departamento de reproduÇÃo animal - teses.usp.br · (bos taurus indicus) e 20 da raça simental...

UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA

DEPARTAMENTO DE REPRODUO ANIMAL

MARIANA DE PAULA RODRIGUES

Perfil oxidativo e avaliao funcional de smen

criopreservado de touros (Bos taurus taurus e Bos taurus

indicus) criados em clima tropical

So Paulo 2009

MARIANA DE PAULA RODRIGUES

Perfil oxidativo e avaliao funcional de smen

criopreservado de touros (Bos taurus taurus e Bos taurus

indicus) criados em clima tropical

So Paulo 2009

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Reproduo Animal da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Medicina Veterinria Departamento: Reproduo Animal rea de concentrao: Reproduo Animal Orientadora: Prof. Dra. Valquiria Hyppolito Barnabe

Autorizo a reproduo parcial ou total desta obra, para fins acadmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAO-NA-PUBLICAO

(Biblioteca Virginie Buff Dpice da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo)

T.2177 Rodrigues, Mariana de Paula FMVZ Perfil oxidativo e avaliao funcional de smen criopreservado de touros (Bos

taurus taurus e Bos taurus indicus) criados em clima tropical / Mariana de Paula Rodrigues. So Paulo : M. P. Rodrigues, 2009.

144 f. : il.

Dissertao (mestrado) - Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia. Departamento de Reproduo Animal, 2009.

Programa de Ps-Graduao: Reproduo Animal. rea de concentrao: Reproduo Animal.

Orientadora: Profa. Dra. Valquiria Hyppolito Barnabe.

1. Bovino. 2. Smen criopreservado. 3. Clima tropical. 4. Perfil oxidativo.

5. Testes funcionais. I. Ttulo.

FOLHA DE AVALIAO

Nome: RODRIGUES, Mariana de Paula.

Ttulo: Perfil oxidativo e avaliao funcional de smen criopreservado de touros (Bos taurus taurus e Bos taurus indicus) criados em clima tropical

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Reproduo Animal da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Medicina Veterinria

Data:____/____/____

Banca Examinadora

Prof. Dr. _______________________ Instituio: ______________________

Assinatura: _______________________ Julgamento:______________________





DEDICATRIA

As grandes caminhadas sempre comeam com o primeiro passo

Lembram disso? Pois , outro passo foi dado e mais uma vez vocs estavam

aqui do meu lado. Confiaram em mim, apoiaram minhas decises, deram

conselhos, construram uma base forte para que tudo isso pudesse

acontecer e fizeram o possvel e o impossvel para me ajudar.

Por isso, dedico este trabalho, esta conquista e todas que esto por

vir minha FAMLIA que, no fosse o que fizeram por mim durante

meus 25 anos, eu no estariam aqui, na verdade, eu no seria

ningum.

AGRADECIMENTOS

Agradeo de todo meu corao:

Deus, por me dar a vida, por me abenoar com sade, com uma famlia

maravilhosa, amigos incomparveis e pessoas inesquecveis, pelas oportunidades,

pelo fato de poder acordar todas as manhs, pelas janelas fechadas e portas

abertas.

Aos meus pais Manuel e Elizabeth, primeiramente pela criao com tanto amor e

carinho, pela educao, por todo apoio em todos os momentos, pela compreenso,

pelos conselhos, pelos sacrifcios, pelas abdicaes, por me ensinarem o significado

das palavras persistncia e esforo, agradeo todas as broncas e puxes de orelha,

para que hoje eu pudesse ser quem sou, e estar onde estou. difcil colocar o

quanto sou grata em apenas, algumas linhas. Simplesmente, agradeo, por serem

pessoas to maravilhosas, verdadeiros exemplos de vida, quem dera eu conseguir

retribuir, pelo menos, um pouco o que fizeram por mim. OBRIGADA!!!

minha av Maria, pela pacincia, pelos ensinamentos, pelas oraes dirias, por

acordar cedinho s para preparar o caf da manh e o almoo, pelas preocupaes,

pelo esforo em me ajudar no que precisei.

s minhas irms Juliana e Fernanda, por estarem ao meu lado em todos os

momentos, por compartilharem no apenas roupas, mas tambm palavras e gestos

de carinho.

Dra. Valquria, uma mulher de fibra, que atravessou tantos momentos

turbulentos sem perder o bom humor. Muito obrigada por ter aceitado me orientar

sem mesmo conhecer meu trabalho, por depositar toda sua confiana em mim.

Espero no ter decepcionado.

Ao Dr. Renato, pela pacincia, pelas conversas, por todas as contribuies, no

apenas ao meu experimento, mas tambm vida da Reproduo Animal. O

senhor um verdadeiro exemplo para ns que ainda engatinhamos.

Maria Amlia, por estar sempre ao meu lado nas horas mais desesperadoras que

aconteceram dentro da sala do HPLC, por se desdobrar e correr atrs de ajuda

para nosso experimento, pelos conselhos, conversas, risadas, uma verdadeira

AMIGA!

Ao Marclio por ter me ajudado desde o comecinho, por ter me ensinado tantas

coisas, pela pacincia em explicar milhes de vezes a reao da peroxidao

lipdica, pelas estatsticas, pelos churrascos, pelas reunies em casa com pratos

variados (hummm!!!!). Obrigada M, espero que seja uma amizade para sempre.

Ao Du e Paty, por compartilharem momentos bons e ruins, por me ouvirem

quando eu precisei desabafar, pelos conselhos, pelo apoio, pela ajuda, pelas

risadas, por compartilhar diversos assuntos profissionais (e outros nem tanto

assim) enfim por estarem sempre ao meu lado. Amigos, Amigos, Amigos.....

Paola, por ajudar tantas vezes com FAPESP, congresso, experimento, por ser

sincera, alegre e realista.

Aos membros do Laboratrio de Urologia da UNIFESP: Ricardo, Brbara, Paulinha,

Thiesa, por me receberem to bem no laboratrio, pela loooooooonga ajuda com o

cometa, pela ateno, pelos almoos, pelas horas de descontrao. Sem vocs no

teria conseguido.

Ao Prof. Pietro, por ter aberto as portas do VRA para mim quando deu a

oportunidade e o privilgio de estagiar em sua equipe, e pelos ensinamentos em

aula.

Ao Prof. Claudio, por ter me aceitado como monitora em suas aulas de graduao.

Espero ter feito tudo certinho.

Ao Prof. Rubens, por ter permitido que eu acompanhasse trabalhos no Laboratrio

de Biotecnologia do Smen e Andrologia e pelos ensinamentos passados, tanto

dentro da sala de aula, como fora dela.

Ao Prof. Marcelo, pela serenidade e pacincia e pelo timo trabalho que faz com a

ps-graduao do nosso departamento.

Profa. Mayra e Marcela, pelas empolgantes aulas na ps graduao, que me

fizeram at gostar de biologia molecular.

Profa. Aneliese, por passar tantos conhecimentos sobre pequenos ruminantes e

por se preocupar com o aprendizado dos alunos.

Ao Prof. Visintin, sempre amvel e alegre. Um grande homem, exemplo de esforo

e competncia.

Ao Prof. Ed, Profa. Camila, Profa. Carla, pelo convvio, pelo aprendizado e por

estarem sempre dispostos a colaborar.

Suzana, colega de monitoria, por ter apoiado e acompanhado todas as

turbulncias do trabalho. S a gente sabe n Su...

Ao Miguel, por ter me ensinado, com toda pacincia do mundo, a coletar smen dos

touros e dos carneiros e a ser uma pessoa mais organizada.

Aos meninos Ira, Belau e Luis por disponibilizarem seu tempo para preparar os

animais para as coletas.

Harumi, Thais e Alice pela competncia, por ajudarem com tantos papis (que s

vezes nem sabia que eram necessrios), por nunca deixarem que perdesse os

prazos e pela amabilidade com que atendem.

D. Silvia, pelo cafezinho, pelo ch, por manter sempre limpo o laboratrio e todo

o departamento.

Ana Paula Mantovani, ex-professora e agora colega, por ter despertado em mim o

gosto pela reproduo animal e por ter me ajudado tanto quando eu no sabia que

rumo seguir.

famlia Bao muito obrigada por me receberem to bem em casa e na famlia, pela

hospitalidade, por me ensinarem uma cultura diferente, pela pacincia em tentarem

se comunicar com quem mal entende a lngua (um dia eu consigo). Aos cunhados

por emprestarem o carro e at o quarto.

Ao Fabin (Morsitooo!!), por ter me dado tanta fora no experimento, na clnica e

na vida, por ter me mudado para melhor, por ter me mostrado tantas

oportunidades e tambm, por ter feito ver que EU dirijo bem melhor!!! (rsrsrs)

TQM!!!

Ao Paulo Holanda, pelas conversas e por me ensinar todas as tcnicas que utilizei

nesse experimento.

Aos veterinrios Marli e Giuseppe, por me aceitarem apesar de todas minhas

limitaes, pela pacincia, por tanto conhecimento que passaram e pela confiana

que depositaram em mim.

Aos colegas de VRA: Lindsay, Andrs, Gabriel, Z Nlio, Alessandra, Henderson,

Roberta, Rogrio, Rodrigo(S), Taty, Lilian, Marina, Marrie, Priscila, Cinthia,

Dominique, Paulo, Zeca, Flavia, Feben, Renata, Adriano, Cris, Liege...... So

tantos!!! Muito obrigada todos (inclusive os que eu no citei o nome).

Universidade de So Paulo, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia e ao

Departamento de Reproduo Animal.

Com certeza aprendi muitas coisas nos 32 meses em que passei nesse

departamento. Convivi com tantas pessoas diferentes, me deparei com diversas

situaes, algumas delas bem difceis, fiz muitos amigos, muitos colegas,

infelizmente, alguns eu nem tive a oportunidade de conhecer. Enfim, foram alguns

meses que me fizeram evoluir anos, no apenas no mbito profissional, mas,

principalmente, na vida pessoal.

RESUMO

RODRIGUES, M. P. Perfil oxidativo e avaliao funcional de smen criopreservado de touros (Bos taurus taurus e Bos taurus indicus) criados em clima tropical. [Oxidative status and functional evaluation of cryopreserved semen, collected from bulls (Bos taurus taurus and Bos taurus indicus) raised under tropical conditions]. 2009. 144 f. Dissertao (Mestrado em Medicina Veterinria) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2009.

A necessidade de criopreservao seminal vem aumentando cada vez mais,

concomitantemente evoluo das biotecnologias aplicadas reproduo animal.

Sabe-se que a principal causa da diminuio do desempenho reprodutivo de um

touro, criado em clima tropical, o estresse trmico. Raas de origem europia

(Bos taurus taurus) so consideravelmente mais sensveis essas condies

climticas quando comparadas aos animais de origem indiana (Bos taurus indicus).

Esses animais no adaptados podem apresentar decrscimo na qualidade

espermtica, como alteraes estruturais, funcionais e maior suscetibilidade ao

estresse oxidativo, aps a descongelao do smen. Para avaliar essa hiptese,

foram utilizadas amostras criopreservadas de 40 touros, sendo 20 da raa Nelore

(Bos taurus indicus) e 20 da raa Simental (Bos taurus taurus), criados em clima

tropical, dessas, 10 amostras seminais de cada raa foram coletadas durante

inverno e 10 durante o vero. Aps a descongelao das amostras, foram

realizados os testes espermticos convencionais como motilidade progressiva, vigor

e ndice de motilidade espermtica, e os testes funcionais tais como integridade de

membrana plasmtica (Eosina/Nigrosina), integridade acrossomal (POPE),

integridade de DNA (Ensaio Cometa) e atividade citoqumica mitocondrial (33

diaminobenzidina DAB). Tambm foi avaliada a suscetibilidade das clulas

espermticas peroxidao lipdica induzida, atravs da mensurao da

concentrao de substncias reativas ao cido tiobarbitrico (TBARS). Os dados

foram analisados levando em conta as classes: raa (Nelore e Simental) ou estao

do ano (vero e inverno), atravs do programa SPSS 13.0 para Windows. A

varivel DAB I foi maior (p=0,04) nas amostras dos touros Nelore em comparao

com Simentais (17,85 2,38 vs 11,4 1,84). Observou-se o efeito das estaes do

ano sobre as variveis motilidade progressiva (26,50% inverno e 13,30% vero;

p=0,02), DAB I (22,32% inverno e 13,30% vero; p=0,04) e DAB III (13,88%

inverno e 22,10% vero; p=0,01), somente no smen dos touros Nelore, e o efeito

das raas (p=0,03) sobre as variveis DAB I (22,34% Nelore e 11,60% Simental) e

DAB III (13,88% Nelore e 21,19% Simental), apenas durante o inverno, quanto ao

nvel de TBARS, no foi verificado diferena entre nenhum grupo. Houve correlao

entre alguns testes funcionais e convencionais, porm a varivel integridade de

DNA no correlacionou com nenhum teste convencional. Esses resultados podem

indicar que a peroxidao lipdica sofrida, espontaneamente, pelos touros Europeus,

devido ao estresse trmico, selecionou espermatozides mais resistentes

criopreservao.

Palavras-chave: Bovino. Smen criopreservado. Clima tropical. Perfil oxidativo.

Testes funcionais.

ABSTRACT

RODRIGUES, M. P. Oxidative status and functional evaluation of cryopreserved semen, collected from bulls (Bos taurus taurus and Bos taurus indicus) raised under tropical conditions. [Perfil oxidativo e avaliao funcional de smen criopreservado de touros (Bos taurus taurus e Bos taurus indicus) criados em clima tropical]. 2009. 144 f. Dissertao (Mestrado em Medicina Veterinria) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2009.

Seminal cryopreservation technique has been increasing concomitant reproductive

biotechnologies. It is known that heat stress is the main cause that affects bulls

reproductive performance under tropical environment. European breeds (Bos taurus

taurus) are much more sensible to these conditions than Indian breeds (Bos taurus

indicus). These non-adapted animals present a fast decrease in sperm quality as

structural and functional parameters and higher oxidative stress susceptibility. In

order to test this hypothesis, cryoprotected semen samples of twenty Nelore (Bos

taurus indicus) and twenty Simmental (Bos taurus taurus) bulls, raised under

tropical conditions, were analyzed; ten samples of each breed were collected during

summer and ten during winter. After thawing, semen samples were submitted to

following conventional tests: progressive motility, vigor and sperm motility index

(IME), and following functional tests: plasmatic membrane integrity (eosin-

nigrosin), acrosomal membrane integrity (POPE), DNA fragmentation (Comet

Assay) and mitochondrial activity (33 diaminobenzidine - DAB). The spermatozoa

susceptibility to the induced lipid peroxidation followed by measurement of

thiobarbituric acid reactive substances concentration (TBARS), was used as an

oxidative stress index. Statistical analysis were performed for breed (Nelore and

Simmental) and season (summer and winter), using SPSS 13.0 for Windows.

Comparing Nelore and Simmental, DAB I was higher (p=0,04) in the first group

(17,85 2,38 and 11,4 1,84, respectively). Season effect was observed only in

Nelore samples on: progressive motility (26,50% winter and 13,30% summer;

p=0,02), DAB I (22,32% winter and 13,30% sumer; p=0,04) and DAB III (13,88%

winter and 22,10% summer; p=0,01); and breed effect (p=0,03) was observed

only during winter on: DAB I (22,34% Nelore and 11,60% Simmental) and DAB III

(13,88% Nelore and 21,19% Simmental). TBARS index, did not differ in breed or

season. Correlations were observed between some of functional and conventional

tests, however, the DNA integrity did not correlate with any conventional test.

These results may indicate that probably, the spontaneous peroxidation that

European bulls suffer due to the heat stress may have selected sperm more

resistant to the cryopreservation.

Keywords: Bovine. Cryopreserved semen. Tropical conditions. Oxidative status.

Functional tests.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Esquema da clula espermtica e seus componentes ........................ 39

Figura 2 - Touro da raa Nelore (Bos taurus indicus) ....................................... 66

Figura 3 - Touro da raa Simental (Bos taurus taurus) ..................................... 67

Figura 4 - Ilustrao esquemtica dos procedimentos experimentais.................. 69

Figura 5 - Eosina-Nigrosina. Espermatozide com a membrana plasmtica ntegra

(a cima) e no ntegra (abaixo).Obj. 100x ...................................... 72

Figura 6 - Colorao simples de POPE. Espermatozide com acrossomo ntegro.

Obj. 100x .................................................................................. 73

Figura 7- Colorao simples de POPE. Espermatozide com acrossomo no ntegro.

Obj. 100x .................................................................................. 73

Figura 8 - Fracionamento do smen in natura e com mitocndrias inativas ......... 74

Figura 9 - Diaminobenzidina. Espermatozide DAB I (esquerda) e DAB III (direita).

Obj. 100x .................................................................................. 75

Figura 10 - Diaminobenzidina. Espermatozide DAB II (direita) e DAB IV

(esquerda). Obj. 100x ................................................................. 75

Figura 11 - Espermatozide Cometa I. Obj. 100x ............................................ 78

Figura 12 - Espermatozides Cometa II. Obj. 100x.......................................... 78

Figura 13 - Espermatozide Cometa III. Obj. 100x.......................................... 78

Figura 14 - Espermatozide Cometa IV. Obj. 100x .......................................... 78

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Efeito das raas e das estaes climticas [mdia erro padro, (IC

95%)] sobre a motilidade (%), vigor (0-5) e ndice de motilidade

espermtica (IME), de amostras seminais criopreservadas, de touros das

raas Nelore e Simental, criados em clima tropical, coletadas em inverno

e vero. .................................................................................... 84

Tabela 2 - Efeito das estaes climticas em funo das raas [mdia erro

padro, (IC 95%)] sobre a motilidade (%), vigor (0-5) e ndice de

motilidade espermtica (IME), de amostras seminais criopreservadas, de

touros das raas Nelore e Simental, criados em clima tropical, coletadas

em inverno e vero. .................................................................... 85

Tabela 3 - Efeito das raas em funo das estaes climticas [mdia erro

padro, (IC 95%)] sobre a motilidade (%), vigor (0-5) e ndice de

motilidade espermtica (IME), de amostras seminais criopreservadas, de


em inverno e vero. .................................................................... 85


95%)] sobre a porcentagem de espermatozides com a membrana

plasmtica ntegra (E/N), de amostras seminais criopreservadas, de


em inverno e vero. ................................................................... 89


padro, (IC 95%)] sobre a porcentagem de espermatozides com a

membrana plasmtica ntegra (E/N), de amostras seminais

criopreservadas, de touros das raas Nelore e Simental, criados em

clima tropical, coletadas em inverno e vero. ................................. 90



membrana plasmtica ntegra (E/N), de amostras seminais


clima tropical, coletadas em inverno e vero. ................................. 90


95%)] sobre a porcentagem de espermatozides com a membrana

acrossomal ntegra (POPE), de amostras seminais criopreservadas, de


em inverno e vero . ................................................................... 92



membrana acrossomal ntegra (POPE), de amostras seminais


clima tropical, coletadas em inverno e vero................................... 92



membrana acrossomal ntegra (POPE), de amostras seminais


clima tropical, coletadas em inverno e vero................................... 92


95%)] sobre a porcentagem de espermatozides classes I, II, III e IV

na avaliao da atividade mitocondrial (DAB I, DAB II, DAB III, DAB IV),

de amostras seminais criopreservadas, de touros das raas Nelore e

Simental, criados em clima tropical, coletadas em inverno e vero..... 94


padro, (IC 95%)] sobre a porcentagem de espermatozides classes I,

II, III e IV na avaliao da atividade mitocondrial (DAB I, DAB II, DAB

III, DAB IV), de amostras seminais criopreservadas, de touros das raas

Nelore e Simental, criados em clima tropical, coletadas em inverno e

vero. ....................................................................................... 95



II, III e IV na avaliao da atividade mitocondrial (DAB I, DAB II, DAB

III, DAB IV), de amostras seminais criopreservadas, de touros das raas

Nelore e Simental, criados em clima tropical, coletadas em inverno e

vero. ....................................................................................... 95


95%)] sobre a porcentagem de espermatozides classes I, II, III e IV

na avaliao da integridade de DNA (COMETA I, COMETA II, COMETA III

e COMETA IV), de amostras seminais criopreservadas, de touros das

raas Nelore e Simental, criados em clima tropical, coletadas em inverno

e vero. .................................................................................... 98



II, III e IV na avaliao da integridade de DNA (COMETA I, COMETA II,

COMETA III e COMETA IV), de amostras seminais criopreservadas, de


em inverno e vero . ................................................................... 98



II, III e IV na avaliao da integridade de DNA (COMETA I, COMETA II,

COMETA III e COMETA IV), de amostras seminais criopreservadas, de


em inverno e vero . ................................................................... 99


95%)] sobre as concentraes de substncias reativas ao cido

tiobarbitrico (TBARS), de amostras seminais criopreservadas, de touros

das raas Nelore e Simental, criados em clima tropical, coletadas em

inverno e vero. ........................................................................101


padro, (IC 95%)] sobre as concentraes de substncias reativas ao

cido tiobarbitrico (TBARS), de amostras seminais criopreservadas, de


em inverno e vero. ...................................................................101


padro, (IC 95%)] sobre as concentraes de substncias reativas ao

cido tiobarbitrico (TBARS), de amostras seminais criopreservadas, de


em inverno e vero. ...................................................................101

Tabela 19 - Coeficientes de correlao (significncia), entre todas as variveis

respostas estudadas, de amostras seminais criopreservadas, de touros

da raa Nelore (Bos taurus indicus), criados em clima tropical, coletadas

durante o inverno. .....................................................................105



da raa Nelore (Bos taurus indicus), criados em clima tropical, coletadas

durante o vero . .....................................................................106



da raa Simental (Bos taurus taurus), criados em clima tropical,

coletadas durante o inverno. .......................................................107

Tabela 22 Coeficientes de correlao (significncia), entre todas as variveis


da raa Simental (Bos taurus taurus), criados em clima tropical,

coletadas durante o vero . ........................................................108

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1 - Porcentagem de espermatozides com alto potencial de atividade

mitocondrial, pela diluio seminal (Smen fresco). ....................... 83

Grfico 2 - Valores das mdias, das variveis estudadas em amostras seminais

criopreservadas de touros das raas Nelore e Simental, criados em

clima tropical, coletadas em inverno e vero. ...............................112

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABCRSS Associao Brasileira dos Criadores de Simental e Simbrasil

ABIEC Associao Brasileira das Indstrias Exportadoras de Carne

ACBN Associao Brasileira dos Criadores de Nelore

AMPc adenosina monofosfato cclica

ASBIA Associao Brasileira de Inseminao Artificial

ATP adenosina trifosfato

B. indicus Bos taurus indicus

B. taurus Bos taurus taurus

CASA Computer Assisted Semen Analisys

CCO citocromo C oxidase

CEPEA Centro de estudos de pesquisa aplicada em economia avanada

cm centmetro

DAB 33 diaminobenzidina

DHA cido docosahexaenico

DNA cido desoxirribonuclico

E/N eosina-nigrosina

EC Ensaio Cometa

EUA Estados Unidos da Amrica

Fe ferro

FeSO4 sulfato de ferro

g gravidade

GPx glutationa peroxidase

GSH glutationa

H2O gua

H2O2 perxido de hidrgnio

IA inseminao artificial

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica

IC intervalo de confiana

IME ndice de motilidade espermtica

JC-1 iodeto de 5,5',6,6' tetracloro 1,1',3,3' tetraetilbenzimidazolicarbocycanina

LMPA Low melting point agarose

LPO peroxidao lipdica/lipoperoxidao

M molar

mA miliampere

MDA malondialdedo

g microgramas

L microlitros

mL mililitros

mM milimolar

NaOH hidrxido de sdio

nm nanmetro

NMPA Normal melting point agarose

NO xido ntrico

O- 2 nion superxido

Obj objetiva

OH- radical hidroxila

PBS Phosphate buffered saline

p nvel de significncia

pH potencial hidrogeninico

r coeficiente de correlao

ROS espcies reativas de oxignio

SCSA Sperm Chromatin Structure Assay

Seg segundos

SOD superxido dismutase

Sptz espermatozide

TBA cido tiobarbitrico

TBARS substncias reativas ao cido tiobarbitrico

TCA cido tricloroactico

TUNEL Terminal Uridine Nick End Labelling

V volts

VS versus

LISTA DE SMBOLOS

Alfa

+ mais

mais ou menos

> maior que

< menor que

% porcentagem

C graus Celsius

x vezes

106 milhes

: para (1:100)

= igual

SUMRIO

1 INTRODUO ..................................................................................... 28

2 HIPTESE........................................................................................... 32

3 OBJETIVOS......................................................................................... 34

4 REVISO DE LITERATURA .................................................................. 36

4.1 COMPOSIO DO SMEN E ESPERMATOZIDES.................................... 36

4.2 EFEITOS DA CRIOPRESERVAO......................................................... 40

4.3 MECANISMOS DA TERMORREGULAO TESTICULAR .............................. 43

4.4 CLIMA TROPICAL E ALTERAES REPRODUTIVAS: BOS TAURUS TAURUS VS BOS TAURUS INDICUS ...................................................................... 45

4.5 ESTRESSE OXIDATIVO....................................................................... 47 4.5.1 Espcies Reativas de Oxignio na fertilidade do macho ........................ 49 4.5.2 Mensurao do estresse oxidativo..................................................... 52

4.6 AVALIAO SEMINAL......................................................................... 54 4.6.1 Testes convencionais ...................................................................... 54 4.6.2 Testes funcionais............................................................................ 56 4.6.2.1 Integridade da membrana plasmtica.......................................... 57 4.6.2.2 Integridade da membrana acrossomal ......................................... 59 4.6.2.3 Atividade citoqumica mitocondrial .............................................. 60 4.6.2.4 Integridade de DNA .................................................................. 61

5 MATERIAIS E MTODOS...................................................................... 66

5.1 LOCAL ............................................................................................. 66

5.2 AMOSTRAS SEMINAIS........................................................................ 66

5.3 COLETA E CRIOPRESERVAO DE SMEN............................................. 67

5.4 PROCESSAMENTO E AVALIAO DO SMEN.......................................... 68 5.4.1 Testes convencionais ...................................................................... 70 5.4.1.1 Avaliao da motilidade espermtica ........................................... 70 5.4.1.2 Avaliao do vigor espermtico .................................................. 70 5.4.1.3 ndice de motilidade espermtica................................................ 71 5.4.2 Testes funcionais............................................................................ 71 5.4.2.1 Avaliao da Integridade da Membrana Plasmtica........................ 71 5.4.2.2 Avaliao da Integridade da Membrana Acrossomal....................... 72 5.4.2.3 Avaliao da Atividade Citoqumica Mitocondrial............................ 73

5.4.2.4 Avaliao da Integridade de DNA................................................ 75 5.4.3 Avaliao do ndice de Resistncia ao Estresse Oxidativo ..................... 79 5.4.4 Anlise Estatstica .......................................................................... 80

6 RESULTADOS E DISCUSSO................................................................ 83

6.1 TESTES CONVENCIONAIS................................................................... 84

6.2 TESTES FUNCIONAIS ......................................................................... 89 6.2.1 Integridade da membrana plasmtica................................................ 89 6.2.2 Integridade da membrana acrossomal ............................................... 91 6.2.3 Atividade citoqumica mitocondrial .................................................... 94 6.2.4 Integridade de DNA ........................................................................ 97

6.3 SUBSTNCIAS REATIVAS AO CIDO TIOBARBITRICO..........................100

6.4 CORRELAES.................................................................................104

6.5 RESUMO DOS RESULTADOS...............................................................112

6.6 CONSIDERAES FINAIS ..................................................................113

7 CONCLUSO ..................................................................................... 116

REFERNCIAS......................................................................................... 118

ANEXOS.................................................................................................. 138

Mariana de Paula Rodrigues

28

1 INTRODUO

A crescente demanda por protena animal tem exigido que os sistemas de

produo sejam cada vez mais eficientes. Dentre os diversos fatores que influenciam a

eficincia econmica dos sistemas, pode-se destacar a reproduo como sendo o mais

bsico de todos, pois sem ela no h a gerao de produtos. Assim, quanto mais

eficiente for o desempenho reprodutivo, maior ser a possibilidade de retorno econmico

positivo.

A pecuria tem uma grande importncia econmica para o Brasil, principalmente a

pecuria de corte; j que, o pas est posicionado como o maior rebanho comercial do

mundo, em torno de 200 milhes de cabeas de gado, ou seja, quase 1(uma) cabea de

gado para cada habitante (Anexo A- a) (IBGE, 2007).

Em 2004, alcanou a condio de maior exportador de carne bovina (Anexo A- b)

e no primeiro trimestre de 2007 exportou 1,363 milhes de toneladas de carne.

Encontra-se como o segundo maior produtor mundial de carne bovina (cerca de 9

milhes de toneladas), sendo inferior apenas aos Estados Unidos (ABIEC 2007, 2009).

Segundo a Pesquisa Trimestral do Abate, no ano de 2008 foram abatidas 28,691

milhes de cabeas de bovinos, deste abate nacional, 35,1% foi proveniente da regio

Centro-Oeste do Brasil; apesar da queda de 6,6% em relao ao ano anterior, devido

crise mundial (IBGE, 2009). Por possuir uma grande extenso de terra, existe ainda

potencial para aumentar cada vez mais a produo de carne brasileira, para isso, basta

empregar biotecnologias que aperfeioem o sistema de produo, sendo possvel, dessa

forma, prognosticar um significativo aumento na demanda interna de carne bovina.

A pecuria de corte brasileira responsvel por cerca de 8% do Produto Interno

Bruto (CEPEA, 2007), sendo que a regio central do pas engloba, aproximadamente,

40% do rebanho bovino de corte brasileiro (Anexo A- c) (IBGE, 2007), rebanho este

constitudo, em sua maioria, por animais de origem zebuna (Bos taurus indicus),

especialmente da raa Nelore, originria da ndia e famosa por se adaptar s condies

tropicais brasileiras, mostrando tima capacidade de aproveitar alimentos grosseiros,

resistncia natural aos parasitas e fertilidade mesmo em temperaturas elevadas (ACNB,

2009).

Os bovinos de origem europia (Bos taurus taurus), quando criados em clima

temperado so excelentes na precocidade produtiva e reprodutiva, ganho de peso e


29

idade ao abate (ABCRSS, 2009), no entanto, quando encontram-se em climas como o

apresentado na regio central do Brasil, passam a mostrar menores ndices de fertilidade

(GABALDI, 2000; NICHI, 2003).

Essa menor fertilidade apresentada pelos touros de origem europia em condies

tropicais vem sendo bastante estudada, porm, as causas da menor resistncia em

relao aos animais zebunos, apesar de bem conhecidas, ainda no foram

completamente desvendadas. Estas condies, em especial no caso dos machos,

culminam em um quadro de infertilidade por degenerao testicular, estresse oxidativo e

alteraes espermticas.

O estresse trmico pode alterar quaisquer caractersticas seminais, tais como

motilidade, concentrao, membrana plasmtica, membrana acrossomal, potencial de

mitocndria e at mesmo integridade de DNA, visto tanto em amostras frescas, como em

criopreservadas (ZGE, 2002).

de grande importncia econmica na produo animal, a resposta seminal

criopreservao, j que a manuteno da qualidade espermtica estratgica para a

disseminao de material gentico e conseqente melhoria do rebanho brasileiro.

Dessa maneira, as biotecnologias da reproduo tem possibilitado um verdadeiro

avano qualitativo na produo bovina, em especial, por facilitar a seleo e

multiplicao de animais geneticamente superiores e possibilitar maior diversidade

gentica entre as populaes. Devido a isso, de suma importncia maximizar os

mtodos de avaliao espermtica e conseqentemente o potencial fecundante da

amostra, garantindo o sucesso em um programa de reproduo, tanto natural quanto

assistida.

A inseminao artificial (IA) uma potente biotecnologia, de custos mais

acessveis, que permite aos produtores usarem raas superiores em suas criaes,

promovendo um rpido aumento na qualidade gentica e produtividade.

Trabalhos realizados nos Estados Unidos reportam que com o advento da IA foi

possvel a implantao dos testes de prognie e conseqentemente, o uso dos touros

provados passou a ser uma rotina nos rebanhos. O grande aumento das mdias de

produo nos rebanhos de gado holands nos EUA, por exemplo, em parte devido

melhoria gentica obtida na IA. esse mesmo fator que tem sido o precursor do

melhoramento dos rebanhos em todos os pases de pecuria desenvolvida (ASBIA,

2008).

Todavia, para sua ampla aplicao, indispensvel o uso de smen congelado.

Em 1999, foram vendidas no Brasil, aproximadamente 6 milhes de doses de smen

criopreservado de touros, e em 2008 esse nmero aumentou para mais de 8 milhes de


30

doses, ou seja, a comercializao de doses de smen criopreservado de bovinos mostrou

uma significativa evoluo de 47,35% nos ltimos 10 anos, mas, infelizmente, no Brasil o

uso desta tcnica tem sido muito limitado, onde somente 5% dos gados so inseminados artificialmente, indicando a oportunidade de crescimento na produo e no uso das doses

de smen criopreservado (Anexo A- d) (ASBIA, 2008). Sendo assim, para suprir essa

demanda, necessrio conhecer os fatores que afetam a produo espermtica e

qualidade seminal.

Dentro desta perspectiva, h uma grande necessidade de se estudar mais sobre

as espcies bovinas e suas condies de manejo e reproduo, visando um aumento e

melhora da qualidade dos rebanhos, alm do que a determinao dos aspectos

qualitativos do smen constitui um processo crtico na tomada de decises para a seleo

de reprodutores. Isso tem permitido um verdadeiro progresso, especialmente nas ltimas

dcadas, na adaptao de testes laboratoriais mais especficos com o objetivo de elucidar

a funcionalidade espermtica, a partir da relao entre os testes convencionais e

funcionais.

A avaliao da integridade do material gentico, atividade mitocondrial,

integridade de membranas plasmtica e acrossomal e resistncia ao estresse oxidativo

das clulas espermticas criopreservadas, iro nos proporcionar a oportunidade de

decifrar causas de infertilidade ou baixa fertilidade entre os animais.


32

2 HIPTESE

A hiptese central deste experimento a de que amostras seminais criopreservadas,

provenientes de touros no adaptados a ambientes tropicais (Bos taurus taurus -

Simental) e coletadas em duas estaes climticas distintas (inverno e vero),

apresentariam, aps a descongelao:

Alteraes espermticas estruturais e funcionais, tais como: alterao de

membranas plasmtica e acrossomal, diminuio da atividade citoqumica

mitocondrial, alto grau de fragmentao do material gentico.

Maior suscetibilidade celular ao estresse oxidativo.

Quando comparadas s caractersticas seminais de amostras, nas mesmas

condies, coletadas de touros adaptados (Bos taurus indicus - Nelore).


34

3 OBJETIVOS

Com base na literatura apresentada, na hiptese formulada e sabendo da

suscetibilidade dos animais de origem europia s condies tropicais, e da ao danosa

dos radicais livres sobre as caractersticas funcionais e estruturais espermticas que afeta

a fertilidade dos animais; este estudo foi realizado com os seguintes objetivos:

Avaliar as diferenas do smen criopreservado de animais adaptados e no

adaptados ao clima tropical, coletados durante inverno e vero, atravs da

avaliao de motilidade, vigor, integridade de membrana plasmtica, integridade

de membrana acrossomal, atividade citoqumica mitocondrial, ndice de

fragmentao de DNA e suscetibilidade celular ao estresse oxidativo;

Correlacionar os resultados obtidos entre ambas as subespcies utilizadas (Bos

taurus taurus - Simental e Bos taurus indicus Nelore), bem como entre as duas

estaes climticas (inverno e vero).


36

4 REVISO DE LITERATURA

4.1 COMPOSIO DO SMEN E ESPERMATOZIDES

Smen

Smen a suspenso celular lquida contendo espermatozides e secrees das

glndulas acessrias do trato genital masculino. A poro fluida dessa suspenso

chamada de plasma seminal (MIES FILHO; BARRETO, 1949).

Essa frao lquida do smen apresenta vrias funes, atuando como diluente e

veculo para os espermatozides, controlador de osmolaridade, fornecedor de energia,

agente antioxidante de compostos bioqumicos, alm de exercer um efeito estimulante

na motilidade. Participa na modulao da capacitao espermtica, possui efeito imuno-

modulatrio e age tambm como agente bactericida (LACKEY; GRAY; HENRICKS, 2002;

PESCH; BERGMANN; BOSTEDT, 2006).

O plasma seminal uma mistura envolvendo secrees provenientes do epitlio

seminfero, epiddimos, ductos deferentes, ampolas, prstata, vesculas seminais,

glndula bulbouretral e, em algumas espcies, glndulas uretrais (AMANN;

SCHANBACHER, 1983), composto basicamente de cido ctrico, cido ltico, ergotionena,

frutose, glicerilfosforilcolina, sorbitol, cido ascrbico, aminocidos, peptdeos, lipdeos,

cidos graxos, enzimas e protenas (GARNER; HAFEZ, 2004). Essas ltimas so

encontradas livres no plasma seminal ou adsorvidas em diferentes regies do

espermatozide e so responsveis por funes especficas como integridade estrutural

da membrana plasmtica, organizao da matriz perinuclear, inibio da capacitao

espermtica e reao acrossomal, sinalizaes trans-membrana e habilidade fecundante

(FOLTZ, 1995; FOUCHCOURT et al., 2002; MTAYER; DACHEUX; GATTI, 2002).

O ambiente que circunda o espermatozide caracterizado por mudanas

contnuas e progressivas na composio e concentrao proticas, desde o fludo

testicular at a secreo do epitlio das vesculas seminais. O papel primordial desta

atividade secretora possibilitar um ambiente favorvel para a maturao e manuteno

da estrutura do espermatozide, incluindo a organizao molecular de suas membranas.

Isso possvel, a partir da exposio das clulas espermticas protenas, secretadas


37

em diferentes segmentos do aparelho reprodutivo, especialmente no epitlio seminfero,

a partir das clulas de Sertoli, cabea, corpo e cauda do epiddimo e, finalmente, pelas

glndulas vesiculares (HERMO; OKO; MORALES, 1994).

No decorrer do trnsito epididimrio, grande parte das protenas secretadas para

o lmen aderem-se membrana espermtica e so responsveis por vrias modificaes

em sua estrutura, conferindo um carter protetor funo celular (DACHEUX; GATTI;

DACHEUX, 2003).

Na composio lipdica do plasma seminal esto presentes os cidos:

docosahexaenico (DHA), palmtico, olico, linolico, araquidnico, linolnico e esterico

(TAVILANI et al., 2006). Esses cidos graxos desempenham um importante papel na

atividade funcional do espermatozide e, consequentemente, na fertilidade masculina

(GULAYA et al., 2001), assim como na proteo celular ao choque trmico e manuteno

da motilidade espermtica (GRAHAM, 1994). No entanto, por outro lado, essa variedade

lipdica encontrada no plasma seminal, tambm responsvel, pelo ataque das espcies

reativas de oxignio (ROS), tornando a amostra seminal mais susceptvel peroxidao

lipdica, comprometendo, assim, sua habilidade fertilizante (DE LAMIRANDE; GAGNON,

1992; BECONI et al., 1991).

O plasma seminal dotado de uma gama de antioxidantes que atuam como

neutralizadores de radicais livres para a proteo dos espermatozides contra o estresse

oxidativo. Contem, no apenas os antioxidantes enzimticos como a catalase, a

glutationa peroxidase (GPx) e a superxido dismutase (SOD), mas tambm os no-

enzimticos como o - tocoferol (vitamina E), ascorbato (vitamina C), glutationa (GSH),

urato, piruvato, taurina e hipotaurina (AGARWAL; PRABAKARAN, 2005; AGARWAL,

2006), cujas atividades permitem manter o balano entre a produo e destruio das

ROS.

Khosrowbeygi e Zarghami em 2007 reportaram que os nveis de catalase no

plasma seminal de homens subfrteis foram menores do que naqueles do grupo controle,

mostrando que a ao dos antioxidantes, tambm est relacionada s caractersticas

seminais.


38

Espermatozide

O espermatozide uma clula haplide, alongada, produzida dentro dos tbulos

seminferos dos testculos, atravs da diviso e transformao das clulas tronco

germinativas, em um processo chamado espermatognese (EDDY; OBRIEN; MRUCK;

CHENG, 2004). Seus principais componentes qumicos so os cidos nuclicos, as

protenas e os lipdeos. Esta clula formada por regies altamente especializadas, tais

como cabea, colo, e flagelo (SANTOS, 2003), envoltos, em sua totalidade, pela

membrana plasmtica (URA; TOSHIMORI, 1990).

A membrana plasmtica composta basicamente de uma bicamada de lipdeos,

principalmente os cidos graxos poliinsaturados, em especial o cido docosahexaenico

(DHA) (FLESCH; GADELLA, 2000). Por um lado, esses cidos graxos so de grande

importncia celular, pois conferem as caractersticas de fluidez e permeabilidade

membrana; no entanto, por outro lado, devido s insaturaes, servem como substrato

aos radicais livres para que ocorra a peroxidao lipdica, tornando os espermatozides

extremamente suscetveis ao estresse oxidativo (TAVILANI et al., 2006).

Na cabea do espermatozide esto contidos: o DNA, uma pequena quantidade de

citoplasma e, no seu extremo apical, o acrossomo; sua principal caracterstica o ncleo

achatado de forma oval, contendo cromatina altamente condensada (YANAGIMACHI,

1994). A extremidade anterior do ncleo espermtico recoberta pelo acrossomo, uma

camada delgada, composta de dupla membrana que envolve intimamente o ncleo

durante os ltimos estgios da formao celular. Essa estrutura, semelhante a uma

vescula, contem acrosina, hialuronidase e outras enzimas hidrolticas vitais para a

interao espermatozide-ocito (URA; TOSHIMORI,1990; GARNER; HAFEZ, 2004).

O colo ou pea de conexo forma uma placa basal que se ajusta dentro de uma

depresso na superfcie posterior do ncleo, cuja funo conectar a cabea do

espermatozide ao flagelo (GARNER; HAFEZ, 2004).

O flagelo ou cauda subdividido em: pea intermediria, pea principal e pea

terminal; est envolvido com a motilidade celular, sendo constitudo internamente pelo

axonema, uma estrutura especializada do citoesqueleto. O axonema formado por um

anel de nove microtbulos duplos envolvendo um par central. As dinenas e nexinas

realizam a ligao entre os pares de microtbulos. As dinenas apresentam projees

chamadas braos de dinena, que so responsveis pela gerao da fora motora do

flagelo. A dinena um complexo de multisubunidades de ATPase (GIBBONS, 1965) que

traduzem energia qumica (ATP) em energia cintica, permitindo que pares de

microtbulos adjacentes deslizem um sobre o outro, causando uma curvatura do


39

axonema e ento o movimento flagelar (MORTIMER, 1997; TURNER, 2006). Nele, ainda,

esto presentes as mitocndrias, cuja funo fisiolgica realizar a fosforilao oxidativa

e produzir o ATP como fonte de energia metablica (FREY; MANNELLA, 2000), a posio

das mitocndrias ao redor da poro proximal do axonema sugere que elas so

necessrias para o suprimento de ATP usado para a motilidade flagelar (Figura 1)

(MORTIMER, 1997).

A habilidade do espermatozide de fertilizar um ocito e garantir o

desenvolvimento embrionrio est relacionada s variveis como motilidade,

metabolismo, integridade de membrana plasmtica, acrossomal e de DNA (FOOTE,

2003). A criopreservao conhecida por afetar, em 50%, todos esses parmetros,

reduzindo a quantidade de espermatozides aptos para a fertilizao (JANUSKAUSKAS et

al., 1996; WATSON, 2000).

Toda caracterstica estrutural especializada do espermatozide est voltada para

sua atividade funcional nica, ou seja, assegurar a liberao do material gentico,

contido em seu ncleo, para o interior do ocito, onde ocorre a unio dos pr-ncleos

masculino e feminino, produzindo o zigoto (EDDY; OBRIEN, 1994). Resumindo, a

Fonte: HAFEZ; HAFEZ, 2004

Figura 1 - Esquema da clula espermtica e seus componentes


40

principal funo da cabea do espermatozide liberar um conjunto haplide de

cromossomos para o ocito, e a do flagelo promover motilidade clula para permitir a

sua passagem pelo trato genital feminino e a penetrao atravs da zona pelcida do

ocito (MORTMER, 1997).

A dinmica das transformaes celulares, ao longo da espermatognese, pode

sofrer o efeito da regulao endcrina (HALL, 1994), da termorregulao testicular e

temperatura ambiental (KASTELIC et al., 1997), h outros fatores que contribuem para

esses distrbios, como o nvel srico de corticides (BARTH; BOWMAN, 1994), ruptura da

barreira hemato-testicular, leses no parnquima testicular (VAN CAMP, 1997) e

alteraes genticas (STEFFEN, 1997).

Assim sendo, caso haja qualquer alterao no ambiente espermtico, seja ela por

aumento de temperatura, criopreservao, excesso de radicais livres ou at mesmo

escassez de antioxidantes, toda caracterstica estrutural e funcional dos espermatozides

ser afetada, resultando em alteraes estruturais do espermatozide e comprometendo

profundamente o potencial fertilizante destas clulas.

4.2 EFEITOS DA CRIOPRESERVAO

A disponibilidade de gametas viveis e funcionalmente normais um pr-requisito

para uma fertilizao bem sucedida em mamferos, tanto in vivo quanto in-vitro e, por

isso, um ponto crtico para a implementao de uma grande variedade de tecnologias

reprodutivas, tais como a inseminao artificial, fertilizao in-vitro, transferncia de

embries e engenharia gentica. Devido a isto, a criopreservao de gametas e embries

tornou-se um procedimento complementar essencial para a aplicao destas tecnologias,

j que eliminam as limitaes de tempo e espao (PARKS, 1997).

Sendo assim, a criopreservao possui um papel fundamental na fertilidade

masculina, tanto para preservao dos gametas por um perodo indeterminado, como

para utilizao desses em um tratamento de reproduo assistida (SHEENA; ISHOLA,

2008).

Dessa forma, essa tcnica foi estabelecida para suspender o metabolismo

espermtico, preservar suas caractersticas por um perodo de tempo prolongado,

mantendo o potencial fertilizante dos espermatozides (AMANN; PICKETT, 1987).


41

Os espermatozides devem reter pelo menos quatro atributos bsicos aps a

congelao e descongelao: 1. Integridade do flagelo, que garante produo de ATP e

motilidade; 2. Integridade do ncleo, que mantm estvel o armazenamento do DNA; 3.

Integridade do acrossomo, j que possui enzimas responsveis pela fecundao; 4.

Integridade de membrana plasmtica, importante para a sobrevivncia do

espermatozide dentro do trato reprodutivo feminino e para a ligao do mesmo com a

membrana do ocito durante a fertilizao (AMANN; PICKETT, 1987; HAMMERSTEDT;

GRAHAM; NOLAN, 1990).

O processo de criopreservao constitudo de diluio, refrigerao, congelao,

armazenamento e descongelao. Cada um desses passos tem sua relao com a

estrutura funcional das membranas e metabolismo celular (HAMMERSTEDT; GRAHAM;

NOLAN, 1990).

No entanto, a exposio da clula temperaturas abaixo da fisiolgica, mesmo

antes de ocorrer a congelao, responsvel por mudanas na organizao

bidimensional dos lipdeos de membrana, diminuindo a longevidade espermtica (HOLT,

2000).

Apesar da interao entre diluidor, crioprotetor, curvas de refrigerao, congelao

e descongelao ser responsvel pela preservao das estruturas espermticas e buscar

minimizar os danos causados pelo choque frio, formao de cristais de gelo e

desidratao celular (YOSHIDA, 2000), a criopreservao, ainda um tanto quanto

prejudicial s funes espermticas, visto que a qualidade de amostras aps a

descongelao se mantm inferior qualidade de amostras frescas (HOLT, 1997; PERIS

et al., 2007).

claro, que a clula espermtica no est adaptada para passar pelas variaes de

temperatura envolvidas no processo de criopreservao, sofrendo, dessa forma,

alteraes na motilidade, estrutura e no material gentico, simultaneamente nas

diferentes etapas de congelao e descongelao (PARKS; GRAHAM, 1992).

A explicao para tais efeitos deletrios clula est relacionada com a fase de

transio dos lipdeos de membrana, resultando na perda de seletividade, caracterstica

das membranas biolgicas de clulas vivas (WATSON; MORRIS, 1987), alm da pequena

quantidade de citoplasma e consequentemente de antioxidantes dos espermatozides

(HOLT, 2000).

A permeabilidade da membrana aumenta aps refrigerao, podendo ser devido a

mudanas nos canais proticos, ainda, a regulao do clcio tambm afetada por esse

processo, tendo conseqncias srias em termos de funo celular (BAILEY; BURH,

1994).


42

A sensibilidade ao choque frio varia de acordo com o grau de maturao do

espermatozide, espcie, variao individual e quantidade de plasma seminal, e pode ser

determinada pelo contedo de colesterol da membrana e o grau de saturao dos cidos

graxos, os quais influenciam na fluidez da membrana plasmtica (WATSON, 1981;

COTTORELLO, 2002).

Parks e Graham (1992) detectaram em seu estudo que o tipo de fosfolipdio

predominante na membrana tambm influenciava na sensibilidade ao choque frio, e

espcies com maior proporo de fosfatidilcolina/ fosfatidiletanolamina eram mais

resistentes. Esses autores observaram ainda que quanto maior o contedo de protena

da membrana, mais baixa a resistncia ao choque frio.

Frente isso, leses irreversveis ocorrem na membrana plasmtica espermtica

durante resfriamento, congelao e aps descongelao, indicativa de separao de fase,

induzida por transio na fase lipdica (HOLT; NORTH, 1984), com mudanas srias em

sua fluidez (BUHR; CURTIS; KAKUDA, 1994).

Alteraes acrossomais tambm foram encontradas em pesquisa realizada por

Alvarenga et al. (1998), onde houve espessamento de segmento apical, ruptura de

membrana acrossomal, contedo menos denso e homogneo, e at mesmo ausncia de

tal estrutura.

Foi sugerido por Henry et al. (1993), que a membrana plasmtica e a mitocndria,

em espermatozides humanos, foram igualmente afetadas pela criopreservao,

concordando com esse resultado, Bollwein, Fuchs e Koess (2007), encontraram em

amostras de bovinos, que a mitocndria e a membrana espermtica so igualmente

vulnerveis esse processo, j o DNA se mostrou um pouco mais resistente, onde

ocorreu fragmentao somente aps um longo perodo de incubao.

Outros estudos em bovinos demonstraram que a criopreservao espermtica est

associada ao aumento da gerao de ROS, bem como a diluio do plasma seminal, uma

importante fonte de antioxidantes, predispem as clulas ao estresse oxidativo

(BILODEAU et al., 2000; CHATTERGEE; GAGNON, 2001).

Apoiando essa idia, Peris et al. em 2007 investigaram o efeito da criopreservao

na funo espermtica de carneiros, avaliando estabilidade de DNA (SCSA), peroxidao

lipdica de membranas (LPO) e caractersticas funcionais, como motilidade (CASA),

viabilidade (eosina/nigrosina) e integridade de acrossomo (CTC); depararam-se com a

diminuio na qualidade espermtica em todas as caractersticas avaliadas quando se

tratava de smen criopreservado.


43

O grupo de pesquisas de Donnelly (2001) encontrou que a criopreservao

provocou diminuio de 50% da motilidade progressiva (CASA) do smen humano, alm

da diminuio em 20% da integridade do DNA (Ensaio Cometa).

Ainda relacionando-se aos danos espermticos, as dimenses morfolgicas da

cabea de espermatozides eqinos foram, estatisticamente, menores em amostras

criopreservadas, provavelmente causada por danos acrossomais ou pela

hipercondensao do material gentico sofrido pelas clulas espermticas durante a

congelao (ARRUDA et al., 2002).

Segundo Slowinska, Karol e Ciereszko (2008), os espermatozides bovinos

possuem um ponto importante de resistncia criopreservao, j que a porcentagem

de fragmentao de DNA (Ensaio Cometa), mesmo sendo significante (P


44

estimulados, enviam informaes para que haja uma resposta de todo o organismo,

diminuindo a temperatura atravs da taquicardia e transpirao (WAITES, 1970).

Alm disso, a pele escrotal possui maior nmero de glndulas sudorparas, as

quais produzem maior quantidade de suor por unidade de rea quando comparadas com

glndulas da pele de outra regio corprea. Em trabalho realizado por Waites e

Voglymayr em 1963, foi verificado que ao elevar a temperatura escrotal, de carneiros,

houve descarga das glndulas sudorparas em intervalos de at 17 minutos, assim como

a queda e subsequente elevao da temperatura testicular, alm disso, foi visto que a

atividade dessas glndulas foi independente da temperatura corporal, a qual se manteve

constante.

Ainda, seu componente muscular permite alterao da espessura e da rea superficial do escroto, e tambm garante a mobilidade testicular. Frente temperaturas

elevadas, este msculo, o Cremster, relaxa totalmente, afastando as gnadas da parede

abdominal e aumentando a superfcie de contato entre o testculo e o escroto. J em

baixas temperaturas, esse msculo se contrai, aproximando os testculos do abdmen.

No entanto, por se tratar de um msculo estriado, essa contratura no se mantem por

perodos muito longos (KASTELIC; COULTER; COOK, 1995).

Dessa maneira, concomitante a esses mecanismos e como componente

fundamental para a termorregulao, est a ao do plexo pampiniforme, estrutura

constituda pela veia e artria testiculares, e juntamente com os vasos linfticos, ducto

deferente e artria e veia diferenciais, formam o funculo espermtico (WAITES, 1970).

No plexo pampiniforme de todos as animais domsticos, a artria testicular uma

estrutura extremamente sinuosa, cuja espessura maior na poro superior, conferindo

a caracterstica cnica do funculo espermtico (SEALFON; ZORGNIOTTI, 1991).

No mecanismo de contracorrente, o sangue arterial que est entrando no testculo

resfriado pelo sangue venoso que est partindo em menores temperaturas. Esse

sistema expressa a propriedade de transferncia de calor, e sua eficincia depende das

diferenas de temperatura entre os fluidos (SETCHELL, 1978, 1998)

Portanto, falhas em qualquer um desses processos de termorregulao ou ainda

temperaturas ambientais extremamente elevadas, resultaro no comprometimento

reprodutivo animal, j que o estresse trmico certamente resultar em degenerao

testicular.


45

4.4 CLIMA TROPICAL E ALTERAES REPRODUTIVAS: BOS TAURUS TAURUS VS BOS TAURUS INDICUS

Os componentes fisiolgicos e biolgicos animais so afetados por fatores

climticos que incluem temperatura, umidade, radiao solar e vento. Temperaturas

extremas aumentam ou diminuem os requerimentos normais de mantena devido a

interrupo da homeostase durante a termorregulao, interferindo na troca de calor

entre animal e ambiente, culminando em alteraes deletreis na reproduo

(GWAZDAUSKAS, 1985).

Maior parte dos rebanhos bovinos mundiais criada nos trpicos, nessas

condies climticas, a reproduo bovina pode ser afetada pelo estresse trmico; em

altas temperaturas ambientais, os mecanismos da termorregulao corprea so

incapazes de promover a perda de calor, havendo um aumento da temperatura interna

acima dos limites fisiolgicos (CHEMINEAU, 1994), alm de resultar em um quadro de

degenerao testicular, caracterizado por alteraes histolgicas do epitlio seminfero

(VANDEMARK; FREE, 1970).

O estresse trmico pode diminuir taxas de concepo, aumentar mortalidade

embrionria em vacas (WOLFENSON et al., 2000) e diminuir a qualidade seminal de

touros (BRITO et al., 2002). Estudos tem mostrado que o aumento da temperatura

testicular, causada pela insulao escrotal resulta em diminuio da motilidade

progressiva e concentrao espermticas, aumento das anormalidades morfolgicas, na

porcentagem de leso acrossomal, bem como alteraes das caractersticas do plasma

seminal (VOGLER et al., 1993; BRITO et al., 2002).

A variao das caractersticas seminais, durante as quatro estaes do ano j foi

bem descrita por alguns autores (REKWOT et al., 1987; KOIVISTO et al., 1996). Em

centrais de inseminao artificial situadas na Nigria, uma grande quantidade de doses

de smen criopreservado foi descartada aps verificarem que a qualidade seminal, aps

descongelao, variou conforme a estao do ano, sendo menor durante as estaes

quentes (REKWOT et al., 1987), deixando claro que, mesmo um curto perodo e uma

pequena insulao escrotal j so suficientes para afetar a viabilidade espermtica aps

a descongelao (VOGLER et al., 1993; JANUSKAUSKAS et al., 2007).

Achados de Casady et al. (1953) indicaram que a temperatura ambiental entre

27C e 32C crtica para ocorrer o estresse trmico testicular e a exposio contnua

temperaturas superiores a 30C so prejudiciais espermatogneses.

Fonseca e Chow (1995) induziram o processo degenerativo em touros zebunos

(insulao escrotal), por 7 dias, e verificaram profundas alteraes morfolgicas,


46

decrscimo na concentrao e motilidade espermticas. Em concordncia, recentemente,

Brito et al. (2003a) descreveram aspectos importantes da induo da degenerao

testicular, tambm em touros Bos taurus indicus, verificaram que as alteraes de ncleo

espermtico, caracterizadas pela presena de vacolos nucleares, foram bem

proeminentes. Provavelmente, aparecimento desses defeitos morfolgicos est associado

sensibilidade das espermtides, nas fases finais da espermiognese (VOGLER et al., 1993).

Meyerhoeffer, em 1985 verificou que a exposio de touros Bos taurus taurus

elevada temperatura resultou em diminuio da qualidade seminal, com base nesse

resultado, Koivisto e colaboradores, em 2008, avaliaram as caractersticas seminais de

touros de origem europeia (Bos taurus taurus) e touros de origem indiana (Bos taurus

indicus) sob efeito das estaes do ano, criados na regio sudeste do Brasil, notando que

a tolerncia ao calor foi maior em touros zebus, j que apresentaram melhor motilidade,

vigor e morfologia espermticas, quando comparados s caractersticas seminais dos

touros europeus, alm de que a congelabilidade seminal desses ltimos variou

consideravelmente ao longo do ano, mas nos ambos gentipos, a congelabilidade foi

melhor no inverno do que no vero.

Os animais de origem indiana so conhecidos por se adaptarem melhor s

condies tropicais, sendo mais resistentes ao stress trmico quando comparado aos de

origem europeia nestas mesmas condies (OHASHI et al., 1998; HANSEN, 2004), pois

os zebunos diferem quanto s caractersticas anatmicas e de termorregulao

testicular; nesses animais, o escroto e a subtnica testicular facilitam o gradiente de

temperatura (troca positiva), em contraste com touros europeus, cujo gradiente

negativo. Alm disso, a espessura da artria testicular significativamente inferior em

diferentes regies do parnquima testicular, em relao aos touros europeus, facilitando

a troca ou perda de calor gerado pelo aumento do fluxo sangneo e metabolismo celular

(BRITO et al., 2004), outra caracterstica importante, que possuem menor

conformao, maior relao superfcie de pele e tamanho corporal, mais glndulas

sudorparas e menor termognese (TURNER, 1980).

Estudos de Lopes (2005), demonstram que as raas Bramhan e Senepol (Bos

taurus indicus) conseguem mostrar uma adaptao s altas temperaturas incluindo

funes celulares de termorregulao coordenadas por mecanismos de controle gnico.

Em particular embries de gado indiano (raa Bramhan) foram capazes de sobreviver a

temperaturas altas (41C por 6 horas) quando comparados a embries da raa Angus ou

Holandeses (Bos taurus taurus) submetidos ao mesmo tratamento.

possvel que tais caractersticas confiram um aspecto diferenciado na resposta

seminal frente ao choque trmico testicular. Devido isso, os bovinos de origem europia,


47

utilizados em cruzamentos industriais, apresentam menores ndices de fertilidade em

relao aos bovinos zebunos (OHASHI et al., 1998).

O mecanismo de estresse trmico que afeta os touros no est restrito apenas ao

testculo. Alm do estresse testicular, ocorre um mecanismo sistmico hormonal.

Concentraes altas de testosterona so necessrias para as funes testiculares e

epididimrias normais. Com o estresse, h o aumento das concentraes de cortisol, que

afetam negativamente a produo de testosterona, interferindo na espermatognese

(BARTH; BOWMAN, 1994).

Porm, a hiptese mais clara para explicar a menor fertilidade dos touros

europeus, seria o maior ndice de estresse oxidativo sofrido em nvel testicular (NICHI et

al., 2006).

No Brasil, a qualidade do smen de touros de raas zebunas foi considerada

inferior aos de raas taurinas, especialmente no perodo de seca, por Silva (1981),

enquanto Koivisto et al. (1998) associaram a qualidade do smen (porcentagem de

espermatozides anormais) das duas subespcies com altas temperaturas e umidade

relativa do ar, presentes nas estaes de primavera e vero. Em Cuba, ambas as

subespcies apresentaram smen de melhor qualidade (motilidade, concentrao,

percentagem de espermatozides vivos) no perodo frio (MENENDEZ-BUXADERA et al.,

1983). Na ndia, as raas zebunas apresentaram smen de melhor qualidade (volume,

pH, concentrao, movimento de massa, motilidade) na estao quente-chuvosa e as

raas taurinas na estao quente-seca (DJIMDE; WENIGER, 1984).

Em geral, quando se compara a qualidade seminal de touros de origem europeia e

indiana, fica claro que os primeiros so os que mais sofrem com o estresse trmico

(MEYERHOEFFER et al., 1985, NICHI et al., 2006), porm, importante ressaltar que at

mesmo os touros zebus demonstraram alteraes seminais devido a variabilidade

sazonal (REKWOT et al., 1987).

4.5 ESTRESSE OXIDATIVO

O oxignio, uma molcula essencial s plantas e animais que, atravs da oxidao

de molculas biolgicas, produz a energia necessria para sua sobrevivncia e

manuteno do metabolismo celular, tambm pode ser potencialmente txico s clulas.

De modo que em certas condies, o oxignio pode reagir com determinadas molculas e


48

culminar na formao de espcies reativas de oxignio, dentre elas esto os radicais

livres (IWASAKI; GAGNON, 1992).

O radical livre qualquer espcie qumica, tomo, on ou molcula que contem um

nmero de eltrons no pareado na camada de valncia, e pode reagir com qualquer

molcula que esteja prxima ao seu local de formao (SINGH; JAISWAL, 1992).

Mesmo uma pequena quantidade de oxignio consumida reduzida por vias

especficas fornecendo uma variedade de substncias qumicas altamente reativas tais

como o xido ntrico (NO), o nion superxido (O2-), o radical hidroxila (OH-), e perxido

de hidrognio (H2O2), substncias essas chamadas de espcies reativas de oxignio (ROS

Reactive Oxygen Species) (CHAN et al., 1999), sendo assim, sua produo uma

conseqncia inevitvel desde que haja oxignio no metabolismo celular (IWASAKI;

GAGNON, 1992). A ROS mais reativa e prejudicial o radical hidroxila (OH-), que pode

ser formado atravs do H2O2 e do O2- (HALLIWELL, 1991).

As ROS desempenham dupla funo no organismo celular (fisiolgica e

patolgica). Essa funo depender no somente da natureza das ROS, mas tambm do

momento em que produzida, de sua concentrao, do tempo de exposio (AITKEN et

al, 1993a; GRIVEAU et al., 1995), e da eficcia dos mecanismos antioxidantes.

Normalmente h certo equilbrio entre a formao e a proteo contra os radicais livres,

caso contrrio, as ROS causariam estresse oxidativo e leso em macromolculas como

lipdeos, protenas e DNA (BIESALSKY, 2002).

O efeito das ROS, tanto daquelas produzidas endogenamente, como daquelas por

agentes contaminantes, limitado pela presena de vrios sistemas regulatrios. Esses

sistemas de defesa, no apenas os enzimticos, mas tambm os no-enzimticos

mantem o balano entre a produo e o metabolismo dessas substncias e ainda agem

em todas as etapas no processo de peroxidao (NISSEN; KREYSEL, 1983).

Trs enzimas constituem um dos sistemas de proteo: 1. Catalase, a qual

permite a degradao do perxido de hidrognio (JEULIN et al., 1989); 2. Glutationa

Peroxidase, que catalisa a degradao do perxido de hidrognio e lipoperxidos

(ALVAREZ; STOREY, 1989); 3. Superxido Desmutase, a qual acelera a dismutao do

nion superxido (NISSEN; KREYSEL, 1983). Do outro sistema de proteo, o no-

enzimtico, fazem parte: a Vitamina E ( -tocoferol), que interrompe a reao em cadeia

da peroxidao lipdica (CHOW, 1991); a Vitamina C (ascorbato), que regenera a

Vitamina E, de oxidada para ativa, e neutraliza o nion superxido e oxignios livres

(DAWSON et al., 1992) 1; a glutationa (GSH), urato, piruvato, taurina e hipotaurina

(AGARWAL, 2006).


49

Ao longo do processo de maturao espermtica, a clula perde citoplasma, dessa

forma, perde tambm parte dos mecanismos antioxidantes que so observadas nos

outros tipos celulares (DONNELLY; MCCLURE; LEWIS, 1999). Contudo, o plasma

seminal que o protege do ataque oxidativo pela presena de enzimas e molculas

antioxidantes (LEWIS et al., 1997; HSU et al., 1998).

De acordo com estudos feitos por Lewis em 1995, Pasqualotto em 2000 e seus

respectivos colaboradores, os nveis de antioxidantes, como vitamina C e E, tanto no

espermatozide como no plasma seminal, so reduzidos nos homens infrteis, quando

comparados ao grupo de homens frteis, alm disso, foi mostrado, em outro trabalho, os

efeitos benficos desses antioxidantes, quando adicionados durante a preparao

espermtica para um tratamento de reproduo assistida (HUGHES et al., 1998).

4.5.1 Espcies Reativas de Oxignio na fertilidade do macho

As espcies reativas de oxignio exercem dupla influncia sobre espermatozides

de mamferos, por um lado, a adio de antioxidantes em diluidores para criopreservao

melhora a qualidade e funo espermticas aps a descongelao (BILODEAU et al.,

2000), por outro lado, pequenas concentraes de ROS exgenas ou endgenas fazem

um papel estimulatrio sobre os espermatozides (AITKEN et al., 1998).

A fonte de maior produo de ROS nos ejaculados de mamferos so leuccitos e

espermatozides anormais, presentes na maioria do smen (AITKEN; WST; BUCKINGHAM,

1994), alm da prpria mitocndria, na cadeia de transporte de eltrons, ao realizar o

processo de respirao celular.

O fato de que, fisiologicamente, a prpria clula espermtica produz ROS

apoiado por estudos que comprovam que essas espcies reativas esto envolvidas em

funes espermticas essenciais, tais como sua funo cintica, o que permite a

movimentao espermtica atravs do aparelho reprodutivo da fmea, sua funo

fusognica, que promove a capacitao, hiperativao, reao acrossmica e a ligao

espermtica zona pelcida (AITKEN et al., 1989a; KODAMA; KURIBAYASHI; GAGNON,

1996).

No entanto, em um estudo de Iwasaki e Gagnon (1992), foi verificado que as ROS

so rotineiramente detectadas em 25% das amostras seminais provenientes de homens

infrteis.


50

O espermatozide particularmente susceptvel ao das ROS (JONES; MANN,

1977). Acredita-se que tal fato deve-se pequena quantidade de citoplasma na clula

espermtica normal, o que limita a quantidade de antioxidantes, principalmente os

enzimticos (VERNET; AITKEN; DREVET, 2004), alm de serem ricos em cidos graxos

poliinsaturados em sua membrana plasmtica, principalmente o DHA (JONES; MANN;

SHERINS, 1979). Esses cidos graxos so essenciais para propiciar a fluidez necessria

para que os espermatozides atinjam o ocito, promovam a fuso e posteriormente, a

fertilizao (AITIKEN; KRAUSZ, 2001).

Desde a primeira metade da dcada de 40 h relatos de que o excesso de ROS

diminui a motilidade espermtica, e mais adiante, que os radicais livres so produzidos

tanto por espermatozides normais quanto por anormais, entretanto os normais

possuem mecanismos de defesa que previnem o dano celular (SULEIMAN et al., 1996), e

os anormais, principalmente pela presena de mitocndrias inativas, produzem mais

radicais livres.

Outro aspecto do excesso de produo de ROS pelos espermatozides anormais

parece estar envolvido com defeitos da pea intermediria, associado reteno do

citoplasma, mais especificamente da gota citoplasmtica (AITKEN et al., 1994). Nichi et

al. (2007), em estudo realizado em smen bovino proveniente de epiddimo, clulas que

possuam gota citoplasmtica proximal (defeito maior) apresentaram maior

suscetibilidade ao estresse oxidativo quando comparadas s clulas com gota

citoplasmtica distal (evento normal em clulas provenientes de epiddimo).

Para que o espermatozide seja considerado qualitativamente vivel e

potencialmente frtil necessrio que possua morfologia, atividade metablica e

membranas normais (JOBIM et al., 2002). Fatores externos s clulas espermticas, tais

como, alteraes na composio, pH, temperatura e osmolaridade do meio que as

circunda, podem provocar alteraes irreversveis em suas membranas, limitando a

funo fertilizante dos das clulas espermticas (WATSON, 2000), um exemplo a

peroxidao lipdica, que pode modificar estruturas proticas, inativar hormnios e

enzimas, aumentar a permeabilidade celular, resultando em perda da integridade da

membrana e ruptura da clula (LI; SHANG; CHEN, 2004).

As espcies reativas de oxignio podem atacar qualquer componente celular,

porm, os cidos graxos poliinsaturados so os principais alvos, j que possuem grandes

quantidades de duplas ligaes (insaturaes) (IWASAKI; GAGNON, 1992).

O processo de peroxidao lipdica inicia-se na presena de ROS, que ao ter

contato com os cidos graxos poliinsaturados da membrana plasmtica, em especial o

DHA, retiram uma molcula de hidrognio de uma dupla ligao, transformando-o em

radical livre, que por sua vez, ir agir em outro cido graxo poliinsaturado. Este


51

mecanismo desencadeia a cascata de peroxidao, causando alteraes estruturais

espermticas, alm da perda de fluidez e da capacidade de regular a concentrao

intracelular de ons envolvidos no controle do movimento espermtico e mudanas no

metabolismo celular (AITKEN; KRAUSZ, 2001; MARQUES et al., 2002).

Segundo Ohyashiki, Tsuka, Mohri (1988) e Block (1991) e colaboradores, o

ataque dos cidos graxos poliinsaturados e a reao em cadeia da peroxidao lipdica,

causam desorganizao na arquitetura da membrana plasmtica, que faz com que haja

perda da funo celular, comprometendo a habilidade do espermatozide em iniciar os

eventos de fuso, reao acrossmica e penetrao no ocito, o que resulta na perda da

capacidade de fertilizao do espermatozide.

Sustentando essa idia, a adio de cido araquidnico, um cido graxo

poliinsaturado, em suspenso de smen humano estimulou a gerao dose-dependente

de ROS e perda de motilidade espermtica (AITKEN; BAKER, 2006).

O estresse oxidativo , dessa maneira, considerado como uma das causas mais

freqentes da disfuno espermtica (ATIKEN et al., 1998); alm de ser um dos

principais fatores associados perda na fertilidade de amostras de smen durante sua

manipulao e armazenamento, principalmente quando utilizadas tcnicas que

necessitam da retirada do plasma seminal (WATSON, 2000; BALL et al., 2001;

CALAMERA et al., 2001; AITKEN; BAKER, 2002), ainda, estudos indicam que a perda de

qualidade de amostras espermticas criopreservadas ou sob refrigerao, tambm pode

estar relacionada ao estresse oxidativo (AURICH et al., 1997; BAUMBER et al., 2000), j

que, aps a descongelao, os processos metablicos das clulas voltam a acontecer,

dentre eles a produo de espcies reativas de oxignio (BALL et al., 1999, 2001).

Em pesquisa realizada por Tavilani, Doosty e Salidi (2005), foi mostrado que a

concentrao de malondialdedo (MDA), produto da peroxidao lipdica, foi quase duas

vezes maior em amostras seminais de homens astenozoosprmicos do que em smen de

homens normozoosprmicos.

Portanto, alteraes mitocondriais, danos estruturais do DNA, perda da

integridade de membrana e inativao de enzimas tm sido correlacionadas com a

formao de lipoperxido (ATIKEN et al., 1998; SIKKA, 2004), dessa forma, o estresse

oxidativo causado pelo acmulo de ROS afeta, no somente a fluidez da membrana

plasmtica do espermatozide, mas tambm promove danos celulares, que induzem a

apoptose das clulas germinativas culminando em perda da sua funo de fertilizao

(OLLERO; POWERS; ALVAREZ, 2000). Neste sentido, o grupo de pesquisa de

Kasimanickam em 2006 verificou que os parmetros seminais normais de carneiros

foram negativamente relacionados ao ndice de fragmentao de DNA e peroxidao

lipdica.


52

4.5.2 Mensurao do estresse oxidativo

Muitas pesquisas tm sido feitas a fim de desenvolver ndices de estresse oxidativo

que possam identificar e quantificar, com acurcia, os efeitos desse processo sobre a

infertilidade. Uma vez que, o estresse oxidativo corresponde a um desequilbrio entre a

produo de ROS e a proteo oxidativa no smen, torna-se concebvel que a avaliao

do estresse oxidativo seja feita atravs da mensurao dos nveis de ROS e/ou seus

metablitos, assim como, dos nveis de antioxidante no smen (NICHI, 2003).

Para a dosagem de ROS em amostras seminais so necessrias tcnicas muito

sensveis, visto que a produo destes no smen relativamente baixa quando

comparada com a produzida por leuccitos, por exemplo, e, alm disso, a meia-vida das

espcies reativas de oxignio muito curta (LUNEC, 1989; KESSOPOULO et al., 1994).

A deteco da peroxidao lipdica do espermatozide pode ser feita atravs da

utilizao de sondas fluorescentes lipoflicas ou mesmo pela cromatografia para avaliao

dos lipdeos de membrana, porm estes mtodos, apesar de serem sensveis, so

trabalhosos e possuem um custo muito elevado (SHEKARRIZ; THOMAS JR.; AGARWAL,

1995; SHEKARRIZ et al., 1995).

A degradao peroxidativa dos cidos graxos poliinsaturados leva formao de

produtos finais txicos como o 4-hidroxilnonenal e o malondialdedo (MDA) (JONES;

MANN; SHERINS, 1979), dessa forma, uma alternativa para a verificao da peroxidao

lipdica a dosagem de produtos finais deste processo que se mantm nos fluidos

corporais, como, por exemplo, o (MDA) (AITKEN; HARKISS; BUCKINGHAM, 1993a;

SIDHU et al., 1998), cujas concentraes apresentam correlao negativa com a

motilidade espermtica e com a penetrao em ocito de hamster (AITKEN et al., 1989;

1993a,b).

A ocorrncia da peroxidao lipdica em espermatozides leva a um acmulo

progressivo de hidroperxidos lipdicos na membrana plasmtica espermtica que

posteriormente se decompem para formar o MDA (SLATER, 1984; JANERO, 1990). A

avaliao dos nveis de MDA tem sido extensivamente utilizada como marcador da

peroxidao lipdica (SLATER, 1984; JANERO, 1990; NICHI, 2003).

Entre os diferentes mtodos analticos estabelecidos, a reao com o cido 2-

tiobarbitrico (TBA) o mais utilizado, sendo que nesta reao, o composto formado pela

reao entre o MDA e o TBA pode ser mensurado atravs de sua absorbncia ou

fluorescncia. Estes produtos so ento chamados de substncias reativas ao cido

tiobarbitrico (TBARS) (JANERO, 1990).


53

Em trabalho de Zalata et al., em 1998, estudaram o efeito do estresse oxidativo

induzido, atravs da peroxidao lipdica dos cidos graxos que compe os

espermatozides, e encontraram que o aumento da produo de TBARS estava associado

com uma diminuio significativa dos cidos graxos poliinsaturados.

Um ano mais tarde, Zabludovky et al. (1999), verificaram que os nveis de TBARS

em amostras seminais humanas foram inversamente correlacionados (r = -0,59, p<

0.01) com as taxas de fertilizao in vitro. Alm disso, os nveis de TBARS foram

significativamente maiores nas amostras que possuam taxa de fertilizao igual a zero,

quando comparadas com as amostras com taxa de fertilizao maior que zero. Neste

mesmo estudo, foram verificadas correlaes entre os nveis de TBARS e volume

espermtico, nmero total de espermatozides no ejaculado e morfologia espermtica

normal (r = -0,48, p< 0,01; r = -0,42, p< 0,01; r = -0,35, p< 0,04; respectivamente).

O ferro o metal mais envolvido nas reaes de peroxidao lipdica, como, por

exemplo, na reao de Fenton. Em condies fisiolgicas do organismo, o Fe 3+ no tem

a capacidade de induzir, significativamente, a formao do radical hidroxila, j que est

associado protenas, no entanto, se esse existir em seu estado livre no plasma seminal,

apoiar a reao em cadeia da peroxidao lipdica (KWENANG et al., 1987; AITKEN et

al., 1993).

A adio de metais (ferro ou cobre) no smen de humanos resulta em uma

acelerao dose dependente da peroxidao lipdica e uma diminuio na motilidade e

potencial fertilizante dessas clulas (AITKEN et al., 1989).

Sendo assim, uma ferramenta importante e muito utilizada para a avaliao dos

nveis de proteo antioxidante e de peroxidao lipdica a gerao artificial de ROS, o

que permite avaliar dois aspectos: a peroxidao lipdica espermtica e a disponibilidade

de hidroperxidos lipdicos na membrana plasmtica do espermatozide, pelos quais iria

se iniciar a reao peroxidativa em cadeia; e a habilidade do espermatozide em inibir a

propagao deste processo atravs de mecanismos antioxidantes (AITKEN; HARKISS;

BUCKINGHAM, 1993a).

Uma das formas de se induzir a produo de ROS atravs da reao entre a

hipoxantina e a xantina oxidase, que resultaria em uma reduo univalente e bivalente

da molcula de oxignio para gerar nion superxido, e do perxido de hidrognio

respectivamente. Estes radicais iro dar origem ao radical hidroxila, que altamente

reativo e especialmente deletrio ao espermatozide (AITKEN; HARKISS; BUCKINGHAM,

1993 a, b; SIKKA, 1996).

Outra tcnica frequentemente utilizada para provocar a peroxidao lipdica, a

induo pelo sistema sulfato de ferro (FeSO4) + cido ascrbico (AITKEN; HARKISS;


54

BUCKINGHAM, 1993b; GRIVEAU et al., 1995). Esta tcnica se baseia na formao de

metais de transio (Ferro e Cobre) que iro catalisar a quebra de hidroperxidos pr-

existentes iniciando a propagao da reao em cadeia da peroxidao lipdica promovida

pelo ferro atravs da reao de Fenton. O cido ascrbico, por sua vez, provocaria a

reduo do Fe3+ para Fe2+, alimentando novamente a reao (AITKEN; HARKISS;

BUCKINGHAM, 1993b; ENGEL; SCHREINER; PETZOLDT, 1999).

4.6 AVALIAO SEMINAL

A avaliao da qualidade seminal apresenta como objetivos principais predizer o

potencial de fertilidade em indivduos desc

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