Dr n.przyr. Ewa Chmara

CZYNNIKI GENETYCZNE WPŁYWAJĄCE NA DZIAŁANIE LEKÓW

Farmakogenetyka - kerunek badań koncentrujący się na:

- dziedzicznie uwarunkowanych różnicach w działaniu leku, a także ich przyczynach na

poziomie molekularnym;

- znaczeniu klinicznym zmienionego działania leku;

- testach umożliwiających identyfikację zagrożonych pacjentów przed rozpoczęciem leczenia

(terapia celowana);

- poszukiwaniu genów oporności;

- mutagennym działaniu leków i ksenobiotyków

„ Głównym celem farmakogenetyki jest zapewnienie pomocy w podawaniu i dawkowaniu

chorym takich leków, których stosowanie stwarza największe prawdopodobieństwo

odniesienia korzyści terapeutycznych i najmniejsze prawdopodobieństwo wystąpienia

reakcji niepożądanych”.

Farmakogenetyka wychodziła od nietypowej reakcji na lek, aby

przez badanie fenotypu dotrzeć do odpowiedzialnej za tę reakcję

mutacji genu.

Farmakogenomika jest próbą odwrócenia podejścia do problemu

odmienności osobniczych:

Wychodzi od odkrytych wielu różnic genetycznych, takich jak liczne SNP, aby

poprzez analizę DNA, RNA (transkryptomika) i powstającego białka (proteomika)

dotrzeć do osobniczych reakcji będących sumą tych wszystkich czynników.

Efekt farmakologiczny zależy od:

genetycznie uwarunkowanej aktywności enzymów metabolizujących leki (procesy I i II

fazy biotransformacji)

ekspresji genów kodujących białka biorące udział w mechanizmie działania leków

(receptory, kanały jonowe, transportery neuroprzekaźników)

ekspresji genów kodujących białka transporterów dla leków (gen ABCB1 kodujący

glikoproteinę P)

Procesy farmakokinetyczne determinowane genetycznie:

1. Wchłanianie

2. Dystrybucja

3. Metabolizm

4. Wydalanie

Molekularne mechanizmy polimorfizmu genetycznego mogą polegać na:

Mutacji pojedynczego nukleotydu SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Mutacjach dotyczących całego genu, jego fragmentu, zwielokrotnienia,

powtórzenia nukleotydu (haplotypy)

Bazy danych NCBI

NCBI (National Center for Biotechnology Information)

bazy danych są ze sobą powiązane poprzez unikalny system wyszukiwania i pobierania, zwany

Entrez: www.ncbi.nlm.nih.gov

BADANIE GENOTYPU Precyzyjna ocena, czy zaburzenie szybkości metabolizmu leków jest związane z defektem

genetycznym , czy też wynikiem oddziaływania dodatkowych czynników niegenetycznych takich

jak np.:

Związana z wiekiem niedojrzałość enzymatyczna wątroby, Wiek, płeć, masa ciała, Ciąża Infekcja, choroba, stres Leki towarzyszące (interakcje) Zmienność dobowa i sezonowa Dieta, suplementy diety Czynność układu sercowo naczyniowego Czynność układu immunologicznego Czynność wątroby, nerek, płuc Spożycie alkoholu, palenie tytoniu Zanieczyszczenia środowiska GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIA WCHŁANIANIA LEKÓW Przyczyna - zwiększona ekspresja genu ABCB1 dawniej nazywanego MDR1 (ang.:Multi Drug Resistance 1, gen oporności wielolekowej) odpowiedzialnego za wytwarzanie białka P glikoproteiny (20 odmian polimorficznych) Leki będące substratami podlegającymi transportowi przez P-gp:

- leki sercowo-naczyniowe (digoksyna, chinidyna, celiprolol, talinolol, werapamil) - leki przeciwnowotworowe (aktynomycyna D, doksorubicyna, daunorubicyna, etopozyd, irynotekan, paklitaksel, winblastyna) - leki immunosupresyjne (cyklosporyna A, takrolimus) - steroidy (aldosteron, hydrokortyzon, deksametazon) - opioidy (morfina, metadon) - leki przeciwgruźlicze (ryfampicyna) - leki różne (cefazolina, kolchicyna, atorwastatyna, erytromycyna, flufenazyna, lowastyna, perfenazyna, ondansetron, fenytoina, tamoksyfen, tiorydazyna, loperamid).

GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIA METABOLIZMU LEKÓW

Polimorfizm utleniania (cytochromu P-450) Polimorfizm acetylacji

Genotyp utleniania – Cytochrom P-450 (CYP-450)

Jest hemoproteiną obecną w mikrosomach komórek wątrobowych (także: nabłonek jelitowy i płuca)

Funkcja: CYP jest końcową oksydazą, która prowadzi do utleniania wielu leków (ok.

80%)

Liczba izoenzymów CYP-450 jest olbrzymia, a do klasycznych należą: CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP1A2, CYP3A4

The percentage of individual isoenzymes

Quantitative differences

Antidepresants

Antihypertensives

Anti-arrhytmics

Analgetics, opiates

Antidiabetics,

Beta-blocers…..

NSAIDs

Anti-epileptics,

Anticoagulants

EtOH, Antirheumatics….

Lovastatin, Simvastatin, Atovarstatin

Cyclosporine

HIV protease inhibitors,

Calcium channel blockers

Erythromycin, clarithromycin

SSRI, TCAs…..

TCAs, Theophylline, Estrogens

www.pharmacologyweekly.com

Farmakogenetyka leków przeciwbólowych

Statyny metabolizowane w układzie P-450: fluwastatyna, ceriwastatyna, atorwastatyna, lowastatyna, simwastatyna Statyny praktycznie niemetabolizowane w układzie P-450: pitawastatyna, prawastatyna, rosuwastatyna Polimorfizm utleniania / fenotypowe grupy:

EM (Extensive Metabolizers) - szybcy metabolizerzy (osoby dobrze, w znacznym stopniu utleniający)

PM (Poor Metabolizers) – osoby wolno, słabo utleniający

IM (Intermediate Metabolizers) – osoby o pośrednim metabolizmie

UM (Ultrarapid Metabolizers) – osoby ze zwielokrotnioną liczbą aktywnych

genów Ważniejsze induktory i inhibitory metabolizmu leków: Induktory: fenobarbital, fenytoina, karbamazepina, ryfampicyna, aminoglutetimid Inhibitory: amiodaron, allopurynol, cymetydyna, diltiazem, erytromycyna, disulfiram, enoksacyna, flukonazol, izoniazyd,ketokonazol, klarytromycyna, metronidazol, omeprazol, rytonawir, werapamil,

CYP2C9: Diklofenak Ibuprofen Ketoprofen Naproksen Meloksykam Piroksykam Indometacyna Celekoksyb Częstość w populacji: CYP2C9*2: 10,7 – 12.5% CYP2C9*3: 7,4 – 8,5%

CYP2D6 : kodeina Hydrokodon Oksykodon Metadon Tramadol

Częstość w populacji: PM: 5-10% UM: 2-3% EM: 80-90%

Polimorfizm reakcji II fazy biotransformacji N-acetylotransferaza (NAT1/2) S-transferaza glutationowa UDP-glukuronylotransferaza S-metylotransferaza tiopuryny NAT2 – enzym odpowiedzialny za acetylację leków i ksenobiotyków bedacych aryloaminami lub hydrazynami. Znanych jest ponad 100 odmiennych alleli: Allel NAT2*4 koduje szybką acetylację; Allele NAT2*5A, *5B, *5D, *6A, *7A, *7B, *14B są przyczyną wolnej acetylacji. W populacji kaukaskiej fenotyp „wolno acetylujący”: 40 - 60% ludzi Przykłady leków metabolizowanych przez N-acetylotransferazę NAT1 i NAT2 NAT1: kwas p-aminosalicylowy, kwas p-aminobenzoesowy, sulfametoksazol, sulfanilamid

NAT2: izoniazyd, sulfametazyna, hydralazyna, dapson, prokainamid, nitrazepam, kofeina, 2- aminofluoren

WYBRANE POLIMORFIZMY

1. Paracetamol / S- transferaza glutationowa Prawidłowy metabolizm paracetamolu: - utlenianie do bardzo toksycznej N-acetylo-p-benzochinoiminy (NAPQI) - koniugacja z glutationem.

Mutacja deaktywująca sprzęganie z glutationem ( GSTM1 i GSTT1)

Efekt mutacji : już małe dawki paracetamolu mogą prowadzić do objawów zatrucia !

dawka > 10-15 g: hipoglikemia, martwica wątroby, śpiączka, zgon dawka 6 g (dawka toksyczna): osoby z chorobami wątroby, alkoholicy

Odtrutka N-acetylocysteina (ACC) lub węgiel aktywny zalecenia Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego !!!!

2. Leki przeciwkrzepliwe

Klopidogrel

Polimorfizm genów:

1. ABCB1 związany z absorpcją (Glikoproteina P)

2. CYP3A5, CYP2C19 – związane z aktywacją proleku w aktywny metabolit w wątrobie

3. P2RY12, ITGB3 – związane z aktywnością receptorów płytkowych

Warfaryna i acenokumarol

Optymalizacja leczenia antagonistami witaminy K - rola polimorfizmów genowych (CYP2C9 i

VKORC1) )

Polimorfizm : CYP2C9

Polimorfizm genetyczny związany z różnym tempem metabolizmu Acenokumarolu i Warfaryny

a wysokością dawki terapeutycznej oraz występowaniem powikłań krwotocznych.

Allele: CYP2C9*2 ( 8-12% chorych) i CYP2C9*3 (3-8% chorych)

– warunkują wolniejszy metabolizm (większe ryzyko krwawień)

Mniejsza dawka jest skuteczna!

Polimorfizm: VKORC1

Polimorfizm podjednostki 1 reduktazy epoksydu witaminy K (VKORC1) istotnie wpływa na

skuteczność działania antykoagulantów doustnych, antagonistów witaminy K.

Allele:

VKORC1*2 mniejsza o ok. 50% ilość enzym

VKORC1*3 i *4 oporność na VKA

Polimorfizm genów CYP2C9 i VKORC1 łącznie odpowiadają za 50% zmienności

odpowiedzi farmakologicznej na warfarynę – stabilnej dawki antagonistów witaminy K

4. Genetycznie uwarunkowany polimorfizm dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej-

G6PD

Istnieje ponad 80 typów G6PD-najbardziej znane:

Afrykański (A) : niedobór – hemoliza powoduje zniszczenie tylko starszych krwinek 63-67

dniowych

Śródziemnomorski (B): niszczone wszystkie krwinki czerwone konieczność przetoczenia krwi

Konsekwencje: nie wolno przyjmować: leków o właściwościach utleniających, bobu (fawizm),

agrestu, czerwonej porzeczki !!!

5. Wrażliwość na sukcynylocholinę

Sukcynylocholina jest lekiem stosowanym pomocniczo w narkozach w celu zmniejszenia

napięcia mięśni szkieletowych. Działanie leku jest zazwyczaj krótkotrwałe (3-5 minut), ponieważ

sukcynyclocholina jest metabolizowana przez cholinoesterazę (ChE).

Nadwrażliwość na sukcynylocholinę jest uwarunkowana genetycznie. U ludzi z tą enzymopatią

prawidłowa dawka sukcynylocholiny może spowodować długotrwały bezdech, prowadzący

niekiedy nawet do śmierci. Reakcja taka spowodowana jest nieprawidłowym genem

cholinesterazy rzekomej. W populacji kaukaskiej u ok. 1 na 3000-3500 osób blokada nerwowo-

mięśniowa po tym leku przedłuża się nawet do 3 - 4 godzin, co z powodu całkowitego porażenia

mięśni oddechowych i bezdechu, stwarza niebezpieczeństwo dla życia ( wystarcza 1/60 zwykłej

dawki leku)!

6. Genetycznie uwarunkowana predyspozycja do hipertermii a stosowanie środków

znieczulenia ogólnego i zwiotczającego

U osób z dziedziczną predyspozycją do złośliwej hipertermii (Malignant Hyperthermia – MH)

gwałtownie wzrasta ciepłota ciała (do 43-44°C), wzrasta napięcie mięśni, pojawia się

przyspieszenie akcji serca, duszność, sinica, rozwija się kwasica metaboliczna i oddechowa,

wzrasta stężenie potasu, zmniejsza się stężenie wapnia we krwi, rozwija rabdomioliza.

U osób będących nosicielami zmutowanego genu RYDR – kodującego wytwarzanie receptora

rianodynowego (Rianodine Receptor - RYDR), kontrolującego kanał wapniowy, zachodzi

niekontrolowany napływ jonów Ca do komórki.

Aktywne usuwanie z komórki jonów Ca przez dążący do homeostazy organizm powoduje

wytwarzanie dużej ilości ciepła.

Częstość występowania hipertermii: 1 / 5000 znieczuleń

Do najsilniejszych aktywatorów należą:

Anestetyki dożylne: ketamina

Anestetyki wziewne: halotan, izofluran, eter dwuetylowy, metoksyfluran

Środki zwiotczajace: suksametonium, deksametonium, galamina

Leki sympatykomimetyczne

Leki nasercowe: glikozydy naparstnicy, wapń

7. Genetycznie uwarunkowany polimorfizm glukuronylotransferazy (UGT1A1)

Substratem UGT1A1 jest Irynotekan.

U słabych metabolizerów (PM) - nosicieli allela UGT1*28 po podaniu leku

przeciwnowotworowego - irynotekanu aktywny metabolit (SN-38) ulega kumulacji, czego

następstwem może być ciężka toksyczność ( biegunka, neutropenia, małopłytkowość).

8. Herceptin (Trastuzumab) - stosowany w leczeniu raka piersi i beta-komórkowego

chłoniaka nieziarniczego.

Jest monoklonalnym przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko receptorowi HER2,

którego białko jest kodowane przez gen ERBB2. Nadekspresja tego receptora obserwowana jest

w 25-30 % przypadków raka piersi i jest skorelowana ze złośliwością nowotworu i zwiększonym

prawdopodobieństwem nawrotu choroby i śmierci.

Trastuzumab wiąże się specyficznie z receptorem, który uległ nadekspresji, wskazując tym

samym komórki rakowe do zniszczenia przez system immunologiczny – specyficznie działający

lek dla nowotworów z nadekspresją HER2/ERBB2

Możliwość skutecznej, celowanej terapii, powstanie nowej grupy leków, takich jak: cetuksymab,

lapatynib i pertuzumab

9. Analiza genu KRAS - analiza 12 i 13 kodonu sekwencji genu (miejsca najczęstszych

mutacji). jakościowo, sekwencjonowanie automatyczne.

Gen KRAS koduje białko, które jest jednym z najczęściej aktywowanych onkoprotein w rakach

trzustki, tarczycy, jelita grubego, płuc oraz białaczkach szpikowych u ludzi.

Forma genu decyduje o powodzeniu terapii celowanej w leczeniu raka jelita

grubego (Panitumumabem, Cetuximabem itd.), opartej na hamowaniu namnażania komórek

poprzez inhibitory receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), epidermal growth

factor receptor)

Określenie statusu genu KRAS jest konieczne przed przystąpieniem do tej terapii,

ponieważ w przypadku występowania mutacji dowiedziono jej nieskuteczność.

Występowanie zmutowanego genu KRAS stwierdza się u ok.45-50% chorych na raka

jelita grubego !!!!

10. Efektywności Albuterolu w leczeniu astmy

Albuterol (salbutamol): agonista receptora -2 adrenergicznego (ADRB2); łagodzi objawy astmy

Badania wykazały związek pomiędzy polimorfizmem w rejonie kodującym genu ADRB2

(warianty alleliczne Arg-16 lub Gly-16) a odpowiedzią na lek.

Pacjenci homozygotyczni (dwa allele Arg-16) wykazywali pięciokrotnie silniejszą odpowiedź na

leczenie niż homozygoty Gly-16.

U pacjentów heterozygotycznych (Arg-16/Gly-16) odpowiedź na lek była 2.3 razy wyższa w

porównaniu do homozygot Gly-16.

11. Nadwrażliwość na Abacavir

Abacavir – inhibitor transkryptazy, stosowany w terapii AIDS

4.3 % pacjentów leczonych abacavirem – nadwrażliwość: gorączka, wysypka, biegunka, w

ostateczności śmierć. Objawy nadwrażliwości cofały się po zaprzestaniu terapii

Badania genetyczne: rejon HLA: allel HLA-B*5701 jest znacząco skorelowany z

nadwrażliwością. Testy genetyczne mogą okazać się skuteczną metodą uniknięcia przypadków

nadwrażliwości na abacavir .

12. Farmakogenetyka nowotworów

Imatinib (Gleevec): lek stosowany w terapii przewlekłej białczki szpikowej(CML)

Działanie: Wiąże i inaktywuje białko BCR-ABL – kinazę tyrozynową aktywującą proliferację

leukocytów (przyczyna CML).

Problem: mutacje BCR-ABL mogą prowadzić do oporności na imatinib (inhibicja wiązania leku)

Badania farmakogenetyczne: zidentyfikowano kilka somatycznych mutacji w BCR-ABL, z czego

6 stanowi 60-70 % wszystkich obserwowanych mutacji

Wskazania do określenia genotypu metabolizmu leku

1. Leki stosowane w formie proleku lub których metabolit ma istotne znaczenie

farmakologiczne/terapeutyczne: enkainid, proguanil, kodeina;

2. Leki o małej wartości indeksu terapeutycznego lub o dużej farmakokinetycznej zmienności

(czyli takie, dla których jedyna lub główna droga metabolizmu jest katalizowana

przez polimorficzny enzym), wykazujące znaczne/ niebezpieczne efekty uboczne

3. Leki mające możliwość alternatywnego metabolizmu, prowadzącego do powstania związku

toksycznego, np.fenacetyna.

Korzyści wynikające z wykonania testu genotypowania

1. Możliwość szybkiego podjecie decyzji dotyczącej dawki leku, a zatem zwiększenie jego

skuteczności i tolerancji;

2. Osoby „słabo metabolizujące": uniknięcie odstawienia leku z powodu braku jego tolerancji

3. Osoby „ultraszybko metabolizujące": uniknięcie odstawienia prawidłowo wybranego leku

wskutek braku efektu terapeutycznego spowodowanego zbyt małym jego stężeniem w krwi, a

w przypadku monitorowania stężenia leku w osoczu uniknięcie niesłusznego

posądzenia pacjenta o niestosowanie się do zaleceń lekarza (noncompliance);

4. Genotypowanie może w dużym stopniu zastąpić monitorowanie stężenia leku w klinice, co

ma szczególne znaczenie w przypadku pacjentów nie reagujących na lek, nie tolerujących

leku oraz osób starszych ze współistniejącymi schorzeniami układu krążenia, wątroby, nerek;

5. Wykonanie jednego z powyższych testów umożliwia (ułatwia) prawidłowe wprowadzenie

nowego leku do terapii przez zastosowanie bezpiecznej dawki;

6. Ponieważ test taki wystarczy wykonać raz w życiu, czas i koszty są usprawiedliwione,

zwłaszcza w przypadku leczenia długotrwałego lekami nasercowymi lub psychotropowymi.

Zalecenia FDA

Markery farmakogenetyczne – przeprowadzane przed podaniem leków (ponad 150 markerów

farmakogenetycznych na liście FDA)

Farmakogenetyka w grupach etnicznych - zróżnicowanie międzypopulacyjne wpływa również

na działanie niektórych leków

Genotypowanie - etapy

1. Izolacja DNA z materiału biologicznego i kontrola jakości :

Metoda chloroformowo-fenolowa

Metoda wysalania

Adsorpcja na kolumnach z krzemionką i solami chaotropowymi

Z zastosowaniem cząstek magnetycznych (Fe3 O4 z krzemionką)

2. Amplifikacja fragmentu DNA (PCR) – specyficzność procesu.

3. Rozdział elektroforetyczny (na żelach agarozowych i poliakryloamidowych)

4. Wizualizacja (bromek etydyny z dwuniciowym DNA wykazuje zdolność do

fluorescencji w świetle UV )

6. Obliczenia częstości występowania alleli.

Metody analityczne - podstawowe techniki biologii molekularnej

PCR / RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction - Łańcuchowa Reakcja

Polimerazy / ang. Restriction Fragment Length Polymorphism-

analiza fragmentów DNA po cięciu enzymami restrykcyjnymi);

RT/PCR (ang.ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction),

Czyli kombinowana metoda z udziałem enzymu odwrotnej transkryptazy w

połączeniu z techniką PCR;

Real Time PCR daje możliwość detekcji przyrostu ilości produktu PCR w

czasie rzeczywistym;

Mikromacierze (ang.DNA microarrays), chipy DNA - badanie profilu

molekularnego komórek i tkanek przez równoczesną hybrydyzację izolowanego z

nich RNA do wielu tysięcy sond oligonukleotydowych – możliwość badania

całego genomu podczas jednej analizy!

Sekwencjonowanie; Pirosekwencjonowanie; Sekwencjonowanie nowej generacji

TORRENT.

Epigenetyka

Pojęcie: „ekspozom” - idea, że środowisko, w którym żyją geny ma większe znaczenie od

samych genów.

Opinie – ponad 70% chorób ma związek z ekspozycją na czynniki środowiskowe.

Zestaw czynników , które decydują o zdrowiu i chorobach:

toksyny, jedzenie, mikroby, wewnętrzne substancje chemiczne, w tym

wszystkie aktywne biologicznie cząsteczki kontrolujące stany zapalne, stres

oksydacyjny, mikroflora jelitowa i inne naturalne procesy.

Epigenomika, nutrigenomika, mikrobiomika, toksygenomika…..i inne omiki !!!!