Kandaki bakteriyel ve fungal DNA’ nın doğrudan tespiti için, multiplex real-time PCR testi kullanan temel klinik bir çalışma

Danışman:Prof.Dr.Mahmut Baykan

Hazırlayan:Arş.Gör.Dr.Özlem Ögüç Şanlı

• Sepsis; birçok sistemi tutan, hemodinamik değişikliklere yol açan; şok, organ fonksiyon bozukluğu ve organ yetmezliğine kadar gidebilen ölümcül bir infeksiyon hastalığıdır

• Bakteremi; canlı bakterilerin dolaşımda bulunmasıdır, tanısı kültür pozitifliği ile konur

• Bakteremi ve fungeminin hızlı tespiti bakteriyoloji laboratuvarının en önemli görevlerinden birisidir

• Mikrobiyolojik raporlandırma , tedavi yeterliliğine ek olarak sepsis anındaki tedavi stratejisinin başarısı için de hayati öneme sahiptir

• Mikrobiyal raporlama mortalite ve morbidite üzerinde büyük bir etkiye sahiptir

• Örneğin, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus kaynaklı infeksiyonlar için sepsisin hızlı ve somut tedavisi önerilmektedir

• Geleneksel kan kültürü (KK) den elde edilen sonuçlar, şüpheli infeksiyonun başlangıcından itibaren 24-72 saat içerisinde genellikle tespit edilemezler, bu durum ampirik tedavinin başlanmasını gerektirir

• Sepsis şüphesinin ilk 24 saati süresince, antibiyotik tedavisinin vakaların %10-60’ ında uygun olmadığı bildirilmektedir(yani ,seçilmiş antibiyotiklere dirençli bir veya daha fazla sayıda patojen tespit edilmiştir)

• Uygun olmayan antibiyotik tedavisi, yoğun bakım ünitelerinde(YBÜ) ortaya çıkan antibiyotik direnci ile birlikte %10-45’lik bir mortalite oranıyla ve daha uzun hastane kalımıyla ilişkilendirilmiştir

• Etken patojenlere yönelik olarak antibiyotik tedavisinin hedeflenmesi direnci azaltmada önemlidir

• Ama, potansiyel patojenlerin tespiti için, daha hızlı ve duyarlı tanı koyucu araçlar daha doğru ve uygun antibiyotiğin seçimi için gereklidir

• Erken şüphelenilen sepsisli hastaların kanında bakteriyel ve fungal DNA’ nın doğrudan belirlenmesi ve tespit edilmeye başlanması uygun antibiyotik tedaviyi belirleme şansını doğurmuştur

• Bu durum ilaç maliyetlerinin düşmesine, daha kısa tedavi süresine,hastanede daha kısa süre kalmaya ve tüm direnç oranlarında azalmaya yol açabilir

• Yoğun bakım ünitelerine kabul edilen hastaların kanındaki tüm infeksiyonların %90’ nına neden olan 20 en önemli bakteriyel ve fungal türü kandan doğrudan tespit etmek için LİGHT CYCLER SeptiFast( LC-SF) testi geliştirilmiştir

• Mevcut çalışma, günlük uygulamada geleneksel kan kültürü ile kıyaslanan bu multiplex real-time PCR kitini kullanan ve kanlarında şüpheli infeksiyonla YBÜ’ ye kabul edilen hastalarla gerçekleştirilmiş prospektif ve gözleme dayalı bir çalışmadır

MATERYAL-METOD

• Bu prospektif gözleme dayalı çalışma, 6 aylık bir sürede 30 yataklı bir YBÜ’ de gerçekleştirilmiştir

• Ateşi (>38°C) veya hipotermisi (<36°C) olan bütün yetişkin hastalar uygun bulunmuş

• Klinik veriler YBÜ’de gelişmiş ve tüm hastane kalımı süresince prospektif olarak toplanmıştır

KAN KÜLTÜRÜ

• Kan örnekleri tek bir venden alınmış (her bir KK için 10 ml)

• KK’leri yapılırken; aerobik ve anaerobik kan kültürü şişeleri (Bact/Alert,bioMerieux,Marcy I’Etoile,France) 37°C’de 5 gün inkübe edilmiş, mantar kültürü için kullanılan mycosis medyum şişesi ise (BACTEC 9200, BD,Point-de-Claix,France) 37°C’de 14 gün süreyle inkübe edilmiş

LC-SF Testi

• LC-SF testi 3 basamakta gerçekleştirilmiştir;• ( i) mekanik liziz ve DNA ayrıştımasıyla birlikte

numune hazırlanması;• ( ii) üç paralel reaksiyonda(Gram-pozitif bakteri,

Gram-negatif bakteri ve mantarlar) hedef DNA’nın real-time PCR amplifikasyonu ve özel hibridizasyon problarıyla tesbit edilmesi

• (iii) türlerin ve kontrollerin otomatize tanımlanması

• LC-SF testiyle tespit edilen hedef numuneler Tablo 1’de gösterilmektedir

• DNA hazırlanması için 1,5 ml tam kan kullanılmış

• PCR ürünlerinin real-time tespiti LightCycler 2.0 aracı kullanılarak gerçekleştirilmiş

• Numunelerin erime sıcaklığı ve kontroller, LC-SF tanımlama yazılımı kullanılarak analiz edilmiş, ve bir rapor düzenlenmiştir

İstatiksel Analiz

• Veri analizleri için SPSS yazılımı (Windows için SPSS, versiyon 14.1; SPSS, Chi cago, IL, ABD) kullanılmış

• Pozitif KK sonuçlarına sahip hastalar ile negatif KK sonuçlarına sahip hastalar arasındaki demografik verileri karşılaştırmak için Mann–Whitney U-testi kullanılmıştır

SONUÇLAR

• 72 hastadan peşpeşe alınan toplam 100 tane KK (aerobik, anaerobik ve fungi) ve LC-SF numuneleri incelenmiş

• Negatif KK sonucuna sahip hastalar ile pozitif KK sonucuna sahip hastalar arasında YBÜ’ne kabulu için sebepler veya demografik veriler bakımından anlamlı düzeyde istatistiksel farka rastlanmamıştır (p >0.05)

• En çok şüphelenilen infeksiyon bölgesi solunum yollarıydı;negatif KK sonuçlarına sahip numunelerin %66’sı (59/90) ve pozitif KK sonuçlarına sahip numunelerin %70’inde (7/10)

• Kanın alınışından LC-SF sonuçlarının elde edilişine kadar geçen süre 7 ile 15 saat arası değişiklik göstermiştir

• Tablo 2, 100 tane eşleştirilmiş numuneye ait 102 tane sonucu göstermektedir

• Altı hastada, KK tek başına pozitifmiş, Staphylococcus epidermidis kan alımında meydana gelen bir kontaminant olarak kabul edilmiştir

• LC-SF ile belirlenen pozitif vakaların sonuçları Tablo 3’te verilmiştir

• Sadece KK’lerinde görülen LC-SF testiyle belirlenemeyen iki tane maya mantarı vardı: Candida glabrata/S. aureus (hasta 4) ve Candida albicans/Candida tropicalis (hasta 9).

• İlk vakada, C. glabrata LC-SF testinden 5 gün önce boğaz ve idrardan elde edilmiş, ikinci vaka için, C. albicans LC-SF testinden 15 gün önce bronşiyal salgılardan izole edilmiştir

• LC-SF’nin sonuçlarının KK’den elde edilenlerle karşılaştırılmasında, testin analitik performans parametreleri aşağıdaki gibi tespit edilmiş: duyarlılık, özgüllük, pozitif prediktif değeri (PPV) ve negatif prediktif değeri (NPV) sırasıyla %40, %88, %27 ve %93 şeklindeydi

• Sekiz hastada, organizmalar LC-SF testi kullanılarak belirlenmiş, fakat bu hastaların KK sonuçları negatifti (Tablo 3)

• LC-SF ve mikrobiyolojik verilerin sonuçları esas alındığında üç hastanın (hasta 2,3 ve 6) antibiyotiği değiştirilmiş

• Bu hastaların iki tanesinde (hasta 3 ve 6) ilk tedavinin yetersiz olduğu düşünülmüştür

• Antbiyotik almayan 2. hasta LC-SF sonucunun (E. coli) pozitif olması yüzünden altıncı gün antibiyotik almaya başlamış

• 5. hastada antibiyotik tedavisi yeterli olduğu düşünülmesine rağmen, kateterin enfeksiyon kaynağı olabileceği düşünülerek, LC-SF testinin ardından kateter çıkarılmış

• Pozitif LC-SF sonuçlarına sahip dört hasta (hasta 1,4,7 ve 8) LC-SF testi döneminde zaten antibiyotik alıyorlardı ve antibiyotik rejiminde değişiklik yapılmamıştır

• Tablo 3’de ilk tedavinin dört hasta için yetersiz olduğu ve antibiyotik rejiminin bu hastalar için değiştirildiği gösterilmektedir

• 11 farklı vakadan (Tablo 3; dokuz tane LC-SF pozitif/KK negatif, iki tane LC-SF pozitif/KK farklı) on tanesinin gerçek-pozitif sonuçları olduğu kabul edilmiş,yani klinik bulgular ve diğer mikrobiyoloji sonuçlar pozitifmiş

• Ayrıca, LC-SF sonuçları negatif fakat KK sonuçları pozitif olan iki numune sonuç olarak klinik bakımdan anlamlı bulunmamış (Tablo 2). Bundan dolayı, LC-SF performansı aşağıdaki gibi belirlendi: duyarlılık %78; özgüllük %99; PPV %93; NPV %95

TARTIŞMA

• LC-SF testi önceden inkübasyona ihtiyaç duyulmadan doğrudan kanda mikroorganizmaları belirlemek için kullanılan ilk DNA bazlı testtir

• Bunun gibi bir test, sepsisi olmasından şüphe edilen hastaların tedavisini optimize etme potansiyeline sahiptir

• Mevcut çalışmada bakteremiden iyileşme oranı, LC-SF testiyle elde edilen sonuçlara göre yapılan tedaviyle, KK’den açık bir şekilde daha iyiymiş

• Ancak, bu sonuçlar üç tane soruyu ortaya çıkarmıştır: (i) Sadece LC-SF testinde belirlenen izolatların klinik uygunluğu nedir; (ii) PCR tarafından bulunan DNA’ nemi gerçek infeksiyonu yansıtır mı; ve (iii) KK ve DNA-bazlı testler arasında bunun gibi bir karşılaştırma için en iyi tasarım nedir?

• Subklinik bakteriyel infeksiyonlara sahip hastalarda bile kanda dolaşan bakteriyel DNA’nın varlığına dair literatürde hiçbir çalışma yoktur

• Mevcut çalışma esas olarak KK setinin sayısıyla ilgili bazı kısıtlılıklara sahiptir

• Aslında, KK’lerin duyarlılığı daha büyük miktarda kanın kültürlenmesi yoluyla arttırılırken, LC-SF testi sadece üç tane aynı zamanda toplanmış KK’den oluşan bir setle karşılaştırılmıştır

• Ancak, bu gibi bir moleküler testin amacı, numune sayısını azaltırken muhtemel en iyi duyarlılığı elde etmeye çalışmaktır

• Diğer bir özellik sirküle eden cansız bakteri ve fungilerin, mesela antimikrobiyallerin inhibite ettiği bakterilerdeki veya fagositik hücrelerin içindeki DNA’ nın amplifikasyonudur

• PCR-bazlı metotlar KK’den daha duyarlıdır

• Aslında, bakterilerin sadece LC-SF testiyle belirlendiği 11 vakada sonuçların yanlış pozitif olduğu varsayılabilir

• Ancak, bu vakalardaki klinik bulgular ve diğer veriler arasındaki ilişki, iyileştirilen bakterinin hastanın durumundan gerçekten sorumlu olduğunu düşündürmektedir

• Bundan dolayı, gelecekte KK artık kan dolaşımı infeksiyonlarının teşhisinde referans standart olmamalıdır

• Bu konuyla ilgili yayınlar arasında, yakın geçmişte yapılan bir çalışma, yanlış-pozitif kan kültür şişelerinin otomatik sistemlerle belirlendiğinin ve bu şişelerde mikrobiyal DNA değerlendirmesini önerdiğinin altını çizmektedir

• İyice anlaşılmıştır ki, uygun antibiyotik tedavisinin zamanında başlanmasının mortalite üzerinde önemli bir etkisi vardır

• LC-SF testi klinikçilere daha önce mümkün olandan çok daha erken ve iyi kalitede bir terapötik yönetim fırsatı sağlamaktadır

• Bu bir ön çalışma olduğu için, pozitif KK ve/veya LC-SF sonuçlarına sahip hastaların sayısı çok azdı

• Ancak, vakaların bir kısmında tedavi rejimi, LC-SF sonuçlarına ve diğer mevcut klinik bilgilere göre değiştirilmiştir

• LC-SF testinin klinik uygunluğu KK sonuçlarında olduğu gibi klinikçiler tarafından belirlenmiştir

• Kontaminasyon ihtimali, otomatik real-time PCR gibi teknik gelişmelere bağlı olarak önemli oranda azalmıştır

• Bununla birlikte, bu çalışmada bir vakada kontaminasyon görülmesine rağmen Louie ve ark. tarafından gerçekleştirilen çalışmada sekiz vakada kontaminasyon (S. epidermidis) bulunmuştur

• Doktorların mikrobiyolojik sonucu numune alındığı gün elde etmesi infeksiyonların tedavisinde ileri bir adım olacaktır

• LC-SF testi gibi PCR bazlı bir testten elde edilen bir sonuç tek başına değil klinik önemi mevcut klinik ve diğer laboratuvar verilerini dikkate alarak yorumlanmalıdır

• Bu ön çalışmadan elde edilen sonuçlar LC-SF testinin klinik olarak sepsisi olmasından şüphe edilen hastaların optimal tedavi yönetiminde değerli bir tamamlayıcı araç olabileceğini öngörmektedir

• Sepsisi olan hastalarda sebep olan etkenlerin geleneksel kültür-bazlı metotlara ilaveten , LC-SF testini kullanarak saptanmasının, klinik faydaları ve nihai sağlık- ekonomik alandaki faydalarını değerlendirmek için daha büyük, çok merkezli, randomize kontrollü çalışmalar gereklidir