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Da Genômica ao MelhoramentoLuis E. Aranha Camargo
Dept. Entomologia, Fitopatologia e Zoologia AgrícolaESALQ/USPPiracicaba
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Genômica
Ciência que analisa estrutura, composição e
funcionalidade de genomas
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Sequenciamento
Análise estrutural
Análise comparativa
Análise funcional (várias abordagens: SAGE, microarranjos, RT-PCR, análise in silico, etc)
Objetivo:Identificar genes e suas funções
Grande volume de informação
Genômica
Mineraçãoou garimpagem
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gene fenótipogenética vegetal
variação genética variação fenotípicamelhoramento vegetal
O melhorista objetiva relacionar variantes de um gene (alelos)com variaçõesem fenótipos de modo a identificar os melhores alelos
ESTsseqüências genômicas SAGE
proteômica análise de mutantes
bioinformática
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FENÓTIPO
melhoristas usam uma variedade de estratégias para separar os efeitos
da variância genética da ambiental...
F = G + A
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-se baseia na análise de médias e variâncias para selecionar melhoresgenótipos
-pouco se sabe sobre os genes que controlam a característica
-seleção baseada no somatório dos efeitos dos genes que controlam a característica
idéia é associar variações alélicas em certos genes candidatos com variações em fenótipos
idéia tornou-se palpável a partir do desenvolvimento da Genômica
mas o que são genes candidatos?
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Efeito menor em maisina eresistência
Resistência a lagarta da espiga (McMullen et al., PNAS 95, 1998)
Efeito maior em maisinae resistência
Outros locos,efeito na
resistênciamas não em
maisina
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Projetos ESTs são fontes de genes cadidadtos
TIGR Soybean Gene Index (GmGI)
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PALperoxidades Lipoxigenase
Necessidade de conhecimento de vias metabólicas
Genes RPr proteínas
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variedade resistente0% doença
variedade suscetível60% doença
pal atccctcatttggGatctaggtg atccctcatttggTatctaggtglox cggtacacgtttaccagggtcA cggtacacgtttaccagggtcGpr-1 ggcttgacatgcaaatcagga ggcttgacatgcaaatcaggaetc...
Associação de alelos com fenótipos (análise de ligação) – cruzamentos experimentais
Progênie de linhagens recombinantes é classificada de acordo com genótipos esperados no gene pal
genótiposparentais
em gene candidatos
genes candidatos
atccctcatttggGatctaggtg atccctcatttggTatctaggtg
Doença 17% 37%
Presença do alelo G a no locus pal está associada com uma reduçaõ de 54% na quantidade de doença
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ProblemaProblema: a lista de genes candidatos ainda é pequena
pois a maioria das vias metabólicas que controlam características de importância agronômica é incompleta
e aqui é onde a Genômica Funcional entra…e aqui é onde a Genômica Funcional entra…para completar esta vias metabólicas por meio de uma série de
técnicas (genética reversa e direta, análise de expressão gênica via microarranjos, SAGE, e de bancos
de EST, etc.)
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SAGE(aguardem…)
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Hibridização in silico:auxílio na seleção de
marcadores candidatos
Comparações entre bibliotecas de ESTs geradas sob condições distintas podem servir
de base para identificar marcadores candidatos
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inoculação Expressão de genes de resistência
Produtos dos genes estarãoPresentes na amostra de RNAm
Comparar com biblioteca feita de RNAm de planta não inoculada
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27.1
20.4
11.9
9.9
6.8
6.1
5.9
3.0
2.7
2.7
1.6
0.9
0.8
0.3
19.9
19.6
10.9
11.7
8.6
7.2
9.0
2.7
2.4
3.9
1.4
1.1
1.4
0.1
0 5 10 15 20 25 30
Photosynthesis
Conserved of unknown function
General metabolism
Macromolecule metabolism
Low hit (E>10e-5)
Cellular process
No hit
Non-classified
Abiotic stress
Biotic stress
Signal transduction
Disease resistance related domains
Ubiquitination pathway
Retrotransposons
% of Bean ESTs
PVEPSE3
PVEPLE1+ PVEPSE2
Comparação entre bibliotecas ESTs de feijoeiro geradas de plantas inoculadas ou não com Colletotrichum
inoculada
não inoc.
Genes candidatos para cruzamentosexperimentais
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Expressão diferencial com Auxílio de arranjos
Hibridização em microarranjos(microarrays)
Permite estudar a expressão de vários genes de uma só vez
Genes são dispostos em lâminas ou “chips”
(Sanghyeob et al., 2004)(Gibly et al., 2004)
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………………………………………………………………………………………………
Microchipcontendo
genes
RNAm de planta inoculada
RNAm de planta não inoculada
Expressão gênica diferencial
Síntese de cDNA e marcação commarcadores fluorescentes
cDNA
cDNA
hibridização
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Genes somente expressos em plantas inoculadas
Gene somente expresso em plantas não inoculadas
Expressão em ambas situações
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Análise de expressão gênica de indivíduos fenotipicamente distintos - descoberta de genes candidatos
e.g.- análise da expressão gênica de fenótipos extremos de uma população segregante
Schadt et al., Nature 2003, 422:297-302
Perfil de expressãoDiferenças em expressão gênica devem
Ser específicas ao fenótipo eGenótipo que separam os grupos
Genes candidatos
RNAmRNAm
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EST
Vias metabólicas
SAGE
Análise in silico
SN
Ps
GENÔMICA
MELHORAMENTO
para análise de ligação em cruzamentos experimentais
Microarranjos
Sequenciamento genômico