
Cellules contrôles Cellules traitées avec Taxol®
Paquets de MTstabilisés
II - LES MICROTUBULES4°) Cibles d’agents anticancéreux
� Epothilones : ixabepilone (Ixempra®)
se lient aux microtubules sur un site proche de celui des taxanes
stimulent la polymérisation de la tubuline en microtubule
2 classes de composés
2. Agents STABILISATEURS des microtubules
III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES
Assemblage de plusieurs tétramères bout à bout
Protofilament
8 protofilaments superenroulés
III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES
La spécificité tissulaire d’expression des FI est en anatomie-pathologie pour déterminer l’histogenèse des tumeurs (nature du tissu d’origine des cellules tumorales)
Desmosmes et hémidesmosomes
III - LES FILAMENTS INTERMEDIAIRES
Les filaments intermédiaires confèrent
aux cellules leur stabilité mécanique