Daño y reparación del Daño y reparación del DNADNA

Daño al DNADaño al DNA

• Cambios en la secuencia debidos a:Cambios en la secuencia debidos a:• Errores en la replicación.(Dna pol)Errores en la replicación.(Dna pol)• Agentes del ambienteAgentes del ambiente

• Mutágenos químicosMutágenos químicos• Radiaciones Radiaciones

Si los cambios no son Si los cambios no son reparadosreparados

• Las células en proliferación o quiescentes Las células en proliferación o quiescentes acumularían tantas mutaciones que acumularían tantas mutaciones que morirían.morirían.

• En las células de la línea germinal pueden En las células de la línea germinal pueden encontrarse mutaciones y estas se encontrarse mutaciones y estas se expresarán en la progenie. expresarán en la progenie.

Cáncer Cáncer

• Es una serie de enfermedades que tiene Es una serie de enfermedades que tiene como característica como característica

• Carcinógenos, si el daño que causan Carcinógenos, si el daño que causan frecuentemente lleva a desarrollar cáncer.frecuentemente lleva a desarrollar cáncer.

Lesiones del DNALesión del DNA Ejemplo/ Causa

Base faltante Remoción de purinas por ácido y calor (encodiciones fisiológicas ≈104 purinas/ dia/ célula en un genoma de mamífero);remoción de bases alteradas (ej. Uracilo porlas DNA glicosilasas

Base alterada Radiaciones ionizantes, agentes alquilantes(ej. Alquil metano sulfonato)

Base incorrecta Mutaciones que afectan la corrección deerrores 3Åå Å® 5Åå por la acción exonucleasade bases incorporadas incorrectamente.

Salientes debidas adeleciones oinserciones de unnucléotido.

Agentes Intercalantes (ej., acridinas) quecausan adiciones o pérdidas de nucleótidosdurante la recombinación o replicación.

Pirimidinas unidas Dimeros Cyclobutilol (usualmente dímerosde timina) resultantes de radiación UV

Rompimientos enhebra sencilla o doble

Rompimiento de enlaces fosfodiester porradiación ionizante o agentes químicos (ej.,bleomicina)

Hebras con enlacescruzados

Enlaces covalentes de dos hebras poragentes alquilantes bifuncionales (e.j.,mitomicina C)

Fragments 3’-d es oxi rib osa

Dis ru pc ió n d e la es tru ctu ra d e l a es tr u ct ru ad e la d eso x irib os a po r r ad ica les l ib re s qu ellevan a rom pi m ien to d e h eb ras.

SOURCE: Adapted from A. Kornberg and T. Baker, 1992, DNA Replication, 2d ed., W. H. Freeman and Company, pp. 771 – 773.

Corrección de pruebas de la Corrección de pruebas de la DNApolDNApol

• Las DNA pol adicionan nucleótidos Las DNA pol adicionan nucleótidos complementarios al molde.complementarios al molde.

• Las subunidad a de la polimerasa III de Las subunidad a de la polimerasa III de E.coliE.coli incorpora un error cada 10 incorpora un error cada 1044 nucleótidos que adiciona.nucleótidos que adiciona.

• Cada gen de Cada gen de E.coliE.coli tiene 10 tiene 1033 bases, bases, entonces habría un error cada 10 genes entonces habría un error cada 10 genes replicados.replicados.

Frecuencia de mutaciónFrecuencia de mutación

• O sea 10O sea 10-1-1 mutaciones por gen y por mutaciones por gen y por generación.generación.

• Se ha determinado experimentalmente Se ha determinado experimentalmente que la frecuencia es menos de 1 falta que la frecuencia es menos de 1 falta cada 10cada 1099 nucleótidos equivalente a 10-5 a nucleótidos equivalente a 10-5 a 1010-6-6 mutaciones por gen y por generación. mutaciones por gen y por generación.

Actividad de exonucleasa 3’Actividad de exonucleasa 3’5’5’

Dna pol III Dna pol III

E.coli

• Casi todas la DNA pol presentan actividad Casi todas la DNA pol presentan actividad de exonucleasa 3’-->5’de exonucleasa 3’-->5’

• Excepto la polimerasa alfa de eucariotes.Excepto la polimerasa alfa de eucariotes.

• Si se muta el sitio o la subunidad con Si se muta el sitio o la subunidad con actividad de corrección la tasa de actividad de corrección la tasa de mutación aumenta 1000 veces en mutación aumenta 1000 veces en promediopromedio

Agentes mutagénicos in Agentes mutagénicos in cancerígenoscancerígenos

De acción directaDe acción directa

• Son electrófilos activos.Son electrófilos activos.• Reaccionan químicamente con el Reaccionan químicamente con el

nitrógeno o el oxígeno del DNAnitrógeno o el oxígeno del DNA• Modifican los nucleótidos distorsionando Modifican los nucleótidos distorsionando

el patrón normal de apareamientoel patrón normal de apareamiento

De acción indirectaDe acción indirecta

• No son reactivosNo son reactivos• Son insolubles en aguaSon insolubles en agua• Deben ser modificados por introducción Deben ser modificados por introducción

de centros electrofílicosde centros electrofílicos• La activación se lleva a cabo por enzimas La activación se lleva a cabo por enzimas

“detoxificadoras”“detoxificadoras”

Reparación del DNAReparación del DNA

• Las lesiones al DNA pueden ocurrir en Las lesiones al DNA pueden ocurrir en células en división pero también en células en división pero también en células que no se dividen.células que no se dividen.

• Si el proceso de reparación fuera óptimo, Si el proceso de reparación fuera óptimo, no habría acumulación de errores.no habría acumulación de errores.

• La acumulación de errores lleva al La acumulación de errores lleva al envejecimiento. envejecimiento.

• Base Loss• Base modification & Deamination

• Chemical Modification• Photodamage• Inter-strand crosslinks

• DNA-protein crosslinks• Strand breakage

Types of DNA damageTypes of DNA damage

Abasic site -loss of a nucleobase(apurinic or apyrimidinic)

Deamination

Base loss

Potential Sites of modification/damagePotential Sites of modification/damage

Chemical DamageChemical Damage

Oxidative damage

Alkylation

UV-induced damageUV-induced damage

La reparación en La reparación en E. coli. E. coli.

• Reparación de mal-apareamiento, ocurre inmediatamente después Reparación de mal-apareamiento, ocurre inmediatamente después de la síntesis de DNA.de la síntesis de DNA.

• PhotolyasePhotolyase• De-alkylation proteins (not catalytic)De-alkylation proteins (not catalytic)• Reparación por escisión, remoción de una región dañada por Reparación por escisión, remoción de una región dañada por

nucleasas especializadas y síntesis de DNA para llenar el hueco.nucleasas especializadas y síntesis de DNA para llenar el hueco.• Base Excision RepairBase Excision Repair• Nucleotide Excision Repair (GG and TC)Nucleotide Excision Repair (GG and TC)

• Recombination RepairRecombination Repair• Error-prone RepaiError-prone Repai• Reparación de rompimientos de cadena doble, ocurre por un Reparación de rompimientos de cadena doble, ocurre por un

proceso de unir los extremos.proceso de unir los extremos.

UV-responsive photolyasesUV-responsive photolyases

Direct reversal (de-alkylating proteins)Direct reversal (de-alkylating proteins)

Base Excision RepairBase Excision Repair

Base Excision RepairBase Excision Repair

Nucleotide Excision Repair Nucleotide Excision Repair

((E.coliE.coli))

Nucleotide Excision Repair Nucleotide Excision Repair (Global Genome Repair -Humans)(Global Genome Repair -Humans)

Nucleotide Excision RepairNucleotide Excision Repair(Transcription Coupled -Humans)(Transcription Coupled -Humans)

Common features of GGR & TCR

Mismatch Repair Mismatch Repair

Recombination RepairRecombination Repair

Other possible mechanisms of recombination repair

Error Prone Bypass Error Prone Bypass (E. coli)(E. coli)

Experimental evidence for Error prone Experimental evidence for Error prone repairrepair(E.coli)(E.coli)

Revertant in His- genes(umuC mutated strain)

UV-responsive activation of the umuC gene

Reparación de mal-apareamientoReparación de mal-apareamiento

Los sistemas de reparación Los sistemas de reparación de mal-apareamientode mal-apareamiento

• Reconocen los malos apareamientos Reconocen los malos apareamientos excepto C--C.excepto C--C.

• Reconocen la cadena normal si existe un Reconocen la cadena normal si existe un sistema lento de metilación mediante el sistema lento de metilación mediante el sistema sistema MutHLSMutHLS..

• Mutaciones en Mut H, S o L aumenta la tasa de Mutaciones en Mut H, S o L aumenta la tasa de mutaciones espontáneasmutaciones espontáneas

• Fallas en la metilasa Dam también incrementan Fallas en la metilasa Dam también incrementan la tasa de mutación.la tasa de mutación.

• Un mecanismo similar repara las lesiones de Un mecanismo similar repara las lesiones de depurinación o de depirimidinación.depurinación o de depirimidinación.

• La depurinación es muy común en mamíferos.La depurinación es muy común en mamíferos.• Todas las células presentan endonucleasas Todas las células presentan endonucleasas

apurínicas que cortan la hebra del DNA cerca apurínicas que cortan la hebra del DNA cerca del sitio apurínico.del sitio apurínico.

Reparación por escisiónReparación por escisión

• Repara regiones que presentan bases Repara regiones que presentan bases modificadas y que alteran la forma normal modificadas y que alteran la forma normal de la doble hélice.de la doble hélice.

• Ej dímeros de timidina o citocina.Ej dímeros de timidina o citocina.

Dímero de timinaDímero de timina

Sistema UvrABC de Sistema UvrABC de reparación por escisiónreparación por escisión

• Primero, se forma un complejo de dos Primero, se forma un complejo de dos moléculas de UvrA y una de UvrB y se unen al moléculas de UvrA y una de UvrB y se unen al DNA.DNA.

• Tanto la formación del complejo como la unión Tanto la formación del complejo como la unión al DNA requiere ATP.al DNA requiere ATP.

• Parece que la unión es sobre DNA no dañado.Parece que la unión es sobre DNA no dañado.• El complejo se transloca sobre la doble hélice El complejo se transloca sobre la doble hélice

hasta encontrar una distorsión. Gasta ATP.hasta encontrar una distorsión. Gasta ATP.

Dímero de TimidinaDímero de TimidinaProteína de Proteína de reconocimiento reconocimiento del dañodel daño

Reparación de unión de Reparación de unión de extremos de DNA no homólogoextremos de DNA no homólogo

• Una célula que tienen una doble cadena Una célula que tienen una doble cadena rota, generalmente tiene más rota, generalmente tiene más rompimientos.rompimientos.

• Los rompimientos se reparan uniéndolos y Los rompimientos se reparan uniéndolos y evitando la pérdida de material aunque se evitando la pérdida de material aunque se rearregle.rearregle.

• Este rearreglo puede dar alteraciones Este rearreglo puede dar alteraciones pero el DNA es egoísta y si el queda pero el DNA es egoísta y si el queda entero no importa que la célula cambie.entero no importa que la célula cambie.

Hay dos mecanismosHay dos mecanismos

• Reparación por recombinación homóloga, Reparación por recombinación homóloga, que repara correctamente.que repara correctamente.

• Reparación por reunión de extremos, en Reparación por reunión de extremos, en que se pierden varias bases del extremo o que se pierden varias bases del extremo o reúne extremos de diferentes regiones reúne extremos de diferentes regiones cromosomales.cromosomales.

Reparación en eucariontesReparación en eucariontes

• Los mecanismos de reparación se han Los mecanismos de reparación se han conservados en la evoluciónconservados en la evolución

• Existe un sistema homologo a Mut, Existe un sistema homologo a Mut, reparación por escisión.reparación por escisión.

• Se ha demostrado un sistema de Se ha demostrado un sistema de reparación ligado a la transcripción en reparación ligado a la transcripción en dónde interviene TFIIH, una helicaza.dónde interviene TFIIH, una helicaza.

Nucleotide Excision Repair Nucleotide Excision Repair (Global Genome Repair -Humans)(Global Genome Repair -Humans)

Nucleotide Excision RepairNucleotide Excision Repair(Transcription Coupled -Humans)(Transcription Coupled -Humans)

Common features of GGR & TCR

Sistemas de reparación Sistemas de reparación induciblesinducibles

• Se activan cuando hay un daño extenso al DNA.Se activan cuando hay un daño extenso al DNA.• En bacterias es el sistema SOS.En bacterias es el sistema SOS.• Se activa con daño extenso ej. UVSe activa con daño extenso ej. UV• La tasa de mutación es más alta después de la La tasa de mutación es más alta después de la

reparación por este sistema que si no existiera.reparación por este sistema que si no existiera.• Mutantes sin sistema SOS presentan menor Mutantes sin sistema SOS presentan menor

tasa de mutación.tasa de mutación.