d) Vznik gamete) Mutace ve vývoji gametofytuf) Opylení, oplodnění

1MBR1

2016 4) Reprodukce rostlin

Životní cyklus rostlinyd) Vznik gamet

Mikrosporogeneze

Megasporogeneze

2

Mikrosporogeneze = tvorba samčího gametofytu = pylových zrn

Sporofytická buňka

Tapetální iniciační buňka

Sporogenní iniciační buňka (pylová mateřská)

Tetráda haploidníchbuněk

4 volné mikrospory

Vegetativní buňka Generativní buňka

2 spermatické buňky

TapetumMeióza (2x)

Mitóza

Mitóza

3

Kaláza = 1,3-ß-D-glukanáza

Kalóza = 1,3-ß-glukan

Tapetální buňky produkují kalázu, polymery a pigmenty

Vývoj samčího gametofytu - mikrosporogeneze

Komunikace mezi vegetativní buňkou a generativní buňkou:ABA-hypersensitive germination3(AHG3) - kóduje protein fosfatázu – přepisována ve veget. buňce ale překládána v generativní buňce.

Update 2015

Samčí pohlavní buňka - pylové zrno

Exina = sporopolenin = polymer fenolů;extrémně rezistentní k chemickým látkám; geny, které utváření exiny kódují, jsou málo známy

Fosilní nálezy pylových zrn

Vývojová biologie

Pylové protoplasty

4

Fellner M (1995) Plant Cell, Tissue and OrganCulture 42: 157-162.

Pestré uspořádání exinypylových zrn

Praktické využití(např. kriminalistika)

5

Vývoj samičího gametofytu - megasporogeneze

Nezralé vajíčko Megaspora Embryonální vak: 7 buněk

3 antipodální (AC)2 synergické (SC)1 centrální (CC)1 vaječná (EC)

6

Meióza (2x) Mitóza (3x)

PN – 2 polární jádra

SEN – jádro sek. endospermu

Je problematické najít geny specificky exprimované v samičím gametofytu: problematické izolovat vajíčko od sporofytického pletiva => obtížné izolovat mRNA a vytvořit cDNA knihovny

Orchidej - experimentální rostlina pro studium genů specificky exprimovaných ve vajíčku

- synchronizovaný vývoj vajíček- vajíčko se vyvíjí dlouhou dobu (11 týdnů) => možnost izolovat vajíčka v různých stádiích

vývoje => mRNA v různých etapách vývoje => možnost determinovat expresi během vývoje

Nadeau JA et al. (1996) Plant Cell 8: 213-239

7

e) Mutace ve vývoji gametofytu

Analýza sterilních mutantů Identifikace genů

8

Pylově sterilní mutanti s defektem ve vývoji pylu - většinou recesivní, homozygotní

- defekt ve vývoji tapetálních buněk- defekt v meióze, netvoří pyl

- deformace prašníků – pyl se neuvolňuje, nebo pozdě- defekt v pylovém otvoru – pyl nemůže klíčit

- defekt ve vývoji sporofytu – pyl nemůže klíčit

Sterilní mutanti s defektem ve vývoji vajíčka

- defekt ve vývoji sporofytu

- defekt ve vývoji embryonálního vaku a vajíčka – ovlivněno oplodnění

- defekt ve vývoji megaspory - ovlivněn vývoj vajíčka a ovlivněno oplodnění

60 –90% genů exprimovaných v gametofytu je exprimováno i ve sporofytu

Sekvenování Arabidopsis genomu (2000)

26 tisích genů 350 genů exprimovaných specificky v prašnících

Specifické pro pyl Nespecifické pro pyl

9

Mutace ve vývoji samčího gametofytu

10

WT tdf1 Trangen TDF1

TDF1(DEFECTIVE IN TAPETAL DEVELOPMENT AND FUNCTION 1)– transkripční faktor MYB; klíčový v regulaci vývoje tapeta

DYT1(DYSFUNCTIONAL TAPETUM 1) – protein DYT1 se váže přímo na promotorovou oblast genu TDF1

DYT1

TDF1

TDF1

Promotor

Exprese genů tvorby pylové stěny (exiny)(např. AMS, MS1, TEK, MS188)

- DYT1 je lokalizován v cytoplazmě i jádře

- C-terminální doména BIF je nezbytná pro dimerizaci, nukleární lokalizaci a schopnost aktivovat transkripci

- Prostorově časová subcelulární lokalizace DYT1 je důležitá pro samotnou funkci DYT1

11

quartet (qrt) – tetrády se nerozdělují a uvolňují se celé z prašníku

QRT – kóduje enzym s pektin metylesterázovou aktivitou (PME); exprimovánv prašníkových pletivech před koncem meiózy

FKP1 (FLAKY POLLEN 1) – kóduje 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A syntázu = enzym mevalonátové (MVA) dráhy zapojený v biosyntéze sterolů

fkp1 – pylová zrna bez povrchové vrstvy

MVA důležitý pro vývoj organel tapetálních buněk => pylová zrna fkp1 nemají povrchovou vrstvu, která vzniká z rozpadlých tapetálních buněk

T-DNA mutant cals5 – narušená fertilita, degenerované mikrospory

12

CALS5 kóduje kalóza-syntázu syntéza kalózy exina

WT cals5-3 cals5-4 cals5-5

Knockout mutant CYP703A2 (cytochrom P450)CYP703A2 – katalyzuje hydroxylaci kys. laurové

Sporopolenin – bloky hydroxylované kyseliny laurové

WT

CYP703A2

13MGP1 (MALE GAMETOPHYTE DEFECTIVE 1) – kóduje Fad podjednotku

mitochondriální F1F0-ATP syntázy u Arabidopsis.

mgp1 mutant – destrukce mitochondrií v pylových zrnech a k zániku pylových zrn

MS1 (MALE STERILITY1) – transkripční faktor regulující tvorbu exiny, pyl. cytosolu a tapeta

MS2 (MALE STERILE2) – kóduje reduktázu mastných kyselin nutnou pro tvorbu exiny

14

Guan Z-F et al. (2008) Plant Physiol 147: 852 - 863

WT rpg1

RPG1 (RUPTURE POLLEN GRAIN1) – membránový protein nezbytný pro tvorbu exiny

TIR1, AFB1 – AFB3 – auxinové receptory; mutanti vytváří krátké tyčinky prašníku a předčasné zrání pylu

MGT4, MGT5, MGT9 (MAGNESIUM TRANSPORTER 4, 5, 9) – nezbytné pro vývoj pylu Arabidopsis

MGT4 – lokalizován v ER, exprimován v pylových zrnech ve dvoubuněčném stádiu až do zralého pylového zrna

mgt4-1 – nevyvinutá pylová zrna, rostliny sterilní

15

Mutace ve vývoji samičího gametofytu

Mutace zapojené v meiotickém a mitotickém buněčném cyklu – samičí gametofyt

23 genů

14 nespecifických ( ) +

9 specifických ( ) (funkce známa)

Arabidopsis mutant fem2 – zastaven vývoj vajíčka před megagametogenezí

Arabidopsis mutant gfa – nedochází k fúzi jader centrální buňky

fem2 gfa

16Specifické geny

Arabidopsis mutant gcd1 – narušené zrání vaječné buňky

Mitochondriální protein GCD1 je nezbytný pro konečné zrání samičích gamet.

17Pagnussat GC et al. (2009) Science 324: 1684-1689

Distribuce auxinů v embryonálním vaku je polarizovaná - tvoří se gradient koncentrace auxinů. Na základě tohoto gradientu auxin určuje identitu buněk:

Vysoká koncentrace auxinu

Nízká koncentrace auxinu

Synergické buňky a vaječná buňka

Antipodální buňky

Cytoplazmatická samčí sterilita (CMS) = pylová sterilita přenášená pouze samičími orgány

Odpovědné geny jsou většinou součástí chloroplastového či mitochondriálníhogenomu.

Ve všech známých případech je CMS je způsobena expresí abnormálních proteinů v mitochondriích prašníků.

Mechanismus, jakým abnormální proteiny ovlivňují mitochondrie, není znám.

Mitochondrie v prašníku mají vliv na vývoj pylu.

Pokud je exprese abnormálního proteinu redukována, fertilita je obnovena.

Ve všech CMS systémech existují jaderné geny, které potlačují expresi (tvorbu)abnormálních proteinů v prašníku.

18

CMS-T systém u kukuřice – abnormální mitochondriální protein URF13

Obnovení fertility vyžaduje 2 jaderné geny: Rf1 a Rf2

Aldehyd dehydrogenáza

Aldehyd?

19

Klíčení pylu

Pro klíčení vyžaduje vysušené pylové zrno vlhkost

2) Rostliny se suchou bliznou – vlhkost je zajištěna lipidy na povrchu pylového zrna. Lipidy hrají významnou roli v klíčení pylu.

Arabidopsis mutant cer – má defektní lipidovou vrstvu – klíčí pouze za extrémní vlhkosti

1) Rostliny s vlhkou bliznou – pylové zrno bere vlhkost z blizny

Arabidopsis mutant fiddlehead – má odlišné lipidy (vysokomolekulární) v epidermálních buňkách listů. Pylová zrna WT na těchto listech klíčí !!!

Flavonoidy na povrchu pylového zrna hrají roli v klíčení pylu. Rostliny kukuřices mutací v genu, kódujícím enzym biosyntézy flavonoidů, jsou self-sterilní.

20

Mechanismus klíčení pylu – není dosud přesně znám

Ca2+ gradient – pozorován při růstu pylové láčky

21

Není známo, jak je Ca2+ signál přeložen do finální reakce prodlužování pylové láčky.

22

cngc18 – nulový mutant s pylovou sterilitou

CNGC18 – kóduje kationtový kanál regulovaný cyklickými nukleotidy

GFP:CNGC18 analýza cngc18: komplementovaný GFP:CNGC18

Frietsch S et al. (2007) PNAS 104: 14531 - 14536

23

Update 2016Di Giorgio JAP et al. (2016) Plant Cell 28: 1063 – 1077

NIP4;1, NIP4;2 – nezbytné pro vývoj pylu a opylení; mutanti - nízký počet semen, redukované klíčení pylu, redukovaný růst pylové láčky; NIP4;1 – velice nízká exprese ve zralém pylu, NIP4;2 – nejvyšší exprese během růstu pylové láčky

C-terminální domény NIP4;1, NIP4;2 – fosforylovány pylově specifickými CPK (Ca2+- dependentní protein kinázy) => modifikace permeability pro H2O

NIP4;1 – transportuje rovněž amoniak, močovinu, H3BO3, H2O2

TIP1;3, TIP1;5 – jsou nejrozšířenější vysoce exprimované geny ve zralých pylových zrnechTIP1;3 – exprimován ve vezikulech a vakuolách vegetativní buňkyTIP5;1 – exprimován ve vakuolách spermatických buněk

Exprese TIP1;3-GFP ve zrajícím pylovém zrně (jádra obarvena modře)Tetráda Mikrospora 2-buněčný pyl 3-buněčný pyl

Exprese TIP1;3-GFP v klíčícím pylovém zrně; exprese v tonoplastu vegetativní buňky a vakuolárních hlavičkách pylové láčkyTonoplast

Vakuolární hlavičky

Mutanti tip1;3 a tip1;5 ukazují krátké pylové láčky pouze v podmínkách při nedostatku dusíku

TIP1;3 a TIP1;5 jsou zapojeny v metabolické dráze N během klíčení pylu

Klíčení se dá indukovat in vitro na médiu obsahujícím cukr, kys. boritou, Ca2+

Klíčení in vivo je vždy rychlejší Další faktory (?) pocházející z blizny, hrající roli v klíčení pylu

24

Další faktory ovlivňující klíčení pylové láčky – rostlinné hormony

25

Gibereliny – stimulují prodlužovací růst

GA deficientní mutantiMutanti s defektem v GA signaling trpasličí vzrůst, defekt ve vývoji prašníků a pylu

Overexprese enzymu deaktivující GA Inhibice růstu pylové láčky

WT

bri1

Brasinosteroidy – stimulují prodlužovací růst

Mutant cpd – CPD kóduje cytochrom P450 (biosyntéza BRs)

Mutant bri1 – BRI1 kóduje receptor BRs

Zastaveno prodlužování pylové láčky

BRs a BRs signaling nutné pro růst pylové láčky

Clouse et al. (1996) Plant Physiol 111: 671-678

f) Opylení, oplodnění

CC

PN

EC

SC

Obě spermatické buňky vnikají do jedné ze synergických buněk (SC). Dochází k dvojímu oplodnění:

1. Oplodnění:1. spermatická buňka oplodní haploidní vaječnou buňku (EC) => diploidní zygota

2. Oplodnění:2. spermatická buňka oplodní diploidní centrální buňku (CC) = spojí se s jádry (PN) => triploidní endosperm

26

CC

PN

EC

SC

27

Beale KM, Johnson MA (2013) Current Opinion in Plant Biology 16: 1-8

Peptidy sekretované synergickou buňkou:Kukuřice: EGG APPARATUS1 (ZmEA1) Torénie: LURE1/LURE2 Arabidopsis: AtLURE1

1) Co nutí a směřuje pylovou láčku k embryonálnímu vaku?

Update 2016Pereira AM et al. (2016) Molecular Plant 9: 601 – 614

Mutant jagger – synergidy nedegenerují, neustálá produkce LURE => polytubey

JAGGER – kóduje arabinogalactan protein AGP4 (typ glykoproteinu); pravděpodobně vychytává Ca2+; oscilace hladiny Ca2+ je důležitá právě pro proniknutí pylové láčky, uvolnění spermatických buněk a oplodnění.

28

Liu J et al. (2013) Current Biology 23: 1-6

LIP1 a LIP2 (Lost In Pollen tube guidance 1 a 2) – kódují cytoplazmatickou receptor-likekinázu; ukotvená k neznámému transmembránovému proteinu – receptoru. Neznámýreceptor přijímá peptidy LURE a EA1.

Vypnutí LIP1 a LIP2 vede ke ztrátě orientace růstu pylové láčky.

29

Update 2016Takeuchi M, Higashiayma T (2016) Nature 531: 245 – 248 Wang T et al. (2016) Nature 531: 241 – 244

Identifikován receptor atraktantů LURE1 a 2

Wang T et al. Takeuchi M, Higashiayma T

1) Dimer proteinů RLK MIK1 a MDIS1; vazba LURE1 vede ke vzniku dimeru a k autofosforylaci MIK1 a přenosu P z MIK1 na MDIS1

2) RLK PRK6 interaguje s druhým PRK6 nebo s PRK3, s quanin-exchange faktorem (GEFs), který aktivuje RhoGTPase protein from plants (ROPs).Vazba LURE na tyto transmembránové receptory => nasměrování růstu a vniknutí pylové láčky do synergidy

2) Co způsobuje přijetí pylové láčky, její prasknutí a uvolnění spermatických buněk?

30

Mutant feronia – pylová láčka vniká do synergické buňky, ale nepraská a neuvolňuje spermatické buňky

Synergické buňky exprimují protein FERONIA (FER, receptor-like kináza)

Neznámý ligand + receptor FERONIA Zastavení růstu pylové láčky, uvolnění spermatických buněk

31Struktura a funkce FERONIA

SS – signální peptid; ECD – extracelulární doména; TM – transmembranová doména

MALA, MALB – tandemové malectin-like domény; exJM – extracelulární juxtamembranová oblast

FERONIA – kontroluje růst a samičí fertilitu, zprostředkuje patogenem indukované reakce, nutný pro normální vývoj buněčné stěny.

RALF = Rapid ALkalinization Factor = malý peptidový růstový regulátor, inhibuje růst hypokotylu a kořene; jediný známý ligand receptoru FERONIA

THESEUS1 – příbuzný k FERONIA – funguje jako odhadce stavu buněčné stěny

ANXUR1 a 2 – homology FERONIA – zajišťují integritu pylové láčky a samčí sterilitu

Interakce pylové láčky a synergických buněk vede k programové smrti (PCD) pylové láčky a jedné ze synergid. Synergidy kontrolují tento proces - koordinují hladiny Ca2+ synergid v reakci na dynamiku Ca2+ v pylové láčce a růstové chování láčky.

FERONIA je vyžadován k iniciaci a modulaci reakcí k Ca2+ a jejich spojení s PCD.

32

Mutant lorelei - defekt v uvolnění spermatických buněk

LORELEI (LRE) - exprimován v synergických buňkách

Pylová láčka mutanta po dosažení embryonálního vaku nepraská, ale pokračuje v růstuuvnitř embryonálního vaku směrem k centrální buňce (CC). Tam se ale otočí a směřujezpátky k mikropyle.

LORELEI je glucosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein – umožňujesamičímu gametofytu rozpoznat vniknutí kompatibilní pylové láčky a umožňujeuvolnění spermatických buněk.

cc – central cell

my – micropylární konec

ch – chalaziální konec

MBR

33

Protein LORELEI (LRE) je exprimován v tzv. filiform aparátu – membránová struktura, která je prvním místem styku pylové láčky se samičím gametofytem.

Update 2016Liu X et al. (2016) Plant Cell 28: 135 – 1052

Ve filiform aparátu je rovněž exprimován receptor FERONIA; proteiny LORELEI a FERONIA spolupracují; LORELEI indukuje expresi FERONIA.

34

Beale KM, Johnson MA (2013) Current Opinion in Plant Biology 16: 1-8

Přiblížení pylové láčky k vaječné buňce

, exprese proteinů FER, LRE a NTE Ca2+

Prasknutí pylové láčky, uvolnění spermatických buněk

35

Funkce ANX1 a ANX2? : kontrola prasknutí pylové; specificky exprimované v pylové láčce

anx1anx2 – pylová láčka praská ještě předtím, než dosáhne samičího gametofytu

Geny ANXUR1 a ANXUR2 – homology genu FERONIA

Pylová láčka dosahuje samičího gametofytu

Aktivace dráhy FERONIA

Deaktivace ANX1/ANX2

Prasknutí pylové láčky, uvolnění spermatických buněk.

MBR

Kessler SA, Grossniklaus (2011) Current Opinion in Plant Biology 14: 622-627

363) Co způsobuje fúzi gamet a zablokování pronikání další pylové láčky?

Beale KM, Johnson MA (2013) Current Opinion in Plant Biology 16: 1-8

Mechanizmus fúze gamet není znám. Signál z EC1 vede k relokalizaci HAP2 k membráně – zapojení neznámých proteinů ve fúzi gamet.

Dva navržené mechanizmy zablokování dalšího oplodnění: 1) Přerušení tvorby atraktantů sekretovaných synergickou buňkou

2) Uvolnění odpuzovačů sekretovaných vaječnou buňkou