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Efecto de nanocompuestos magnéticos en el comportamiento de peces cebra Danio rerio

Sara Bejarano1,2, Adolfo Amézquita2, Verónica Akle1

1Laboratorio de Neurociencia y Ritmos Circadianos, Facultad de Medicina, Universidad de los Andes

2Grupo de Eco fisiología Comportamiento y Herpetología, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes

RESUMEN Los nanocompuestos magnéticos tienen un alto uso potencial en el tratamiento de aguas residuales. El objetivo de esta investigación fue determinar el efecto de nanocompuestos magnéticos en los comportamientos del modelo animal de pez cebra. Se aplicaron pruebas de campo abierto, preferencia de color, respuesta a estímulo (luz) y actividad circadiana, para evaluar la etología de individuos tratados a 8 horas post-fertilización (hpf) y a los 6 días post-fertilización (dpf) con 7 diferentes funcionalizaciones de nanocompuestos y a tres concentraciones (10, 100 y 1000ug/ml). Los datos de comportamiento fueron recogidos con la cámara de observación DanioVision® y analizados con el software EthoVision®. En las pruebas de campo abierto hubo efectos significativos en la distancia recorrida de los animales expuestos a algunos nanocompuestos (p<0.05). En particular, las larvas expuestas a magnetita+anhidrido-3-trietoxisililpropil-succinil mostraron patrones de comportamiento compatibles con ansiedad, i.e., recorrieron distancias cortas a alta velocidad, independiente de la edad o la concentración. En la prueba de respuesta a la luz, los individuos expuestos durante el desarrollo, a 8 hpf y a concentraciones de 100µg/ml, mostraron tiempos de reacción aumentados o disminuidos (p<0.05). Este estudio preliminar muestra que algunas funcionalizaciones podrían tener efecto en el comportamiento de los animales. Sin embargo, los nanocompuestos podrían ser una alternativa viable en la remediación de agua si se concluye que estos cambios comportamentales no afectan su bienestar a largo plazo. Palabras clave: larvas de pez cebra, etología, remediación, nanocompuestos, magnetita

Abstract Magnetic nanocompounds for water waste treatment have great potential. However, to implement them, it is necessary to evaluate whether they have an impact on life forms in aquatic ecosystems. The objective of this research was to determine the effect of magnetic nanocompounds on the behaviors of the animal model, zebrafish. Open field, circadian activity, color preference and startle response tests were designed and applied to assess the ethology of individuals treated at 8 hours post-fertilization (hpf) and at 6 days post-fertilization (dpf) with 7 different functionalization of nanocompounds at three different concentrations (10, 100 and 1000ug / ml). The behavioral data were collected with the DanioVision® chamber and analyzed with the EthoVision® software. In the open field test, there were significant effects on the distance traveled in animals exposed to some

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nanocompounds (p <0.05). In particular, the larvae exposed to the magnetite nanocompound + anhydride-3-triethoxysilylpropyl-succinyl showed behavioral patterns compatible with anxiety, i.e., they traveled short distances at very high speeds, regardless of age or concentration. In the startle response test, individuals exposed during development, at 8 hpf and at concentrations of 100 µg / ml, showed extended or decreased reaction times (p <0.05). This preliminary study shows that some functionalization could influence animal behaviors. However, nanocompounds could be a viable alternative in water remediation if it is concluded that these behavioral changes do not affect your long-term well-being. Key words: Zebrafish larvae, ethology, bioremediation, nanocompounds, magnetite INTRODUCCIÓN La actual preocupación por la conservación y la mitigación de los efectos contaminantes a causa de las actividades del ser humano ha generado un creciente desarrollo en tecnologías especializadas para tal fin. La nanotecnología, que es el uso de moléculas en escala alrededor de 230nm, está siendo evaluada como una de las posibles herramientas para la descontaminación de aguas residuales. En particular, los nanocompuestos con magnetita son moléculas especializadas en remover contaminantes disueltos en el agua tales como metales pesados, compuestos orgánicos, alcoholes entre otros, para luego ser extraídos del cuerpo de agua por sus propiedades magnéticas. Para avalar el uso de estas tecnologías es importante hacer ensayos de toxicología para estudiar los posibles efectos en el ecosistema. Para tal fin, los embriones y larvas de pez cebra son un modelo óptimo para esta evaluación. Por un lado, es un vertebrado acuático de desarrollo ex útero que podría ser afectado por nanocompuestos en un ecosistema, y, por otro lado, es un modelo ampliamente usado en investigación biomédica por su fisiología y genética. En particular, es un modelo estandarizado para investigación de toxicidad en el mundo. -Descripción del pez cebra

El pez cebra (Danio rerio) es un ciprínido de aguas dulces caracterizado por tener de 5-7 franjas azules y plateadas a lo largo de su cuerpo. Mide aproximadamente 25 mm y se encuentra con frecuencia en los campos de arroz de la India de donde es endémico, usualmente en cardúmenes de 5-20 individuos (Harper & Lawrence, 2016). El pez cebra es reconocido por su alta taza de reproducción, las hembras desovan cada 2-3 días aproximadamente y en cada evento se pueden contar cientos de huevos cada uno con un diámetro promedio de 0.7mm. Las condiciones de su ambiente son flexibles, su habitad se caracteriza por ser aguas estancadas, toleran cambios de temperatura entre 16-38°C, rangos de pH de 5.9-8.5 y conductividad entre 10-2000μS según estudios en campo (Engeszer, Patterson, Rao, & Parichy, 2007). En condiciones de laboratorio, se estima que vive entre tres y cuatro años (Spence, 2011).

El pez cebra es un modelo de investigación reciente en ciencias biomédicas. Comparte cerca del 80% de su genoma con el de los humanos, se puede manipular genéticamente con facilidad y los embriones son transparentes, lo que permite que se pueda observar con claridad el desarrollo de sus órganos (Engeszer et al., 2007). Además, su mantenimiento es económico, comparado con el de un mamífero, y es de fácil manipulación (Bootorabi et al., 2017). Estas características del pez cebra hicieron que fuera adoptado por primera vez en investigación genética en 1980 con el Grupo de George Streisinger, de la Universidad de Oregón, donde postularon a este animal como una alternativa a los invertebrados que

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se usaban en la época para el estudio de biología del desarrollo (Harper & Lawrence, 2016). Por otro lado, el pez cebra se utiliza para estudiar la toxicidad, los efectos de fármacos y sustancias psicoactivas en el desarrollo neuronal, los efectos secundarios y cambios de comportamiento de los mismos (McGrath, 2012). El pez cebra es diurno y los ritmos circadianos han sido elucidados (Golith, 2011 ), así como el efecto que este puede tener en la libración de diferentes neurotransmisores, como la dopamina (Connaughton, Wetzell, Arneson, Delucia, & L. Riley, 2015), o en la transcripción de genes (Purushothaman et al., 2015a) y en la plasticidad en los ciclos de vigilia y sueño (Elbaz et al., 2013).

Por otro lado, parte de las investigaciones han sido enfocadas en el desarrollo embrionario de los animales. Por esta razón, el uso del pez cebra para estos estudios de este tipo, ha sido de gran utilidad. Aparte de los beneficios anteriormente mencionados, en estado embrionario el pez cebra es capaz de absorber componentes disueltos en el agua. El desarrollo de los órganos se genera en menos de una semana y su pequeño tamaño lo hace de fácil manipulación (McGrath, 2012). Por consiguiente, el estudio del comportamiento en larvas de pez cebra, para este caso puntual, puede ser un indicativo del estado de desarrollo o afecciones en el sistema nervioso de los individuos cuando éstos son expuestos a algún tratamiento en su estado embrionario.

-Comportamiento de larvas de pez cebra

El estudio del comportamiento del pez cebra, ha sido de suma importancia para el desarrollo y progreso de las neurociencias trasnacionales. La amplia gama de comportamientos estudiados, así como el conocimiento de los núcleos nerviosos y genes asociados a los mismos, hacen que el pez cebra sea un modelo muy usado para investigaciones comportamentales (Kalueff et al., 2013). No obstante, hay una gran diferenciación entre las edades de los individuos como sujeto de investigación, separando los estudios con larvas de los que son con adultos.

Los estudios en estados embrionarios se enfocan en la incidencia de un tratamiento en el desarrollo del organismo y, por ende, de las facultades del individuo. Los estudios etológicos no son la excepción; de hecho, se sabe que hay un desarrollo en cuanto a las facultades comportamentales en esta especie, dependiendo del estado embrionario en el que se encuentre el animal (Basnet, Zizioli, Taweedet, Finazzi, & Memo, 2019). También es importante resaltar que la mayor parte del repertorio de comportamientos de un animal adulto tiene una procedencia del comportamiento básico en los primeros estadíos de vida, por lo general, los estadíos jóvenes se destacan por tener comportamientos de detección y evasión de predadores así como de la búsqueda de sitios seguros (H. A. Burgess & Granato, 2007)

En consecuencia, el grupo de investigación de Sanit-Amad et-al, dedicado al desarrollo del movimiento locomotor en embriones del pez cebra, reportan que a las 17hpf (horas post fertilización) el embrión exhibe contracciones en su tronco, que decrece gradualmente desde 0.57Hz hasta 0.1 al cabo de 27hpf. A las 21hpf, los embriones responden al tacto, moviéndose vigorosamente y con mayor intensidad al cabo de 48hpf cercanas a la eclosión del huevo.(Saint-Amant & Drapeau, 1998). Demostrando que incluso antes de poder efectivamente nadar, el pez cebra, en su desarrollo muestra reflejos de movimiento frente a pulsos táctiles. Una vez generado el proceso de eclosión los peces cebra empiezan a nadar tras 4 dpf (días post fertilización)(Buss & Drapeau, 2001).

Descripción de la locomoción de las larvas (OF)

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La prueba de uso típico para la evaluación de la locomoción de los animales en su estado “basal” se denomina de “campo abierto” (Open Field, por sus siglas en inglés). Se dice que es un estado basal puesto que los animales no se enfrentan a ningún estímulo que pueda alterar su comportamiento, además de la interacción con un ambiente nuevo. Por lo tanto, se recomienda, para esta prueba y cualquier otra con peces cebra, un tiempo de habituación de aproximadamente 5 minutos (Walsh & Cummins, 1976).

La caracterización del comportamiento en larvas de pez cebra frente a esta prueba se ha resumido bajo el nombre de “comportamiento exploratorio” en donde prima la tigmotaxia (constante contacto físico con las paredes de la arena) y la evasión del punto central del pozo que los contiene (Ahmad & Richardson, 2013). No obstante, a medida que el individuo crece, aumenta su velocidad de locomoción, disminuye el tiempo de descanso y aumenta la distancia recorrida, el comportamiento exploratorio se mantiene en todos los estadíos de crecimiento pero tiende a disminuir dependiendo del tiempo de habituación a la arena(Colwill & Creton, 2011b).

Umbral de respuesta frente a estímulo

Las primeras etapas de vida de un animal son sin duda alguna las más vulnerables, debido a la falta de agilidad y al desarrollo pleno de las capacidades motrices para el efectivo escape de una amenaza. Por esto es importante que animales como el pez cebra, cuya especie no presenta conductas de cuidado parental, desarrollen estrategias de respuesta rápida frente a eventos inesperados en el ambiente que habitan (Harold A Burgess & Granato, 2007). La prueba de sobresalto (startle response), por medio de la aparición intempestiva de factores táctiles, visuales o auditivos programados, mide la capacidad de respuesta de protección de los animales(Wolman & Granato, 2012).

Estudios de respuesta a estímulos en larvas de peces cebra pueden iniciarse desde los 2 días post fertilización (dpf) para estímulos táctiles (Colwill & Creton, 2011a), 3dpf para estímulos visuales que consiste de flashes de luz y oscuridad con una duración inferior a 0.5 segundos(Ganzen, Venkatraman, Pang, Leung, & Zhang, 2017) y 5dpf para estímulos auditivos con frecuencias superiores a 200Hz (Zeddies & Fay, 2005). En cuanto a los comportamientos esperados frente a los estímulos, se encuentra un pico de actividad luego del cambio de luz, como cambio instantáneo del ángulo de nado y mayor distancia recorrida (Emran, Rihel, & Dowling, 2008).

Preferencia de color

Factores abióticos presentes en el ambiente tales como la luz, las formas, y los colores, son determinantes para el entendimiento del animal en su entorno, y, por lo tanto, claves para la identificación de factores potencialmente peligrosos. Las pruebas de preferencia de color tratan de estimar cuales son los tonos afines o aversivos para el individuo en estudio. En esta prueba, se sitúa al sujeto en una arena delineada por distintas zonas diferenciadas por colores y se mide el tiempo en el que el animal pasa tiempo en cada una (Ahmad & Richardson, 2013).

Estudios previos demuestran que el pez cebra es capaz de identificar colores debido a que posee células bien especializadas en la corteza visual, de tal modo distinguen las frecuencias de 362nm para luz ultravioleta, 415nm para luz azul, 480nm para luz verde y 570nm para luz roja (Hughes, Saszik, Bilotta, Demarco, & Patterson, n.d.). Se ha demostrado que larvas evaluadas a los 6dpf tienen la capacidad de desplegar

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comportamientos de preferencia de color, de modo que evaden los colores azules, negro y rojo y prefieren los colores naranja y verde. Demostrando con este estudio que también las larvas de pez cebra son unas buenas candidatas como sujetos de estudio para estudiar cambios de preferencia del ambiente (Ahmad & Richardson, 2013).

Ritmos circadianos y pez cebra

Los ritmos circadianos son ciclos de alrededor de 24 horas que afectan el funcionamiento de la mayoría de los seres vivos. La principal función es la de preparar la fisiología celular en anticipación a las actividades comprendidas dentro de las 24 horas que dura el día (Kreitzman & Foster, 2017). Este mecanismo está mediado por una serie de relojes periféricos todos sincronizados por un reloj maestro, que en los mamíferos está ubicado en el sistema nervioso central, en el núcleo supraquiasmático. En el pez cebra, no se ha determinado la ubicación de un reloj maestro, o si este existe. Sin embargo, igual que en los mamíferos, la glándula pineal produce melatonina en horas de la noche y en la oscuridad. Por medio de la liberación sistémica de melatonina por la glándula pineal, los relojes endógenos se sincronizan en todo el cuerpo, siendo sensibles a la cantidad de luz y el tiempo de exposición.

Los genes reloj son los responsables por mantener el ciclo de 24 horas en la actividad celular tales genes son per, cry, clk y bmal. que fueron descritos inicialmente en la mosca de la fruta, pero el mecanismo de funcionamiento es homólogo en vertebrados también aunque su nombre cambie (Konopka & Benzer, 1971). Al iniciar el día se producen dos genes, clock y bmal1, quienes codifican la producción de dos proteínas con el mismo nombre formando un heterodímero, que se va acumulando durante el día hasta que activan los genes Per1-3 y Cry1,2 cuyo heterodímero fosforila el de clock y bmal1 durante la noche y de esta manera sucesivamente durante 24 horas (R.-C. Huang, 2018).

Por medio de la expresión de los genes reloj y los genes controlados por estos, se regulan las actividades indispensables para la homeostasis, como los ciclos de sueño, la ingesta de comida, la termorregulación y la reproducción (Mistlberger & Rusak, 1987). En el pez cebra, mutaciones en la glándula pineal afectan la sincronía en tejidos circundantes (pacemakers) responsables de la segregación de melatonina y la modulación en sistemas de conducta (Ben-Moshe Livne et al., 2016). Al ser un animal de actividad diurna, alteraciones en su ritmo circadiano tiene repercusiones en la expresión de genes asociados como per1b, bmal1b, cry1b, bmal2 y nr1d2, postulando al pez cebra como un buen modelo de estudio de alteraciones de estos ritmos en humanos (Purushothaman et al., 2015b). Los tejidos de la retina del pez, necesarios para la adaptación a la oscuridad, presentan el incremento de un 42% de la expresión de tirosina, por lo que se podría inferir que los ciclos de luz y oscuridad son responsables en gran medida de la liberación y metabolismo de dopamina (Connaughton et al., 2015). También, peces cebra knockout de per 1b, muestran una serie de comportamientos hiperactivos, déficit de atención y bajos niveles de dopamina asociados con disrupciones en su ritmo circadiano. Por tal razón, este modelo ha sido usado para entender con mayor profundidad los síntomas de personas con déficit de atención o trastorno di hiperactividad (ADH). En un estudio se encontró que el ritmo circadiano tiene un papel muy importante en la regulación de genes involucrados en la producción de monoaminas como la dopamina, así como el mantenimiento de los núcleos dopainérgicos regulando el número y la proliferación de neuronas productoras de dopamina, una alteración en las horas de sueño puede generar una disminución en estos núcleos y por tanto de la producción de dopamina (J. Huang et al., 2015)

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-Pez cebra y nanopartículas

Actualmente, en el auge de la ciencia por resolver problemáticas existentes y entender fenómenos naturales, desde hace no mucho ha emergido un campo de investigación especializado en la manipulación de la materia en su millonésima parte de metro, denominada nanotecnología (Charles P & Frank J, 2007).

En el caso de las nanopartículas magnéticas, han sido de particular interés en el campo de la biomédica ya que debido a su reducida escala, pueden compartir espacios con células (10–100µm), virus (20–450 nm), proteínas (5–50 nm) e incluso genes (2 nm wide and 10–100 nm long) dependiendo del material y la síntesis de tales elementos (Pankhurst, Connolly, Jones, & Dobson, 2003). De este modo pueden operar dentro de los cuerpos en interacciones muy pequeñas realizando tareas como la entrega de medicamentos, la adhesión a moléculas orgánicas afines con los nanomateriales y, por lo tanto, teniendo repercusiones en el funcionamiento de los órganos de un individuo. En segunda instancia, al ser partículas magnéticas, obedecen a las leyes de Coulomb, por lo que pueden ser manipuladas por un campo magnético externo (Kodama, 2009).

Por otro lado, las propiedades de los nanocompuestos magnéticos antes descritas, han sido de particular interés en el campo de la remediación ambiental. A pesar de ser una solución potencial, aun se evalúa la utilidad de la nanotecnología como agente descontaminante de agua, suelo y aire, para mitigar los efectos de las actividades industriales en el ambiente (Rizwan, Singh, Mitra, & Morve, 2014). Tal es el caso del uso de materiales como el hierro el cual, se ha probado su efectividad en cuanto a la remoción de metales pesados y microorganismos patógenos en suelos contaminados (Cecchin, Reddy, Onio Thom E B, Tessaro, & Schnaid, 2016).

El pez cebra ha sido utilizado por investigadores en diferentes aras del desarrollo de nanotecnologías. Desde el impacto contaminante de nano túbulos de carbón en los ecosistemas acuáticos (Cheng, Flahaut, & Shuk, 2007) como de óxido de hierro (Zhu, Tian, & Cai, 2012), hasta los efectos en el desarrollo de larvas de pez cebra frente a sedimentos de nanopartículas de ZnO (Zhu, Wang, Zhang, Chang, & Chen, 2009), y la toxicidad de nanopartículas de hierro (Asharani, Lian Wu, Gong, & Valiyaveettil, 2008) entre otras. Las consideraciones tenidas en cuenta para establecer el efecto que podría llegar a tener las partículas en el organismo del pez cebra son: el tamaño de la nanopartícula, la forma, las propiedades de la superficie, la capacidad de su disolución y carga iónica. Otras variables pertinentes son la presencia del corión, el tiempo en presencia de las nanopartículas y la edad de exposición (Lin, Lin, Zhao, & Nel, 2013).

Actualmente técnicas de remediación basados en la implementación de nano tecnologías, están siendo evaluadas como una alternativa para la descontaminación de aguas residuales en los acueductos. Sin embargo, para la total implementación de estas tecnologías en el plano actual de los ecosistemas, es importante saber si tales compuestos pueden llegar a tener una incidencia en el desarrollo y bienestar de animales que posiblemente lleguen a tener contacto con tales compuestos. Estos deben ser animales de vida acuática y con un papel importante en la cadena trófica, es por esto por lo que en el actual experimento se decidió utilizar al pez cebra, puesto que cumple con los requisitos ecológicos del modelo de biorremediación planteado. Además de eso, representa un importante biomodelo en el actual panorama de la investigación científica, ampliamente utilizado en el mundo y con el que se tienen guías internacionales de su uso como modelo en toxicología (OCDE, 2012). Una vez realizadas todas las pruebas de toxicología

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necesarias se podrá decidir si tal estrategia de recuperación de aguas contaminadas es viable y puede llegar a implementarse sin causar daño alguno a las diferentes formas de vida dependientes de este importante recurso, incluso, que no representa amenaza para el ser humano.

Estudios anteriores realizados en el laboratorio de Neurociencias y Ritmos Circadianos en conjunto con el Centro de Microelectrónica, Ambos de la Universidad de Los Andes, tuvieron como objetivo evaluar cambios morfológicos e índices de mortalidad en larvas de pez cebra cuando fueron expuestas a las mismas nano-moléculas utilizadas en la presente investigación a una concentración de 1000µg/ml. Los resultados obtenidos a partir de este procedimiento no rechazaron la hipótesis nula, de manera que no se demostró que tales nanocompuestos tuvieran alguna incidencia en el desarrollo y supervivencia de tales individuos (Guillén, 2018). Sin embargo, variables comportamentales o de bioacumulación son el paso siguiente en la descripcion del efecto de los nanocompuestos en la vida acuática, y el foco de esta tesis..

Por esta razón, la hipótesis planteada para esta investigación afirma que la exposición de las larvas de pez cebra expuestas a nanocompuestos magnéticos, afectará el comportamiento de los individuos.

OBJETIVO GENERAL

Determinar el efecto de nanocompuestos de magnetita con diferentes funcionalizaciones y concentraciones en el comportamiento del pez cebra.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Analizar los cambios en la actividad locomotora de larvas de pez cebra expuestas a diferentes concentraciones y funcionalidades de nanocompuestos magnético Determinar el efecto en el tiempo de reacción (a un estímulo de luz blanca) de los animales expuestos al tratamiento de nanocompuestos magnéticos Cuantificar la preferencia de color de las larvas expuestas al tratamiento de nanocompuestos magnéticos Identificar el efecto del tratamiento de nanocompuestos magnéticos en el ritmo circadiano de las larvas de pez cebra

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Las larvas de pez cebra (Danio rerio) fueron criados en las instalaciones del cebrario del Laboratorio de Neurociencias y Ritmos Circadianos (L.NRC) de la Universidad de los Andes. Los animales son criados en sistemas de recircualción automática (Aquaneering. S.A San Diego) con condiciones del agua óptimas para la especie con una temperatura promedio de 28°C, y un pH de 7.33 El cebrario cuenta con una regulación de temperatura constante de 26 ± 1 °C, una exposición a la luz de 14 horas luz y 10 horas de oscuridad.

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Las larvas fueron criadas desde el momento de la fertilización de los huevos, en platos de 6 pozos con un diámetro de 3.48cm en donde se dispusieron 7 individuos por pozo mantenidos en 10ml de “agua de huevo”, la cual, es una solución de bicarbonato, sal marina y agua de osmosis inversa bajo un pH de 7.3 y una conductividad de 600 uS/m. Durante el periodo de tratamiento hasta el tiempo de evaluación, los animales no recibieron alimentación ni tuvieron contacto con los demás individuos presentes en el cebrario.

Posterior al periodo de observación etológica, se realizó eutanasia, que consiste en exponerlos a un choque térmico con una inmersión en una solución de hipoclorito de sodio al 6.15% relación Cloro: Agua 1:5, durante 5 minutos. Luego, se verificó en el estereoscopio la pérdida del latido cardíaco, procedimiento seleccionado por ser rápido e indoloro.

Todos los protocolos utilizados para el presente proyecto fueron debidamente aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) con el FUA No: 19-004.

Nanocompuestos

El Laboratorio ML101B Centro de Microelectrónica de la Universidad de los Andes (L. CMUA) bajo la dirección del Dr. Johann Osma, fabricó los nanocompuestos y realizó las funcionalizaciones. Los nanocompuestos fueron transferidos al L. NRC en una solución buffer o de agua de huevo, para ser manipulados. Los procesos de bioseguridad fueron coordinados y vigilados por el L. CMUA y Seguridad en el trabajo de la Universidad de los Andes. Las recomendaciones especiales implementadas fueron: la designación de un espacio aislado para el tratamiento de los individuos y materiales exclusivos para tal fin y la disposición exclusiva para nanocompuestos. Como medidas de bioseguridad personal se mantuvo el uso de guantes de nitrilo, tapabocas y bata antifluido durante todo el proceso experimental.

Se utilizaron partículas de magnetita de 230nM en cuya superficie fueron unidos grupos químicos funcionales, utilizados para la remoción de componentes fenólicos, microorganismos, metales pesados y compuestos orgánicos presentes en el agua contaminada.

Debido a que los nanocompuestos tienden a decantarse, fue necesario el uso del vortex para conseguir una solución homogénea y de esta forma, se prepararon las soluciones con concentraciones de 10µg/ml y 100µg/ml usando como solvente el “agua de huevo”. Cada una de las soluciones de tratamiento, consistieron en pozos con 9.8ml de agua de huevo y 0.2ml del nanocompuesto funcionalizado a las diferentes concentraciones.

Tratamientos

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Se evaluaron siete tipos de nanocompuestos magnéticos, cada uno a una concentración de 10µg/ml y de 100µg/ml. Se realizaron tres réplicas por cada tratamiento, cada una con un n de 7 individuos. Las funcionalizaciones evaluadas se les asignó un código de referencia para los compuestos durante el procedimiento experimental y análisis de datos. Las funcionalizaciones y su respectiva referencia se muestran en la tabla 1.

El tratamiento se realizó de forma independiente en individuos de dos etapas del desarrollo enbriones de 8 hpf y larvas de 248 hpf. Los animales de cada edad fueron evaluados de acuerdo con el diseño experimental descrito en las figuras 2 y 3.

Caja experimental

Para la realización de las pruebas de comportamiento se utilizó el equipo DanioVision®. Este consiste en una cabina que es donde se colocaron los platos de 24 pozos con los animales. En la parte superior tiene una cámara de infrarrojo, un des-humificador y una serie de luces programables. Adicionalmente, hay una unidad conectada, que es un mecanismo de recirculación de agua necesaria para mantener una temperatura constante al interior de la cabina.

Para las pruebas de comportamiento, se ubicó 1 animal por pozo en platos de 24 pozos, en donde 6 animales pertenecían al mismo tratamiento como se observa en la figura 1.

Tabla 1: Nombre asignado a cada uno de los nanocompuestos sintetizados por el grupo de investigación del Centro de Microelectrónica de la Universidad de los Andes. En la columna izquierda, se muestra el nombre del nanocompuesto y en el lado izquierdo, el nombre asignado para el presente estudio.

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Diseño Experimental

-Embriones

Animales del 8 hpf, en estadío embrionario de blástula fueron tratados por 4 días con los nanocompuestos a diferentes funcionalizaciones y concentraciones. Al día 6, se realizaron los estudios comportamentales, como lo indica la figura 2.

Larvas

Figura 2: Diseño experimental realizado para el estudio con embriones de pez cebra de 6dpf.

Figura 1: Imagen del programa EthoVision ® haciendo seguimiento de la posición de las larvas de pez cebra siendo los animales control, los situados en la primera fila de la parte superior y las experimentales, las de las filas restantes. Los puntos amarillos indican el punto mas oscuro en la cabeza de la larva, mientras que la parte amarilla, es la silueta del animal que el software reconoce

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Animales de 6 dpf, en estadio larval, fueron tratados por 4 días continuos con los nanocompuestos a diferentes funcionalizaciones y concentraciones. Al día 10, se lavaron y se realizaron los estudios comportamentales, como lo indica la figura 3.

Para evitar la influencia de más variables, además de los tratamientos propuestos, se tomaron las siguientes medidas de precaución: todas las pruebas fueron realizadas en horas de la tarde entre las 2 y 5 pm para evitar la intervención de las fluctuaciones generadas por el ritmo circadiano de los animales. Antes de cada prueba se adecuaron las condiciones de la cabina de observación, asegurando que el mecanismo de control de temperatura al interior de esta alcanzara la temperatura óptima de 27°C. Justo antes de cada una de las pruebas de comportamiento, las larvas fueron ubicadas en el plato experimental para su tiempo de ambientación que duró cinco minutos. Por último, durante el periodo de crianza y exposición al tratamiento, las larvas no fueron alimentadas, decisión tomada teniendo en cuenta el artículo de Hernandez et al. Que indica que no hay diferencias en el comportamiento de los animales cuando no se alimentan a partir del día 5 y hasta el día 10 post fertilización, como lo indica la guía. (Hernandez, Galitan, Cameron, Goodwin, & Ramakrishnan, 2018).

Pruebas de comportamiento

Se utilizó la cabina de observación DanioVision® que mantiene la temperatura estable. El software EthoVision® se utilizó para la programación de las pruebas de comportamiento (Figura 4), la modulación del uso de dispositivos al interior de la cabina DanioVision® como las luces, áreas, temperatura y el análisis de las variables establecidas para cada prueba, como se explica a continuación. Campo abierto: Consistió en una observación de los individuos en un intervalo de 5 minutos posterior al tiempo de aclimatación (de 5 minutos), en donde se evaluaron las variables: distancia recorrida, velocidad promedio y tiempo de inactividad.

Respuesta a estímulo: Consistió en una prueba con un tiempo total de 15 minutos en la cual, al finalizar el minuto 10, se generó un pulso de luz de 0.1 segundos y se evaluó el tiempo de reacción de los animales teniendo en cuenta las variables de elongación, distancia recorrida y velocidad.

Preferencia de color: Para esta prueba se dividió cada uno de los pozos en dos zonas, colocando un color verde de fondo hasta la mitad del pozo y dejando el otro lado

Figura 3: Diseño experimental realizado para el estudio con larvas de pez cebra de 10dpf.

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descubierto, la observación contó con una duración de 15 minutos en donde se hizo seguimiento del comportamiento de la larva en cuanto a distancia recorrida, velocidad, tiempo en cada una de las zonas y frecuencia de visita a las zonas. Ritmo circadiano: La duración total de la prueba fue de 24 horas en donde se realizó el seguimiento de la actividad de los animales una vez por segundo. Se programaron las luces de la cámara de observación para que tuvieran el mismo fotoperiodo en el que fueron criadas las larvas en el cebrario (14:10). La variable para análisis fue porcentaje de movimiento.

Análisis de datos

Para la prueba de campo abierto, se tomaron los 5 minutos posteriores al tiempo de aclimatación y se evaluaron las variables de distancia recorrida (cm), velocidad (cm/s) y tiempo sin moverse (s). En la prueba de reacción frente al estímulo de luz, se realizó un seguimiento del animal 25 veces por segundo, de modo que para el análisis de esta prueba, se utilizó un rango de tres segundos antes del estímulo de luz y de tres segundos posteriores a tal estímulo, se graficaron las diferencias de las variables de velocidad (cm/s), elongación y distancia recorrida (cm) del animal antes y después, de modo que las gráficas muestran la reacción del animal frente al estímulo. En la prueba de preferencia de color se calculó el porcentaje de tiempo (s) de permanencia del animal en cada zona. Por último, la prueba de ritmo circadiano consistió en medir el porcentaje de actividad del animal durante el periodo de 24 horas en el periodo de luz y de oscuridad.

Para el análisis estadístico se utilizó un alfa de 0.05 y los datos fueron analizados por medio de una prueba T estudiante. En todas las pruebas propuestas para la presente pregunta de investigación se compararon los datos obtenidos en los individuos tratados con nanopartículas funcionalizadas con aquellos pertenecientes al control.

Figura 4: Condiciones de las pruebas de comportamiento consideradas para el presente estudio. En la primera columna se encuentra el nombre de la prueba, en la segunda la duración, en la tercera el estímulo utilizado y en la cuarta, las variables medidas en los individuos evaluados.

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Los datos fueron representados por medio de un diagrama de barras en donde se muestra el error estándar de los datos, así como los datos significativos obtenidos a partir de la prueba T por medio de un asterisco en la barra correspondiente

RESULTADOS

Los diferentes grupos de tratamiento con las nanopartículas mostraron cambios en su comportamiento, algunos de manera significativa. El resumen de los resultados se puede observar en las gráficas de la figura 5 a 9. Campo abierto

Los individuos evaluados en esta prueba de comportamiento mostraron variabilidad en su comportamiento.

Los animales en la funcionalización S4 evaluados a los 6dpf, mostraron una diferencia significativamente mayor en la distancia recorrida a 10 ug/ml (p=0.015), pero significativamente menor en el “tiempo recorrido” (p=0.023). Igualmente, la velocidad en este grupo fue más alta que en los controles, aunque no alcanzó significancia estadística (p=0.054) (Figura 5A, C y E). Ninguna de estas variables fue significativa en la concentración de 100 mg/ml).

Los animales en la funcionalización S6 evaluados a los 6dpf, recorrieron distancias menores y a más baja velocidad que los controles, aunque no alcanzaron significancia estadística (p=0.057) (Figura 5, A y C).

En cuanto a los tratamientos evaluados a los 10dpf en concentraciones de 10 ug/ml, se reportaron valores inferiores en las variables de distancia y velocidad únicamente en el tratamiento S5 (p=0.019 y p= 0.001). De manera congruente, el “tiempo sin movimiento” fue significativamente mayor (p=0.0008) (Figura 5, B, D y F).

En la misma edad de 10 dpf a 100ug/ml, los individuos expuestos al nanocompuesto S1 en las variables de distancia y velocidad, fueron significativamente inferiores (p=0.03) y mayor en la variable de “tiempo sin movimiento” (p=0.026). Por otro lado, el tratamiento con S4 tuvo una distancia recorrida mayor que el control (p= 0.043), pero a menor velocidad (p=0.03) y “tiempo sin movimiento” (p=0.008). En cuanto al tratamiento con S6, se recorrió una distancia significativamente inferior que el control (p=0.051).

Tanto en la edad de 6dpf como en la de 10 dpf, en las variables de distancia y velocidad (figura 5, A-D) para la funcionalización de S6, se observa un patrón particular, en el que el recorrido de una distancia corta se da a una gran velocidad siendo significativos únicamente los valores para la concentración de 100µg/ml (barras azules).

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Figura 5: Prueba de campo abierto. En el lado izquierdo del panel se muestran los datos para la edad de 6dpf y al lado derecho, los de 10dpf. Agrupados según a variable calculada: en la parte superior están las gráficas de distancia recorrida, en el medio, las gráficas de velocidad y en la parte inferior, las gráficas de tiempo sin actividad motora. Se graficó por pares de barras en donde las barras de color azul, hace referencia a los valores para la concentración de 100µg/ml y las azules de 10 µg/ml. Sobre las barras está graficado el error estándar y con un asterisco, aquellos valores que fueron significativos.

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Prueba de respuesta a estímulo (luz) Esta prueba se realizó mediante el delta (diferencia) entre antes y después de un estímulo de luz (0.1s), en las variables de velocidad, distancia y elongación. La significancia estadística fue calculada por la comparación de la sensibilidad (tiempo de reacción) entre los animales tratados y los animales de control (Figura 6 y 7). - Concentración de 100µg/ml

Las pruebas realizadas con animales expuestos a una concentración de 100µg/ml de nanopartículas demostraron que el comportamiento de los animales tratados es significativamente diferente al de los controles (Figura 6). Los grupos tratados tuvieron comportamientos que los distinguía de los controles por dos características esenciales. Algunos grupos mostraron una alta sensibilidad al estímulo de luz, mientras que otros no reaccionaron. Este comportamiento ocurrió de manera similar a las dos diferentes edades evaluadas. Larvas evaluadas a los 6 dpf pertenecientes a los tratamientos S1, S2 y S3 mostraron gran sensibilidad al estímulo, reflejado en una alta diferencia en las variables correspondientes a la velocidad (p=2.49 x 10-30, p=2.95 x 10-31 y p=2.79 x 10-31, respectivamente) , y distancia recorrida (p= 2.45 x 10-35, p=9.82 x 10-36 y p=5.23 x 10-36, respectivamente) (Figura 6, A y C). En consecuencia, tales tratamientos (S1, S2 y S3) presentaron menor elongación (p= 0.003, p=0.007 y p=4.1 x10-05). En contraste, los individuos del resto de tratamientos tuvieron una reacción mucho más baja al estímulo en cuanto a la velocidad y distancia, destacando una mayor diferencia en la variable de elongación en los tratamientos S2, S4 y S6 (p= 2.71 x 10-7, p= 0.02 y p=1.57 x10-23). Las larvas evaluadas a los 10 dpf, mostraron menor variabilidad en los aspectos de velocidad y distancia (Figura 6, B y D). Los animales en el tratamiento de S1, mostraron una elevada sensibilidad al pulso de luz, evidenciada en la velocidad y distancia recorridas (p=0.002 y 0.069), mientras que los individuos pertenecientes a los tratamientos S2-S7 no mostraron reacción alguna al estímulo. En la variable de elongación, se observó que individuos bajo el tratamiento de S2 y S3 mostraron mayor diferencia (p= 0.001 y p=6.40x10-

05) (Figura 6F) que los controles. Los grupos S 6 y S7 no mostraron diferencias significativas en la variable de elongación. Entre las dos edades evaluadas, se observaron comportamientos similares en las variables de velocidad y distancia en los tratamientos S1, por provocar una alta diferencia en las variables. Mientras que en los tratamientos S4-S7, se observa una diferencia menor al control.

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Figura 6: Prueba de estímulo de luz para la concentración de 100µg/ml. En la columna izquierda del panel se muestran los datos para la edad de 6dpf y al lado derecho, los de 10dpf. Agrupados horizontalmente según a variable mostrada en el eje Y. Sobre las barras está graficado el error estándar y con un asterisco, aquellos valores que fueron significativos.

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- Concentración de 10µg/ml

En los tratamientos evaluados a una concentración de 10µg/ml (Figura 7), se evidenció un menor efecto de los nanocompuestos respecto al control. En individuos de 6dpf, solo hubo diferencias significativas en los grupos S3 y S6 en las variables de distancia (p=1.65 x 10-06 y p=0.03) y velocidad (p=1.65 x10-06 y p=0.032), siendo estas mayores que el control (Figura 7A y 7C). Mientras que, en la variable de elongación, los tratamientos S3 - S6 fueron significativamente menores que el control siendo S3 y S4 los tratamientos en los cuales se cuantificó una menor elongación entre todos los nanocompuestos (p=7.17 x10-07 y p=1.16 x10-08) (Figura 7E). En individuos evaluados a los 10 dpf, todos los datos significativos se caracterizan por ser mayores al control. En las variables de distancia y velocidad, se observaron diferencias significativas en los tratamientos S5 (p= 6.34 x10-06, p=7.35 x10-06) y S6 (p=2.31x10-05, p=3.25 x10-04) (Figura 7B y 7D). Y en la variable de elongación, las diferencias significativas fueron observadas en los tratamientos S1 y S4-S7 (Figura 7F). En individuos de ambas edades y en todas las variables, los animales en el tratamiento con S6, se comportaron de manera significativamente distinta al control, mostrando una mayor sensibilidad al efecto del pulso de luz. En cuanto al tratamiento de S4 en los individuos de menor edad, se presenta una diferencia menor a la del control, mientras que a los 10 dpf, la diferencia en su reacción es mayor que en el control.

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Figura 7: Prueba de estímulo de luz para la concentración de 10µg/ml. En el lado izquierdo del panel, se muestran los datos para la edad de 6dpf y al lado derecho, los de 10dpf. Agrupados horizontalmente según a variable mostrada en la parte lateral izquierda del panel. En el área superior están las gráficas de distancia recorrida, en el medio, las gráficas de velocidad y en la parte inferior, las gráficas de elongación. Sobre las barras está graficado el error estándar y con un asterisco, aquellos valores que fueron significativos.

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Preferencia de color Entre todas las pruebas ejecutadas, la prueba de preferencia de color fue la menos sensible, mostrando pocas diferencias entre los grupos tratados y los controles. En el tratamiento evaluado a los 6 dpf en 100ug/ml (Figura 8A), solo el tratamiento S6 pasó significativamente menor tiempo en la zona verde que el control (p=0.03). Por otro lado, en tratamientos evaluados a los 10dpf, bajo una concentración de 100ug/ml (Figura 8B), el tratamiento S3, también estuvo en la zona verde en un tiempo significativamente mayor que el control (p= 0.012). Mientras que el tratamiento S7 registró un tiempo significativamente menor al control (p=0.049). Los individuos evaluados a la misma edad, pero en una concentración menor de 10ug/ml (figura 8D), solo fueron significativos los comportamientos del tratamiento S2, reportando un mayor tiempo en la zona verde que el control (p=0.02).

Figura 8: Prueba de preferencia de color. En el lado izquierdo del panel, se muestran los datos para la edad de 6dpf y al lado derecho, los de 10dpf. En la parte superior se encuentran los datos correspondientes a la concentración de 100µg/ml y en la parte inferior, aquellos correspondientes a la concentración de 10µg/ml. Las barras están divididas en dos colores en donde la zona verde representa la cantidad de segundos en la que el pez estuvo en la zona verde del pozo, por ende, el tiempo restante, representado por la zona blanca de la barra, representa el tiempo transcurrido en el resto del pozo. Sobre las barras se representó el error estándar de la muestra y con un asterísco (*) aquellos datos significativos.

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*

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A B

C D

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Prueba de Ritmo Circadiano

En términos generales, en los individuos tratados y evaluados bajo esta prueba de 24 horas, se puede observar que presentan un porcentaje de actividad superior que el control en la mayoría del tiempo (Figura 9). En varias ocasiones, los picos de actividad de los grupos tratados y el control coinciden en fase; pero por lo general, el pico de actividad de los animales tratados, tienen mayor amplitud que el control.

Ya que los peces cebra son diurnos, para el ritmo circadiano se esperan curvas de alta actividad en el día y baja actividad en la noche. Los comportamientos representados en las gráficas muestran diferencias en cuanto a lo esperado. Tan solo determinados experimentos bajo condiciones específicas, aquellos que muestran una curva circadiana típica, en dónde al apagarse las luces del sistema, el porcentaje de actividad decrece.

Los grupos con despliegue de comportamientos esperados fueron S1, S2 y S3 en edades de 6 dpf y 10 dpf a concentraciones de 100 µg/ml. No obstante, hubo gráficas en las cuales las larvas mostraron una disminución en sus actividades en las horas de oscuridad; sin embargo, tal inactividad no fue constante durante toda la noche. Los tratamientos que mostraron este comportamiento fueron S4, S5, S6 y S7 en ambas edades evaluada a una concentración de 10 µg/ml.

Para las gráficas restantes, se observan inconsistencias en el comportamiento circadiano tanto para los individuos del tratamiento como para los del control, en donde parece que éste no se ve afectado por la luz. Siendo contradictorio con el ritmo circadiano que corresponde al de un animal diurno.

En cuanto a la actividad observada en los tratamientos cuyas gráficas corresponde a las expectativas, se puede observar que el comportamiento de los animales tratados (figura 9, línea azul) es más sensible que el control (figura 9, línea naranja) al momento en el que las luces se encienden. Incluso cuando los individuos se encuentran en fase oscura, prevalece esta diferencia de actividad siendo superior la de los individuos tratados.

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Discusión El uso del pez cebra como bio-modelo para estudios de toxicología ha probado ser efectivo en cuanto a la evaluación de fármacos y drogas narcóticas; sin embargo, son pocos los estudios comparativos del uso de estos animales en cuanto a la experimentación con nanomateriales (Fako & Furgeson, 2009). Los nanocompuestos disueltos en el agua están siendo actualmente evaluados por su efectividad para la remediación de aguas contaminadas (Mohmood et al., 2013). Por la emergencia de este campo de la nanotecnología como solución a las problemáticas actuales ambientales, es necesario tener modelos de evaluación eficientes y eficaces para examinar su impacto en los seres vivos. Este estudio es parte de la evaluación del posible impacto del uso de nanocompuestos en los ecosistemas acuáticos, midiendo el efecto de tales tratamientos en los cambios comportamentales de los individuos. Los comportamientos evaluados fueron la actividad locomotora, reacción ante el estímulo de luz, preferencia al color y posibles irregularidades en su ritmo circadiano. -Análisis del comportamiento En el estudio fueron observados varios comportamientos destacables, entre los cuales, muchos de ellos parecen ser compatibles con comportamientos ansiosos (Spence, 2011). Demostrando que, así como en estudios con otras nanopartículas, los nanocompuestos magnéticos evaluados podrían tener repercusiones importantes en el desarrollo etológico de las larvas de pez cebra. La prueba de comportamiento que demostró mayor efectividad por provocar un mayor despliegue de comportamientos significativamente distintos a los animales pertenecientes al control fue la de estímulo de luz. En general, los tratamientos S1, S2 y S3 a altas concentraciones, se caracterizaron por tener una alta diferencia de comportamiento frente al estímulo. En el tratamiento con menor concentración, los nanocompuestos S4, S5 y S6 presentan mayor sensibilidad al pulso de luz. Dentro de los comportamientos observados en la prueba del estímulo de luz, cabe destacar los altos niveles de actividad locomotora en peces sometidos al tratamiento S1, cuya convención corresponde al nanocompuesto de Magnetita sin ninguna funcionalización. El fenómeno locomotor fue observado en individuos tratados a una concentración de 100ug/ml y el efecto se presentó de manera independiente en ambas edades evaluadas en donde el tratamiento mostró alta sensibilidad al estímulo aplicado, generando mayor distancia y velocidad recorrida luego del flas de luz. La presencia de magnetita en el cuerpo de animales acuáticos incluyendo teleósteos como el pez cebra, juega un papel importante en la detección de campos magnéticos presentes en el hábitat. Estudios previos muestran presencia de células especializadas en la contención de magnetita en el bulbo olfatorio y en asociación con la línea lateral, órgano importante para la geolocalización del animal en su medio (Kirschvink et al., 2011). Varias otras especies incluyendo los elasmobranquios y aves, comparten estas similitudes. Estos han evolucionado en el uso de pequeños cristales de magnetita ubicados en los principales órganos sensoriales que sirven para la orientación espacial, principalmente en aquellos que poseen hábitos migratorios (Kirschvink et al., 2011; Walker, Kirschvink, & Dizon, 1985). Por estas razones, es probable que, en el presente experimento, la presencia de magnetita sin ninguna funcionalización pudo haber sido asimilada con mayor facilidad por las larvas en

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estadíos de desarrollo y crecimiento. Tal evento pudo alterar funciones con las que naturalmente se encuentra relacionada que es la ubicación espacial y, por ende, la locomoción. Lo que podría explicar las razones por las cuales este nanocompuesto pudo haber generado una respuesta locomotora más alta frente al estímulo. Para corroborarlo, haría falta realizar experimentos en los cuales se estudie la posible bioacumulación de tal compuesto en el organismo y su efecto en facultades como la geolocalización midiendo variables como el cambio de dirección, ángulo de giro y los efectos en presencia de un campo magnético en el medio. Por otro lado, en la prueba de campo abierto, hubo un comportamiento particular observado para el tratamiento S6. Independiente de la edad o de la concentración, los individuos tratados con S6, recorrieran distancias muy cortas a velocidades superiores al resto de los tratamientos (ver figura 5D y 5E). El compuesto en cuestión es Magnetita con la funcionalización de 3-(triethoxysilylpropyl) Succini anhydride. Según la ficha técnica de tal funcionalización, el químico posee la característica de formar enlaces entre compuestos orgánicos e inorgánicos para formar complejos entre ambos compuestos deseados, o generar ambientes heterogéneos (Gelest, 2014). Por tal motivo, ha sido empleado en el desarrollo de nanopartículas útiles en campos como la biomedicina como agente antibacterial, contra bacterias Gram-positivas (E.coli) y gran-negativas (S.aureus)(Wu, Xu, Cai, Zang, & Li, 2014), y también como antiviral y antitumoral, ofreciendo una alternativa para la aplicación de medicamentos en zonas específicas del cuerpo (Bogner et al., 2014). Estudios toxicológicos demuestran biocompatibilidad de tal funcionalización con células humanas del epitelio alveolar (Antoinette Mbeh, 2014). Sin embargo, poco se sabe del efecto que pueda tener en la toxicidad en animales expuestos o en remediación de agua contaminada. No obstante, la caracterización de los comportamientos descritos en los animales expuestos a este compuesto muestra compatibilidad con comportamientos de ansiedad (Kalueff & Cachat, 2011)y poco comunes, que podrían deberse a la formación de complejos inorgánicos (magnetita) y orgánicos (tejido nervioso) en relación con el estudio hecho en tejido alveolar, el cual muestra un efecto en el cambio metabólico de células expuestas a tal compuesto. Para tal fin, sería necesario el estudio de la posibilidad de bioacumulación y efecto en la actividad nerviosa debido a la presencia de 3-(triethoxysilylpropyl) Succini anhydride en el sistema del pez cebra. Respecto a los comportamientos observados en este experimento, se encuentran similitudes con estudios preliminares de toxicología en donde la exposición del pez cebra a nanopartículas de distintos compuestos revelan cambios en el comportamiento del individuo. Tal es el caso de las nanopartículas de sílica que genera cambios en la preferencia al color y comportamientos comparables con el Parkinson (Li et al., 2014). Por otro lado, las nanopartículas de níquel producen cambios de comportamiento en larvas y peces adultos retrasando la respuesta de evasión y alterando funciones locomotoras. Parte de las conclusiones que los autores dan frente a este estudio apuntan a que los peces, debido a su exposición al níquel en etapas de desarrollo, generaron malformaciones y puede que alguna de éstas haya influido en la formación de memoria de corto plazo frente a estímulos que parecen ser amenazantes para el pez y en la coordinación locomotora del individuo (Nabinger et al., 2018). Por otro lado, un estudio que evaluó las nanopartículas de plata, ampliamente utilizadas en la industria debido a sus propiedades antifúngicas y antibacteriales, reportó comportamientos de hiperactividad en larvas de pez cebra, descritos como distancias recorridas a altas velocidades (Ašmonaitė, Bresolin de Souza, Wassmur, Sturve, & Boyer, 2016). En particular, este comportamiento es similar al observado en el presente estudio en el caso del tratamiento con magnetita (S1) en donde, así como el estudio realizado con nanocompuestos de plata, los individuos tienen un

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despliegue de actividad locomotora mucho mas alta que los del control. En general, comparado con tratamientos a concentraciones de 10ug/ml, los tratamientos de 100ug/ml evaluado desde las 4hpf hasta los 6dpf, mostraron un mayor efecto en la reacción frente a las pruebas del estímulo de luz y anomalías locomotoras en campo abierto. Teniendo en cuenta los resultados de este estudio, se puede afirmar que se rechaza la hipótesis nula que enunciaba que ningún cambio comportamental se produciría al exponer larvas de pez cebra a nanocompuestos magnéticos. -Extrapolación a un escenario real Las concentraciones experimentadas en los tratamientos posiblemente no serían las mismas encontradas en el ecosistema, puesto que las concentraciones que podrían encontrarse serían mucho más bajas, producto de un residuo industrial, dado el caso de que este procedimiento sea avalado como método de remediación. Sin embargo, siendo este estudio una evaluación toxicológica, se buscaba encontrar la concentración bajo la cual las consecuencias para los organismos a estos compuestos podrían llegar a ser dañinos y establecer una curva sobre la cual se permita un grado máximo de presencia de tales nanocompuestos en el ambiente. -Consideraciones para el presente estudio Tipos de Pruebas comportamentales Pese a tener una fuerte base teórica como fundamento de las pruebas diseñadas, dos de éstas no mostraron resultados concluyentes. Por un lado, la prueba de preferencia de color no demostró alguna relación entre los individuos y las zonas del pozo delimitadas con colores distintos. En esta prueba se esperaba que los animales prefirieran la zona menos luminosa y de color verde; sin embargo, no se observó alguna tendencia relacionada a lo reportado en la literatura. Esto pudo deberse a que debido al contraste del fondo del pozo (background), el programa EthoVision® no pudiera hacer un seguimiento efectivo de los individuos, perdiendo el rastro de estos en largos periodos de tiempo. También pudo haber sido una falta de medición de las frecuencias de onda de luz visible en cada zona, de modo que se asegura de que el pez pudiera diferenciar ambos colores, tomando como referencia pruebas previas en las que se ha establecido este rango de visibilidad para larvas. Por otro lado, en la prueba de ritmo circadiano la mayoría de los resultados, tanto en el control como en los tratamientos, presentaron muchas irregularidades. Todas las curvas de actividad circadiana no fueron las esperadas. Esto pudo haberse debido a cambios inesperados en cuanto a la programación de las luces durante el periodo de observación. Sin embargo, en los casos en donde hubo un ritmo circadiano en la locomoción, las actividades durante los periodos de luz y oscuridad fueron evidentes, y lo esperado para la especie, con aumento en la amplitud (actividad) en los animales tratados, comparados con el control.

CONCLUSIONES

La exposición de larvas de Danio rerio a la presencia de nanopartículas magnéticas tiene algunos efectos en su comportamiento a las altas concentraciones evaluadas.

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Magnetita y Magnetita + 3-(triethoxysilylpropyl) Succini anhydride tiene cambios profundos en la velocidad de los animales, aunque la distancia recorrida es corta, independiente de la edad de tratamiento.

Podría ser probable que la Magnetita altera la percepción de luz, o hay un cambio cognitivo en el que hay mayor sensibilidad a los cambios intempestivos en el ambiente.

Se recomienda hacer estudios enfocados a la bioacumulación de estas nanopartículas magnéticas en el tejido nervioso para determinar qué tan afines son los compuestos con este tipo de tejido durante las primeras etapas del desarrollo del pez cebra. Además, es necesario criar las larvas a edades fértiles para determinar el efecto en fecundidad.

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