derivatizace v hplc
DESCRIPTION
Derivatizace v HPLC. Obecný způsob derivatizace a derivatizační techniky v HPLC Mnoho látek neprojevuje absorpci v UV oblasti nebo fluorescenci - mohou být převedeny na UV – absorbující nebo fluoreskující deriváty před nebo po kolonovou derivatizací Způsob derivatizace - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
HPLC derivatizace 1
Derivatizace v HPLC
Obecný způsob derivatizace a derivatizační techniky v HPLC
Mnoho látek neprojevuje absorpci v UV oblasti nebo fluorescenci - mohou být převedeny na UV – absorbující nebo fluoreskující deriváty před nebo po kolonovou derivatizací
Způsob derivatizace Pokolonová derivatizace – nejsou změny v
chromatografickém systému Předkolonová derivatizace – umožní změny v
chromatografickém procesu
HPLC derivatizace 2
DerivatizaceDůvody použití derivatizace v HPLC - zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec - zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec - zamezení nežádoucí sorpce látek na koloněZpůsob derivatizacea) Předkolonová derivatizace (pre-column chromatography);
chemická reakce probíhá před kolonoub) Pokolonová derivatizace (post-column chromatography);
chemická reakce probíhá za kolonouc) Derivatizace na koloně; chemická reakce probíhá přímo v
koloně Všechny způsoby derivatizace mají vliv na eluční
charakteristiky separovaných látek (účinnost separace a dobu analýzy), ale požadavky na deriváty jsou poněkud odlišné.
HPLC derivatizace 3
Požadavky na deriváty předkolonové derivatizace derivát musí být chemické individuum a měl by být
dostatečně stabilní derivatizační reakce musí probíhat kvantitativně derivatizační reakce nemusí probíhat rychle reakce by měla být pokud možno selektivní reakce by měla být bez vedlejších produktů a měla by
probíhat za mírných reakčních podmínek (pH, teplota) tak, aby nebyla nutná předseparace vzniklého individua
při použití nadbytku derivatizačního činidla musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně a pokud možno by mělo mít jiné fyzikálně-chemické vlastnosti (nevykazuje fluorescenční vlastnosti)
Předkolonová derivatizace vyžaduje poměrně velkou experimentální náročnost a zkušenost operátora (reprodukovatelnost výsledků)
HPLC derivatizace 4
Předkolonová derivatizaceVýhody Reakční podmínky mohou být vybrány bez omezení Reakce může být pomalá Derivatizace může sloužit jako krok přípravy a čištění
vzorku Přebytek činidla může být odstraněn Derivatizace může zlepšit chromatografické vlastnosti
vzorku (rychlejší eluce …) Nevýhody V průběhu reakce mohou vznikat vedlejší produkty Reakce by měla být kvantitativní Po derivatizaci vzniká více podobných sloučenin –
selektivita chromatografie může být nižší
HPLC derivatizace 5
Požadavky na deriváty pokolonové derivatizace derivatizační reakce nemusí poskytovat jednoznačné chemické
individuum derivatizační reakce nemusí probíhat kvantitativně, ale
rozhodující je dobrá reprodukovatelnost chemické reakce derivatizační reakce musí probíhat rychle, reakce může
probíhat za extrémních podmínek (pH, teplota) používá se nadbytek reakčního činidla a dochází tak ke
zřeďování mobilní fáze činidlem a dochází ke snížení účinnosti separace vlivem rozmytí chromatografické zóny
reakce může být neselektivní, vedlejší produkty reakce nejsou na závadu
není nutné hledat nové podmínky separace, neboť se vzorek separuje v nezměněné podobě
vysoké náklady na techniku, neboť se musí používat speciální zařízení a reaktory, v nichž je nutno provádět řadu operací, výhodou je automatizace procesu derivatizace
veškeré manuální operace jsou eliminovány
HPLC derivatizace 6
Pokolonová derivatizaceVýhody Reakce nemusí probíhat kvantitativně Další detektor může být vložen před derivatizací (např. kolona –
UV detektor – reakce s fluorescenčním činidlem – fluorescenční detektor)
Vysoce specifický detekční systém (např. immunoassay) může být instalován
Vzhledem k separaci před detekcí je možné stanovovat látky, které tvoří identické reakční produkty (např. formaldehyd)
Nevýhody Reakce musí probíhat v prostředí mobilní fáze – omezení
možností Samotné derivatizační činidlo by nemělo vyvolávat odezvu
detektoru. Pokolonová derivatizace s cílem zlepšit UV absorpci velmi relativní – všechna dostupná reakční činidla silně absorbují v UV oblasti
HPLC derivatizace 7
Reaktory používané za chromatografickou kolonou
Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu. V průběhu reakce dochází k rozmývání zóny v celém systému, které je nutno potlačit na minimum.
HPLC derivatizace 8
Teorie toku mobilní fáze pokolonovým reaktorem Derivatizace za kolonou (post-column derivatization) se
někdy rovněž nazývá on-line derivatizace a jedná se o průtočný reaktor, který je umístěn za chromatografickou kolonu. V průběhu reakce dochází k rozmývání zóny v celém systému, které je nutno potlačit na minimum, čehož se dosáhne vhodnou konstrukcí reaktoru, směšovačů a spojovacího potrubí.
Tok kapaliny reaktorem by se měl svými vlastnostmi blížit pístovému toku bez axiálního promíchávání mobilní fáze. Podle účelu lze pak používat různé typy reaktorů a to buď prázdné, které jsou vhodné pro rychlé reakce, kdy doba zdržení tr v reaktoru je menší než 30 sekund, nebo náplňové, které jsou vhodné pro chemické reakce pomalé.
Rozšiřování elučních pásů, které přicházejí do reaktoru z kolony a procházejí jím za současné tvorby derivátu, je uvnitř reaktoru způsobováno axiální disperzí, která se vyjadřuje rozptylem, resp. standardní odchylkou
HPLC derivatizace 9
Průtokový kapilární reaktorPro standardní odchylku průtokového kapilárního reaktoru platí: Rozmývání zón (rozšiřování píků) je závislé zejména na průměru reakční kapiláry dt a objemovém průtoku F. Při konstantní hodnotě reakčního času se zmenšujícím se průtokem se rozmývání zón v kapilárním reaktoru zvyšuje.
Axiální disperzi je možné snížit geometrickým uspořádáním trubkového reaktoru např. jeho spletením, čímž dojde k rozrušení parabolického profilu toku (vlivem geometrické deformace proudnice). Změna geometrického uspořádání se realizuje u kapilárních reaktorů zhotovených z PTFE
HPLC derivatizace 10
Trubkový náplňový reaktorTrubkový náplňový reaktor je trubice, stočená do spirály a naplněná neporézním materiálem. Je-li náplň trubkového reaktoru tvořena skleněnými kuličkami o velmi malém průměru (dp ≈10 μm), pak axiální disperze je srovnatelná s disperzí v kapilárním reaktoru.
HPLC derivatizace 11
Derivatizační techniky v průtokových reaktorech (1) 1. Derivatizační techniky využívající tvorby derivátů
reakcí s činidly v kapalné fáziTato technika je nejrozšířenější a je realizována
v derivatizačním reaktoru, kdy do proudu mobilní fáze vycházející z kolony je aplikováno ve směšovací komůrce reakční médium, které vyvolá požadovanou reakci v samotném reaktoru, který může být termostatován
Na tento typ derivatizace jsou kladeny určité požadavky: kapalný reagent musí být mísitelný s mobilní fází nesmí docházet k reakci činidla a mobilní fáze musí vznikat struktury poskytující charakteristické
absorpce v UV-VIS oblasti nebo vykazují fluorescenci využívají se i reakce redoxní nebo hydrolytické
HPLC derivatizace 12
Optimalizace parametrů: a) průtok derivatizačního činidla a průtok mobilní fáze b) teplota derivatizační reakcec) vliv pH na derivatizační reakci
HPLC derivatizace 13
Derivatizační techniky v průtokových reaktorech (2)
2. Reakce vyvolaná změnou pH před vstupem do detektoru
Do této skupiny derivatizačních technik jsou zařazeny reakce, kdy nevznikají nové deriváty, avšak změnou pH dojde k výrazné změně absorpce v oblasti UV.
HPLC derivatizace 14
Derivatizační techniky v průtokových reaktorech (3)
3. Derivatizační reakce v systému tuhá látka kapalina
Vlastní reakce probíhá na povrchu tuhé fáze, která může vystupovat jako vlastní reagent, katalyzátor nebo nosič vázané látky (zpravidla enzymu). Výhodou této techniky je, že nedochází ke zřeďování mobilní fáze činidlem a vliv na rozšíření chromatografické zóny je minimální. Příklad pokolonové derivatizace v systému tuhá látka-kapalina:stanovení nízkých hladin vitaminu K s fluorimetrickou detekcí. Vitamin K je redukován na hydronaphtochinon po předchozí hydrolýze. K redukci vitaminu K se používají tři způsoby redukce:pokolonová derivatizace s kovovým zinkemredukce elektrochemická fotochemická redukceVitamin K1 může být redukován na příslušný hydrochinon kovovým zinkem za přítomnosti iontů zinku. Zinkový reduktor se zařazuje mezi analytickou kolonu a detektor
HPLC derivatizace 15
4. Fotochemické derivatizační reakce (působením UV záření)
Tato technika má velkou výhodu ve své vysoké specifičnosti a selektivitě, kdy se využívá především tvorby fluoreskujících sloučenin
Příkladfotocyklodehydrogenace stilbenu za vzniku derivátů fenanthrenu (toto vede k vyšším hodnotám fluorescence i absorpce v UV oblasti spektra)
Obecnou výhodou těchto reaktorů je, že nedochází ke zřeďování mobilní fáze činidlem
Derivatizační techniky v průtokových reaktorech (4)
HPLC derivatizace 16
Fotochemické derivatizační reakceVýhoda: nedochází ke zředění efluentu derivatizačním činidlem a k rozmývání chromatografické zóny dochází pouze k difuzi v otevřené kapiláře.Nevýhoda:zařazení příliš velkého mrtvého objemu (0,7-1,2 ml) za chromatografickou kolonu ve formě kapiláry, která propouští UV záření.
Vysoká specifičnost, selektivita a citlivost fluorescenční detekce
Mohou vznikat deriváty, které mají zabudované ve své molekule chromofory, fluorofory nebo elektroaktivní skupinu, které umožní detekci nebo zvýší citlivost detekce. V ideálním případě obsahuje efluent nefluoreskující nebo elektroinaktivní solut, který přechází v reaktoru ve vysoce fluoreskující resp. elektroaktivní derivát, což vede k minimálnímu šumu základní linie a nízké mezi detekce.
Příklad - stanovení barbiturátů s elektrochemickou detekcí, s UV detekcí při 270 nm - stanovení beta-laktamových antibiotik s elektrochemickou detekcí
HPLC derivatizace 17
Schéma pokolonové fotochemické derivatizace
HPLC derivatizace 18
Aplikace fotochemické derivatizaceUplatnění fotochemické derivatizace při stanovení aflatoxinů, kdy dochází k fotolýze aflatoxinu G1 a B1 na jejich fluoreskující deriváty G2a a B2a.
HPLC derivatizace 19
Rozdíl ve fluorescenční odezvě
separace aflatoxinů před fotolýzou a po fotolýze aflatoxinů
Aplikace fotochemické derivatizace
HPLC derivatizace 20
Aplikace derivatizace
Aplikované derivatizační reakce vedoucí k tvorbě detekovatelných derivátů
V HPLC několik skupin:
a) deriváty vhodné k detekci v oblasti UV-VIS spektrab) deriváty vhodné k detekci fluorimetrickéc) deriváty vhodné k detekci radiochemickéd) deriváty vhodné k detekci elektrochemickée) deriváty vhodné k detekci atomovou absorpční spektrofotometrií
HPLC derivatizace 21
Derivatizace v HPLC 1. Deriváty pro detekci v ultrafialové a viditelné
oblasti spektra 1.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny 1.2 Činidla pro karboxylové kyseliny 1.3 Činidla pro hydroxyderiváty 1.4 Činidla pro karbonylskupinu
2. Deriváty pro fluorimetrickou detekci 2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny2.2 Činidla pro karbonylovou skupinu2.3 Činidla pro karboxylovou skupinu
HPLC derivatizace 22
1. Deriváty pro detekci v ultrafialové a viditelné oblasti spektra
HPLC derivatizace 23
1.1 Činidla pro aminy a aminokyselinyStanovení aminosloučenin metodou HPLC, pomineme-li problematickou přípravu vzorku, separaci těchto látek na chromatografické koloně (iontová chromatografie, separace na reverzní fázi), je limitováno detekcí a to nepřítomností vhodného chromoforu v molekule. Vlastní kvantifikace aminů v HPLC není možná bez předchozího kroku jejich derivatizace. Mechanismus derivatizace: primární a sekundární aminoskupina - nukleofilní substituční reakce
NinhydrinIsokyanáty a isothiokyanátyAcylchloridyArylsulfonylchloridyNitrobenzeny
HPLC derivatizace 24
Ninhydrin
Separace aminokyselin na ionexové koloně s pokolonovou derivatizací ninhydrinemMolekula aminokyseliny reaguje s dvěma molekulami ninhydrinu za vzniku tzv. Ruhemannova purpuru jehož maximum absorbance je při 570 nm. Sekundární aminokyseliny jako prolin a hydroxyprolin poskytují poněkud odlišný komplex s maximem absorbance při 440 nm (R=H - prolin, R=OH - hydroxyprolin).
HPLC derivatizace 25
Isokyanáty a isothyokyanátyRozložení elektronové hustoty u isokyanátů a isothiokyanátů ukazuje, že atom uhlíku karbonylové skupiny bude silným nukleofilním centrem. Elektrofilní atak může nastat v obou místech - na atomu dusíku nebo kyslíku u isokyanátů a na atomu dusíku nebo síry u isothiokyanatanů. Z uvedeného je zřejmé, že u isokyanátů bude přednostním místem elektrofilního ataku atom kyslíku, u alkylisothiokyanátů pak atom dusíku.
HPLC derivatizace 26
Fenylisothiokyanát (PITC) a naftylisothiokyanát (NITC)Fenylisothiokyanát (PITC) se používá výhradně pro předkolonovou derivatizaci aminů (C3 až C10) a aminokyselin a následnou separaci derivátu aminokyselin jako fenylthiokarbamoylu (PTC) aminokyselin na reverzní fázi s gradientovou elucí s detekcí UV většinou při 254 nm, i když absorbční maxima derivátů jsou 269 nm.Nevýhodou je, že samotné činidlo reaguje s interferujícími látkami (reziduální kyseliny) ve vzorku a ty dávají interferující píky na chromatogramu (matrix effect). Stabilita derivátu je funkcí teploty a času. Za laboratorní teploty je maximální stabilita při pH 5,0-7,5.
Fenylisokyanát a naftylisokyanátFenylisokyanát reaguje s alifatickými a aromatickými primárními a sekundárními aminy na N,N´-disubstituovanou močovinu. Reakce je kvantitativní a probíhá v několika minutách. Primární aminy poskytují vždy velmi stabilní deriváty, voda a alkoholy také reagují s činidlem, ale aminoskupina je reaktivnější. Reakce probíhá v N,N´-dimethylformamidu (DMF), nadbytek činidla se odstraňuje přídavkem alifatického alkoholu. Separace probíhá na reverzní fázi, detekce při vlnové délce 240 až 260 nm a detekční limit je 1 - 10 ng
Isokyanáty a isothyokyanáty
HPLC derivatizace 27
AcylchloridyAcylchloridy reagují obecně s aminoskupinou za vzniku amidů, přičemž reakce probíhá vždy v alkalickém prostředí, protože se v reakčním prostředí uvolňuje kyselina chlorovodíková a ta by se vázala na původní amin. Jako bazická činidla se používají pyridin, hydroxid sodný, triethylamin.p-Methoxybenzoylchlorid Absorbční maximum derivátů se pohybuje kolem 252 nm.
m-ToluoylchloridZ mnoha acylchloridů poskytuje pouze m-toluoylchlorid deriváty, které jsou rozpustné v nepolárních rozpouštědlech a jsou tak velmi snadno extrahovatelné z reakčního prostředí. BenzoylchloridBenzoylchlorid je nejpreferovanější derivatizační činidlo pro diaminy a polyaminy. Detekční limit derivátů polyaminů při vlnové délce 254 nm je asi 100 pmol.
HPLC derivatizace 28
Arylsulfonylchloridy - reagují s primárními i sekundárními aminy za vzniku sulfonamidů
Toluensulfonylchlorid (TSCl)
Toluensulfonamidy mají vyšší absorbční koeficienty ale také zlepšují separaci na chromatografické koloně (reverzní fáze při vlnové délce 254 nm). N,N´-Dimethylaminoazobenzensulfonylchlorid (DABSCl) - jedno z derivatizačních činidel používaných ke stanovení aminokyselin. Deriváty sulfonamidů mají absorbční maximum při 420 až 450 nm a dovolují tak detekci při vyšších vlnových délkách a nedochází tak k interferencím na chromatografické koloně. Separace aminokyselin probíhá na reverzní fázi při isokratické eluci s UV detekcí při 464 nm, ale nedochází k separaci histidinu a argininu
HPLC derivatizace 29
Nitrobenzeny2,4-dinitro-1-fluorbenzen (DNFB)(též Sangerovo činidlo) derivatizace aminů a aminokyselin. Reakce 2,4-dinitro-1-fluorbenzen s primárními i sekundárními aminy je velmi rychlá. 4 -nitrobenzoyl skupina propůjčuje derivatizovaným aminům vysoce absorptivní chromofor. Separace probíhá na reverzní fázi, detekce při vlnové délce 254 nm.
Trinitrobenzensulfonová kyselina (TNBSA)stanovení aminoglykosidů v biologických materiálech - amikacinu a tobramycinu v krevním séru. Deriváty se přečišťují na pevné fázi C18, separace na reverzní fázi při teplotě 50°C a při vlnové délce 254 nm, detekční limit je 25 pmol. Výhodou je selektivita, na rozdíl od 2,4-dinitro-1-fluorbenzenu reaguje i s fenoly
HPLC derivatizace 30
1.2 Činidla pro karboxylové kyseliny
Alifatické karboxylové kyseliny neobsahují žádný chromofor a vykazují v ultrafialové oblasti spektra velmi nízké hodnoty absorbance
Je nutné do molekuly zavést některý z chromoforů.
Jedná se o esterifikační reakce
Požadavek splňují deriváty, jejichž molekula obsahuje aromatické jádro
HPLC derivatizace 31
Fenacylbromid, naftacylbromid a jejich deriváty
p-bromfenacylbromid
Zlepšit citlivost a selektivitu esterifikačních reakcí lze použitím katalyzátorů jako „crown ethery“ (makrocyklický polyether na bázi ethylenoxidu) a terciárních aminů. Crown-ethery (většinou 18-crown-6-ethery, kde 18 značí počet článků makroheterocyklu a číslo 6 počet atomů kyslíku v kruhu heterocyklu) mohou ve vnitřku svého kruhu solvatovat komplexotvorné kovové kationty a tvoři tzv. kryptáty. Dochází tak ke vzniku kryptátu kationu neutralizované karboxylové kyseliny a ten zvyšuje rozpustnost kationu. Aktivovaný anion vytěsní bromid fenacylbromidu (nukleofilní substituční reakce). HPLC analýza probíhá jak na normální tak na reverzní fázi s UV detekcí při 243 nm až 266 nm.
HPLC derivatizace 32
Spektrální vlastnosti reakčních činidel
Činidlo Molární absorpční koeficient
Vlnová délka detekce (nm)
a-bromo-2-acetonafton 37 000 254
a-p-dibromoacetofenon 28 000 260
a-bromoacetofenon 35 000 243
a-bromo-p-nitroacetofenon14 59020 000
263266
Spektrální vlastnosti některých fenacyl a naftacylbromidů
HPLC derivatizace 33
N-chlormethyftalimidy
N-chloromethylftalimid (ClMPI) a N-chlormethyl-4-nitroftalimid (ClMNPI) reagují kvantitativně s mastnými kyselinami, dikarboxylovými kyselinami a barbituráty. Pro kvantitativní průběh reakce je nutná konverze volného karboxylu na sůl alkalickou nebo amonnou, jako katalyzátor se používá triethylamin a crown ether. Nevýhodou těchto činidel je jejich reakce s alkoholy, s primárními i sekundárními aminy a látkami s kyselým protonem (CH, NH).
HPLC derivatizace 34
1.3 Činidla pro hydroxyderiváty
Mezi hydroxyderiváty patří alkoholy, fenoly cukry a steroidy a mnohé z nich jsou důležité biologické sloučeniny. Hydroxylová skupina ochotně přechází na estery reakcí s acylchloridy nebo mohou být derivatizovány substituovanými isokyanáty na N,N´- alkyl disubstituovanou močovinu.
HPLC derivatizace 35
Acylchloridy
Patří mezi nejznámější a nejrozšířenější derivatizační činidla hydroxylové skupiny; esterifikační reakce s benzoylchloridem a jeho analogy zavádí do molekuly vysoce absorptivní chromofor. Mezi tyto činidla patří:
Benzoylchlorid - derivatizace cukrů, alkoholů a glykolů. UV detekce je při 230 nm
p-Methoxybenzoylchlorid p-Nitrobenzoylchlorid - derivatizace mono-, di- a
trisacharidů, deriváty vykazují maximum absorbance při 260 nm. Relativně nepolární deriváty dovolují rychlou separaci na polární fázi (silikagel nebo oxid hlinitý).
3,5-Dinitrobenzoylchlorid - derivatizace glykosidů (digitoxin, digoxin aj.) Deriváty vykazují absorbční maximum při 230 nm
Anthracen-9-karbonylchlorid - deriváty vykazují absorbční maximum při 250 nm
HPLC derivatizace 36
Fenylisokyanáty (PIC)
Fenylisokyanáty reagují s hydroxyskupinou podobně jako aminy. Adicí alkoholů na isokyanáty vznikají estery N-substituovaných karbamových kyselin. Deriváty jsou separovány na reverzní fázi při teplotě 50 °C s UV detekcí při 230 nm. Byla vyvinuta metoda pro stanovení sorbitolu a galactitolu derivatizací fenylisokyanatanem. Separace probíhá na reverzní fázi při 240 nm, detekční limit je 3 ng
HPLC derivatizace 37
1.4 Činidla pro karbonylskupinu Samotná karbonylová skupina se chová jako chromofor s absorpčním maximem vyšším než 225 nm (aceton λ max = 270 nm), ale absorpční koeficient karbonylové skupiny je velmi nízký. Aldehydy a ketony reagují se substituovanými hydraziny a hydroxylaminy na příslušné deriváty absorbující v UV oblasti spektra. Jedná se o kysele katalyzovanou nukleofilní adici na karbonylovou skupinu. Při kyselé katalýze vzroste polarita vazby >C=O v protických rozpouštědlech, za přítomnosti kyseliny může dojít k úplné protonaci karbonylu:>C=O(+)-H ―› >C(+)-OH
2,4-dinitrofenylhydrazin (DNPH)Ketony a aldehydy reagují s 2,4-dinitroafenylhydrazinem na příslušné 2,4-dinitrofenylhydrazony. Tvorba hydrazonů probíhá v kyselém prostředí a separace derivátů probíhá jak na normální tak reverzní fázi.
p-Nitrobenzylhydroxylamin (NBHA)Aldehydy a ketony reagují s p-nitrobenzylhydroxylaminem na příslušné oximyPoužití - stanovení prostaglandinu v biologickém materiálu
HPLC derivatizace 38
2. Deriváty pro fluorimetrickou detekci
HPLC derivatizace 39
2. Deriváty pro fluorimetrickou detekci Účelem je zavést do molekuly takovou skupinu, která vykazuje
fluorescenční vlastnosti, a umožní tak detekci těchto látek. Deriváty vykazují detekční limit až o tři řády nižší než deriváty detekované v ultrafialové a viditelné oblasti spektra. Pro praktické použití fluoroderivátů by měly platit určité předpoklady:
a) rychlá a kvantitativní reakce za mírných podmínek (vodně-organická rozpouštědla, laboratorní teplota)
b) tvorba nepolárních derivátů dovolující jejich extrakci do nepolárních rozpouštědel
c) specifičnost pro danou funkční skupinoud) nadbytek derivatizačního činidla musí být snadno separován od
jeho produktůe) deriváty by měly mít uspokojivé chromatografické vlastnosti a
měly by být dostatečně stabilní
HPLC derivatizace 40
2. Deriváty pro fluorimetrickou detekci
2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny
2.2 Činidla pro karbonylovou skupinu
2.3 Činidla pro karboxylovou skupinu
HPLC derivatizace 41
2.1 Činidla pro aminy a aminokyseliny
SulfonylchloridyKarbonylchloridyHalogennitrobenzofuranyIsokyanáty a isothiokyanátyFluorescamineSchiffovy báze a obdobná činidla
HPLC derivatizace 42
Sulfonylchloridy5-N,N´-dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid (Dns-Cl)Dansylchlorid (Dns-Cl) je jedno z nejstarších a nejrozšířenějších derivatizačních činidel vůbec, který poskytuje deriváty s aminy i některými fenoly. Reakce s primárními, sekundárními aminy a aminokyselinami probíhá v mírně alkalickém prostředí. Za vyššího pH reaguje i s fenoly, imidazoly a pomalu dokonce i s alkoholy. Rychlost dansylační reakce vzrůstá se vzrůstajícím pH prostředí, ale současně vzrůstá rychlost hydrolýzy derivátů. Optimální pH prostředí se pohybuje od pH 9,5 do 10.
Dansylchlorid reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami za vzniku příslušných sulfonamidů s absorpčním maximem při 298 nm, dansylderiváty fluoreskují při hodnotě vlnové délky λ = 470 do 530 nm s excitačním zářením od λ = 340 do 380 nm. Derivatizace probíhá výhradně před kolonou. Největší nedostatek je velmi dlouhý reakční čas (2 až 60 minut) a vysoká reakční teplota (60 až 100 °C). Výhoda - jednoduchý derivatizační krok, velmi krátký čas, Dansylderiváty stabilní
HPLC derivatizace 43
5-N,N´-dibutylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid (Bns-Cl) Bansylchlorid (Bns-Cl) je analogem dansylchloridu.Deriváty bansylchloridu jsou
stabilnější, ale reakce s aminy je mírně pomalejší. Bansylderiváty jsou ve srovnání s dansylderiváty méně polární a jsou tudíž extrahovatelné lépe z reakční směsi organickými rozpouštědly o nižší polaritě (ethylacetát).
6-N-methylanilinonaftalen-2-sulfonylchlorid (Mns-Cl) Mansylchlorid (Mns-Cl) reaguje s primárními i sekundárními aminy - byl navržen
jako činidlo k určení N-terminálních aminokyselin. Mansylderiváty fluoreskují při hodnotách λ = 450 nm s excitačním zářením λ = 321 až 324 nm.
2-p-chlorosulfofenyl-3-fenylidon (Dis-Cl) Disylchlorid (Dis-Cl) reaguje s aminy, imidazoly, fenoly a alkoholy na příslušné
amidy resp. estery. Disylchlorid tvoří oranžové až červené deriváty. Tyto deriváty mohou být převedeny na vysoce fluoreskující deriváty - 1-fenyl-3-p-sulfofenylisobenzofurany - reakcí s alkoholickým KOH nebo ethoxydem sodným. Toto zvýšení detekce umožní detekovat aminokyseliny v rozmezí 0,1 až 1 pmol.
1,2-naftoylbenzimidazol-6-sulfochlorid reaguje s alifatickými i aromatickými aminy, imidazoly. Detekční limit je 0,1 pmol
až 50 fmol
Sulfonylchloridy
HPLC derivatizace 44
Karbonylchloridy9-Fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) deriváty - chloroformáty (oxycarbonylchloridy) - reaguje jak s primárními tak sekundárními aminokyselinami za vzniku
fluoreskujících derivátů s excitačním maximem při 263 nm a emisním maximem 313 nm a používá se výhradně k derivatizaci před kolonou
2-Naftyloxycarbonylchlorid (NCF-Cl) reaguje s terciárními aminy za přítomnosti uhličitanu draselného
v benzenu v uzavřené vialce při teplotě 100 °C po dobu 1 hodiny. Aminy podléhají za těchto podmínek dealkylaci a vznikají fluorescenční deriváty ve vysokém výtěžku.Tyto deriváty jsou vhodné pro chromatografickou separaci, excitační vlnová délka derivátů je 275 nm, emisní vlnová délka 335 nm s detekčním limitem řádově pmol.
HPLC derivatizace 45
Isokyanáty a isothiokyanáty Činidla s isokyanátovou skupinou resp. isothiokyanátovou skupinou
reagují s aminy, fenoly a alkoholy za vzniku derivátů močoviny (thiomočoviny) nebo karbamátů (thiokarbamátů).
2-(4´-isokyanátofenyl)-6-methylbenzothiazol reaguje s primárními i sekundárními aminy nejlépe v chlorbenzenovém
roztoku. Deriváty fluoreskují při hodnotách λ = 374 nm s excitačním zářením λ = 350 nm
9-Isothiokyanátoakridin je derivatizačním činidlem isothiokyanátového typu, který reaguje
s primárními i sekundárními aminy za tvorby vysoce fluoreskujících derivátů. K maximálnímu výtěžku reakce se reakční směs nechá působit UV záření (fotochemický reaktor). Deriváty v toluenu fluoreskují při hodnotách λ = 500 nm až 525 nm s excitačním zářením λ = 295 nm až 310 nm.
Fluoresceinisothiokyanát stanovení volných aminokyselin jako fluoreskujících thiohydantoinů
HPLC derivatizace 46
Fluorescamine
4-fenylspiro[furan-2-(3H),1´-naftalan]-3,3´-dion nefluoreskující derivatizační činidlo s teplotou tání 154 °C. Je velmi dobře rozpustný v acetonu, dioxanu, tetrahydrofuranu, dimethylsulfoxidu apod. Ve vodě je nepatrně rozpustný. Sloučeniny s funkčními nukleofilními skupinami (aminy, alkoholy) jsou schopné reakce s fluorescaminem, ale pouze primární aminy poskytují fluoreskující produkt. Fluorescamin je selektivní derivatizační činidlo pro primární aminy. Při reakci dochází k adici aminu na dvojnou vazbu furanu, přičemž tato reakce je reverzibilní. Poté dochází k přesmyku za vzniku fluoroforu. pH reakčního prostředí se pohybuje od pH 8 do pH 9. Deriváty jsou stabilní v neutrálním a mírně alkalickém prostředí za tmy. Absorbční maximum 390 nm a emisní vlnová délka je 475 nm. Fluorescamin - stanovení aminů při pokolonové derivatizaci stanovení aminokyselin v automatických analyzátorech aminokyselin, při předkolonové derivatizaci biogenních aminů.
HPLC derivatizace 47
Schiffovy báze a obdobná činidla (1)o-Phthaldialdehyd (OPA)/alkylthiolReakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti 2-merkaptoethanolu nebo jiných thiolů s primárními aminy a aminokyselinami. Reakce je poměrně rychlá a probíhá za laboratorní teploty při pH 10. o-phthaldialdehydu sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenční výtěžky; excitační maxima derivátů se pohybují okolo 340 nm, emisní maxima se pohybují okolo 450 nm. o-phthaldialdehydu reaguje pouze s primárními aminokyselinami
HPLC derivatizace 48
Stanovení asparaginu metodou HPLC/FLD v reverzní fází
Schéma probíhající derivatizace asparaginu
CHO
CHO
CH2 CH2
SH
OH CH
NH2
CH2H2NOC COOHN CH
CH2CONH2
COOH
SCH2CH2OH
+ +
o-ftaldialdehyd 2-merkaptoethanol asparagin
Příklad: Stanovení asparaginu
Podmínky stanovení:analytická kolona: MERCK, LichroCART (250x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5m)analytická předkolona: MERCK, LichroCART (4x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 m)teplota kolony: 30 °Cmobilní fáze: 0,01 M Na2HPO4; 0,013 mM Na2EDTA; methanol (Merck); pH 6,4gradientová eluce: 0 – 15 min. 28 - 50 % methanolu 15 -20 min. 50 % methanoluprůtok: 0,7 ml/minnástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo v nástřikové smyčce desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonuFLD detektor: ex = 340 nm; em = 455 nm
HPLC derivatizace 49
min 4 6 8 10 12
%F
5
10
15
20
25
30
kyselina asparagová kyselina glutamová
asparagin
glutamin
homoserin
Chromatografický záznam aminokyselin ve vzorku brambor
Validace metody pro Asparagin
Výtěžnost : 92%
Opakovatelnost metody(RSD): 4,3%
LOD : 5 mg/kg
HPLC derivatizace 50
Benzoin
2-hydroxy-2-fenylacetofenon
kondenzuje se substituovaným guanidinem na 2-substituovaný amino-4,5-difenylimidazol.
Tyto imidazoly jsou vhodné k chromatografické separaci s fluorescenční detekcí s excitační vlnovou délkou 325 nm a emisní vlnovou délkou 425 nm. Přídavek 2-merkaptoethanolu stabilizuje výsledný derivát imidazolu a siřičitan sodný potlačuje pozadí fluorescence. Derivatizace byla uplatněna při stanovení guanidinových derivátů - creatinu, agmatinu apod
Schiffovy báze a obdobná činidla (2)
HPLC derivatizace 51
2.2 Činidla pro karbonylovou skupinu
Substituované hydraziny
Činidla pro alfa-ketokyseliny
Kondenzace alifatických aldehydů s 1,3-diketony a amoniaku na deriváty lutidinu
HPLC derivatizace 52
Substituované hydrazinyDansylhydrazin (Dns-H)Aldehydy a ketony reagují se substituovanými hydraziny za vzniku hydrazonů a jsou analogické 2,4-dinitrofenylhydrazinu. Stanovení maduramicinu v krmivech (fluoreskující derivát s excitačním maximem při 220 nm a emisním maximem 470 nm).Stanovení monosacharidů i polysacharidů. Fluoreskující deriváty mají excitační maxima závislá na složení derivátu - 240 nm a 360-370 nm a emisní maxima 525 - 540 nm.
2-Difenylacetyl-1,3-indendion-1-hydrazinreaguje rovněž s ketony a aldehydy za vzniku derivátů s excitačním maximem v rozmezí od 400 do 415 nm a emisním maximem kolem 525 nm4-Hydrazo-7-nitrobenzofurazan (Nbd-H)
HPLC derivatizace 53
Činidla pro α-ketokyselinyo-FenylendiaminKondenzací o-fenylendiaminu a a-ketokyseliny vzniká vysoce fluoreskující derivát hydroxychinolinu. Reakce probíhá ve vodném prostředí kyseliny chlorovodíkové za přítomnosti merkaptoethanolu. Substituované deriváty hydroxychinolinu jsou poměrně stabilní, excitační maxima většiny a-ketokyselin se pohybují kolem 375-377 nm, emisní maxima kolem 407 nm. Detekční limit se pohybuje řádově v pmolech, separace na chromatografické koloně probíhá jak v isokratickém tak gradientovém módu
1,2-Difenylethylendiamin (DPE)je analogem o-fenyldiaminu a používá se k derivatizaci a-ketokyselin (catecholaminů, kyseliny glyoxalové, dopaminu v séru a moči). Deriváty cyklického difenylimidazolidinu mají excitační maxima 345 nm a emisní maxima kolem 485 nm.1,2-Diamino-4,5-methylendioxybenzen (DMB)kondenzační činidlo pro stanovení a-ketokyselin v séru a moči. Hlavní výhodou DMB je velmi nízká mez detekce a pohybuje se od 6 do 30 fmol v 5 ml vzorku.
HPLC derivatizace 54
Kondenzace alifatických aldehydů s 1,3-diketony a amoniakem na deriváty lutidinu
Aldehydy kondenzují s 1,3-diketony (1,3-cyklohexandion) za přítomnosti amoniaku na fluoreskující deriváty lutidinu
Optimální pH reakce je okolo 5, excitační maximum derivátů je okolo 385 nm a emisní maximum 460 nm. Detekční limit se pohybuje řádově kolem jednotek fmol
HPLC derivatizace 55
2.3 Činidla pro karboxylovou skupinu
4-Bromomethyl-7-methoxykumarin (Br-Mc)1-Bromacetylpyren9-anthryldiazomethan
Derivatizace karboxylu je důležitá zejména při stanovení mastných kyselin, dikarboxylových kyselin a dalších organických kyselin. Jako derivatizační činidla se nejčastěji používají deriváty 4- bromomethylkumarinu.
HPLC derivatizace 56
Činidla pro karboxylovou skupinu4-Bromomethyl-7-methoxykumarin (Br-Mc)činidlo reaguje s karboxylovými kyselinami v acetonovém prostředí za přídavku uhličitanu draselného nebo za katalýzy crown-etherů. Deriváty v methanolu nebo směsném rozpouštědle methanol-voda (1:9) se excitují zářením o vlnové délce 323 až 325 nm a emitují záření okolo od 395 do 402 nm. 1-Bromacetylpyrenposkytuje fluoreskující derivát pyrenacylesteru o emisní vlnové délce 420 nm a excitační vlnové délce 360 nm.
9-anthryldiazomethanEsterifikace - reakce karboxylu s diazomethanem. Jako činidlo se využívá 9-anthryldiazomethan za vzniku fluoreskujícího derivátu s excitačním maximem při 365 nm a emisním maximem 418 nm. Činidlo bylo použito ke stanovení řady karboxylových kyselin.